CN116391031A - 用于增加干细胞功能的组合物和方法 - Google Patents

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CN116391031A CN202180063423.6A CN202180063423A CN116391031A CN 116391031 A CN116391031 A CN 116391031A CN 202180063423 A CN202180063423 A CN 202180063423A CN 116391031 A CN116391031 A CN 116391031A
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Abstract

包含NAD+前体、优选烟酰胺核糖核苷和维生素B12的组合的组合物用于增加造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)群中的干细胞功能的用途。

Description

用于增加干细胞功能的组合物和方法
技术领域
本发明涉及造血干细胞和祖细胞(HSPC)。具体地讲，本发明涉及用于增加造血干细胞中的干细胞功能，例如增加HSPC的群的植活和/或增加自我更新和分化的能力的组合物和方法。
背景技术
造血系统是不同成熟细胞谱系的复杂细胞层级。这些包括提供对病原体的防护的免疫系统的细胞、携带氧气通过身体的细胞以及涉及伤口愈合的细胞。所有这些成熟细胞均来源于能够自我更新并分化成任何血细胞谱系的造血干细胞(HSC)库。
HSC与它们的定向后代的区别在于主要依赖于厌氧糖酵解而不是线粒体氧化磷酸化来产生能量(Simsek,T.等人，2010年，《细胞·干细胞(Cell Stem Cell)》，第7卷，第380-390页；Takubo,K.等人，2013年，《细胞·干细胞(Cell Stem Cell)》，第12卷，第49-61页；Vannini,N.等人，2016年，《自然通讯(Nat Commun)》，第7卷，第13125页；Yu,W.M.等人，2013年，《细胞·干细胞(Cell Stem Cell)》，第12卷，第62-74页)。据信，这种不同的代谢状态保护HSC免受活性线粒体中的反应性氧物质(ROS)所致的细胞损伤，从而维持细胞长期体内功能(Chen,C.等人，2008年，《实验医学杂志(J Exp Med)》，第205卷，第2397-2408页；Ito,K.等人，2004年，《自然(Nature)》，第431卷：第997-1002页；Ito,K.等人，2006年，《自然医学(Nat Med)》，第12卷，第446-451页；Tothova,Z.等人，2007年，《细胞(Cell)》，第128卷，第325-339页)。
由四甲基罗丹明甲酯(TMRM)荧光指示的线粒体膜电位先前已被用作细胞代谢状态的替代物，并且已证实表型定义的HSC与祖细胞相比具有较低的线粒体膜电位(Vannini,N.等人，2016年，《自然通讯(Nat Commun)》，第7卷，第13125页)。在同一研究中，发现通过线粒体电子传递链的化学解偶联而人为降低线粒体膜电位迫使HSC在通常诱导快速分化的培养条件下维持其功能(Vannini,N.等人，2016年，《自然通讯(Nat Commun)》，第7卷，第13125页)。重要的是，在人HSC中观察到类似的机制，其中通过用烟酰胺核糖核苷(NAD+和维生素B3前体)补充培养基来人为降低线粒体膜电位导致植活水平显著更高并且能够维持主要和次要受体人源化小鼠两者中的长期血液产生。
然而，仍然显著需要在体内和体外增加HSC中干细胞功能的附加方法，特别是增加HSPC的群的植活(例如在造血干细胞移植程序期间)和增加HSC的自我更新和分化能力的方法。
发明内容
本申请已经发现烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)前体、优选烟酰胺核糖核苷和维生素B12、优选甲基钴胺素的组合对改善造血干细胞(HSC)功能具有协同作用，诸如通过增加植活和自我更新。
不受理论的束缚，增加的干细胞功能可通过在暴露于所述组合的细胞中通过线粒体自噬诱导调节线粒体膜电位来实现。
在一个方面，本发明提供了包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物用于增加造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)群中的干细胞功能的用途。
在一些实施方案中，用途为体外用途。在一些实施方案中，用途为离体用途。
在一些实施方案中，群是HSPC的分离群。
在一些实施方案中，HSPC具有CD34+表型。
在一些实施方案中，HSPC具有CD34+CD38-表型。
在另一个方面，本发明提供了包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物，其用于增加造血干细胞功能。
在一些实施方案中，包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物用于增加个体的造血干细胞功能。
在一些实施方案中，干细胞功能包括植活。在一些实施方案中，干细胞功能包括自我更新。在一些实施方案中，干细胞功能包括分化。
在一些实施方案中，干细胞功能是植活。在一些实施方案中，干细胞功能是自我更新的。在一些实施方案中，干细胞功能是分化。
在另一个方面，本发明提供了包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物，其用于增加个体的血细胞水平。
在另一个方面，本发明提供了包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物，其用于治疗或预防个体的(a)贫血、白细胞减少症和/或血小板减少症；(b)感染；和/或(c)癌症。
在另一个方面，本发明提供了包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物，其用于治疗或预防贫血、白细胞减少症和/或血小板减少症。
在另一个方面，本发明提供了包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物，其用于治疗或预防感染。
在另一个方面，本发明提供了包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物，其用于治疗或预防癌症。
在一些实施方案中，癌症是血液癌症。在一些实施方案中，癌症是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
在优选的实施方案中，NAD+前体选自由以下项组成的组：烟酸、烟酰胺、烟酰胺核糖核苷(NR)、还原型烟酰胺核糖核苷(NRH)、烟酰胺单核苷酸(NMN)、烟酸单核苷酸、烟酸核糖核苷、以及它们的混合物。
在优选的实施方案中，维生素B12是甲基钴胺素。
在一些实施方案中，将包含该NAD+前体和维生素B12的组合的组合物肠内或肠外、优选肠内施用于个体。在优选的实施方案中，将尿石素口服施用给个体。
在一些实施方案中，包含该NAD+前体和维生素B12的组合的组合物为药物组合物或营养组合物的形式。
在一些实施方案中，包含该NAD+前体和维生素B12的组合的组合物为食物产品、食品补充剂、营养制品、特殊医学用途配方食品(FSMP)、营养补充剂、乳基饮品、低容量液体补充剂或代餐饮料的形式。
在一些实施方案中，个体具有亚正常量的造血细胞或存在具有亚正常量的造血细胞的风险，该造血细胞为例如，红细胞、白细胞和/或血小板。
