BRPI0612672B1 - composição de extrato aquoso de alga verde-azulada - Google Patents

Abstract

componente purificado de alga azul-verde e método de uso. a presente invenção refere-se a extratos de alga verde-azulada, tal como aphanizomenon fios aquae, que são enriquecidos por um ligante da selectina, tal como um ligante da l-selectina. os ligantes da selectina isola- dos de células de alga verde-azulada são descritos aqui. os métodos são descritos para isolar estes ligantes da selectina. os ligantes da selectina pu- rificada encontram uso na indução de mobilização de célula-tronco em um indivíduo. desta maneira, os métodos para induzir o isolamento de célula- tronco que incluem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do extrato enriquecido formam o ligante da selectina, ou um ligante da selectina isolado.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÃO DE EXTRATO AQUOSO DE ALGA VERDE-AZULADA (73) Titular: DESERT LAKE TECHNOLOGIES. Endereço: P.O. BOX 489, KLAMATH FALLS OR 97601, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: GITTE S. JENSEN; CHRISTIAN DRAPEAU.

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 11/12/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 11/12/2018

Assinado digitalmente por:

Liane Elizabeth Caldeira Lage

Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÃO DE EXTRATO AQUOSO DE ALGA VERDE-AZULADA . Referência Cruzada aos Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica o benefício de Pedido Provisório N^o U.S. 60/693,808, depositado em 24 de junho de 2005, e Pedido Provisório N^o U.S. 60/700,882, depositado em 19 de julho de 2005. Ambos os pedidos provisórios estão incorporados à guisa de referência neste em sua totalidade.

Campo

Este pedido refere-se a um extrato aquoso de alga verdeazulada, tal como um extrato aquoso de alga que inclui um ligante de selectina.

Antecedentes

As células-tronco são células pluripotentes derivadas de tecido somático capazes de se diferenciar entre células mais especializadas. Por exemplo, as células-tronco hematopoiéticas podem se diferenciar entre muitos tipos diferentes de células sangüíneas, inclusive hemácias, plaquetas e leucócitos.

As células-tronco hematopoiéticas exercem uma função na renovação fisiológica contínua para a vida toda de células sangüíneas. As células-tronco se desenvolvem tanto nas células de linhagem hematopoiética como não-hematopoiética, células específicas de tecido. Recentemente, as células-tronco se diferenciam entre uma variedade de tipos de células específicas de tecido, tais como miócitos, hepatócitos, osteócitos, células gliais e neurônios. Por exemplo, as células-tronco provaram cruzar a barreira hematoencefálica (Willams and Hickey, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 202:221- 245, 1995) e se diferenciam entre neurônios (Mezey, Science 290:1779-82, 2000). Desta maneira, é possível que as células-tronco possam ser usadas para tratar a doença de Parkinson (Polli, Haematologica 85:100910, 2000), doença de Alzheimer (Mattson, Exp. Gerontol. 35:489-502, 2000), e lesão cerebral traumática (Magavi, Nature 405: 892-3, 895, 2000). As célulastronco também provaram se diferenciar entre fibroblastos ou células tipo fiPetição 870180132552, de 20/09/2018, pág. 5/12 broblasto, e expressam colágeno (Periera et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 95:1142-7, 1998). Desta maneira, é possível que as células-tronco possam ser usadas para tratar osteogênese imperfeita e fraturas ósseas. Peterson et al. (Science 284: 1168-70, 1999) também provou que as células do fígado podem se originar de células-tronco. Desta maneira, as células-tronco podem ser de uso no tratamento de uma variedade de patologias do fígado, inclusive, porém sem caráter limitativo, cirrose. Ademais, as células-tronco derivadas de medula óssea provaram migrar para o sítio de um infarto do

miocárdio e formar o miocárdio (Orlic, Nature 410:701-5, 2000). Desta maneira, as células-tronco podem ser de uso no tratamento de infarto do miocárdio.

w Uma vez que as células-tronco são capazes de se diferenciar entre uma ampla variedade de tipos de células, estas exercem um papel importante nos processos de cura e regenerativos de diversos tipos e órgãos (veja, Koc et al., Bone Marrow Transplant, 27(3):235-39, 2001). Os ligantes 15 de selectina estimulam a liberação de células-tronco da medula óssea (Frenette et al., Blood 96:2460-68, 2000).

Muitos estudos sugerem que a mobilização, migração e diferenciação de células-tronco da medula óssea no tecido alvo constituem um fenômeno natural de cura no corpo humano (Spencer et al., Thorax 60(1):60-2,

2005; Ishikawa et al., FASEB J. 18(15): 1958-60, 2004; Mattsson et al.,

Transplantation 15;78(1): 154-7, 2004; Thiele Jet al., Transplantation 77(12):

1902-5, 2004; Cogle et al., The Lancei 363(9419): 1432-7, 2004; Deb et al.,

Círculation 107(9): 1247-9, 2003; Korbling et al., N Engl J Med 346(10):73846, 2002; Adams et al., Blood 102(10):3845-7, 2002; Krause et al., Cell

105(3):369-77, 2001). As células-tronco mobilizadas seguem os gradientes de concentração de citocinas liberadas por tecidos danificados e migram independentemente para dentro de tecidos que seguem tais gradientes. De fato, a mobilização de células-tronco de medula óssea induzidas por injeção de citocinas provou acelerar a cura do tecido cardíaco após infarto agudo do miocárdio. Portanto, simplesmente deflagrar a mobilização de células-tronco da medula óssea com um consumível eficaz e seguro pode aumentar este processo fisiológico natural e proporcionar uma terapia potencial de diversas

patologias. Desta maneira, há a necessidade de composições que aumentam e processam a mobilização de célula-tronco.

Sumário

Um procedimento exemplificativo é descrito para obter um extra5 to aquoso de alga verde-azulada que contém um ligante de selectina. Neste procedimento, um ligante de selectina é isolado de alga verde-azulada utilizando um substrato sólido covalentemente ligado a uma selectina, tal como L-selectina, P-selectina e/ou E-selectina. O ligante de selectina pode se ligar

especificamente à L-selectina, P-selectina e/ou E-selectina.

Descrevem-se os ligantes de selectina purificados que são isolados de alga verde-azulada. Estes ligantes são isolados de alga verdeazulada que são uma proteína ou uma glicoproteína de um peso molecular de cerca de 55 kDa sob condições de redução. Em diversos exemplos, o ligante de selectina possui um peso molecular de cerca de 54 kDa ou cerca 15 de 57 kDa sob condições de redução. Em exemplos adicionais, o ligante de selectina possui um peso molecular de cerca de 54 kDa, cerca de 57 kDa, cerca de 162 kDa, cerca de 171 kDa, cerca de 233 kDa ou cerca de 111 kDa sob condições de redução.

Um extrato de Aphanizomenon fios aquae (AFA) que é descrito aqui contém ligante de L-selectina. Este extrato pode ser formulado para administração em um indivíduo. As composições que incluem apenas o extrato, ou inclusive outros extratos de Aphanizomenon fios aquae (AFA) podem ser administradas em um indivíduo necessitado de mobilização de célu la-tronco e/ou número aumentado de células-tronco circulantes. Em um e25 xemplo, o extrato que contém o ligante de L-selectina é administrado com um extrato de Aphanizomenon fios aquae (AFA) que contém polissacarídeos. As composições, que incluem ou consistem no ligante de L-selectina de Aphanizomenonflos aquae (AFA) são de uso para mobilização de célulatronco e aumentam o número de células-tronco circulantes.

Descreve-se um método neste para deflagrar a mobilização de célula-tronco ao administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um extrato específico de alga verde-azulada em um indivíduo. Os extratos de uso na indução de mobilização de célula-tronco incluem extratos de alga verde-azulada que contêm um ligante de selectina, tal como um ligante de Lselectina, P-selectina e/ou E-selectina. Em um exemplo, a alga verdeazulada é Aphanizomenon fios aquae (AFA). Os extratos podem ser admi5 nistrados separadamente ou em conjunto com outros extratos de Aphanizomenon fios aquae (AFA). Em um exemplo, um polissacarídeo que contém extrato também é administrado.

A administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um extrato da alga verde-azulada, tal como um extrato dotado de ligante de Γ 10 selectina, induz um aumento transitório na população de algumas célulastronco, tais como células-tronco CD34+ e/ou células-tronco CD133+, no sistema circulatório do indivíduo.

A descrição anterior e outras características e vantagens tornarse-ão óbvias a partir da seguinte descrição detalhada de diversas modalida15 des, esta procede com referência às figuras em anexo.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1 é um gráfico em linha que mostra um curso de tempo do aumento no número de células-tronco circulantes no sangue de humanos saudáveis mediante ingestão de AFA. A citometria de fluxo foi realizada em

linfócitos e monócitos humanos, onde o anticorpo monoclonal CD34, com especificidade para células-tronco humanas foi usado para demonstrar que o extrato AFA A contém um composto que mobiliza células-tronco ao aumentar seus números na circulação sangüínea.

A figura 2 é um gráfico de barras que mostra a citometria de flu25 xo que foi realizada em linfócitos, monócitos humanos e células nucleadas de polimorfo, onde o anticorpo monoclonal TQ1, específico para a área de ligação-ligante de L-selectina humana, foi usado para demonstrar que o extrato AFA A contém um composto que compete com a ligação sobre o sítio de ligação-ligante de L-selectina. O efeito de competição entre o anticorpo

TQ1 e o composto de Extrato AFA A é dependente de concentração.

A figura 3 é uma ilustração esquemática do método usado para purificar o ligante de selectina de Extrato AFA A. As esferas magnéticas fo-

ram cobertas com Proteína G, que se liga à parte Fc de imunoglobulina. Estas esferas foram usadas para capturar uma proteína recombinante quimérica da parte extracelular de L-selectina humana, unida juntamente com a parte Fc de imunoglobulina humana lgG1. Uma reação química foi realizada para formar ligações covalentes entre a parte Fc da quimera e a Proteína G sobre as esferas magnéticas. Estas esferas, agora cobertas com a quimera, com a parte extracelular de L-selectina humana que se estende a partir das esferas, foram usadas para capturar o ligante de L-selectina em extratos AFA.

As figuras 4A-4B são imagens digitais que mostram eletroforese em gel que ilustram o peso molecular aproximado do composto que foi purificado por afinidade a partir de extrato AFA A, quando o método de afinidade descrito na Figura 3 for empregado. As figuras são imagens digitais de géis, onde a eletroforese em gel foi realizada sobre material eluído a partir de esferas magnéticas após estas esferas capturarem o ligante de selectina de Extrato AFA A. A Figura 4A é uma imagem digital que mostra o composto eluído a partir das esferas que foram cobertas com L-selectina recombinante humana, e a Figura 4B é uma imagem digital que mostra o composto eluído a partir de esferas cobertas com P-selectina recombinante humana. Os géis foram administrados sob condições de redução. Duas faixas distintas em aproximadamente 54 e 57 kDa são mostradas. Os padrões de faixa idênticos foram observados tanto para L- como P-selectina, indicando que o ligante de selectina é um ligante tanto de L- como P-selectina.

A figura 5 é uma imagem digital de um gel, onde a eletroforese em gel foi realizada em material eluído a partir das esferas magnéticas após estas esferas serem utilizadas para capturar ligantes de selectina potenciais em Extrato AFA A versus Extrato B. O ligante de selectina de AFA foi encontrado no Extrato A. Nenhum ligante de selectina de AFA pode ser detectado no Extrato B. A Via de Acesso 1 é um controle negativo, a Via de Acesso 2 mostra o ligante purificado a partir de Extrato A (seta), e a Via de Acesso 3 mostra que uma faixa correspondente não foi observada no Extrato B.

A figura 6 é um gráfico de linha que mostra os resultados da análise de citometria de fluxo da expressão do receptor de quimiocina CXCR4, visto que esta induzida por um ligante de L-selectina conhecido, Fucoidan. Os dados indicam que o ligante de L-selectina conhecido Fucoidan, compete com o composto de AFA para ligação à L-selectina em linfócítos de sangue periférico humano.

A figura 7 é um gráfico de linha que mostra os resultados de uma análise de citometria de fluxo da expressão do receptor de quimiocina CXCR4, visto que esta é induzida por um ligante de L-selectina conhecido, Fucoidan. Os dados indicam que o ligante de L-selectina conhecido Fucoidan, compete com o composto de AFA para ligação à L-selectina na linhagem celular KG-1a de CD34+ humana.

A figura 8 é uma Tabela. Os resultados apresentados mostram que o Extrato A (AFA-W) bloqueia a ligação de TQ1 MoAb à L-selectina em leucócitos humanos.

A figura 9 é um gráfico de linha que mostra o curso de tempo do número de células CD34+ no sangue periférico humano após o consumo (seta) de ligante de L-selectina (LSL), migratose (MGT), combinação de reforçador de célula-tronco (SE) ou um placebo (Ctrl marcado). O ligante de Lselectina (LSL) é um extrato de Aphanizomenonflos aquae (AFA) enriquecido com o ligante de L-selectina. Para os indivíduos tratados com LSL, um grama do extrato concentrado no ligante de L-selectina (veja a seção de exemplos) foi misturado em 40 ml de água e consumido pelo indivíduo. Migratose (MGT) é um extrato onde Aphanizomenonflos aquae (AFA) líquida foi extraída com 10% de etanol a 85° C durante três horas. A solução foi centrifugada e o sobrenadante foi seco utilizando RW. Para administração, 150 mg do produto seco foram misturados com 250 mg de um veículo, encapsulados em uma cápsula vegetal e consumidos pelos indivíduos. A combinação de reforçador de célula-tronco (SE) era uma mistura de LSL e MGT, como descrito acima. Um grama de SE foi misturado em 40 ml de água e consumido pelos indivíduos. O controle era 400 mg de flocos de batata finamente triturados em cápsulas vegetais.

