KR20100062140A

KR20100062140A - 푸코이단을 함유하는 골 형성 촉진 및 활성용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20100062140A
Application number: KR1020080120587A
Authority: KR
Inventors: 김세권; 조영숙
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2008-12-01
Filing date: 2008-12-01
Publication date: 2010-06-10
Also published as: WO2010064792A3; US20110301119A1; WO2010064792A2

Abstract

본 발명은 푸코이단을 함유하는 골 형성 촉진 및 활성용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 푸코이단을 유효성분으로 함유하여 알칼리성 포스파타아제 활성 및 오스테오칼신 생산을 증가시키고, 골 형태형성 단백질(BMP-2)의 생산을 증강시키는 효과가 있다.

푸코이단, 골형성성 분화, 알칼리상 포스파타아제, 오스테오칼신, 골 형태형성 단백질-2

Description

푸코이단을 함유하는 골 형성 촉진 및 활성용 약학 조성물{A pharmaceutical composition for stimulating and activating ossification containing fucoidan}

본 발명은 푸코이단을 함유하는 골 형성 촉진 및 활성용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 푸코이단을 유효성분으로 함유하여 알칼리성 포스파타아제 활성 및 오스테오칼신 생산을 증가시키고, 골 형태형성 단백질(BMP-2)의 생산을 증강시키는 골 형성 촉진 및 활성용 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

골다공증은 골 흡수와 골 형성 사이의 불균형으로 인해 골격 질량이 감소되는 것인 반면, 골 항상성에는 골아세포와 파골세포 사이의 균형잡힌 상호작용을 필요로 한다(Ducy et al., 2000; Teitelbaum, 2000). 골 건강을 위한 종래의 약물 및 기능성 식품에는 비스포스페네이트, 칼시토닌, 에스트로겐, 비타민 D 유사체, 이프리플라본 및 이소플라본이 포함된다. 이들은 모두 골 흡수 저해제로서, 파골세포의 작용을 억제함으로써 골 질량을 유지시킨다(Rodan and Martin, 2000). 따 라서 새로운 골 형성을 촉진시킬 수 있고 정착된 골다공증의 특징인 피질 마이크로아키텍춰(trabecular microarchitecture)의 불균형을 바로잡는 만족할만한 골-형성제(동화제)를 보유하는 것이 바람직하다 (Berg et al., 2003 and Ducy et al., 2000).

새로운 골 형성이 주로 골아세포의 기능이기 때문에, 골형성을 조절하는 작용제는 골아세포 계통의 세포 증식을 증가시키거나 또는 골아세포의 분화를 유도함으로써 작용한다(Ducy et al., 2000). 최근의 연구들은 각각 골아세포성 세포 분화 및 골 재생에 대한 설페이트화 단당류(sulfated monosaccharide; SGlc) 및 다당류(polysaccharide; 음이온성 PEC)의 유익한 효과를 제시한 바 있다 (Kim et al., 2007; Naghata et al., 2005).

갈조류들은 다양한 다당류, 즉 알지네이트, 라미나란 및 푸코이단을 생성한다고 알려져 있다(Painter, 1983; Percival, 1967). 이들 다당류들 중, 푸코이단은 주로 대한민국, 중국, 일본 등의 동아시아에서 상업용 해조류서 이용되는 미역(U. pinnatifida), 참다시마(L. japonica)에서 추출되고 있다. 설페이트화 다당류인 푸코이단은 다량의 L-푸코오스 및 설페이트와 더불어 미량의 다른 당류, 예를 들어, 자일로오스, 갈락토오스, 만노오스 및 글루쿠론산을 함유한다(Duarte et al., 2001; Percival, 1967). 최근 들어, 이들의 항산화, 항응혈, 항혈전, 항염증, 항종양 및 항바이러스 생리 활성이 보고된 바 있다(Chevolot et al., 2001; Cumashi et al., 2007; Mourao, 2004; Itoh et al., 1993; Maruyama et al., 2006; Thompson and Dragar, 2004). 그러나 지금까지 골 건강 및 형성에 대한 푸코이단 의 유익한 효과에 대해서는 보고된 바 없다.

따라서 본 발명자들은 상기와 같은 종래의 연구 결과들로부터 착안하여 골아세포 MG-63 세포 분화에 대한 푸코이단의 효과를 밝혀내고, 특히 미역 유래 푸코이단이 각각 초기 단계 및 말기 단계 분화에 대한 표현마커(phenotypic marker)인 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase; ALP)의 활성 및 오스테오칼신(osteoclacin; OC)의 수준을 증진시킬 수 있다는 사실을 연구하고, 골 형성, 리모델링 및 무기화에 대한 중요한 인자인 골 형태형성 단백질-2(bone morphogenic protein-2; BMP-2)의 양성 효과를 연구한 결과 푸코이단의 골아세포 분화에 있어서의 통찰 및 골 건강 보충제로서의 응용 가능성을 찾아내고 본 발명에 이르게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 골 형성 촉진제로서 푸코이단의 신규한 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 푸코이단을 유효성분으로 함유하는 골 형성 촉진 및 활성용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 푸코이단을 유효성분으로 함유하는 골 형성 촉진 및 활성용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적은 미역 유래 푸코이단을 이용하여 인체 골육종 세포주 MG-63를 처리하고, 이들의 세포생존력 분석, 알칼리성 포스파타아제(ALP) 활성 분석, 무기화 분석, 오스테오칼신 및 BMP-2 수준 분석 및 RT-PCR 분석을 통해 푸코이단이 알칼리성 포스파타아제 활성 및 오스테오칼신 생산을 증가시키고, 골 형태형성 단백질(BMP-2)의 생산을 증강킴을 확인함으로써 달성되었다.