在一些实施方案中，个体患有贫血、白细胞减少症和/或血小板减少症或存在患上贫血、白细胞减少症和/或血小板减少症的风险。
在一些实施方案中，个体已经历选自以下项的干预：造血干细胞移植；骨髓移植；清髓性预处理；化疗；放射疗法；以及外科手术。
在一些实施方案中，个体是免疫受损的个体。
在一些实施方案中，个体在干预后3周-4周。
在一些实施方案中，个体为人或非人哺乳动物，优选地为人，任选地为成人、儿童或婴儿。
在一些实施方案中，将NAD+前体和维生素B12同时、依次或分开，优选同时施用于个体。
在一些实施方案中，包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物为与选自以下项的物质同时、分开或依次使用的组合制剂：G-CSF类似物、TPO受体类似物、SCF、TPO、Flt3-L、FGF-1、IGF1、IGFBP2、IL-3、IL-6、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、EPO以及它们的组合。
在另一个方面，本发明提供了扩增造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)的分离群的方法，该方法包括使该群与包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物接触。
在一些实施方案中，该接触包括在存在包含尿石素、NAD+前体和维生素B12的组合的组合物的情况下培养该群。
在一些实施方案中，该方法包括以下步骤：
(a)提供HSPC的群；
(b)任选地培养HSPC的所述群，优选地在HSPC扩增或维持培养基中培养；
(c)任选地分离由低线粒体膜电位表征的HSPC的亚群；以及
(d)使(a)或(b)的所述群或(c)的所述亚群与包含NAD+前体、优选烟酰胺核糖核苷和维生素B12的组合的组合物接触。
在一些实施方案中，步骤(a)中提供的群得自骨髓、流动外周血或脐带血。
在一些实施方案中，步骤(d)的产物富含具有长期多谱系血液重构能力的细胞。
在另一方面，本发明提供可通过本发明的方法获得的造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)的群。
在另一方面，本发明提供了包含本发明的造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)群的药物组合物。
在另一个方面，本发明提供了细胞培养基，该细胞培养基包含：包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物。
在优选的实施方案中，NAD+前体选自由以下项组成的组：烟酸、烟酰胺、烟酰胺核糖核苷(NR)、还原型烟酰胺核糖核苷(NRH)、烟酰胺单核苷酸(NMN)、烟酸单核苷酸、烟酸核糖核苷、以及它们的混合物。
在优选的实施方案中，维生素B12是甲基钴胺素。
在优选的实施方案中，NAD+前体是烟酰胺核糖核苷。
在一些实施方案中，培养基为造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)培养基。
在一些实施方案中，培养基为扩增或维持培养基。
在另一个方面，本发明提供了为个体植活造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)的方法，该方法包括使HSPC的分离群与包含NAD+前体、优选烟酰胺核糖核苷和维生素B12的组合的组合物接触，以及将HSPC的群施用于对其有需要的个体。
在另一个方面，本发明提供了增加造血干细胞功能的方法，该方法包括使造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)的群与包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物接触。
在另一个方面，本发明提供了增加个体的造血干细胞功能的方法，该方法包括使造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)的群与包含NAD+前体、优选烟酰胺核糖核苷和维生素B12的组合的组合物接触，以及将HSPC的群施用于对其有需要的个体。
在另一个方面，本发明提供了增加造血干细胞植活的方法，该方法包括使造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)的群与包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物接触。在另一个方面，本发明提供了增加造血干细胞自我更新的方法，该方法包括使造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)的群与包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物接触。在另一个方面，本发明提供了增加造血干细胞分化的方法，该方法包括使造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)的群与包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物接触。在一些实施方案中，在个体中增加植活、自我更新和/或分化，并且该方法还包括将HSPC的群施用给对其有需要的个体。
在另一方面，本发明提供了以下方法：(a)增加血细胞水平；(b)治疗或预防贫血、白细胞减少症和/或血小板减少症；(c)治疗或预防感染；和/或(d)治疗或预防个体的癌症，包括使造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)的群与包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物接触，以及将HSPC的群施用于对其有需要的个体。
在另一个方面，本发明提供了增加血细胞水平的方法，该方法包括使造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)的群与包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物接触。
在另一个方面，本发明提供了治疗或预防贫血、白细胞减少症和/或血小板减少症的方法，该方法包括使造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)的群与包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物接触。
在另一个方面，本发明提供了治疗或预防感染的方法，该方法包括使造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)的群与包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物接触。
在另一个方面，本发明提供了治疗或预防癌症的方法，该方法包括使造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)的群与包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物接触。
在一些实施方案中，该方法为离体方法。在一个实施方案中，该方法为体内方法。
在一些实施方案中，群是HSPC的分离群。在一些实施方案中，该方法还包括向对其有需要的个体施用HSPC的群。
在另一个方面，本发明提供了增加造血干细胞功能的方法，该方法包括将包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物施用于对其有需要的个体。