Descrição Detalhada

/. Abreviações

AFA: Aphanizomenonflos aquae

Ctrl: controle

LSL: Ligante de L-selectina mg: miligrama ml: mililitro

MGT: migratose

SE: combinação de reforçador de célula-tronco, inclui LSL e MGT g: gramas kg: quilogramas //. Termos

Salvo observação em contrário, os termos técnicos são usados de acordo com o uso convencional. As definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Para facilitar a análise das diversas modalidades desta descrição, as seguintes explicações de termos específicos são proporcionadas:

Administração em um indivíduo. Fornecer alga verde-azulada em um indivíduo inclui administrar todas as células e/ou extratos (frações) de alga verde-azulada de células de alga verde-azulada. As rotas de administração incluem, porém sem caráter limitativo, rotas orais e parenterais, tais como intravenosas (IV), intraperitoneais (IP), retais, tópicas, oftálmicas, nasais, e transdérmicas. A administração oral inclui tanto a alga verde-azulada total como extratos de alga verde-azulada. Mais de um extrato pode ser administrado. Se administrado oralmente, todas as células ou extratos podem ser proporcionados ou administrados na forma de uma dose única em forma de dosagem sólida, semi-sólida ou líquida tais como comprimidos, pílulas, pós, soluções líquidas, ou suspensões líquidas. Entretanto, os extratos de alga verde-azulada também podem ser administrados de forma intravenosa em qualquer meio convencional para injeção intravenosa, tal como um meio salino aquoso, ou em um meio de plasma sanguíneo. O meio também pode conter materiais farmacêuticos auxiliares convencionais, tais como sais far5 maceuticamente aceitáveis para ajustar a pressão osmótica, veículos de lipídeo (por exemplo, ciclodextrinas), proteínas (por exemplo, albumina de soro), agentes hidrofílicos (por exemplo, metil celulose), detergentes, tampões, conservantes, e similares. Uma explicação mais completa de veículos

farmacêuticos aceitáveis pode ser encontrada em Remington: The Science 10 and Practice of Pharmacy (19^th Edition, 1995) no capítulo 95.

Agente que afeta hematopoiese. Um composto, anticorpo, molécula de ácido nucléico, proteína, glicoproteína, ou célula que altera a formação de células sangüíneas, tais como leucócitos. Um agente molecular pode ser uma molécula naturalmente ocorrente ou uma molécula sintética.

Em algumas modalidades, o agente afeta a mobilização, crescimento, proliferação, maturação, ou diferenciação ou liberação de células hematopoiéticas. Em uma modalidade, o agente é um ligante de selectina extraída de

uma célula de alga verde-azulada.

Agente que afeta a circulação de célula-tronco. Um composto, anticorpo, molécula de ácido nucléico, proteína, glicoproteína, ou célula, inclusive neuropeptídeos e outras moléculas de sinalização, que afeta a liberação de células-tronco no sistema circulatório, bem como retorno do sistema circulatório no tecido. Um agente molecular pode ser uma molécula naturalmente ocorrente ou uma molécula sintética. Em um exemplo específico, o agente é um ligante de selectina de alga verde-azulada.

Um agente que afeta a circulação de célula-tronco pode afetar a razão de células-tronco no grupo quiescente para o grupo ativo. Em algumas modalidades, o agente afeta o equilíbrio entre células-tronco nãodiferenciadas e células-tronco diferenciadas em célula negativa CD34 30 (CD34-) e positiva CD34 (CD34+-), e/ou células negativas CD133 (CD133-) e positivas CD133 (CD133+). Em outras modalidades, o agente afeta a liberação de células-tronco a partir de locais de tecido, tal como a liberação de

células CD34+ e/ou células CD 133+ e/ou células detectadas por métodos baseados nas ações enzimáticas de aldeído desidrogenase, do ambiente de medula óssea.

Animal. Um organismo vivo, multicelular, vertebrado inclusive, por exemplo, mamíferos, peixe, répteis, e aves.

Alga verde-azulada. O nome comum para bactérias fotossintéticas gram-negativas que pertencem à Divisão Cyanophyta que podem se apresentar em formas unicelulares, coloniais ou filamentosas. As algas verde-azuladas representativas incluem, porém sem caráter limitativo, espécies Spirulina e espécies Aphanizomenon. Aphanizomenon fios aquae (AFA) é um tipo específico, não-limitativo de alga verde-azulada.

O termo algas é a forma no plural de alga, que é uma célula de uma espécie de microalga. Por exemplo (e sem caráter limitativo), alga verde-azulada se refere a múltiplas células de uma única espécie de Aphanizomenon, múltiplas células de uma única espécie de Spirulina, ou uma mistura de células de múltiplas espécies de Aphanizomenon e/ou Spirulina.

Sistema circulatório. Em animais, o sistema circulatório é composto das estruturas que movem o sangue e componentes de sangue por todo o corpo, inclusive os sistemas vasculares e linfáticos. Os componentes do sistema circulatório incluem o coração, vasos sanguíneos (artérias, veias, e vasos capilares), e vasos linfáticos.

Célula-tronco circulante. Uma célula-tronco presente no sistema circulatório. Componente de alga verde-azulada. Qualquer fração, extrato, ou molécula isolada ou purificada de uma célula de alga verde-azulada. Em uma modalidade, o componente é uma proteína ou uma glicoproteína ou ácido nucléico. Em outra modalidade, o componente é um componente é um fitoquímico. Em outra modalidade, o componente é um extrato aquoso de uma alga verde-azulada que inclui um ligante de selectina. Desta maneira, a alga verde-azulada é dividida, um solvente inorgânico ou orgânico é adicionado, e extratos são coletados. Exemplos específicos, não-limitativos são extratos isolados que utilizam cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia de camada fina, coluna de afinidade, esferas magnéticas ou destila10 ção. Em uma modalidade, o fracionamento se baseia no peso molecular ou na hidrofobicidade dos componentes de alga verde-azulada.

Diferenciação. O processo através do qual as células se tornam mais especializadas para realizar funções biológicas. A diferenciação é uma 5 propriedade que é geralmente total ou parcialmente perdida por células que se submeteram à transformação maligna.

Quantidade Eficaz. Uma quantidade, tal como uma quantidade de um extrato dotado de selectina de alga verde-azulada, capaz de deflagrar ou aumentar a mobilização de célula-tronco mobilization, esta pode ser de10 terminada através de diversos métodos usados nas ciências biológicas. Estes métodos incluem, porém sem caráter limitativo, gerar uma curva doseresposta empírica. Em uma modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade eficaz para aumentar a mobilização de célulastronco que reforçam, reparam, ou rejuvenescem o tecido. Em outra modali15 dade, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade eficaz para aumentar o trânsito de células-tronco. Ainda em outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade eficaz para aumentar o retorno de células-tronco a partir do sistema circulatório até diversos tecidos ou órgãos.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz também pode ser uma quantidade suficiente para tratar uma condição ou doença, tal como uma quantidade suficiente para aliviar sintomas associados com distúrbios do sistema nervoso (por exemplo, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose múltipla), lesão traumática cerebral ou da medula espinhal, doen ça no fígado, ou distúrbios dos ossos ou cartilagem. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também pode ser uma quantidade suficiente para acelerar e aumentar a recuperação de infarto agudo do miocárdio.

Em um exemplo específico não-limitativo, a quantidade terapeuticamente eficaz do extrato, tal como um extrato dotado de selectina de alga verde-azulada, é cerca de 0,01 a cerca de 1,0 g por kg de peso de corpo, tal como cerca de 0,05 a cerca de 0,5 grama por kg de peso de corpo, ou de cerca de 0,1 a cerca de 0,5 grama por kg de peso de corpo. Em outro exem

pio específico não-limitativo, a quantidade do extrato dotado de selectina de alga verde-azulada é cerca de 0,25 grama a cerca de 5 gramas, de cerca de 0,5 grama a cerca de 5 gramas, ou de cerca de 1 grama a cerca de 2 gramas. Em um exemplo específico não-limitativo, a quantidade eficaz de extrato dotado de selectina de alga verde-azulada é 1 grama. Esta quantidade eficaz pode ser administrada em uma dada frequência, tal como cerca de uma vez por semana, cerca de duas vezes por semana, cerca de três vezes por semana, uma vez ao dia, cerca de duas vezes ao dia, cerca de três vezes ao dia, ou mais.

A quantidade terapeuticamente eficaz de um extrato de alga verde-azulada, tal como um extrato aquoso dotado de selectina de alga verde-azulada e a frequência de administração pode depender de uma variedade de fatores, tais como o gênero ou espécies de algas utilizadas, a saúde geral do indivíduo que está sendo tratado, e as características fisiológicas (por exemplo, altura, peso, porcentagem de gordura corporal, metabolismo, etc.) do indivíduo que está sendo tratado.

São proporcionadas aqui análises específicas para determinar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um extrato aquoso, tal como um extrato dotado de ligante de selectina, de alga verde-azulada. Em um exemplo específico, não-limitativo, quantidades diferentes de um extrato dotado de ligante de selectina de alga verde-azulada, tal como AFA, são consumidas por indivíduos humanos e a presença e/ou quantidade de células-tronco (que podem incluir subtipos de tais células) presente no sistema circulatório é detectada e/ou analisada. Em outra modalidade, um modelo animal (por exemplo, rato) é utilizado, e a população de células-tronco recentemente integradas é monitorada em diversos tecidos (veja os Exemplos abaixo). Os métodos descritos possuem aplicação igual em áreas médicas e veterinárias. Portanto, o termo geral indivíduo que está sendo tratado inclui todos os vertebrados (por exemplo, porém sem caráter limitativo, humanos, macacos, cães, gatos, camundongos, ratos, coelhos, carneiros, cavalos, porcos e vacas).

Aumento (reforço). Um aumento em um parâmetro particular de

uma célula ou organismo. Em uma modalidade, o aumento se refere a um aumento de 25%, 50%, 100% ou mais que 100% em um parâmetro. Em um exemplo específico, não-limitativo, o aumento de circulação de célula-tronco se refere a um aumento em uma população específica das células, tal como um aumento de 25%, 50%, 100%, 200%, 400%, 500%, ou mais na população específica de células ou a resposta da população de células. Em uma modalidade, o parâmetro é a mobilização de células-tronco. Em outra modalidade, o parâmetro é a diferenciação de células-tronco. Ainda em outra modalidade, o parâmetro é o retorno de células-tronco.

Eritrócitos. Hemácias que transportam oxigênio para tecidos do corpo.

Extrato. Uma preparação concentrada de uma composição, tal como uma alga verde-azulada, obtida ao remover os constituintes ativos da composição com solventes adequados, evaporar todo ou quase todo o solvente, e ajustar a massa ou pó residual à quantidade padrão predeterminada. Um extrato é enriquecido com um produto, tal como um ligante de selectina, se a atividade ou quantidade de um componente de interesse for aumentada substancialmente no extrato quando comparado com outros extratos ou com a mesma quantidade da composição original extraída.

Glicoproteína. Uma molécula de complexo feito de uma porção de proteína e uma porção de glicano ou polissacarídeo.

Hematopoiese. A formação e desenvolvimento de células sanguíneas. A hematopoiese envolve a proliferação e diferenciação terminal de células-tronco hematopoiéticas. Em mamíferos adultos, a hematopoiese é conhecida por ocorrer na medula óssea. A hematopoiese é a produção de células hematopoiéticas que incluem células B, células T, células da linhagem monócito-macrófago, e hemácias.

Retorno. O processo de uma célula que migra do sistema circulatório para dentro de um tecido ou órgão. Em alguns casos, o retorno é realizado através de moléculas de adesão específicas de tecido e processos de adesão.

Imunologicamente normal. Imunologicamente normal se refe13

re a um indivíduo que apresenta características do sistema imune típicas das espécies às quais o indivíduo pertence. Estas características típicas incluem, entre outras, células B e células T de funcionamento bem como componentes celulares estruturais, chamados de antígenos de superfície celular, que 5 atuam como a assinatura imunológica para um organismo particular.

O uso de tais receptores imunologicamente normais significa que um sistema imune do receptor imunologicamente normal, através de suas células B (resposta humoral) e T (resposta celular), irá identificar os antígenos de superfície celular de uma célula estranha ou um tecido enxer10 tado como estranho. Este reconhecimento resulta essencialmente em uma resposta imune contra a célula ou tecido, resultando em destruição da célula ou rejeição do enxerto. Uma resposta imune contra um tecido alogênico é conhecida como rejeição do enxerto-contra-hospedeiro.

Imunologicamente comprometido. Um indivíduo imunologi15 camente comprometido possui uma imunodeficiência genotípica ou fenotípica. Um indivíduo genotipicamente-imunodeficiente possui um defeito genético que resulta em uma incapacidade de gerar tanto respostas humorais ou mediadas por célula. Um exemplo específico, não-limitativo de um indivíduo

genotipicamente imunodeficiente é um camundongo genotipicamente imunodeficiente, tal como um camundongo SCID ou um camundongo bg/nu/xid (Andriole et al., J. Immunol. 135:2911, 1985; McCune et al., Science

241:1632, 1988) ou um XSCID humano. Um indivíduo fenotipicamenteimunodeficiente é um indivíduo, que é geneticamente capaz de gerar uma resposta imune, ainda foi fenotipicamente alterada de modo que nenhuma resposta seja observada. Em um exemplo específico, não-limitativo, um receptor fenotipicamente-imunodefíciente é irradiado. Em outro exemplo espe cífico, não-limitativo, um indivíduo fenotipicamente-imunodeficiente foi trata do com quimioterapia. Ainda outro exemplo específico, não-limitativo, o indi víduo fenotipicamente-imunodeficiente sofreu uma infecção bacteriana ou viral, tal como o vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou vírus da imunodeficiência símia (SIV).

Aumento: Um aumento significativo em uma atividade particular

ou de um componente de interesse. Em uma modalidade, a inibição se refere a pelo menos cerca de 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% de aumento na atividade ou concentração.

Inibição. Uma redução em um parâmetro particular de uma cé5 lula ou organismo. Em uma modalidade, a inibição se refere a uma redução de 25%, 50%, ou 100% em um parâmetro.