在另一个方面，本发明提供了增加造血干细胞植活的方法，该方法包括将包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物施用于对其有需要的个体。在另一个方面，本发明提供了增加造血干细胞自我更新的方法，该方法包括将包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物施用于对其有需要的个体。在另一个方面，本发明提供了增加造血干细胞分化的方法，该方法包括将包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物施用于对其有需要的个体。
在另一方面，本发明提供了增加血细胞水平的方法，该方法包括将包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物施用于对其有需要的个体。
在另一个方面，本发明提供了治疗或预防贫血、白细胞减少症和/或血小板减少症的方法，该方法包括将包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物施用于对其有需要的个体。
在另一个方面，本发明提供了治疗或预防感染的方法，该方法包括将包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物施用于对其有需要的个体。
在另一个方面，本发明提供了治疗或预防癌症的方法，该方法包括将包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物施用于对其有需要的个体。
附图说明
图1
NR和维生素B12的组合诱导线粒体膜电位的降低。A)在补充有NR、Vit B12(MC)、NR+MC(浓度；NR:500μM，Vit B12(MC):100μM)的基础培养基(对照)中培养的骨髓来源的鼠HSC。每24小时补充NR。仅在NR和MC条件下，TMRM低栅极中的细胞比例增加，并且MFI TMRM降低(左侧和中间图)。NR+MC的组合与单独的NR或MC显著不同。与培养中的基础或仅NR相比，NR+MC的组合的线粒体质量(通过Mitotracker测量)(右图)显著降低。
具体实施方式
本文中所用，术语“包含”和“由......构成”与“包括”或“含有”同义，并且包括端值在内或是开放式的，并且不排除另外的未列举的成员、要素或步骤。术语“包含”和“由......构成”也包括术语“由......组成”。
造血干细胞
干细胞能够分化成许多细胞类型。能够分化成所有细胞类型的细胞被称为全能细胞。在哺乳动物中，只有受精卵和早期胚胎细胞是全能的。干细胞存在于大多数(如果不是全部的话)多细胞生物体中。它们的特征在于通过有丝分裂细胞分裂而自我更新，并分化成不同范围的特化细胞类型的能力。这两种广泛类型的哺乳动物干细胞是从胚泡的内细胞团分离的胚胎干细胞和存在于成体组织中的成体干细胞。在发育中的胚胎中，干细胞可分化成所有特化胚胎组织。在成体生物体中，干细胞和祖细胞充当身体修复系统，补充特化细胞，但也维持再生器官诸如血液、皮肤或肠组织的正常周转。
造血干细胞(HSC)是可存在于例如外周血、骨髓和脐带血中的多能干细胞。HSC能够自我更新并分化成任何血细胞谱系。它们能够在所有造血组织(诸如骨髓、脾和胸腺)中重新定植整个免疫系统以及红系细胞谱系和骨髓谱系。它们提供造血细胞的所有谱系的终生生产。
造血祖细胞具有分化成特定类型细胞的能力。然而，与干细胞相比，它们已经更具特异性：它们被推动分化成它们的“靶”细胞。干细胞与祖细胞之间的差异在于干细胞可无限期地复制，而祖细胞仅可分裂有限次数。造血祖细胞可仅通过功能性体内测定(即移植和证明它们是否可在延长的时间周期内产生所有血液谱系)严格区别于HSC。
分化细胞是与干细胞或祖细胞相比已变得更特化的细胞。当生物体从单个受精卵变为组织和细胞类型的复杂体系时，在多细胞生物体发育期间发生分化。分化也是成体中常见的过程：成体干细胞在组织修复和正常细胞周转期间分裂并产生完全分化的子细胞。分化显著改变细胞的大小、形状、膜电位、代谢活性和对信号的响应性。这些变化在很大程度上是由于基因表达中高度受控的修饰。换句话讲，分化细胞是具有特定结构并且由于涉及特定基因的活化和失活的发育过程而执行某些功能的细胞。此处，分化细胞包括造血谱系的分化细胞，诸如单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞、T细胞、B细胞和NK细胞。例如，造血谱系的分化细胞可通过检测未在未分化细胞上表达或在较小程度上表达的细胞表面分子而与干细胞和祖细胞区分开。合适的人谱系标记物的示例包括CD33、CD13、CD14、CD15(骨髓)、CD19、CD20、CD22、CD79a(B)、CD36、CD71、CD235a(红细胞)、CD2、CD3、CD4、CD8(T)、CD56(NK)。
HSC来源
在一些实施方案中，造血干细胞从组织样品获得。
例如，HSC可从成人和胎儿外周血、脐带血、骨髓、肝脏或脾获得。它们可在体内细胞移动后通过生长因子治疗获得。
移动可使用例如G-CSF、plerixaphor或它们的组合进行。其他物质诸如NSAID、CXCR2配体(Grobeta)和二肽基肽酶抑制剂也可用作调动剂(mobilising agent)。
由于干细胞生长因子GM-CSF和G-CSF的可用性，大多数造血干细胞移植程序现在使用从外周血而不是从骨髓收集的干细胞进行。收集外周血干细胞提供较大的移植物，不需要供体经受一般麻醉来收集移植物，导致植活时间较短，并且可提供较低的长期复发率。
骨髓可通过标准抽吸方法(稳态或在移动之后)，或通过使用下一代收集工具(例如，Marrow Miner)收集。
此外，HSC可来源于诱导的多能干细胞。
HSC特性
通过流式细胞术程序，HSC通常具有低前向散射和侧向散射分布。一些是代谢静态的，如罗丹明标记所证实的，其允许线粒体活性的测定。人HSC可包含某些细胞表面标记物，诸如CD34、CD45、CD133、CD90和CD49f。它们也可被定义为缺少CD38和CD45RA细胞表面标记物的表达的细胞。然而，这些标记物中的一些标记物的表达取决于HSC的发育阶段和组织特异性环境。一些称为“侧群细胞”的HSC不包括流式细胞术检测到的Hoechst 33342染料。因此，HSC具有允许其识别和分离的描述性特征。
阴性标记物
CD38是用于人HSC的最确定和最有用的单个阴性标记物。
人HSC对于谱系标记物诸如CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD36、CD56、CD66b、CD271和CD45RA也可以是阴性的。然而，这些标记物可能需要组合用于HSC富集。
所谓“阴性标记物”，应当理解为人HSC缺乏这些标记物的表达。
阳性标记物
CD34和CD133是HSC的最有用的阳性标记物。
一些HSC对于谱系标记物诸如CD90、CD49f和CD93也是阳性的。然而，这些标记物可能需要组合用于HSC富集。
所谓“阳性标记物”，应当理解为人HSC表达这些标记物。
在一些实施方案中，HSC具有CD34+表型。
在一些实施方案中，HSC具有CD34+CD38-表型。
可进行进一步分离以获得例如CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+细胞。
干细胞功能
如本文所用，术语“干细胞功能”是指通常与干细胞相关的细胞特性，例如分化成特定细胞谱系的能力和/或自我更新的能力。
在一个实施方案中，干细胞功能包括植活、自我更新和/或分化。
在一些实施方案中，干细胞功能包括植活。在一些实施方案中，干细胞功能包括自我更新。在一些实施方案中，干细胞功能包括分化。
在一个实施方案中，干细胞功能是植活、自我更新和/或分化。
在一些实施方案中，干细胞功能是植活。在一些实施方案中，干细胞功能是自我更新的。在一些实施方案中，干细胞功能是分化。
如本文所用，术语“植活”是指造血干细胞和/或祖细胞在其移植后(即移植后的短期和/或长期)在个体中增殖和存活的能力。例如，植活可指在移植后约1天至24周、1天至10周、或1天-30天或10天-30天检测到的从移植的造血干细胞和/或祖细胞(例如移植物来源的细胞)下降的造血细胞的数目和/或百分比。在一些实施方案中，在移植后约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天评估植活。在其他实施方案中，在移植后约4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周或24周时评估植活。在其他实施方案中，在移植后约16周至24周，优选20周时评估植活。
植活可由技术人员容易地分析。例如，可对移植的造血干细胞和/或祖细胞进行工程改造以包含标记物(例如报告蛋白，诸如荧光蛋白)，该标记物可用于定量移植物来源的细胞。用于分析的样品可从相关组织中提取并离体分析(例如，使用流式细胞术)。
如本文所用，术语“自我更新”是指细胞经历多个细胞分裂循环同时保持未分化状态的能力。
某些状态下的细胞数和/或百分比(例如活细胞、死细胞或凋亡细胞)可使用本领域已知的多种方法中的任一种进行定量，包括使用血球计、自动细胞计数器、流式细胞计和荧光激活细胞分选机。这些技术可使得能够区分活细胞、死细胞和/或凋亡细胞。除此之外或作为另外一种选择，可使用易得的凋亡测定法(例如基于在细胞膜表面上检测磷脂酰丝氨酸(PS)的测定法，诸如通过使用结合到暴露的PS的膜联蛋白V；凋亡细胞可通过使用荧光标记的膜联蛋白V来定量)测定凋亡细胞，该凋亡测定法可用于补充其他技术。
细胞群的分离和富集
本文公开了细胞(诸如造血干细胞和/或祖细胞(HSPC))的群。在一些实施方案中，细胞群是细胞的分离群。
如本文所用，术语“分离群”是指不包含在体内的细胞群。分离的细胞群可能已经预先从个体中移除。可使用本领域已知的标准技术离体或在体外培养和操纵分离的细胞群。随后可将分离的细胞群重新引入个体内。所述个体可以是最初从其中分离细胞的相同个体或不同的个体。
可针对表现出特定表型或特征的细胞选择性地纯化细胞群，并且从不表现出该表型或特征或在较小程度上表现出该表型或特征的其他细胞纯化细胞群。例如，可从起始细胞群中纯化表达特定标记物(诸如CD34)的细胞群。另选地或除此之外，可纯化不表达另一种标记物(诸如CD38)的细胞群。
如本文所用，术语“富集”是指群中一种类型的细胞的浓度增加。其他类型的细胞的浓度可伴随地降低。
纯化或富集可导致细胞群在其他类型的细胞中基本上是纯的。
纯化或富集表达特定标记物(例如，CD34或CD38)的细胞群可通过使用结合该标记物，优选地基本上特异性结合该标记物的物质来实现。
结合细胞标记物的物质可为抗体，例如抗CD34或抗CD38抗体。
如本文所用，术语“抗体”是指能够结合所选靶标的完全抗体或抗体片段，并且包括Fv、ScFv、F(ab’)和F(ab’)2、单克隆和多克隆抗体、工程化抗体(包括嵌合抗体、CDR-移植抗体和人源化抗体)以及使用噬菌体展示或其他技术产生的人工选择抗体。
此外，本发明中还可使用经典抗体的替代形式，例如“阿维体(avibody)”、“阿维聚体(Avimer)”、“抗转运蛋白(anticalins)”、“纳体(nanobody)”和“锚蛋白重复蛋白(DARPin)”。
可使用本领域已知的多种技术中的任一种来标记结合至特定标记物的物质以便为可识别的。该物质可以被固有地标记，或者可以通过将标记缀合到其上而被修饰。所谓“缀合”，应当理解为物质和标签可操作地连接。这意味着物质和标签以使得二者能够基本上不受阻碍地执行其功能(例如结合至标记物，允许荧光鉴定，或当置于磁场中时允许分离)的方式连接在一起。合适的缀合方法是本领域熟知的，并且易于被技术人员识别。
标签可允许例如经标记的物质和与其结合的任何细胞从其环境中纯化(例如，物质可用磁珠或亲和标签诸如亲和素标记)、检测或两者。适合用作标签的可检测标记物包括荧光团(例如绿色、鲜红色、青色和橙色荧光蛋白)和肽标签(例如，His标签、Myc标签、FLAG标签和HA标签)。
多种用于分离表达特定标记物的细胞群的技术是本领域已知的。这些技术包括基于磁珠的分离技术(例如，基于闭路磁珠的分离)、流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)、亲和标签纯化(例如，使用亲和柱或珠，诸如生物素柱来分离亲和素标记的物质)和基于显微镜的技术。
还可以使用不同技术的组合进行分离，诸如基于磁珠的分离步骤，然后通过流式细胞术针对一种或多种附加(阳性或阴性)标记物对所得的细胞群进行分选。
临床级分离可例如使用
Figure BDA0004128080870000121
系统(Miltenyi)进行。这是基于闭路磁珠的分离技术的示例。
还设想到可使用染料排除特性(例如，侧群或罗丹明标记)或酶活性(例如，ALDH活性)来富集HSC。
组合物
当与T细胞的体外培养物接触时，本发明的组合物可以适于体外细胞培养的任何形式(例如，无毒形式)使用。当施用于个体时，本发明的组合物可以适于动物、优选地人类摄取的任何形式使用(例如，是无毒的)。
该组合物可以任何适当的量用于例如组合物诸如营养组合物中。技术人员将能够根据物质的期望剂量来确定其适当的量。剂量可取决于诸如向其施用物质的个体的年龄、体型和健康状况的因素，取决于生活方式以及取决于基因遗传。剂量可符合由诸如美国国家科学院食品与营养委员会的组织发布的每日推荐摄入量(RDA)。
NAD+前体
根据本发明的NAD+前体选自由以下项组成的组：烟酸(Nicotinic Acid/Niacin)、烟酰胺(Nicotinamide/Niacinamide)、烟酰胺核糖核苷(NR)、还原型烟酰胺核糖核苷(NRH)、β-烟酰胺单核苷酸(NMN)、烟酸单核苷酸、烟酸核糖核苷、富含这些化合物中的至少一者的食物提取物，例如富含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的食物提取物、以及它们的混合物。如本文所用，“烟酰胺核糖核苷”包括烟酰胺核糖核苷的L-缬氨酸和L-苯丙氨酸酯。
在优选的实施方案中，NAD+前体是烟酰胺核糖核苷。
烟酰胺核糖苷
烟酰胺核糖苷(NR)是维生素B3的吡啶核苷形式，它是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的前体。
烟酰胺核糖苷具有以下结构：
Figure BDA0004128080870000131
在一些实施方案中，T细胞与NR以1-10mM、1-5mM、1-2.5mM或1-2mM的NR浓度接触。在其他实施方案中，T细胞与NR以1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM、优选地2mM的NR浓度接触。
烟酰胺核糖核苷或NAD+前体可以下列量施用：约0.001mg/天至约2000mg/天，优选约0.001mg/天至约1000mg/天，更优选约0.001mg/天至约750mg/天，甚至更优选约0.001mg/天至约500mg/天，最优选约0.001mg/天至约250mg/天，例如约0.001mg/天至约100mg/天、约0.001mg/天至约75mg/天、约0.001mg/天至约50mg/天、约0.001mg/天至约25mg/天、约0.001mg/天至约10mg/天、或约0.001mg/天至约1mg/天。当然，日剂量可在一天的各个小时处分批施用。然而，在任何给定情况下，所施用的化合物的量将取决于诸如活性组分的溶解度、所用的制剂、受治疗者状况(诸如体重)和/或施用途径之类的因素。例如，上文公开的烟酰胺核糖核苷的日剂量是非限制性的，并且在一些实施方案中，可以是不同的；尤其是，本文所公开的组合物可用作用于特殊医疗用途的急性护理食物(FSMP)，并且含有至多约2.0mg烟酰胺核糖核苷/天。