Isolado. Um componente biológico ‘isolado (tal como uma molécula de ácido nucléico, polipeptídeo, polissacarídeo, selectina, ligante de

selectina, ou outra molécula biológica) foi substancialmente separado ou purificado distante dos componentes biológicos de células onde o componente ocorre naturalmente. Uma célula isolada foi substancíalmente separada ou purificada distante de outras células de espécies diferentes (no caso de microorganismos) ou células do organismo (no caso de organismos multicelulares). Os ácidos nucléicos e proteínas podem ser isolados por méto15 dos de purificação padrão, expressão recombinante em uma célula hospedeira, ou quimicamente sintetizados. As células podem ser isoladas por métodos de cultura padrão. Em uma modalidade, a alga verde-azulada é colhida de uma fonte natural (tal como Klamath Lake), e preparada por secagem (veja abaixo).

Leucócitos. Glóbulos brancos. Corpúsculos esféricos, incolores e nucleados envolvidos na defesa do hospedeiro, inclusive respostas imunológicas. Os tipos específicos de leucócitos incluem basófilos, celomócitos, eosinófilos, hemócitos, linfócitos, neutrófilos e monócitos, células dendríticas circulantes, e células-tronco hematopoiéticas circulantes.

L-selectina. Um elemento de lectinas cálcio-dependentes da família da selectina, também conhecido como CD62L. Uma molécula de a· desão usada por células-tronco para se aderir ao ambiente de medula óssea. L-selectina, a menor das selectinas vasculares, é uma molécula de 74100 kDa, que é constitutivamente expressa nas pontas de microdobras em 30 granulócitos, monócitos, e uma vasta série de linfócitos circulantes de Lselectina também é conhecida como LECAM-I, LAM-I, antígeno Mel-14, gp90^mel, e antígeno Leu8/TQ-1. L-selectina é considerada importante para

ligação de leucócitos ao endotélio em diversas situações fisiológicas, inclusive ligação de fagócitos ao endotélio, ligação de leucócitos ao endotélio inflamado, e retorno de linfócito e adesão a células endoteliais altas de vênulas pós-capilares de linfonodos periféricos. Ademais, esta molécula de ade5 são contribui bastante para a captura de leucócitos circulantes durante as fases iniciais da cascata de adesão. As sequências de aminoácido de muitas L-selectinas são conhecidas,

Um ligante de L-selectina liga a L-selectina. Em algumas modalidades, um ligante pode bloquear a ativação por meio de outros ligantes, 10 por exemplo, por interferência espacial com a área de ligação de ligante. Um ligante também pode ativar a célula através da ligação à L-selectina, por exemplo, ao deflagrar o fluxo de cálcio, rearranjos citoesqueléticos, ou outros eventos de sinalização. Ademais, um ligante pode alterar as vias de transdução de sinal, desta maneira uma ligação subsequente tanto com outro ligan15 te de L-selectina como com um estímulo independente de L-selectina resulta em uma resposta fisiológica alterada. Em alguns exemplos, quando os linfócitos humanos forem ativados através de alguns ligantes de L-selectina, a Lselectina deflagra a expressão de CXCR4, um receptor de Fator Derivado do Estroma 1 (SDF1), uma citocina envolvida na residência de células-tronco na

medula óssea. Em uma modalidade, o extrato dotado de L-selectina da alga verde-azulada inibiu a expressão de CXCR4 deflagrada pela ativação de Lselectína com Fucoidan. As sequências de aminoácido de ligantes de L· selectina exemplificativos são conhecidas. Por exemplo, Mus musculus GlyCam-1 é mostrado no Número de Acesso GENBANK NM_008134 e os iso25 lados de mRNA humano GlyCam-1 são mostrados nos Números de Acesso GENBANK AJ„489 590, AJ 489 591, AJ 489 592, AJ 489 593, e AJ 489 589, todos disponíveis em 24 de junho de 2005, estes estão incorporados aqui à guisa de referência. Estas sequências de aminoácido são devem ser consideradas limitativas, porém são proporcionadas como exemplos. As formas recombinantes e modificadas estão incluídas na presente descrição.

Linfócitos. Um tipo de glóbulos broncos que está envolvido nas defesas imunes do corpo. Há dois tipos principais de linfócitos: célula B e células T.

Linfoproliferação. Um aumento na produção e/ou divisão de linfócitos.

Mamífero. Este termo inclui tanto mamíferos humanos como não-humanos. Similarmente, o termo indivíduo¹¹ inclui tanto indivíduos humanos como animais.

Monócito. Um glóbulo branco grande no sangue que ingere micróbios ou outras células e partículas estranhas. Quando um monócito sair da corrente sanguínea e entrar nos tecidos, este se desenvolve em um ma10 crófago.

Célula Muscular. Uma célula de tecido muscular estriado, cardíaco, ou liso. No músculo estriado (esquelético), uma célula é composta de um sincício formado pela fusão de mioblastos embriônicos. No músculo liso, uma célula muscular é uma única célula caracterizada por grandes quanti15 dades de actina e miosina e capaz de se contrair a uma pequena fração de seu comprimento total. No músculo cardíaco, a célula muscular é ligada a células adjacentes por meio de junções especializadas chamadas de discos intercalados.

Veículos Farmaceuticamente aceitáveis. Os veículos farma-

ceuticamente aceitáveis úteis são convencionais. Remington’s Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975), descreve composições e formulações adequadas para entrega farmacêutica de alga verde-azulada e extratos descritas aqui. Em geral, a natureza do veículo irá depender do modo particular de administração que é empregado. Por exemplo, formulações parenterais compreendem geralmente fluidos injetáveis que incluem fluídos farmacêutica e fisiologicamente acei· táveis tais como água, salina fisiológica, soluções salinas balanceadas, dextrose aquosa, glicerol ou similares como um veículo. Para composições sólidas (por exemplo, formas em pó, pílula, comprimido, ou cápsula), os veícu30 los sólidos não-tóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido ou estearato de magnésio. Além de veículos biologicamente neutros, as composições farmacêuticas que serão

administradas podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares não-tóxicas, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes, e agentes de tamponamento de pH e similares, por exemplo acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano.

Plasticidade. A capacidade que será moldada, geralmente usada para se referir à flexibilidade e reversibilidade de tecido e especificação de linhagem.

Plaquetas. Pequenos fragmentos celulares no sangue derivados

de megacariócitos. As plaquetas participam na cicatrização de ferida, coagu10 lação sangüínea, reparo de vasos sangüíneos danificados e processos inflamatórios patológicos.

Célula progenitora. Uma célula que dá origem à progênie em uma linhagem celular definida. Uma célula progenitora hematopoiética é uma célula que dá origem às células da linhagem hematopoiética.

P-selectina. Um elemento das lectinas cálcio-dependentes da família de selectina, também conhecido como CD62P. A P-selectina é expressa sobre a superfície de células endoteliais, plaquetas (quantidades aumentadas com ativação), e megacariócitos. A P-selectina pode mediar a ligação de plaquetas ativadas a leucócitos, e pode contribuir adicionalmente

para a ligação subseqüente destes leucócitos ao endotélio. A expressão de P-selectina sobre o endotélio da medula óssea exerce uma função para localização de célula-tronco in vivo, inclusive retenção, mobilização e retorno à medula óssea (Frenette and Weiss, Blood 96(7): 2460,2000).

Recrutamento de uma célula-tronco. Um processo por meio do qual uma célula-tronco no sistema circulatório migra para dentro de um tecido ou órgão. O recrutamento pode ser facilitado por um composto ou molécula, tal como um sinal quimioatraente ou receptor celular. Por exemplo, tanto CXCR4 como SDF-I possuem funções identificadas em retorno de célula-tronco. Hidalgo et. al., Exp. Hematol 29(3):345-55, 2001; Kollet et al.

Blood 97(10)3283-91,2001.

Célula satélite. Uma célula-tronco específica de músculo, geralmente localizada na periferia do tecido muscular, e capaz de migrar para

dentro de um músculo para auxiliar no reparo e reconstrução do tecido.

Selectina. Uma família de lectinas cálcio-dependentes, também conhecida como CD62. Os três elementos desta família incluem L-selectina (CD62L), P-selectina (CD62P), e E-selectina (CD62E). Estas moléculas de adesão estão envolvidas nos leucócitos circulantes redutores durante seu trânsito em vênulas, e também estão envolvidas em um hospedeiro de outras interações adesivas, inclusive, porém sem caráter limitativo, interações plaqueta-leucócito, retenção celular em certos tecidos inclusive medula óssea, e adesão de leucócitos ao endotélio inflamado.

Célula-tronco. Uma célula pluripotente que dá origem à progênie de muitos tipos de tecido, inclusive (porém sem caráter limitativo) todas as linhagens de células hematopoiéticas e do estroma medular. Uma célulatronco típica reside na medula óssea, tanto como um tipo celular do estroma aderente, ou como uma célula mais diferenciada que expressa CD34, tanto 15 sobre a superfície celular como em uma maneira na qual a célula seja negativa na superfície celular CD34. As células-tronco também podem expressar CD133. Desta maneira, uma célula-tronco pode ser uma célula CD34+, uma célula CD133+, ou pode ser mostrada para expressar tanto CD34 como

CD133 (veja, He et al., Stem cells and Development 14(2): 188-198, 2005).

Alternativamente, uma célula-tronco pode ser uma célula que pode ser medida por aminoacetaldeído fluorescentemente marcado, formada quando uma enzima no citoplasma de célula-tronco, converter um substrato nãofluorescente em um composto fluorescente que é retido dentro da célulatronco e permite sua detecção baseada na função enzimática.

Um subconjunto de células CD34⁺ na medula óssea, produtos de leucaférese e sangue do cordão umbilical com características fenotípicas primitivas expressam CD133, uma molécula 5-transmembrana de função desconhecida. Os anticorpos específicos de CD133 marcam 35-75% da população CD34⁺ dependendo da fonte de células-tronco (De Wynter et al., 30 Stem Cells 16:387- 396, 1998). O transplante de uma fração de célula-tronco não aderente isolada CD133⁺CD34⁺ em camundongos imunodefcientes

NOD/SCID induziu alto enxerto de multilinhagem mielóide e linfóide, suge19

rindo que estas células são altamente enriquecidas em células de repopulação (Kuci et al. Blood 101:869-876, 2003).

Células-tronco totipotentes, tais como células-tronco hematopoiéticas ou neuronais, geralmente dão origem à progênie de um número 5 limitado de tipos de tecido. As células-tronco hematopoiéticas, células-tronco musculares e células precursoras neuronais são diversos exemplos de células-tronco totipotentes.

Indivíduo. Um animal que possui um sistema circulatório, inclu-

sive vertebrados tais como humanos e outros indivíduos animais, tais como, porém sem caráter limitativo, primatas, cães, felinos, bovinos e roedores.

Trânsito. Os processos de movimento de uma célula a partir do tecido de origem e se movem dentro do sistema circulatório. Em uma moda lidade, o trânsito inclui o movimento de uma célula a partir do tecido de ori gem, retorno por adesão ao endotélio, transmigração, e migração final den15 tro do órgão alvo. Em uma modalidade, a condução é o processo de movimento de uma célula do sistema imune. Em outra modalidade, o trânsito in clui mobilização de célula-tronco. Um exemplo específico, não-limitativo de trânsito é o movimento de uma célula-tronco até um órgão alvo. Outro e-

xemplo específico, não-limitativo de trânsito é o movimento de uma célula B ou uma célula pré-B deixando a medula óssea e se movendo para um órgão alvo.

Transdiferenciação. A alteração de uma célula ou tecido de um estado diferenciado para outro, ou a diferenciação de uma célula-tronco específica de tecido em outro tipo de célula como, por exemplo, uma diferenci25 ação de célula-tronco de medula óssea em um neurônio.

Transplante. A transferência de uma população celular, tecido ou um órgão, ou uma parte deste, de um corpo ou parte do corpo para outro corpo ou parte do corpo. Um transplante alogênico ou um transplante heterólogo é um transplante de um indivíduo para outro, onde os indivíduos 30 possuem genes em um ou mais locais que não são idênticos em sequência nos dois indivíduos. Um transplante alogênico pode ocorrer entre dois indivíduos da mesma espécie, que se diferem geneticamente, ou entre indivíduos de duas espécies diferentes. Um transplante autólogo é um transplante de um tecido ou uma parte deste de um local para outro no mesmo indivíduo, ou transplante de um tecido ou uma parte deste de um indivíduo para outro, onde os dois indivíduos são geneticamente idênticos.

Salvo explicação em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento possuem o mesmo significado conforme comumente entendido por um versado na técnica ao qual esta descrição pertence. Os termos no singular um, uma, e o incluem referências no

plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Similarmente, a palavra ou pretende incluir e a menos que o contexto indique claramente o contrário. Será adicionalmente entendido que todos os tamanhos de base ou tamanhos de aminoácido, e todos os valores de peso molecular ou massa molecular, dados por ácidos nucléicos ou polipeptídeos são aproxi mados, e são proporcionados para descrição. Embora métodos e materiais 15 similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste desta descrição, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. O termo compreender significa incluir. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas aqui estão incorporadas à guisa de referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo explicações de termos, será controlado. Ademais, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos.

Ligante de Selectina Isolado de Células de Alga verde-azulada

Descreve-se aqui um extrato aquoso de alga verde-azulada, tal como Aphanizomenon fios aquae (AFA), que é enriquecida com um ligante de selectina, tal como, um ligante de L-selectina. Em uma modalidade, o extrato é Extrato A, um extrato aquoso que inclui compostos polares rapidamente dissolvidos em água ou salina, este é enriquecido com um ligante de selectina, tal como um ligante de L-selectina. Em outra modalidade, este ex30 trato é seco utilizando um processo conhecido, e ressuspenso em uma solução aquosa.

A alga verde-azulada, tal como, Aphanizomenon fios aquae (A21

FA) ou Spirulina pode ser dividida. O processo para desenvolver, colher e concentrar células de alga verde-azulada foi descrito. A alga verde-azulada, tal como AFA ou Spirulina, pode ser isolada de qualquer fonte. A fonte pode ser uma fonte natural de alga verde-azulada, tal como um lago (por exemplo, 5 Klamath Lake). A fonte também pode ser uma fonte feita pelo homem de alga verde-azulada, tal como, um lago artificial ou fonte de água. A fonte pode ser um ambiente produzido para desenvolver e colher comercialmente a alga verde-azulada. A alga verde-azulada pode ser diretamente usada, ou pode ser armazenada como líquido, líquido congelado, seca por congela10 mento ou seca utilizando o método descrito abaixo. Em uma modalidade, as algas verde-azuladas são colhidas utilizando REFRACTANCE WINDOW® Technology. O termo REFRACTANCE WINDOW® Technology se refere a um sistema onde o secador utilize as muitas propriedades de água para retirar água do produto. Em suma, quando água for colocada sobre uma fonte 15 de aquecimento, o calor se dispersa na água através de convecção. Visto que esta absorve calor, a água transmite energia infravermelha para fora de três formas: evaporação, condução e radiação. Se a superfície da superfície de água for coberta por um meio transparente tal como plástico, a evaporação e sua perda de calor associada são bloqueadas e apenas a condução — 20 ocorre. A membrana plástica atua como um espelho que reflete energia infravermelha. Quando um material úmido, tal como água azul-verde molhada, for colocado sobre a superfície plástica, a água no material cria uma janela que permite a passagem de energia infravermelha. Acredita-se que neste sistema, a água no material permite que ocorra a radiação, condução e eva25 poração, tornando a transferência de calor excepcionalmente eficaz. Entretanto, após alguns minutos, à medida que o material seca, a janela infravermelha se fecha e a condução permanece como o único meio de transferência de calor. Uma vez que o plástico é um fraco condutor de calor, pouco calor é perdido e transferido para o produto. Portanto, quando secas com 30 REFRACTANCE WINDOW® Technology, as algas são expostas ao calor apenas por um curto período de tempo.

Neste sistema de secagem, as algas líquidas (células suspensas

em solução) são colocadas sobre a superfície da correia transportadora do secador. A correia é um mylar de grau alimentício (película de poliéster transparente) ajustado sobre a superfície de água quente. O calor da água circulante é conduzido para a correia e então para a água presente no pro-

duto que será seco, acelerando suavemente o processo natural de evaporação enquanto protege nutrientes naturais. À medida que o produto seca e a água evapora, o calor pára de ser transmitido ao produto. Sem se ater à teoria, este impede a degradação de polipeptídeos, ácidos nucléicos, nutrientes e pigmentos. Desta maneira, o processo de secagem mantém a temperatura 10 da alga abaixo da temperatura da água circulante sob a correia transportadora.

Outros sistemas de secagem podem ser usados para produzir algas secas. Geralmente, dois fatores exercem uma função na degradação de algas: o grau de calor e tempo de exposição ao calor. A aplicação de uma 15 grande quantidade de calor durante um curto período de tempo resulta em menos degradação dos componentes das algas verde-azuladas. Em um exemplo, o calor, tal como, uma temperatura de cerca de 65°C a cerca de 80°C é aplicado, tal como, uma temperatura de cerca de 70°C a cerca de 75°C, ou cerca de 72°C. O calor pode ser aplicado em uma quantidade sufi-

ciente de tempo para secar as algas, tal como, cerca de 1 a cerca de 15 minutos, ou durante cerca de 2 a cerca de 10 minutos, ou durante cerca de 3 a cerca de 7 minutos. Em um exemplo, o calor é aplicado às algas a 72°C durante apenas 3 a 5 minutos. Este processo é conhecido pelo versado na técnica, e está completamente descrito em Rossha Enterprises Website, e está 25 descrito em Abonyi et al., Evaluation of Energy Efficiency and Quality Retention for the REFRACTANCE WINDOW® Drying System: Research Report, Washington State University, Pullman, WA, December 30, 1999). Entretanto, as células secas por congelamento também podem ser utilizadas.

Conforme descrito aqui, um extrato aquoso pode ser preparado a partir de células de alga verde-azulada frescas, desidratadas, ou conservadas, tal como Aphanizomenon fios aquae (AFA). As algas podem ser extraídas com água ou uma solução salina tamponada adequada. Por exem23

pio, utiliza-se água ou soluções tamponadas, geralmente de um pH neutro (cerca de pH 7,0 a cerca de pH 7,8, tal como cerca de pH 7,2 a cerca de pH 7,6, ou cerca de pH 7,4). As soluções salinas tamponadas adequadas são bem-conhecidas na técnica e incluem salina tamponada com fosfato (tal como cerca de 0,1 M de salina tamponada com fosfato) e meio de cultura comercialmente disponível. A extração aquosa é geralmente realizada abaixo da temperatura ambiente (geralmente 25°C), tal como em temperaturas de cerca de 3°C a cerca de 15°C, tal como a cerca de 4°C a cerca de 10°C, ou a cerca de 4°C, porém a extração também pode ser realizada em temperatura ambiente (cerca de 25°C).

Em um exemplo, um grama de material de alga seco, tal como, Aphanizomenon fios aquae (AFA) seca, é suspenso em cerca de 10 ml a cerca de 50 ml, tal como, cerca de 40 ml de salina tamponada com fosfato (por exemplo, 0,1 M de salina tamponada com fosfato, pH 7,4), e incubado a 4°C. Esta incubação pode durar 5 minutos, meia hora, várias horas ou uma noite. Em diversos exemplos, a alga é incubada em uma solução aquosa durante cerca de meia hora a cerca de duas horas, cerca de meia a hora a cerca de três horas, ou cerca de meia hora a cerca de 12 horas. A alga suspensa na solução salina tamponada pode ser protegida da luz para reduzir a degradação. Após a incubação em uma solução aquosa, o material sólido é separado do extrato aquoso. A mistura de alga na solução aquosa, tal como a solução salina, pode ser misturada por inversão repetida do frasco, e centrifugada para remover material sólido. Por exemplo, a suspensão pode ser centrifugada em 400g durante 10 minutos.

Após a separação do material sólido, o sobrenadante, que aparece geralmente na cor azul, é isolado. Este extrato é chamado de Extrato A. Este sobrenadante pode ser opcionalmente esterilizado, tal como por filtração. Em um exemplo, um sobrenadante azul-claro é decantado após a centrifugação e esterilizado por filtração utilizando um filtro de 0,22 mm. Este filtrado pode ser armazenado, tal como a cerca de 4°C no escuro.

O extrato que contém o ligante de selectina, tal como o ligante de L-selectina, tal como Extrato A, pode ser seco, como descrito acima. Em um exemplo, o calor, tal como uma temperatura de cerca de 65°C a cerca de

80°C é aplicado ao extrato aquoso, tal como uma temperatura de cerca de

70°C a cerca de 75°C, ou cerca de 72°C. O calor pode ser aplicado e uma quantidade suficiente de tempo para secar o extrato, tal como cerca de 1 a 5 cerca de 15 minutos, ou durante cerca de 2 a cerca de 10 minutos, ou durante cerca de 3 a cerca de 7 minutos. Em um exemplo, o calor é aplicado ao extrato a 72°C durante apenas 3 a 5 minutos. Este processo é similar ao

processo para secar algas (veja, Abonyi et al., Evaluation of Energy Efficiency and Quality Retention for the REFRACTANCE WINDOW® Drying Sys10 tem: Research Report, Washington State University, Pullman, WA, December 30, 1999). Um versado na técnica pode produzir facilmente um produto seco de um extrato aquoso utilizando metodologias conhecidas.

Em diversos exemplos específicos, não-limitativos, uma quantidade eficaz do extrato dotado de selectina de alga verde-azulada, tal como 15 um extrato aquoso enriquecido com um ligante de L-selectina, é cerca de

0,25 grama a cerca de 5 gramas, ou de cerca de 0,5 grama a cerca de 5 gramas, ou de cerca de 1 grama a cerca de 2 gramas de um extrato aquoso seco, tal como extrato A. Em um exemplo específico, não-limitativo, a quantidade eficaz do extrato dotado de selectina de alga verde-azulada é cerca 20 de 1 grama de um extrato aquoso seco, tal como extrato A.

Um ligante de selectina pode ser adicionalmente purificado a partir do extrato aquoso A. Por exemplo, o ligante de selectina é isolado utilizando purificação por afinidade. Em um exemplo, o Extrato A é colocado em contato com um substrato sólido inclusive L-selectina, P-selectina, ou E25 selectina. As esferas magnéticas covalentemente ligadas a uma selectina, tal como L-selectina humana podem ser utilizadas. Uma sequência de aminoácido exemplificativa de L-selectina humana é estabelecida como Número de Acesso GENBANK NP 000646; uma seqüência de aminoácido exemplificativa de L-selectina murina é estabelecida como CAB55488 e uma seqüên30 cia exemplificativa de L-selectina de camundongos é estabelecida como Número de Acesso GENBANK AAH52681. Todas estas sequências estavam disponíveis na Internet em 24 de junho de 2005, e estão incorporadas aqui à

guisa de referência. As sequências exemplificativas adicionais de L-, P- e Eselectinas podem ser encontradas no banco de dados GENBANK.

A selectina pode ser uma molécula nativa, tal como uma Lselectina humana, uma P-selectina humana, uma L-selectina murina ou uma

P-selectina murina. A selectina também pode ser uma forma geneticamente engenheirada, tal como uma molécula recombinante que é uma forma estável da L-selectina, e/ou uma molécula que inclui um fragmento de uma selectina, tal como a parte extracelular da molécula de L-selectina humana. Em

um exemplo, a selectina é uma proteína de fusão onde a parte extracelular de L-selectina humana e a parte Fc de imunoglobulina. Tais proteínas de fusão recombinantes estão comercialmente disponíveis, tal como junto à, por exemplo, R&D Systems, e podem ser ordenado através da Internet. O substrato sólido covalentemente ligado à selectina, tal como, porém sem caráter limitativo, L-selectina, é incubado com o sobrenadante Extrato A (o extrato solúvel em água da alga verde-azulada).

O material da alga que liga especificamente uma selectina é então isolado. Por exemplo, o ligante de selectina pode ser clivado a partir da molécula de selectina recombinante utilizando um tratamento com ácido. O

ligante de selectina também pode ser clivado a partir da molécula de selecti20 na recombinante utilizando um tratamento alcalino e/ou utilizando tratamento com calor. Conforme descrito aqui, o ligante de selectina isolado possui um peso molecular de cerca de 50 kDa a cerca de 60 kDa, tal como cerca de 55 SkDa, sob condições de redução. Em um exemplo, o ligante de selectina isolado possui um peso molecular de cerca de 54 kDa ou cerca de 57 kDa sob condições de redução. Em uma modalidade, o ligante de selectina não forma um complexo. Por exemplo, o ligante de selectina não pode formar um complexo com o mesmo ou com outro ligante de selectina.

Em diversos exemplos, sob condições de não-redução, o ligante de selectina pode se associar a um complexo. Desta maneira, se um com30 plexo de três subunidades de 54 kDa for formado sob condições de nãoredução, o peso molecular é cerca de 162 kDa, e se um complexo de três subunidades de 57 kDa for formado, o peso molecular aparente sob condi26

ções de não-redução é cerca de 171 kDa. Se um complexo de três subunidades de 54 kDa e três subunidades de 57 kDa for formado sob condições de não-redução, o peso molecular do complexo é cerca de 233 kDa. Desta maneira, o ligante de selectina purificado pode possuir um peso molecular de cerca de 200 kDa sob condições de não-redução. Se um complexo de cada ligante for formado, então o peso molecular aparente do complexo é aproximadamente cerca de 111 kDa. Alternativamente, as duas subunidades podem não estar em um complexo, e o peso molecular aparente sob condições de não-redução será igual sob condições de redução. O ligante de selectina pode ser uma proteína ou uma glicoproteína.

Os extratos e composições descritos aqui podem ser administrados de qualquer maneira, inclusive como sólidos tais como comprimidos ou pós ou como uma preparação líquida. Em um exemplo, as composições são formuladas para administração entérica. Um exemplo de uma formulação de uso é uma preparação farmacêutica (tal como, um comprimido, líquido entérico, líquido parenteral, cápsula, líquido intranasal ou outra forma). Em um exemplo particular descrito, a composição é uma preparação farmacêutica, em particular um comprimido ou cápsula. Conforme conhecido na técnica, as composições adequadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades separadas tais como, cápsulas, sachês, ou comprimidos, sendo que cada um contém uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição, como um pó ou grânulos, ou como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso. Desta maneira, as formas de dosagem incluem comprimidos, cápsulas, dispersões, suspensões, soluções e similares. Devido à sua facilidade de administração, os comprimidos e cápsulas representam uma forma de unidade de dosagem oral conveniente, em tal caso empregam-se veículos farmacêuticos sólidos, conforme descrito acima. Entretanto, os compostos também podem ser administrados por meio de liberação controlada, ou podem ser formuladas para outros meios de entrega, tal como, porém sem caráter limitativo, entrega intranasal ou transdérmica.

As composições podem incluir ingredientes inativos tais como

agentes de ligação (tais como, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose); aglutinantes ou cargas (tais como, lactose, pentosano, celulose microcristalina ou hidrogênio fosfato de cálcio); lubrificantes (tais como, estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (tais como, amido de batata ou glicolato de amido sódico); ou agentes umectantes (tais como, lauril sulfato de sódico).