维生素B12
维生素B12(也称为钴胺素)是一类含钴的水溶性维生素，其不能由人体合成，因此必须从食物中获取或通过肠道菌群合成。
人体中的维生素B12群由几种形式组成：氰钴胺素，它是无活性的并且需要转化才有活性；以及甲基钴胺素和腺苷钴胺素，它们是维生素B12的代谢活性形式。
已知两种酶依赖维生素B12作为辅因子：甲硫氨酸合成酶和甲基丙二酰辅酶A变位酶。甲硫氨酸合成酶是依赖甲基钴胺素将同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸的细胞质酶。因此它在提供S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基化供体并预防同型半胱氨酸的毒性积聚方面起着关键作用。在维生素B12严重缺乏时观察到的低SAM水平和高同型半胱氨酸水平会损害外周神经和脊髓的髓鞘形成。甲硫氨酸合成酶还催化5-甲基-四氢叶酸活化为生物活性四氢叶酸，这是一碳代谢和DNA合成所需的，因此是高效红细胞增殖所需的。甲基丙二酰辅酶A变位酶是依赖腺苷钴胺素将甲基丙二酰辅酶A转化为琥珀酰辅酶A的线粒体酶，琥珀酰辅酶A随后进入TCA循环。它涉及支链氨基酸和奇链长度脂肪酸的降解，并且在胚胎期对于控制神经发育至关重要，但在成年期并不重要。
本发明的维生素B12可为例如维生素B12本身、半合成衍生物氰钴胺素、羟钴胺素、甲基钴胺素和/或腺苷钴胺素的形式。甲基钴胺素可为特别有效的。
在一些实施方案中，T细胞与维生素B12以10-100μM、10-75μM或10-50μM的维生素B12浓度接触。在其他实施方案中，T细胞与维生素B12以25-100μM、25-75μM或25-50μM的维生素B12浓度接触。在其他实施方案中，T细胞与维生素B12以1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM或100μM、优选地50μM的维生素B12浓度接触。
在一些实施方案中，维生素B12每天以维生素B12的每日推荐需求量(RDA)的0.1至40倍，例如每天以维生素B12的每日推荐需求量(RDA)的1至10倍施用于个体。
因此，维生素B12每天可以维生素B12的RDA的约10倍、20倍、30倍或40倍的日剂量施用。优选地，日剂量提供每天10至40，更优选10至30，或甚至更优选10至25倍的维生素B12的RDA，最优选每天约12至21倍的维生素B12的RDA。
对于14岁及以上年龄的人，维生素B12的美国RDA为每日2.4微克，因此可向此类个体施用提供每天约0.002mg至约0.4mg的维生素B12、优选地每天0.02mg至0.07mg的维生素B12、更优选地每天0.03mg至0.05mg的维生素B12的日剂量。
药物和营养组合物
在一些实施方案中，包含该NAD+前体和维生素B12的组合的组合物为药物组合物的形式。
药物组合物还可包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方案中，造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)为药物组合物的形式。
可配制本发明的细胞，用于与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起向个体施用。合适的载体和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水，并且可能含有人类血清白蛋白。
细胞治疗产品的处理优选地根据用于细胞治疗的FACT-JACIE国际标准进行。
在一些实施方案中，包含该NAD+前体和维生素B12的组合的组合物为营养组合物的形式。
在一些实施方案中，包含该NAD+前体和维生素B12的组合的组合物为食物产品、食品补充剂、营养制品、特殊医学用途配方食品(FSMP)、营养补充剂、乳基饮品、低容量液体补充剂或代餐饮料的形式。在一些实施方案中，组合物是婴儿配方食品。
在一些实施方案中，包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物是食品添加剂或药物的形式。
食品添加剂或药物可为例如片剂、胶囊、锭剂或液体的形式。食品添加剂或药物优选作为持续释放制剂提供，允许长时间恒定供应活性成分。
组合物可选自以下项：基于乳粉的产品；速溶饮品；即饮型制剂；营养粉末；营养液体；乳基产品，尤其是酸乳酪或冰淇淋；谷类产品；饮料；水；咖啡；热牛奶咖啡；麦芽饮料；巧克力风味饮料；烹饪产品；汤；片剂；和/或糖浆。
组合物还可包含保护性水性胶体(诸如树胶、蛋白质、改性淀粉)、粘结剂、成膜剂、包囊剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、包衣、乳化剂、表面活性试剂、增溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等)、吸附剂、载体、填料、共化合物、分散剂、润湿剂、加工助剂(溶剂)、流动剂、掩味剂、增重剂、胶凝剂、凝胶形成剂、抗氧化剂和抗微生物剂。
此外，根据政府机构(例如USRDA)的推荐，组合物可含有适用于口服或经肠施用的有机或无机载体材料，以及维生素、矿物质痕量元素和其他微量营养素。
本发明的组合物可包含蛋白质源、碳水化合物源和/或脂质源。
可使用任何合适的膳食蛋白质，例如动物蛋白质(诸如乳蛋白、肉蛋白和卵蛋白)；植物蛋白(诸如大豆蛋白、小麦蛋白、大米蛋白和豌豆蛋白)；游离氨基酸的混合物；或其组合。乳蛋白(诸如酪蛋白和乳清)和大豆蛋白是特别优选的。
如果组合物包含脂肪源，则脂肪源优选地提供配方食品的5％至40％的能量；例如20％至30％的能量。可添加DHA。可使用低芥酸菜籽油、玉米油以及高油酸葵花油的共混物来获得合适的脂肪分布型。
碳水化合物源可更优选地提供组合物的40％至80％之间的能量。可使用任何合适的碳水化合物，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体、麦芽糊精、以及它们的混合物。
造血干细胞移植
本发明提供了根据本发明的方法制备的造血干细胞和/或祖细胞群以用于治疗。
该用途可作为造血干细胞移植程序的一部分。
造血干细胞移植(HSCT)是来源于骨髓(在这种情况下称为骨髓移植)或血液的血液干细胞的移植。干细胞移植是血液学和肿瘤学领域的医疗过程，最常对患有血液或骨髓疾病或某些类型的癌症的人进行。
HSCT的许多受体是多发性骨髓瘤或白血患者，其将不会受益于用化疗长时间治疗或已经对化疗有抗性。HSCT候选者包括儿科病例，其中患者患有先天性缺陷，诸如严重联合免疫缺陷或具有缺陷干细胞的先天性中性粒细胞减少症，以及出生后失去其干细胞的患有再生障碍性贫血的儿童或成人。用干细胞移植治疗的其他病症包括镰状细胞疾病、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、淋巴瘤、尤文氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和霍奇金病。最近，已开发出需要较小剂量的制备化疗和辐射的非清髓性或所谓的“微型移植”手术。这允许HSCT在老年人和其他患者中进行，否则这些患者将被认为太弱而不能承受常规的治疗方案。
在一些实施方案中，造血干细胞和/或祖细胞作为自体干细胞移植程序的一部分施用。
在其他实施方案中，造血干细胞和/或祖细胞作为同种异体干细胞移植程序的一部分施用。
所谓“自体干细胞移植程序”，应当理解为起始细胞群(即，在与本发明的物质接触之前)从与施用最终细胞群的个体相同的个体获得。自体移植程序是有利的，因为它们避免了与免疫学的组织不相容性相关联的问题，并且无论基因匹配供体的可用性如何，自体移植程序都可用于个体。
所谓“同种异体干细胞移植程序”，应当理解为起始细胞群(即，在与本发明的物质接触之前)从与施用最终细胞群的个体不同的个体获得。优选地，供体将与施用细胞的个体基因匹配以最小化免疫学的组织不相容性的风险。
治疗方法
应认识到，本文对治疗的所有提及包括治愈性、缓和性和预防性治疗。优选哺乳动物，特别是人类的治疗。人类治疗和兽医治疗均在本发明的范围之内。
施用
虽然用于本发明中的组合物可单独施用，但它们将通常与药物载体、赋形剂或稀释剂混合施用，特别是对于人类疗法而言。
在一些实施方案中，包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物为同时、分开或依次、优选同时使用的组合制剂。
在一些实施方案中，包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物为与选自以下项的物质同时、分开或依次使用的组合制剂：G-CSF类似物、TPO受体类似物以及它们的组合。
如本文所用，术语“组合”或术语“以组合”、“与……组合使用”或“组合制剂”可指两种或更多种物质同时、相继或分别组合施用。
如本文所用，术语“同时”意指同时(即，在同一时间)施用这些物质。
如本文所用，术语“相继”意指一个接一个地施用这些物质。
如本文所用，术语“分别”意指物质彼此独立地但在一定时间间隔内来施用该时间间隔使该物质可以产生组合的、优选协同的影响。因此，“分别”施用可能允许例如在1分钟、5分钟或10分钟内在施用一种物质之后施用另一种物质。
剂量
无需进行过多实验，技术人员可容易地确定向个体施用的本发明物质之一的合适的剂量。通常，医师会确定对个体患者最适合的实际剂量，并且该剂量将取决于多种因素，包括所采用的具体物质的活性、物质的代谢稳定性和作用时长、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用模式和时间、排泄率、药物组合、特定病症的严重程度和个体正接受的疗法。当然也可存在有益的较高或较低剂量范围的个别情况，这在本发明的范围之内。
个体
在一些实施方案中，个体是人类或非人动物。
非人类动物的示例包括脊椎动物例如哺乳动物，如非人类灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、狗、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠或豚鼠)、猪和猫。非人类动物可为伴侣动物。
优选地，个体是人类。
本发明可例如用于增加个体的血细胞产生。
本发明可例如用于增加个体的血细胞水平。
在一些实施方案中，个体具有亚正常量的造血细胞或存在具有亚正常量的造血细胞的风险，该造血细胞为例如，红细胞、白细胞和/或血小板)。
人类白细胞的正常范围是4500个细胞/μl-10000个细胞/μl。男性人类中红细胞的正常范围是5百万个细胞/μl-6百万个细胞/μl，女性人类中红细胞的正常范围是4百万个细胞/μl-5百万个细胞/μl。血小板的正常范围为140000/μl-450000/μl。技术人员可使用本领域已知的多种技术中的任一种技术容易地测量血细胞水平(也可称为血细胞计数)，例如使用血球计和自动血液分析仪。
在一些实施方案中，个体患有贫血、白细胞减少症和/或血小板减少症或存在患上贫血、白细胞减少症和/或血小板减少症的风险。
在一些实施方案中，亚正常量的造血细胞继发于造血系统的原发性或自身免疫疾病，例如先天性骨髓衰竭综合征、特发性血小板减少症、再生障碍性贫血和骨髓增生异常综合征。
存在发展成血细胞水平降低的风险的个体包括患有贫血或骨髓增生异常综合征的患者，经历化疗、骨髓移植或放射治疗的患者，以及患有自身免疫性血细胞减少症(包括但不限于免疫性血小板减少性紫癜，纯红细胞再生障碍和自身免疫性中性粒细胞减少症)的患者。
存在发生移植后并发症风险的个体包括已从原代或体外操纵的HSPC接受自体或同种异体造血干细胞或祖细胞移植物的造血细胞耗尽的个体。
在一些实施方案中，个体可能已经历清髓性预处理；化疗；放射疗法；和/或外科手术。清髓性预处理；化疗；放射疗法；和/或外科手术可能导致造亚正常量的造血细胞。
具有亚正常量的造血细胞或存在具有亚正常量的造血细胞的风险的个体包括患有以下疾病的个体：血癌(例如，白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、血液疾病(例如，遗传性贫血、先天性代谢缺陷、再生障碍性贫血、β-地中海贫血、Blackfan-Diamond综合征、球状细胞脑白质营养不良、镰状细胞贫血、重症联合免疫缺陷、X-连锁淋巴组织增生综合征、Wiskott-Aldrich综合征、亨特氏综合征、赫尔勒氏综合症、Lesch Nyhan综合征、骨硬化症)，经历免疫系统的化疗抢救的个体，以及患有其他疾病(例如，自身免疫疾病、糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮)的个体。此外，具有亚正常量的造血细胞或存在具有亚正常量的造血细胞的风险的个体包括呈现严重嗜中性白血球减少症和/或严重血小板减少症和/或严重贫血的个体，例如移植后个体或经历实体肿瘤的消融化疗的个体，经受毒性、药物诱导或感染性造血衰竭(即苯衍生物、氯霉素、B19细小病毒等)的患者，以及经受骨髓增生异常综合征、严重免疫病症或先天性血液学病症(无论是中枢性(即，范可尼贫血)或外周起源的(G6PDH缺陷型)的患者。
本发明可用于例如治疗或预防贫血、白细胞减少症和/或血小板减少症；感染(例如，非病毒或病毒感染)；和/或癌症，诸如血液学癌症(例如，白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)。
本发明的组合、组合物和细胞群可用于治疗WO 1998/005635中列出的疾病。为了便于参考，现在提供该列表的一部分：癌症、炎症或炎性疾病、皮肤病、发烧、心血管作用、出血、凝血和急性期反应、恶病质、食欲缺乏、急性感染、HIV感染、休克状态、移植物抗宿主反应、自身免疫疾病、再灌注损伤、脑膜炎、偏头痛和阿司匹林依赖性抗血栓形成；肿瘤生长、侵袭和扩散，血管生成、转移，恶性腹水和恶性胸腔积液；脑局部缺血、缺血性心脏病、骨关节炎、类风湿性关节炎、骨质疏松症、哮喘、多发性硬化、神经变性、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、中风、血管炎、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎；牙周炎、齿龈炎；牛皮癣、特应性皮炎、慢性溃疡、大疱性表皮松解；角膜溃疡、视网膜病和外科伤口愈合；鼻炎、过敏性结膜炎、湿疹、过敏反应；再狭窄、充血性心力衰竭、子宫内膜异位症、动脉粥样硬化或内硬化症。
除此之外或作为另外一种选择，本发明的组合、组合物和细胞群可用于治疗WO1998/007859中列出的疾病。为了便于参考，现在提供该列表的一部分：细胞因子和细胞增殖/分化活性；免疫抑制剂或免疫刺激剂活性(例如，用于治疗免疫缺陷，包括用人免疫缺陷病毒感染；淋巴细胞生长的调节；治疗癌症和许多自身免疫疾病，以及预防移植排斥或诱导肿瘤免疫)；造血的调节，例如骨髓或淋巴疾病的治疗；促进骨、软骨、肌腱、韧带和神经组织的生长，例如用于愈合伤口、治疗烧伤、溃疡和牙周病以及神经退行性变；卵泡刺激素的抑制或激活(生育力的调节)；趋化/化学动力活性(例如用于将特定细胞类型移动到损伤或感染部位)；止血和血栓溶解活性(例如，用于治疗血友病和中风)；抗炎活性(用于治疗例如脓毒性休克或克罗恩氏病)；作为抗微生物剂；例如代谢或行为的调节剂；作为止痛药；治疗特定的缺陷障碍；在例如牛皮癣的治疗中，在人或兽医学中。