Em um exemplo, um comprimido que contém as composições descritas aqui, tais como, porém sem caráter limitativo, um extrato enriquecido com um ligante de L-selectina ou uma forma sólida deste, ou um ligante de selectina purificado, pode ser preparado por compressão ou moldagem, opcionalmente, com um ou mais ingredientes adicionais. Os comprimidos comprimidos podem ser preparados por compressão em uma máquina adequada, uma forma fluidizante, tal como, pó ou grânulos de um extrato seco e/ou ligante de selectina, opcionalmente misturados com um aglutinante, lubrificante, diluente inerte, agente dispersante ou surfactante. A composição, tal como, o comprimido, pode incluir componentes farmaceuticamente aceitáveis, tais como, lactose, glicose, sucrose, amido de milho, amido de batata, ésteres de celulose, tais como, acetato de celulose, etil celulose, estearato de magnésio, silicato de cálcio, sílica precipitada, talco, ácidos graxos, tais como, ácido esteárico, celulose microcristalina, cera de carnaúba e similares. Os comprimidos ou cápsulas podem ser revestidos por métodos bem-conhecidos na técnica.

As preparações líquidas para administração oral podem tomar a forma, por exemplo, de soluções, xaropes ou suspensões, ou estas podem ser apresentadas como um produto seco para constituição com água ou outro veículo adequado antes do uso (veja a seção de exemplos). Tais preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis que são agentes inativos, tais como, agentes de suspensão (tais como, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras comestíveis hidrogenadas), agentes emulsificantes (tal como, lecitina ou acácia) e conservantes (tais como, metil ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As composições também podem ser feitas para possuir um

sabor agradável, e desta maneira podem conter sais-tampão, agentes aromatizantes, corantes e adoçantes conforme apropriado.

Os diluentes e outros ingredientes inativos, tais como, um ou mais agentes de ligação farmaceuticamente aceitáveis, cargas, suportes, 5 agentes espessantes, agentes intensificadores de sabor, agentes corantes, conservantes, estabilizantes, reguladores, emulsificantes, agentes de fluxo, absorventes e similares ou misturas destes podem ser usadas dependendo

da forma da composição empregada. A composição também pode incluir um adoçante, tal como, um adoçante natural (por exemplo, açúcar ou mel) ou 10 adoçante artificial (por exemplo, sacarina), se desejado. Geralmente, os veículos, açúcares, diluentes, estabilizantes, tampões, ingredientes aromatizantes e texturizantes são considerados ingredientes inativos, visto que estes conferem um efeito terapêutico nos mesmos.

Em diversas modalidades, a composição pode incluir um ou mais extrato(s) adicional(is) de Aphanizomenon fios aquae (AFA) que induz a migração de células-tronco. Este extrato pode ser obtido ao extrair Aphanizomenon fios aquae (AFA) líquida em um álcool, tal como, porém sem caráter limitativo, etanol ou metanol. Em um exemplo, o extrato adicional é pro-

duzido ao extrair Aphanizomenon fios aquae (AFA) em cerca de 10% a cer20 ca de 20% de etanol. Em um exemplo, a composição inclui um extrato preparado ao extrair Aphanizomenon fios aquae (AFA) líquida em cerca de 10% de etanol. Em um exemplo, o extrato adicional que é produzido ao incubar

AFA líquida em cerca de 10% de etanol em uma temperatura de cerca de 65°C a cerca de 85°C é aplicado ao extrato aquoso, tal como, uma tempera25 tura de cerca de 70°C a cerca de 905°C, ou cerca de 85°C. A solução é então centrifugada e o sobrenadante é seco (veja acima). Em uma modalidade, cerca de 50 mg a cerca de 500 mg, tal como, cerca de 100 mg a cerca de

250 mg, tal como, cerca de 150 mg do produto seco são administrados no indivíduo.

Em um exemplo, uma composição de uso inclui cerca de 0,25 grama a cerca de 5 gramas, de cerca de 0,5 grama a cerca de 5 gramas, ou de cerca de 1 grama a cerca de 2 gramas de um extrato dotado de selectina

/.-X/ seco, tal como, uma forma sólida de um extrato aquoso enriquecido com um ligante de L-selectina, tal como, extrato A. Em um exemplo específico, nãolimitativo, a composição inclui cerca de 1 grama de um extrato dotado de selectina seco de alga verde-azulada (tal como, AFA), tal como uma forma 5 sólida de um extrato aquoso enriquecido com um ligante de L-selectina, tal como um extrato A. A composição também inclui cerca de 150 mg de um segundo extrato seco de AFA , onde o segundo extrato seco é produzido ao incubar AFA em cerca de 10% a cerca de 20% de etanol a cerca de 70°C a cerca de 90°C durante cerca de uma a três horas, tal como, ao incubar AFA 10 em cerca de 10% de etanol a cerca de 850°C durante cerca de uma a três horas.

Aumento de Mobilização de Célula-Tronco

Descreve-se aqui um método para aumentar a mobilização de célula-tronco ao administrar em um indivíduo uma quantidade terapeutica15 mente eficaz de um extrato aquoso de uma alga verde-azulada tal como Aphanizomenon fios aquae (AFA), enriquecido com um ligante de selectina, tal como, L-selectina e/ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ligante de selectina purificado. O ligante de selectina pode ser um ligante de L-selectina, P-selectina e/ou E-selectina. Os ligantes de selectina estimulam 20 a liberação de célula-tronco (Frenette and Weiss, Blood 196(7): 2460, 2000).

O indivíduo pode ser qualquer indivíduo, tal como um indivíduo humano ou animal.

Um extrato aquoso de alga verde-azulada enriquecido com um ligante de selectina, tal como uma L-selectina, ou um ligante de selectina 25 purificado de alga verde-azulada, pode ser administrado separadamente ou em combinação com outros agentes. Em diversas modalidades, o ligante de selectina purificado e/ou o extrato aquoso enriquecido com um ligante de selectina (ou uma forma sólida deste), está incluído em uma composição farmacêutica juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Quantidades terapeuticamente eficazes de componentes adicionais, tais como formas sólidas de extratos adicionais, também podem ser administradas no indivíduo. Em uma modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma forma sólida de um extrato aquoso de uma alga verdeazulada enriquecido com um ligante de selectina é administrada no indivíduo. Desta maneira, proporciona-se aqui um método para aumentar a mobilização de células-tronco em um indivíduo, que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um extrato aquoso de alga verdeazulada enriquecido com um ligante de selectina, tal como L-selectina, aumentando, dessa forma, a mobilização de células-tronco no indivíduo.

Em um exemplo específico, não limitativo, o extrato aquoso é seco, de modo que uma forma sólida seja produzida, e uma quantidade terapeuticamente eficaz da forma sólida é administrada em um indivíduo de interesse. A quantidade terapeuticamente eficaz do extrato, tal como um extrato aquoso de alga verde-azulada enriquecido com um ligante de selectina, é cerca de 0,01 a cerca de 1,0 g por kg de peso de corpo, tal como, cerca de 0,05 a cerca de 0,5 grama por kg de peso de corpo, ou de cerca de 0,1 a cerca de 0,5 grama por kg de peso de corpo. Em outro exemplo específico, não limitativo, a quantidade eficaz da forma sólida de um extrato aquoso de alga verde-azulada enriquecido com um ligante de selectina é cerca de 0,25 grama a cerca de 5 gramas, de cerca de 0,5 grama a cerca de 5 gramas, ou de cerca de 1 grama a cerca de 2 gramas. Em um exemplo específico, não limitativo, a quantidade eficaz da forma sólida do extrato aquoso de alga verde-azulada enriquecido com um ligante de selectina é cerca de 1 grama.

Os agentes ativos das composições descritos aqui podem ser misturados com um veículo. Em geral, a natureza do veículo dependerá do modo particular de administração empregado. Por exemplo, as formulações parenterais compreendem geralmente fluidos injetáveis que incluem fluidos farmacêutica e fisiologicamente aceitáveis, tais como, água, salina fisiológica, soluções salinas balanceadas, dextrose aquosa, glicerol ou similares como um veículo. Para composições sólidas (por exemplo, formas em pó, pílula, comprimido ou cápsula), os veículos sólidos não-tóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido ou estearato de magnésio. Além dos veículos biologicamente neutros, as composições farmacêuticas que serão administradas podem conter quan31 tidades menores de substâncias auxiliares não-tóxicas, tais como, agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes, e agentes de tamponamento de pH e similares, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano.

Esta quantidade eficaz pode ser administrada em uma dada freqüência, tal como, cerca de uma vez por semana, cerca de duas vezes por semana, cerca de três vezes por semana, uma vez ao dia, cerca de duas vezes ao dia, cerca de três vezes ao dia, ou mais. Um versado na técnica pode determinar facilmente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ligante de selectina purificado, ou um extrato aquoso enriquecido com um ligante de selectina. Em um exemplo específico, não limitativo, a quantidade de células-tronco circulantes, tal como, a quantidade de células que expressam CD34, é estimada.

A quantidade terapeuticamente eficaz de um extrato aquoso de alga verde-azulada enriquecido com um ligante de selectina e a freqüência de administração destas composições podem depender de uma variedade de fatores, tais como, o gênero ou espécie de alga utilizada, a saúde geral do indivíduo que será tratado, e as características fisiológicas (por exemplo, altura, peso, porcentagem de gordura corporal, metabolismo, etc.) do indivíduo que será tratado. O extrato aquoso pode ser diretamente administrado, sem alterar os parâmetros físicos, ou pode ser administrado em outra forma física. Desta maneira, em uma modalidade, o extrato é seco e é administrado como um sólido. Em outra modalidade, o extrato aquoso é seco, e então uma quantidade específica é dissolvida em um veículo subseqüentemente administrada no indivíduo.

Proporcionam-se ensaios específicos para determinar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um extrato aquoso, tal como, um ligante aquoso enriquecido com uma selectina. Em um exemplo específico, não limitativo, quantidades diferentes de um extrato dotado de ligante de selectina de alga verde-azulada, tal como AFA, são consumidas por indivíduos humanos e a presença e/ou quantidade de células-tronco (podendo incluir subtipos de tais células) presente no sistema circulatório é detectada e/ou analisada. Em outra modalidade, um modelo animal (tal como, um camundongo, rato ou outro animal) é utilizado, e a população de células-tronco recentemente integradas é monitorada em diversos tecidos (veja os Exemplos abaixo). Deveria ser observado que os métodos descritos possuem a5 plicação igual em áreas médicas e veterinárias.

Independente da maneira proporcionada ou administrada, o extrato de alga verde-azulada e/ou ligante de selectina purificado induz um aumento transitório na população de células-tronco circulantes, tais como células-tronco CD34+ e/ou células CD133+. O extrato de alga verde-azulada 10 também pode incluir um aumento transitório em células-tronco que pode ser medido por aminoacetaldeído fluorescente mente marcado. Este procedimento está descrito em stem cell website (veja, http://www.stemcell.com/technical/aldefluor.asp, veja também http://www.stemcell.com/technical/12_aldefluor.pdf ). Resumidamente, o a15 minoacetaldeído fluorescentemente marcado pode se difundir livremente em células. Uma enzima intracelular ALDH (aldeído desidrogenase) converte este aminoacetato fluorescentemente marcado, que não pode se difundir para fora das células. Desta maneira, as células que possuem a enzima ALDH (tal como, células-tronco) se tornam fluorescentes. Outras células (tais

como, células que não são células-tronco, inclusive células diferenciadas) se mostram não-fluorescentes após a lavagem.

O aumento de mobilização de célula-tronco pode ser medido ao examinar a resposta de células-tronco a uma dose particular de extrato de alga verde-azulada. Em uma modalidade, fornecer um ligante de selectina purificado de alga verde-azulada a um indivíduo irá aumentar a mobilização daquelas células-tronco do indivíduo dentro de um certo período de tempo, tal como menos que cerca de 5 horas, menos que cerca de 4 horas, menos que cerca de 2 horas, menos que cerca de 1 hora, menos que cerca de 30 minutos, ou menos que cerca de 10 minutos após a administração.

Em uma modalidade, a administração do extrato aquoso de alga verde-azulada enriquecido com um ligante de selectina, e/ou o ligante de selectina purificado, resulta na mobilização de células-tronco na circulação

de cerca de 10 a cerca de 30 minutos após a administração. As célulastronco mobilizadas irão entrar no sistema circulatório, desta maneira aumentando o número de células-tronco circulantes no corpo do indivíduo. O aumento de percentagem no número de células-tronco circulantes comparado 5 com uma linha de base normal pode ser cerca de 25%, cerca de 50%, cerca de 100% ou mais que cerca de 100% de aumento como comprado com um controle. Em uma modalidade, o controle é um valor de linha de base do mesmo indivíduo. Em outra modalidade, o controle é o número de células-

tronco circulantes em um indivíduo não-tratado, ou em um indivíduo tratado 10 com um placebo ou um veículo farmacológico.

Em algumas modalidades, o indivíduo é saudável. Em outras modalidades, o indivíduo sofre de uma doença ou condição fisiológica, tal como imunossupressão, doença crônica, lesão traumática, ou doença degenerativa. Em certas modalidades, o indivíduo sofre de uma doença ou condi15 ção da pele, sistema digestivo, sistema nervoso, sistema linfático, sistema cardiovascular, ou sistema endócrino. Em modalidades específicas, o indivíduo sofre de osteoporose, doença de Alzheimer, infarto cardíaco, doença de Parkinson, lesão cerebral traumática, esclerose múltipla, cirrose do fígado, ou qualquer uma das doenças e condições descritas nos Exemplos abaixo.

Exemplos

Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar características particulares de diversas modalidades descritas. O escopo da presente invenção não deve se limitar às características exemplificadas.

Exemplo 1

Produção de AFA e extração

Uma alga verde-azulada, Aphanizomenon fios aquae (AFA), foi isolada do Lago Klamath. A alga verde-azulada foi seca utilizando REFRACTANCE WINDOW® Technology.

Um grama de material de alga seco foi ressuspenso em 10 ml de salina tamponada com fosfato ou água e incubado durante 1 hora a 4°C e protegido da luz. Esta lama foi misturada por inversão repetida do frasco, e centrifugada em 400g durante 10 minutos. O sobrenadante azul-claro foi de34

cantado e esterilizado por filtração utilizando um filtro de 0,22 mm. Este filtrado foi armazenado a frio e no escuro, e usado no mesmo dia de preparação. Este extrato foi chamado de Extrato A.