除此之外或作为另外一种选择，本发明的组合、组合物和细胞群可用于治疗WO1998/009985中列出的疾病。为了便于参考，现在提供该列表的一部分：巨噬细胞抑制和/或T细胞抑制活性，以及因此抗炎活性；抗免疫活性，即对细胞和/或体液免疫应答的抑制作用，包括与炎症不相关的应答；抑制巨噬细胞和T细胞附着于细胞外基质组分和纤连蛋白的能力，以及T细胞中上调的fas受体表达；抑制不需要的免疫反应和炎症，包括关节炎，包括类风湿性关节炎、与超敏反应相关联的炎症、过敏反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原病和其他自身免疫疾病，与动脉粥样硬化相关联的炎症、动脉硬化、动脉粥样硬化心脏疾病、再灌注损伤、心脏停滞、心肌梗塞、血管炎性疾病、呼吸窘迫综合征或其他心肺疾病、与消化性溃疡相关联的炎症、溃疡性结肠炎和胃肠道的其他疾病、肝纤维化，肝硬化或其他肝脏疾病，甲状腺炎或其他腺疾病、肾小球肾炎或其他肾和泌尿系统疾病、耳炎或其他耳鼻喉疾病、皮炎或其他皮肤疾病、牙周病或其他牙齿疾病、睾丸炎或附睾-睾丸炎、不育症、睾丸创伤或其他与免疫相关的睾丸疾病、胎盘功能障碍、胎盘机能不全、习惯性流产、子痫、先兆子痫和其他与免疫和/或炎症相关的妇科疾病、后色素层炎、中色素层炎、前色素层炎、结膜炎、脉络膜视网膜炎、眼色素层视网膜炎、视神经炎、眼内炎症例如视网膜炎或囊性斑状水肿、交感性眼炎、巩膜炎、色素性视网膜炎、退行性fondus病的免疫和炎性部分、眼外伤的炎性部分、由感染引起的眼部炎症、增生性玻璃体-视网膜病、急性局部缺血性视神经病、例如在青光眼过滤手术后的过度瘢痕形成、针对眼植入物的免疫和/或炎性反应以及其他与免疫和炎症相关的眼病、与自身免疫病或病症或障碍相关的炎症，在此情况下对中枢神经系统(CNS)或任何其他器官的免疫和/或炎症抑制是有益的、帕金森病、由治疗帕金森病引起的并发症和/或副作用、与艾滋病相关的痴呆综合征、HIV相关的脑病、德维克病、Sydenham舞蹈病、早老性痴呆和CNS的其他退行性疾病、病症或障碍、中风的炎性部分、小儿麻痹后综合征、精神障碍的免疫和炎性部分、脊髓炎、脑炎、亚急性硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、Guillaim-Barre综合征、Sydenham舞蹈病、重症肌无力、脑假肿瘤、唐氏综合征、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化、CNS压迫或CNS外伤或CNS感染的炎性部分、肌肉萎缩和营养不良的炎性部分、以及中枢神经系统和外周神经系统的与免疫和炎症相关的疾病、病症或障碍、外伤后炎症、脓毒性休克、传染病、手术的炎症并发症或副作用、骨髓移植或其他移植并发症和/或副作用、例如由于感染病毒载体引起的基因治疗的炎症和/或免疫并发症和副作用、或与艾滋病相关联的炎症、为了抑制或阻止体液和/或细胞免疫应答、为了通过减少单核细胞或淋巴细胞的量来治疗或缓解单核细胞或白细胞增生性疾病例如白血病、在移植天然或人工细胞、组织或器官(诸如角膜、骨髓、器官、晶状体、起搏器、天然或人造皮肤组织)的情况下用于预防和/或治疗移植排斥。
扩增方法和培养基
在另一个方面，本发明提供了扩增造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)的分离群的方法，该方法包括使该群与包含NAD+前体、优选烟酰胺核糖核苷和维生素B12的组合的组合物接触。
在一些实施方案中，该接触包括在存在包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物的情况下培养该群。
在一些实施方案中，该方法包括以下步骤：
(a)提供HSPC的群；
(b)任选地培养HSPC的所述群，优选地在HSPC扩增或维持培养基中培养；
(c)任选地分离由低线粒体膜电位表征的HSPC的亚群；以及
(d)使(a)或(b)的所述群或(c)的所述亚群与包含NAD+前体、优选烟酰胺核糖核苷和维生素B12的组合的组合物接触。
在一些实施方案中，步骤(a)中提供的群得自骨髓、流动外周血或脐带血。
在一些实施方案中，步骤(d)的产物富含具有长期多谱系血液重构能力的细胞。
如本文所用，术语“扩增培养基”和“维持培养基”分别指适用于干细胞扩增和维持的任何标准干细胞培养基，诸如例如本文示例中所述或Boitano等人，2010年，《科学(Science)》，第329卷，第1345-1348页中所述的培养基。
在另一个方面，本发明提供了细胞培养基，该细胞培养基包含：包含NAD+前体、优选烟酰胺核糖核苷和维生素B12的组合的组合物。
在一些实施方案中，培养基包含细胞因子和生长因子。细胞因子和生长因子可与或不与支持基质饲养细胞或间充质细胞一起使用，并且可包括但不限于：SCF、TPO、Flt3-L、FGF-1、IGF1、IGFBP2、IL-3、IL-6、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、EPO、制瘤素-M、EGF、PDGF-AB、血管生成素和类血管生成素家族，包括Angl5、前列腺素和类花生酸(包括PGE2)、芳烃(AhR)受体抑制剂诸如StemRegeninl(SRI)和LGC006(Boitano等人，2010年，《科学(Science)》，第329卷，第1345-1348页)。
HSC隔室中的膜电位，具体地线粒体膜电位，可通过技术人员已知的方法进行测定，诸如本文在实施例中所述的方法，具体地用四甲基罗丹明甲酯(TMRM)染色的细胞的流式细胞术。
药盒
在另一个方面，本发明提供了包含本发明的组合和/或细胞群的药盒。
细胞群可在合适的容器中提供。
药盒还可包括使用说明。
技术人员将理解，在不脱离所公开的本发明范围的前提下，他们可以组合本文所公开的本发明的所有特征。
现将通过非限制性实施例来描述本发明的优选特征和实施方案。
除非另外指明，本发明的实践将采用常规化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力范围内。此类技术在文献中有所阐述。参见：例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.，1989年，《分子克隆：实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》，第二版，冷泉港实验室出版社；Ausubel,F.M.等人，(1995年和定期补充)，《分子生物学的最新进展(Current Protocols inMolecular Biology)》，第9、13和16章，约翰·威利父子出版公司；Roe,B.、Crabtree,J.和Kahn,A.，1996年，《DNA分离和测序:基本技术(DNA Isolation and Sequencing:EssentialTechniques)》，约翰·威利父子出版公司；Polak,J.M.和McGee,J.O’D.，1990年，《原位杂交:原理与实践(In Situ Hybridization:Principles and Practice)》，牛津大学出版社；Gait,M.J.，1984年，《寡核苷酸合成:一种实用的方法(Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach)》,IRL出版社；以及Lilley,D.M.和Dahlberg,J.E.，1992年，《酶学方法:DNA结构A部分:DNA的合成和物理分析(Methods in Enzymology:DNA Structures PartA:Synthesis and Physical Analysis of DNA)》，学术出版社。这些一般性文本均以引用的方式并入本文。
实施例
实施例1
材料和方法
流式细胞术
对来自C57Bl6小鼠的新鲜分离的骨髓(BM)进行流式细胞术分析。从压碎的股骨和胫骨中提取BM。将细胞悬浮液通过70μm细胞过滤器过滤，并通过与红细胞裂解缓冲液(eBioscences公司(eBioscences))温育来消除红系细胞。在冰冷的PBS 1mM EDTA中进行分离和染色。然后用磁性谱系耗尽套盒(BD生物科学公司(BD biociences))移除谱系阳性细胞。然后将细胞悬浮液用干细胞隔室的特异性抗体染色，并通过FACS(BD FACS Aria III)分选到1.5ml Eppendorf管中。
抗体
在该研究中使用以下抗体：抗cKit(2B8)、Sca1(D7)、CD150(TC-15-12F12.2)、CD48(HM48-1)的大鼠mAb。抗体购自Biolegend公司(Biolegend)、eBiosciences公司和BD公司(BD)。抗CD3、CD11b、CD45R/B220、Ly-6G、Ly-6C和TER-119的生物素酰化mAb的混合物被用作谱系标记物(“谱系混合物”)并购自BD公司。将DAPI或碘化丙啶(PI)染色用于活细胞/死细胞辨别。
mHSC培养物
将鼠HSC分选到1.5ml Eppendorf管中并在补充有100ng/ml SCF(R&D公司(R&D))和2ng/ml Flt3(R&D公司)的Stemline II(SIGMA)中培养。这被定义为基础条件。将所示不同浓度的NR和Vit B12(MC)加入特定的孔中。每24小时补充NR。
线粒体活性的分析
将已经在培养中的小鼠HSC与200nM四甲基罗丹明甲酯(TMRM，英杰公司(Invitrogen))和100nM Mitotracker绿在37℃下温育1小时。然后用FACS缓冲液洗涤细胞，并在BD LSR II上通过流式细胞术进行分析。
结果与讨论
NR和维生素B12的组合诱导线粒体膜电位的降低
将新鲜FACS分选的mHSCs(LKS CD150+CD48-)在补充有UroA、NR和MC的基础培养基(Stemline+SCF+FLT3L)中在特定孔(如所示)中培养。在第3天收获细胞并用四甲基罗丹明甲酯(TMRM，用以测量线粒体膜电位)和Mitotracker(用以测量线粒体质量)染色，并且通过流式细胞术分析。
我们发现，与基础条件相比，在NR和MC条件下，TMRM低栅极中的细胞比例显著增加，并且TMRM荧光强度(平均荧光强度，MFI)显著降低。与单独的NR或MC相比，NR+MC的双重组合显著增加(TMRM低栅极中细胞的比例)和减少(MFI TMRM)。与培养中的基础或仅NR相比，NR+MC的组合的线粒体质量(通过Mitotracker测量)(右图)显著降低。
总之，我们的发现证明了烟酰胺核糖核苷和维生素B12的组合经由可能通过线粒体自噬诱导调节线粒体膜电位来协同改善HSC功能的能力，从而导致所述组合在HSC移植的环境中应用于治疗血液恶性肿瘤。
在上述说明书中提到的所有出版物均以引用方式并入本文。本发明所公开的组合物、用途和方法的各种修改和变型在不脱离本发明范围和实质的情况下对技术人员将是显而易见的。虽然已结合具体优选的实施方案对本发明进行了公开，但是应当理解，受权利要求书保护的本发明不应不当地受限于此类具体实施方案。实际上，对技术人员显而易见的对用于实践本发明所公开的模式的各种修改旨在落在以下权利要求书的范围内。

Claims (19)

1.包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物用于增加造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)群中的干细胞功能的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述维生素B12是甲基钴胺素。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述NAD+前体选自由以下项组成的组：烟酸、烟酰胺、烟酰胺核糖核苷(NR)、还原型烟酰胺核糖核苷(NRH)、烟酰胺单核苷酸(NMN)、烟酸单核苷酸、烟酸核糖核苷、以及它们的混合物。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述组合是烟酰胺核糖核苷和维生素B12。
5.NAD+前体和维生素B12的组合，其用于增加造血干细胞功能。
6.根据权利要求5用于所述用途的组合，其中所述造血干细胞功能包括以下中的一者或多者：植活；自我更新；以及分化。
7.根据权利要求5或6用于所述用途的组合，其中所述用途增加个体的血细胞水平。
8.包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物，其用于治疗或预防(a)贫血、白细胞减少症和/或血小板减少症；(b)感染；和/或(c)癌症。
9.根据权利要求5至8中任一项用于所述用途的组合物，其中所述维生素B12是甲基钴胺素。
10.根据权利要求5至9用于所述用途的组合物，其中所述NAD+前体选自由以下项组成的组：烟酸、烟酰胺、烟酰胺核糖核苷(NR)、还原型烟酰胺核糖核苷(NRH)、烟酰胺单核苷酸(NMN)、烟酸单核苷酸、烟酸核糖核苷、以及它们的混合物。
11.根据权利要求5至10用于所述用途的组合物，其中所述组合是烟酰胺核糖核苷和维生素B12。
12.根据权利要求5至11中任一项用于所述用途的组合物，其中所述尿石素为药物组合物或营养组合物的形式，任选地为食物产品、食品WO 2022/064063A1
补充剂、营养制品、特殊医学用途配方食品(FSMP)、营养补充剂、乳基饮料、低容量液体补充剂或代餐饮料的形式。
13.根据权利要求5至12中任一项用于所述用途的组合物，其中个体具有亚正常量的造血细胞或存在具有亚正常量的造血细胞的风险，任选地其中所述造血细胞为红细胞、白细胞和/或血小板。
14.根据权利要求5至13中任一项用于所述用途的组合物，其中个体患有贫血、白细胞减少症和/或血小板减少症或存在患上贫血、白细胞减少症和/或血小板减少症的风险。
15.根据权利要求5至14中任一项用于所述用途的组合物，其中个体已经历选自由以下项组成的组的干预：造血干细胞移植；骨髓移植；清髓性预处理；化疗；放射疗法；以及外科手术。
16.根据权利要求5至15中任一项用于所述用途的组合物，其中所述NAD+前体和维生素B12为与选自由以下项组成的组的物质同时、分开或依次使用的组合制剂：G-CSF类似物、TPO受体类似物以及它们的组合。
17.扩增造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)的分离群的方法，所述方法包括使所述群与包含NAD+前体和维生素B12的组合的组合物接触。
18.根据权利要求13所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)提供HSPC的群；
(b)任选地培养HSPC的所述群，优选地在HSPC扩增或维持培养基中培养；
(c)任选地分离由低线粒体膜电位表征的HSPC的亚群；以及
(d)使(a)或(b)的所述群或(c)的所述亚群与包含NAD+前体、优选烟酰胺核糖核苷和维生素B12的组合的组合物接触。
19.细胞培养基，所述细胞培养基包含：包含NAD+前体、优选烟酰胺核糖核苷和维生素B12的组合的组合物。
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