Exemplo 2

Ligante de selectina extraído de AFA-W : materiais e métodos

Tampões e meio: Para culturas celulares, as células foram ressuspensas e cultivadas em RPMI-1640 com 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina e estreptomicína, e L-glutamina. Para imunomarcação, as células foram lavadas, ressuspensas e marcadas em salina tamponada com fosfato que contém 0,02% de Azida e 1 % de soro fetal bovino ou albumina de soro bovino. Para análises de proliferação e para estimulação de ensaios de blotting de fosfotirosina, as células foram preparadas em RPMI 1640 com vermelho de fenol, 10% de Soro Bovino Fetal (Gibco, Grand Island NY), 1% de glutamina, 1% de Penicilina e 1% de Estreptomicína.

Extratos de cianobactérias: O pó seco da alga verde-azulada Aphanizomenon fios aquae (AFA) de água doce foi obtido do Upper Klamath Lake em Oregon, USA. Para experimentos iniciais, um pó seco por congelamento foi usado. Para experimentos posteriores, um pó foi obtido a partir de Desert Lake Technologies LLC, Keno, OR, este foi seco utilizando a tecnologia de secagem de REFRACTANCE WINDOW®. O pó seco de Spirulina platensis foi obtido junto a Healthforce Nutritionals Inc, Escondido CA. Um grama de material de alga seco foi ressuspenso em 10 ml de salina tamponada com fosfato, e incubado durante a noite a 4°C e protegido da luz. A lama foi misturada por inversão repetida do frasco, e centrifugada em 400 g durante 10 minutos. O sobrenadante azul-claro foi decantado e esterilizado por filtração utilizando um filtro de 0,22 mm. Este filtrado foi armazenado a frio e no escuro, e usado no mesmo dia de preparação.

Anticorpos monoclonais: O anticorpo monoclonal CD62L TQ1 (específico para área de ligação-ligante da molécula de L-selectina) ligado a ficoeritrina (PE), foi adquirido junto a Coulter (Hialeah, FL). CD45-PerCP, CD11b-PE, CD14-PE e os anticorpos de controle de isotipo foram obtidos junto a Becton-Dickinson.

Captura de ligante utilizando Dynabeads e proteínas quimera:

Para identificar o peso molecular do composto de ligação de selectina, um método isento de células foi usado, onde Dynabeads (Dynal Biotech lnc., Lake Success, NY) revestidas com Proteína G foram incubadas com uma 5 proteína quimera de selectina (R & D Systems lnc., Minneapolis, MN). A proteína quimera é uma fusão do domínio extracelular de L-selectina, Pselectina, ou E-selectina humana, com a parte Fc de imunoglobulina humana

G. A proteína quimera foi coval ente mente ligada a esferas magnéticas re-

vestidas com Proteína G utilizando o protocolo recomendado pelo fabricante, onde tais esferas foram incubadas durante 1 hora em 5,4 mg/ml de solução recentemente produzida de dimetil pimelimidato x 2HCI (Sigma Aldrich) em

0,2 M de trietanolamina tampão pH 8,0 (Sigma Aldrich). A reticulação foi interrompida ao remover as esferas da solução reticulante, e estas ressuspensas em 50 mM de TRIS tampão pH 7,5 (Sigma Aldrich) durante 15 minutos.

A quimera não-ligada foi eluída das esferas através de duas lavagens em citrato/ácido cítrico tampão de pH 2,8. As esferas foram então lavadas diversas vezes em PBS pH 7,4, e adicionadas a um extrato aquoso de AFA recentemente produzido. O material ligado do extrato aquoso de AFA foi eluído

em uma entre três formas: 1) por ebulição em tampão Laemmli dotado de 20 beta-mercaptoetanol, 2) eluição com pH 12,5 e 3) competição com o sítio de ligação de ligante de selectina utilizando ligantes de selectina conhecidos.

Foi verificado que um composto de peso molecular aparentemente idêntico foi purificado por afinidade tanto por L-selectina como P-selectina.

Em experimentos paralelos, as esferas revestidas com proteína de fusão recombinante de L-selectina/lgG1 humana foram usadas para verificar se um extrato aquoso similar de outra alga verde-azulada, Spirulina piatensis, continha um composto de ligação de selectina similar.

Eletroforese: As amostras de eluante do método de afinidade com esferas magnéticas foram preparadas para eletroforese em gel ao mis30 turar 1:1 v/v em tampão de amostra de Laemmli (Biorad cat# 161-0737) com mercaptoetanol. A eletroforese em gel de SDS foi realizada em 4-15% de géis (BioRad) em tampão TRIS/glicina/SDS (Biorad cat# 161-0732) durante

hora a 120 V.

A eletroforese de proteína nativa foi realizada com reagentes isentos de SDS, utilizando Tampão de Amostra Nativa (Biorad cat# 161 0738) para carregamento, e tampão TRIS/glicina (Biorad cat# 161-0734) para eletroforese.

Indivíduos humanos: Os voluntários humanos saudáveis foram convocados mediante consentimento informado da equipe do laboratório e estudantes entre 20 e 45 anos de idade. As amostras de sangue foram obtidas por venipuntura sob condições assépticas, e imediatamente processadas.

Isolamento de Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMC): O sangue venoso periférico foi lamelado com Ficoll-Hypaque (Amersham), e centrifugado durante 25 minutos em 400 g. A interface rica em PBMC foi colhida, e as células lavadas duas vezes em RPMI.

Isolamento de Células Nucleadas de Polimorfo (PMN): O sangue venoso periférico foi misturado com dextran70 em 0,9% de salina a uma concentração final de 1% de dextrano em temperatura ambiente. A sedimentação foi permitida durante 1 hora. O sobrenadante rico em leucócito foi colhido e os leucócitos peletizados por centrifugação. O pélete foi ressuspenso em 2 ml de salina tamponada com fosfato que foi então lamelado sobre 3 ml de Ficoll-Hypaque, e a centrifugação em gradiente realizada em células mononucleares separadas (linfócitos e monócitos) de neutrófilos. O pélete que contém neutrófilos foi ressuspenso em salina. As células foram lavadas, ressuspensas em um meio rico em nutriente (RPMI 1640), e mantidas em gelo até o uso.

Imunomarcação de L-selectina: Os leucócitos de sangue periférico fixados em formalina foram distribuídos em poços em uma placa de microtiter de 96 poços com fundo em V na concentração aproximada de 10⁵ células por poço. Um extrato baseado em água recentemente preparado da alga verde-azulada AFA foi preparado em salina fisiológica e diluições seqüenciais foram realizadas. As células foram ressuspensas tanto em PBS, PBS-AFA-W, PBS-AFA-W-azida, como em PBS-PC em diversas diluições.

As células foram incubadas em temperatura ambiente e no escuro durante 20 minutos. A fração não-fixada não foi colocada em contato com azida de sódio durante o tratamento com extrato de AFA, porém foi ressuspensa em tampão dotado de azida de sódio para imunomarcação subsequente. Esta foi permitida para movimentos citoesqueléticos livres e queda de shedding Lselectina. A fração que foi mantida em 0,02% de azida de sódio estava em contato com azida de sódio durante todo o procedimento, tanto tratamento com extrato de AFA como imunomarcação subseqüente. Isto poderia bloquear o movimento esquelético e reduzir ou bloquear a queda de Lselectina. Após a incubação com ou sem AFA-W, o tampão foi adicionado, e as células centrifugadas. O sobrenadante foi descartado, e as células ressuspensas em um volume de 50 μΙ de salina tamponada com fosfato contendo 1% de soro fetal bovino e 0,05% de azida. Quantidades ótimas de anticorpos monoclonais, como determinado por titulações anteriores, foram adicionadas. As placas foram incubadas em temperatura ambiente durante 10 minutos, o tampão foi adicionado, e as placas centrifugadas. Os sobrenadantes foram descartados, as células resssupensas em 50 μΙ de tampão, e fixadas em 1% de formalina. As amostras foram mantidas no frio e no escuro até a captura por citometria de fluxo. A captura foi realizada dentro de 24 horas de fixação.

Imunomarcação para expressão de CXCR4 induzida por ligantes de L-selectina: A ligação de Fucoidan a L-selectina resulta em externalização de CXCR4 preparado anteriormente sobre a superfície celular, seguida por internalização, criando uma janela a tempo para correspondência a fatores quimiotáticos. Este sistema foi usado para verificar se AFA-W poderia competir com Fucoidan pela ligação á L-selectina na superfície celular de leucócito, e para avaliar se este poderia bloquear este efeito funcional de outro ligante de L-selectina. Para se fazer isto, PBMC humanas recentemente purificadas foram ressuspensas em RPMI, e distribuídas em uma série de micropoços com fundo redondo. Fucoidan foi adicionado a uma série de poços, AFA-W para outra série, e uma mistura de Fucoidan e AFA-W foi adicionada à terceira série de poços. Em pontos de tempo diferentes (1, 10, 20,

30, 40, 60 minutos), PBS contendo azida de sódio foi adicionada a poços para parar os movimentos citoesqueléticos, e desta forma, parar a reciclagem de CXCR4, permitindo a coloração para CXCR4 expressa na superfície celular em cada ponto de tempo. As células foram lavadas em salina tamponada com fosfato contendo azida, manchadas com CXCR4-PE utilizando o protocolo de coloração descrito acima, fixadas em formalina, e analisadas por citometria de fluxo.

Estimação de peso molecular de componentes nativos versus desnaturados do ligante de selectina de AFA: As distâncias sobre o gel foram medidas pelos marcadores de peso molecular conhecidos. A posição do ligante de selectina derivado de AFA (banda dupla) foi representada naquele gráfico.

Exemplo 3

Células-tronco são mobilizadas por um extrato aquoso de AFA

Estes experimentos descritos abaixo demonstram que o extrato aquoso de AFA (Extrato A, também chamado de AFA-W) é enriquecido com um ligante de selectina e pode ser usado para aumentar a mobilização de células-tronco CD34+.

Voluntários humanos saudáveis foram identificados, e a proporção de células CD34+ avaliada no sangue periférico (células CD34+ circulantes) de cada pessoa antes do consumo do extrato dotado de selectina de alga verde-azulada bem como 10 minutos, 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos após o consumo. Os voluntários foram instruídos a limitar a atividade mental e física durante um período de tempo antes e depois do consumo do extrato de AFA. Em uma modalidade, 5 gramas de AFA seca foram extraídos em 40 ml de água o participante bebeu a água. Em outra modalidade, os participantes consumiram 750 mg de extrato dotado de ligante de Lselectina seco de AFA. Os glóbulos vermelhos em todas as amostras de sangue de cada voluntário foram lisados utilizando solução de lise FACS (Beckton-Dickinson, San Jose, CA). As células restantes foram lavadas e manchadas com anticorpo monoclonal HPCA-2 conjugado com isotiocianato de fluoresceína. As amostras foram fixadas em 1 % de formalina e analisa39

das por citometria de fluxo utilizando um citômetro de fluxo FacsCalibur (Becton-Dickinson, San Jose, CA) e software CelIQuest (Becton- Dickinson, San Jose, CA).

A figura 1 ilustra que o consumo de extrato dotado de ligante de 5 selectina de AFA deflagrou um aumento transitório em células-tronco circu-

lantes. Especificamente, o eixo geométrico X mostra o curso de tempo de um experimento típico em 0, 10, 30, e 60 minutos após a ingestão do extrato dotado de ligante de L-selectina de AFA, expresso como uma porcentagem do nível de controle. No momento da ingestão, a proporção de células 10 CD34+ circulantes é a mesma do controle. O aumento no pico em células

CD34+ circulantes foi observado em cerca de 10 a 30 minutos após o consumo. Neste ponto de tempo, o número de células CD34+ circulantes aumentou 2 dobras (mais de 200%) sobre o valor de controle. 1 hora após a ingestão do extrato dotado de ligante de selectina de AFA, as células CD34+

circulantes retornaram para o valor de linha de base. Portanto, um extrato aquoso de AFA pode aumentar a liberação de células-tronco endógenas (por exemplo, células CD34+) da medula óssea e outros sítios anatômicos em circulação. O consumo do extrato dotado de ligante de selectina de AFA mobiliza as células-tronco CD34+.

Exemplo 4

Um Extrato aquoso de AFA Contém um Ligante de selectina

Os experimentos descritos abaixo documentam que AFA contém um composto solúvel em água que reduz especificamente a marcação TQ1 de L-selectina em linfocitos, monócitos e neutrófilos humanos.

As Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMC) foram isoladas por lamelação de sangue venoso periférico em Ficoll-Hypaque (Amersham), e centrifugadas durante 25 minutos em 400 g. A interface rica em PBMC foi colhida, e as células foram lavadas duas vezes em RPMI. As Células Polimorfonucleares (PMN) foram isoladas ao misturar sangue venoso periférico com dextran70 em 0,9% de salina a uma concentração final de 1% de dextrano em temperatura ambiente. A sedimentação foi permitida durante 1 hora. O sobrenadante rico em leucócito foi colhido e os leucócitos peletiCl zados por centrifugação. O pélete foi ressuspenso em 2 ml de salina tamponada com fosfato que foi então lamelado sobre 3 ml de Ficoll-Hypaque, e a centrifugação em gradiente realizada em células mononucleares separadas (linfócitos e monócitos) de neutrófílos. O pélete que contém neutrófilos foi ressuspenso em salina. As células foram lavadas, ressuspensas em um meio rico em nutriente (RPMI 1640), e mantidas em gelo até o uso.

Os leucócitos de sangue periférico e frescos fixados em formalina foram distribuídos em poços em uma placa de microtiter de 96 poços com fundo em V na concentração aproximada de 10⁵ células por poço. Um extrato baseado em água recentemente preparado da alga verde-azulada AFA foi preparado em salina fisiológica e diluições seqüenciais foram realizadas. As células foram ressuspensas tanto em PBS, PBS-AFA-W, PBS-AFA-W-azida, como em PBS-PC em diversas diluições. As células foram incubadas em temperatura ambiente e no escuro durante 20 minutos. A fração não-fixada não foi colocada em contato com azida de sódio durante o tratamento com extrato de AFA, porém foi ressuspensa em tampão dotado de azida de sódio para imunomarcação subseqüente. Esta foi permitida para movimentos citoesqueléticos livres e queda de L-selectina. A fração que foi mantida em 0,02% de azida de sódio estava em contato com azida de sódio durante todo o procedimento, tanto tratamento com extrato de AFA como imunomarcação subseqüente. A azida de sódio bloqueia o movimento citoesquelético e reduz ou bloqueia a queda de L-selectina. Portanto, qualquer redução na coloração de L-selectina com um anticorpo monoclonal se deve à competição direta com um composto no Extrato AFA.

Após a incubação com ou sem Extrato A (AFA-W), o tampão foi adicionado, e as células centrifugadas. O sobrenadante foi descartado, e as células ressuspensas em um volume de 50 μΙ de salina tamponada com fosfato contendo 1 % de soro fetal bovino e 0,05% de azida. Quantidades ótimas de anticorpos monoclonais, como determinado por titulações anteriores, foram adicionadas. As placas foram incubadas em temperatura ambiente durante 10 minutos, o tampão foi adicionado, e as placas centrifugadas. Os sobrenadantes foram descartados, as células resssupensas em 50 μΙ de

tampão, e fixadas em 1% de formalina. As amostras foram mantidas no frio e no escuro até a captura por citometria de fluxo. A captura foi realizada dentro de 24 horas de fixação. O anticorpo monoclonal CD62LTQ1 (específico para área de ligação de ligante da molécula de L-selectina) ligado á ficoeritrina (PE), foi adquirido junto à Coulter (Hialeah FL).

A incubação de PBMC e PMN com o extrato aquoso de AFA (AFA-W) resultou em redução de marcação com o anticorpo monoclonal de Lselectina TQ1 anti-humano, que é conhecido como específico para a área de ligação de ligante de L-selectina (Spertini et al., J lmmunol.H7(3):942-9, 1991). A redução mediada por AFA-W de coloração TQ1 foi mais forte em linfócitos e PMN, porém também foi observada em monócitos (Figura 2A). Em linfócitos e PMN, uma redução aproximada de 40-70 dobras em coloração de TQ1 foi observada quando as células foram pré-incubadas com AFAW, ao contrário de uma redução de 15 dobras em monócitos.

A expressão de CD1 Ib foi ligeiramente aumentada, enquanto nenhuma alteração significativa foi observada com outros marcadores de adesão (CD1 Ia, CD1 8, CD29, CD49d, CD49e e CD44). Os linfócitos de sangue periférico fixados em formalina foram incubados na ausência ou presença de diluições em série de AFA-W. A coloração de linfócitos com o anticorpo TQ1 mostrou uma redução dose-dependente em ligação de TQ1 à Lselectina com concentrações crescentes de Extrato A. Como o efeito foi observado também nos linfócitos fixados em formalina, a coloração reduzida poderia não ser devido à queda de L-selectina. (Figura 2).

Exemplo 5

Ligante de selectina de AFA bloqueia a expressão de receptores quimiocina ativados por Fucoidan na linhagem celular KG-1a CD34^bnght

A linhagem celular simples KG-1a é claramente positiva para CD34 e ligante de L-selectina, como avaliado por coloração com anticorpo monoclonal TQ1. KG-1a também contém reservatórios do receptor quimiocina CXCR4 que são externalizados mediante ligação de L-selectina. A incubação de KG-1a com o Fucoidan, um agonista de L-selectina, deflagra a expressão do receptor quimiocina CXCR4. O Extrato A de AFA bloqueou o e

feito mediado por Fucoidan sobre a expressão de CXCR4 (Figura 3). Exemplo 6

Purificação do ligante de L-selectina de AFA

Um ligante de selectina foi isolado de AFA utilizando esferas magnéticas covalentemente ligadas à proteína de fusão geneticamente engenheirada onde a parte extracelular de L-selectina ou P-selectina recombinante humana é acoplada à parte Fc de imunoglobulina. As esferas são incubadas com a fração solúvel em água de AFA e o ligante de selectina é isolado (veja Figura 4A: L-selectina, Figura 4B: P-selectina). As esferas foram coletadas utilizando um ímã e lavadas diversas vezes. As esferas foram então expostas a um tratamento com ácido ou ebulição ou um tratamento alcalino para romper a ligação entre o ligante e a selectina recombinante. O ligante de selectina também foi isolado utilizando uma coluna de afinidade.

Quando o ligante de selectina for recuperado sob condições de redução, este é um dímero formado de duas subunidades de aproximadamente 54 kDa e 57 kDa (Figura 4B). Uma molécula de compósito baseada nestas subunidades poderia possuir pesos de 108, 111, ou 114 kDa aproximadamente, e variações maiores destes. Ao utilizar técnicas de exclusão por tamanho, quando a fração de extrato A for passada através de um filtro de 100 kDa, o ligante foi encontrado em concentrações maiores na fração acima de 100 kDa. Portanto, o ligante pode ser isolado como um dímero de pelo menos 100 kDa.

Exemplo 7

O Ligante de selectina extraído de AFA não é encontrado no Extrato B.

O Extrato B foi produzido em diversas etapas, primeira, extração de compostos em etanol, então novamente em um tampão polar (água, salina). A primeira etapa é a produção de um pó amarelo/marrom de AFA seca, inicialmente durante 3 horas a 50°C com uma solução aquosa que contém 20% de etanol. O sobrenadante foi decantado e os sólidos foram precipitados ao adicionar etanol a 80% de uma concentração final. O precipitado foi seco utilizando a técnica de secagem de REFRACTANCE WINDOW®. Quando este pó amarelo for colocado novamente em solução aquosa (água

ou salina), um extrato laranja foi produzido. Os sólidos foram removidos por centrifugação, e o sobrenadante esterilizado por filtração. Este líquido é o Extrato B. Este extrato foi incubado com as esferas magnéticas revestidas descritas acima. O Extrato B não contém um ligante de selectina (Figura 5). Exemplo 8

Ligante de selectina de alga verde-azulada modula a expressão de CXCR4.

As células-tronco são mantidas dentro do local de medula óssea pelo menos em parte através de moléculas de adesão de selectina. Quando a selectina for ligada por um ligante apropriado, esta deflagra a expressão do receptor de citocina CXCR4. CXCR4 é um receptor específico de Fator Derivado do Estroma 1 (SDF-I) e a ligação de SDF-l a CXCR4 ajuda a manter as células-tronco ligadas à medula óssea. A inibição de ligação de ligante de selectina reduz a expressão de CXCR4, isto resulta em uma separação de células-tronco da medula óssea e sua liberação na corrente sanguínea.

Para demonstrar o efeito fisiológico do ligante de selectina de AFA, em uma modalidade o ligante de selectina foi testado sobre expressão de CXCR4 deflagrada por fucoidan, um ligante de L-selectina conhecido que estimula a expressão de CXCR4. A expressão de receptores CXCR4 após a exposição a fucoidan foi avaliada em linfócitos utilizando citometria de fluxo. A incubação com o ligante de selectina AFA inibiu significativamente a expressão de CXCR4 em linfócitos humanos (Figura 6) e na linhagem celular progenitora humana CD34+ KG-1a (Figura 7), indicando que este é um mecanismo através do qual o ligante de selectina de AFA pode deflagrar a mobilização de célula-tronco.

Exemplo 9

Células-tronco da medula óssea preenchem diversos tecidos distantes.

Um modelo murino pode ser usado para avaliar a capacidade de as células-tronco, mobilizadas por consumo de alga verde-azulada, preencherem tecidos distantes do corpo. Camundongos machos são selecionados como animais doadores de medula óssea, enquanto todos os camundongos receptores são fêmeas. Os receptores fêmeas são irradiados de forma subletal antes da injeção de células da medula óssea nas veias de suas caudas.

Dois grupos de camundongos são avaliados. O primeiro grupo de 20 animais é irradiado de forma subletal, injetado com medula óssea, e introduzido à alimentação normal. O segundo grupo de 20 animais também é irradiado de forma subletal, recebe medula óssea do macho, e é alimentado com uma 5 dieta de alimentação normal mais 0,5 a 15% p/v da fração contendo ligante de selectina de AFA.

Cerca de 6 x 10⁶ células nucleadas de medula óssea de adulto

são colhidas de camundongos machos com 8 a 10 semanas de idade e injetadas nas veias da cauda de receptores fêmeas adultas isogênicas irradia10 dos de forma subletal, também com 8 a 10 semanas de idade. Os camundongos de cada grupo são sacrificados em cada um dos seguintes pontos de tempo: tempo 0, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas e 8 semanas. Em pontos de tempo de 2 e 8 semanas, 6 camundongos de cada grupo são sacrificados. Todos os outros pontos de tempo, 2 camundongos 15 de cada grupo são sacrificados.

Durante as primeiras duas semanas após a injeção, 15 microlitros do sangue total são retirado da orelha, cauda ou pata, e imediatamente diluídos em 200 microlitros de tampão (salina tamponada com fosfato, pH = 7,2, 2% de soro, o.o,2% de azida) para diluir os fatores de coagulação e im-

pedir a a mesma. As amostras de sangue são analisadas para monitorar a repopulação de plaquetas, glóbulos vermelhos, e leucócitos no sangue. Uma parte da amostra de sangue é usada para obter uma contagem celular e para avaliação diferencial de glóbulos vermelhos versus glóbulos brancos. A amostra é analisada utilizando um citômetro de fluxo, e a proporção de neu trófilos, linfócitos e monócitos será avaliada utilizando dispersão frontal e lateral de luz (forward and side scatter). Os leucócitos sanguíneos serão examinados por origem de macho utilizando citometria de fluxo.

No momento de sacrifício, diversos tipos de célula e tecido serão examinados por antígeno Hy, que demonstra que a célula ou tecido pertence 30 a um camundongo macho. Os cérebros são colhidos e todo o cérebro é examinado, inclusive o bulbo olfatório, hipocampo, áreas corticais, e cerebelo. A medula óssea, músculo do coração, músculo da pata traseira, fígado, pân45

i creas, seções do intestino delgado, e tecido do pulmão são examinados pela presença de células com cromossomo Y, tanto mediante detecção de antígeno Hy de superfície por imunofluorescência como mediante hibridização por fluorescência in situ utilizando sondas para o cromossomo Y. Estes dados irão documentar até que extensão uma dieta que contém alga verdeazulada promove o processo de retorno, implantação e diferenciação das células-tronco da medula óssea injetadas.

Exemplo 10 Células-tronco da medula óssea preenchem diversos tecidos distantes.

Um estudo similar àquele descrito acima é realizado utilizando camundongos machos transgênicos que transportam o gene para proteína verde fluorescente (GFP) e camundongos isogênicos fêmeas como receptores. Os animais são tratados, alimentados e sacrificados como descrito acima, e amostras sanguíneas também são analisadas de maneira similar. Os leucócitos sanguíneos são examinados para a expressão de GFP utilizando citometria de fluxo e, no momento do sacrifício, diversos tipos de célula e tecido serão examinados para antígeno GFP, que demonstra a origem do doador. Os tecidos e órgãos são colhidos como descrito acima e a presença de células que transportam GFP é detectada por citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência.

Exemplo 11

Re-população de célula-tronco aumentada de tecido traumatizado.

Um modelo de camundongo é usado para avaliar o retorno e integração de células-tronco derivadas da medula óssea no tecido traumatizado.

Todos os doadores de medula são camundongos machos adultos (8 a 10 semanas de idade), e todos os camundongos receptores são fêmeas adultas (8 a 10 semanas de idade). Dois grupos de camundongos são avaliados. Um grupo de receptores irradiados de forma subletal recebe 6 x 10⁶ células doadoras nucleadas através de injeção na veia da cauda e permitiu 2 semanas de recuperação. Os animais são então levemente traumatizados por inserção de agulha fina no músculo da pata traseira, coração e

cérebro. Todos os animais recebem alimentação normal durante o estudo. No segundo grupo, os camundongos fêmeas são identicamente tratados como o primeiro grupo, porém são alimentados com uma dieta que inclui 0,5 a 15% p/v da fração dotada de ligante de selectina de AFA.

Dois camundongos são sacrificados antes do trauma para avaliar os níveis de linha de base de células derivadas de machos. Subseqüentemente, os camundongos são sacrificados nos seguintes pontos de tempo: 1 semana, 2 semanas, 3 semanas e 4 semanas. Dois camundongos são sacrificados em cada ponto de tempo, exceto no ponto de tempo de 2 semanas, onde 6 camundongos de cada grupo são sacrificados. O tecido do músculo da pata traseira, coração, e do cérebro é isolado dos animais sacrificados. As seções são cortadas através das áreas traumatizadas, e marcadas em células derivadas de macho utilizando tanto análise de marcador de superfície celular para a expressão do antígeno Hy como hibridização por fluorescência in situ utilizando sondas no cromossomo Y. Alternativamente, um camundongo doador transgênico que expressa GFP será usado (similar ao Exemplo #4).

Os dados obtidos demonstram o efeito de consumo da fração dotada de ligante de selectina de AFA sobre a velocidade de recrutamento de célula-tronco após o trauma.

Exemplo 12

Relato de caso para reparo de tecido.

Um indivíduo era um fisiculturista que sofreu um acidente de carro três anos atrás. Um carro bateu no carro dela na porta do lado do motorista e diversos músculos se despedaçaram em seu quadril e coxa. Ela se submeteu a uma série de cirurgias para reconectar os músculos cortados. Apesar das cirurgias bem sucedidas, o dano no músculo foi tão grave que ela permaneceu com uma dor constante e poderia não retomar os treinamentos de levantamento de peso, visto que mesmo uma seção de treinamento leve poderia ser seguida por inchação e dor, o que a impediría de andar durante vários dias.

Ela experimentou muitos fármacos antiinflamatórios, porém após meses ela ainda não podia treinar. Ela começou a consumir a fração de alga verde-azulada que contém um ligante de selectina. Duas semanas depois, ela relatou estar capaz para retornar à academia, e após dois meses de consumo, ela retomou ao treinamento normal, indicando amplo reparo de tecido muscular.

Exemplo 13

Relato de caso para reparo de tecido.

Um indivíduo de 55 anos de idade partia para a sexta substituição de quadril - quarta no lado esquerdo. Geralmente, ocorreu prognóstico muito insatisfatório e grandes dificuldades envolvidas.

O cirurgião ortopédico reconstruiu a bacia e acetábulo. Entretanto, antes da cirurgia o indivíduo foi informado pela equipe médica que não há forma de o corpo produzir o osso novo necessário para o sucesso em longo prazo do procedimento. Foi apresentado que se o indivíduo desenvolver o crescimento do osso é provável que seja menos do que requerido para cura.

Imediatamente após a cirurgia foi oferecida ao indivíduo a fração de alga verde-azulada que contém L-selectina. O crescimento do osso forte e novo ocorreu rapidamente e a recuperação foi ligeira. O indivíduo relatou que não precisava mais de muletas e se encontrava em condições de sustentar todo seu peso em 6 semanas - comparado com 6 meses com a cirurgia anterior do indivíduo. O indivíduo relatou que a cura acelerada foi confirmada a cada exame físico. O indivíduo também relatou que sua coxa direita que passou por uma revisão no início dos anos 80 estava muito forte. Isto foi considerado excepcional.

Exemplo 14

Relato do caso

Uma menina jovem foi diagnosticada aos três anos com distrofia muscular infantil. Ela estava incapaz de andar. Ela estava muito frágil, e freqüentemente se encontrava com pneumonia, o que a cada vez resultou em confinamento na cama durante 8 a 10 dias. Ela estava em terapia convencional para distrofia muscular durante seis meses, porém isto não resultou em alteração. Ela começou a consumir Spirulina, que até aperfeiçoou de certa forma sua função imune visto que ela teve pneumonias menos freqüentes e menos graves. Ela então começou a consumir a fração de alga verde-azulada que contém um ligante de selectina (Extrato A). Após duas semanas ela começou a dar seus primeiros passos. Após três meses ela estava andando. Ela não tinha mais pneumonia.

A doença é uma doença congênita, e diversos membros da família com a mesma doença - porém mais degenerada - também começaram a consumir a fração de alga (Extrato A). Estes indivíduos relataram que

sentiram benefícios de se consumir esta fração.

Exemplo 15

Estudos em humano

Um estudo controlado por placebo, randomizado triplo cego em indivíduos humanos foi realizado sobre o efeito de diversos extratos de AFA sobre os números de células-tronco circulantes. Os seguintes métodos ιοί 5 ram usados nestes estudos:

Consumíveis: Quatro consumíveis foram testados. Dois eram líquidos, e dois eram encapsulados. Nem os voluntários, nem a pessoa que administra a substância, nem a equipe do laboratório que realiza a análise de dados conhecia tal substância que estava sendo administrada em um

dado dia de estudo.

1. LSL: Extrato A, uma fração de AFA enriquecida no ligante de

L-selectina. Um grama da fração concentrada em ligante de L-selectina (LSL) foi misturado em 40 ml de água e servidas aos indivíduos do estudo em um copo de papel.

2. Migratose (MGT): A fração conhecida por conter o composto bioativo responsável pela migração de células-tronco imunes foi obtida ao extrair AFA líquida com 10% de etanol a 50°C durante uma hora. A solução foi centrifugada e o sobrenadante foi seco utilizando RW. Este produto foi internamente chamado de Migratose (MGT). Migratose (150mg) foi mistura30 da com 250 mg de placebo e administrada em uma cápsula vegetal.

3. Reforçador de Célula-tronco StemEnhance (SE): StemEnhan- ce é uma mistura de LSL e Migratose. Um grama de StemEnhance foi mistu49

rado em 40 ml de água e serviram aos indivíduos do estudo em um copo de papel.

4. Placebo: O placebo consistia em 400 mg de flocos de batata finamente triturados tingidos de verde encapsulados em cápsulas vegetais.

A aparência era idêntica àquela de cápsulas que contêm Migratose.

Indivíduos: Um total de 19 pessoas foram entrevistadas de voluntários saudáveis doadores de sangue normais. Os seguintes critérios foram usados;

- Abaixo de 20 ou acima de 65 anos de idade

- Gravidez

- Asma grave e alergias que requerem medicação diária

- Qualquer doença crônica ou doença venérea anterior/atual

- Uso freqüente de drogas recreativas

- Função digestiva comprometida (inclusive cirurgia gastrointes15 tinal de grande porte anterior).

Das pessoas entrevistadas, 14 eram compatíveis com os critérios de estudo e se dispuseram a participar. Entre as 14, três foram subse-

quentemente excluídas durante o estudo devido à falta de compatibilidade. Entre os 11 voluntários restantes, seis passaram por quarto dias de estudo cada, de modo que os dados foram obtidos para todos os quatro consumíveis na mesma pessoa. Os cinco voluntários restantes foram capazes de participar de três dias de estudo cada.

Os indivíduos foram programados para chegar no mesmo dia da semana em quatro semanas sucessivas durante um período de dois meses.

Os indivíduos foram programados para o mesmo dia da semana para maior compatibilidade de dados. Estes foram instruídos para terem uma boa noite de sono antes de cada dia de estudo, e para comerem o mesmo tipo de desjejum simples em cada dia de estudo.

Na chegada, os voluntários se sentaram em áreas tranquilas distantes uns dos outros, para evitar conversa e produzir um ambiente calmo (não havia perturbações como telefones, campainhas, conversa entre a equipe do laboratório). Os voluntários foram instruídos a permanecerem para-

dos, confortavelmente sentados em uma cadeira, durante uma hora. O movimento foi limitado a andar lentamente até o banheiro, se necessário. Após uma hora, a amostra de sangue da linha de base foi retirada. Imediatamente após a retirada da amostra de linha de base, um consumível foi proporcionado. Os voluntários foram instruídos para permanecerem parados durante toda a duração do experimento. As amostras de sangue foram posteriormente retiradas 30, 60 e 120 minutos após a ingestão do consumível.

Todo dia, na chegada ao laboratório, os voluntários preenchiam um questionário com a avaliação diária das condições gerais. Este questionário foi projetado para identificar qualquer caso para que pontos de dados possam ser eliminados devido a circunstâncias extraordinárias. Os seguintes critérios foram usados para eliminar pontos de dados:

- Falta de sono

- Estimulantes dentro de 2 horas de chegada

- Estresse.

Avaliação de células-tronco circulantes: Em cada ponto de tempo, 5 ml de sangue foram retirados em heparina, e 2 ml de sangue foram retirados em EDTA. Os fracos de sangue foram colocados sobre uma placa oscilante até o uso. O sangue retirado em EDTA foi usado para obter uma contagem de sangue completa (CBC) utilizando um contador Coulter (Micro Diff II, Beckman Coulter). Todas as CBCs foram realizadas dentro de uma hora de retirada de amostra. Todas as CBCs foram realizadas em triplicata.

O sangue heparinizado foi usado para purificação da fração de célula mononuclear de sangue periférico por centrifugação em gradiente, e processado para imunomarcação e citometria de fluxo. Os marcadores de célula-tronco CD34-FITC (clone 8G12) e CD133-PE foram usados para imunofluorescência bicolor. A marcação de todas as amostras com CD34FITC/CD133-PEW foi realizada em triplicata. Controles de isotipo apropriados foram usados em amostras paralelas. Controles positivos para cada doador incluíram CD45 e CD14. As células marcadas foram fixadas em 1% de formalina e adquiridas por citometria de fluxo imediatamente. Arquivos de 200.000 eventos foram coletados em cada amostra. Uma vez que as usadas

para imunomarcação não incluíram a população de granulócito, a aquisição de 200.000 eventos incluiu mais células-tronco do que se todo o sangue tivesse sido usado. O uso de fração de célula mononuclear de sangue periférico permite, desta maneira, a coleta de dados com números maiores de cé5 lulas-tronco, fornecendo um melhor peso estatístico para diferenças observadas em números de célula-tronco.

A marcação de CD14 foi realizada em amostras paralelas, para não interferir na análise de CD34 e CD133. A análise de citometria de fluxo foi realizada utilizando o software CelIQuest Pro (Becton Dickinson).

Os seguintes resultados foram obtidos:

O consumo de SE e LSL resultaram em um aumento no número de células CD34+ circulantes (veja Figura 9), enquanto MGT resultou em uma redução no número de células CD34+ circulantes. Após o consumo de placebo, pequenas alterações não eram estatisticamente significativas. Tan15 to com SE como com LSL inúmeros voluntários mostraram uma tendência a uma redução transitória inicial no número de células CD34+; esta observação foi maior para LSL apesar de não atingir significância. Em seis minutos após o consume, SE (p<0,003) e LSL^p<0,02) deflagrou um aumento significativo no número de células CD34+. Entretanto, MGT deflagrou uma redu20 ção significativa (p<0,03). Em uma parte subsequente da análise de dados, as respostas de cada voluntário a extratos de AFA foram normalizadas para a resposta da mesma pessoa a placebo. Isto foi feito ao subtrair a alteração de porcentagem obtida com o placebo pela alteração de porcentagem obtida com o extrato. Isto foi feito para todos os três consumíveis. Este procedimen25 to não aumentou a magnitude ou significância das respostas; o padrão obtido era similar à Figura 9.

Outra parte da análise de dados concentrada na alteração de porcentagem máxima de cada consumível comparada com placebo. O fundamento lógico desta análise é que a absorção de compostos bioativos, en30 trega em órgãos alvo, e tempo para gerar uma resposta fisiológica quantificável podem ser diferentes dependendo da fisiologia total de cada voluntário. Este método de análise reduz a diferenças em tempos de resposta indi-

vidual e permite uma comparação da extensão de alteração, independente se a alteração máxima foi observada em 30 ou 60 minutos. Baseado neste método um aumento de 24 ±- 5% no número de células-tronco circulantes com SE e uma redução de 24 ± 2% com MGT foram observados. Uma resposta intermediária de 27% e 77%, respectivamente, para SE e MGT foi observada.

O intervalo de tempo para atingir a resposta máxima parece ser superior a algumas semanas. Para evitar um fator de confusão potencial nos dados, a maioria dos estudos foi realizada em amostras de indivíduos que consumiam AFA regularmente. No presente estudo, apenas um indivíduo não era um consumidor regular de AFA. Este indivíduo não mostrou aumento considerável em mobilização de células CD34+. Deveria ser observado que este voluntário foi removido da análise. Visto que havia apenas um único indivíduo que não consumia AFA regularmente, as amostras obtidas do indivíduo não puderam ser usadas para uma análise estatística relevante. Ademais, uma comparação neste tipo de protocolo é o fato que nem todos os indivíduos se mobilizaram de acordo com um período de tempo similar, e desta maneira pode ter ocorrido uma subestimação do pico real de mobilização. A resposta ao placebo mostrou variações, apesar de tais flutuações não atingiu significância estatística. Todavia, estas flutuações parecem ser reais e sugerem que uma melhor compreensão do ciclo diário de CD34+ circulantes podería ser de uso no projeto de estudos futuros.

Este estudo confirmou que SE e LSL, sendo que ambos incluem um extrato aquoso seco enriquecido com um ligante de selectina, são eficazes na mobilização de células-tronco da medula óssea ao aumentar o número de células CD34+ circulantes. Os dados coletados neste estudo mostram que SE aumenta o número de células-tronco circulantes em até 35%.

Tornar-se-á óbvio que os detalhes precisos dos métodos ou composições descritos podem ser variados ou modificados sem que se abandone o espírito da invenção descrita. Reivindica-se que todas tais modificações e variações sejam incluídas no escopo e espírito das reivindicações abaixo.

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição, caracterizada pelo fato de que (a) compreende 1 a 2 gramas de uma composição sólida de uma forma seca de um primeiro extrato aquoso de Aphanizomenon flos aquae em água ou uma solução salina e remoção da matéria sólida, em que o primeiro extrato aquoso é enriquecido para um ligante de L-selectina, e (b) compreende ainda uma segunda composição sólida compreendendo 100 mg a 500 mg de uma forma seca de um segundo extrato de Aphanizomenon flos aquae, em que o segundo extrato é um extrato etanólico de Aphanizomenon flos aquae, e em que o extrato etanólico é produzido pelo processo de:

   colocar uma primeira quantidade de Aphanizomenon flos aquae em contato com 0,1 molar de solução salina tamponada com fosfato ou água durante meia-hora até 12 horas para produzir um extrato aquoso;

   remover o material sólido do extrato aquoso;

   secar o extrato aquoso para produzir uma composição sólida que compreende um ligante de L-selectina;

   incubar uma segunda quantidade de Aphanizomenon flos aquae em 10% de etanol a 50°C, durante uma hora, para produzir um extrato etanólico;

   remover o material sólido do extrato etanólico;

   secar o material sólido do extrato etanólico para produzir uma forma sólida do extrato etanólico; e misturar uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição sólida que compreende o ligante da L-selectina e uma quantidade terapeuticamente eficaz da forma sólida do extrato etanólico; e (c) compreende um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como ciclodextrina, metilcelulose, soro fisiológico, dextrose, glicerol, manitol, lactose, amido ou estearato de magnésio.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido extrato etanólico é produzido ao suspender Aphanizomenon flos aquae seca em 10 a 20 por cento de etanol a 50°C até

   Petição 870180132552, de 20/09/2018, pág. 6/12

   60°C.
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende 1 grama do extrato aquoso seco de Aphanizomenon flos aquae, em que o extrato é enriquecido por um ligante 5 de L-selectina, e 150 mg de um extrato etanólico seco de Aphanizomenon flos aqua.

   Petição 870180132552, de 20/09/2018, pág. 7/12

   ÍP

   1/9 % Controle

   Tempo (horas)