본 발명은 푸코이단을 유효성분으로 함유하는 골 형성 촉진 및 활성용 약학 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 푸코이단 함유 조성물은 골 형성 촉진 및 활성을 통해 골다공증 및 골절 등 골 형성과 관련된 질환을 예방 및 치료할 수 있다.

본 발명에 있어서, “유효성분”이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 의약품의 효능·효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군(약리학적 활성성분등이 밝혀지지 않은 생약 등을 포함한다)으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 푸코이단을 함유하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 푸코이단을 유효성분으로 함유하는 골 형성 촉진 및 활성용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 골 형성 촉진 및 활성용 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 내지 95 %, 바람직하게는 1 내지 80 % 중량백분율로 포함한다.

또한, 골 형성 촉진 및 활성을 위한 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

본 발명에 따르면, 푸코이단의 존재가 다양한 단계의 골형성성 분화에서 알칼리성 포스파타아제 활성 및 오스테오칼신 생산의 유의적인 증가를 가져온다. 또한, 푸코이단은 골 형태형성 단백질(BMP-2)의 활성화와 관련이 있는 골 무기화를 촉진시킬 수 있다. 본 발명에 따르면, 푸코이단의 존재가 초기 단계의 골형성성 분화를 촉진시키기 때문에, 본 발명은 푸코이단의 골형성성 분화에 있어 새로운 통찰과 골 건강 보충제에 응용가능성을 제공할 수 있다.

상기한 바와 같이 본 발명에 따른 푸코이단을 함유하는 골 형성용 약학 조성물은 푸코이단을 유효성분으로 함유하여 알칼리성 포스파타아제 활성 및 오스테오칼신 생산을 증가시키고, 골 형태형성 단백질(BMP-2)의 생산을 증강시키는 효과가 있다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

갈조류 미역(Undaria pinnatifida)에서 추출된 푸코이단(총 다당류 : 62.12% 및 황산염 : 34.20%)을 해원 바이오텍사(HAEWON BIOTECH Inc.; Seoul, Korea)에서 구입하였다. 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS), MEM 배지(minimal essential medium), 페니실린 G, 및 스트렙토마이신은 깁코-비알엘(GIBCO-BRL; Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다. BMP-2 ELISA 키트는 알&디 시스템스(R&D Systems; Minneapolis, MN, USA)에서 입수하였다. 오스테오칼신 ELISA 키트는 타카라(Takara; Tokyo, Japan)에서 구입하고, p-니트로페닐 포스페이트 및 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]는 시그마(Sigma; St. Louis, MO)에서 구입하였다. RT-PCR 시약들은 프로메가(Promega; Madison, WI, USA)에서 구입하였다.

모든 데이터는 평균±S.D.로 나타내었다. 결과들의 통계적 비교는 분산 분석법(analysis of variance; ANOVA)을 이용하였다. 대조군과 시험군의 평균 간의 유의적 차이(P<0.05)를 두네트 시험(Dunnett's test)으로 분석하였다.

실시예 1 : 세포 배양

인체 골육종 세포주 MG-63 (CRL-1427)을 ATCC(American Tissue Culture Collection)에서 입수하였다. MG-63 세포를 10% 우태아혈청(FBS)와 항생제(페니실린 G 100 IU/mL 및 스트렙토마이신 100 μg/mL)이 보충된 MEM 배지에서 배양하였다.

실시예 2 : 세포 생존력 분석

포르마잔으로의 미토콘드리아-의존성 환원에 의해 측정된 세포 생존력의 지시자로서 MTT를 이용하였다. 간략하게, 세포를 파종한 후, 지정된 시간 간격으로 다양한 시약 처리하였다. 다양한 처리 후, 배지를 제거하고, 세포를 0.5 mg/mL MTT로 배양하였다. 37℃ 및 5% CO₂에서 3 시간 동안 배양한 후, 상청액을 제거하고, 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 신호를 모니터링함으로써 포르마잔의 형성을 관찰하였다.

실시예 3 : 알칼리성 포스파타아제(ALP) 활성 분석

세포를 96-웰 플레이트에 5X10³ cells/well의 밀도로 파종하고, 24 시간 동안 배양하였다. 시험용 시약을 웰에 가하고, 2 일 동안 계속 배양하였다. 이어서 생리 식염수로 세포를 3 회 세척하고, 0.1% Triton X-100 함유 B [비신코닌산(bicinchoninic acid)] 단백질 분석 시약에서 37℃로 1시간 동안 배양하여 세포 단백질 농도를 측정하였다. 1 M NaOH를 가하여 반응을 중단시키고, 560 nm에서 흡수능을 측정하였다.

세포를 생리 식염수로 3회 세척한 후, 0.1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl₂ 및 15 mM p-니트로페닐 포스페이트를 함유한 pH 10의 0.1 M NaHCO₃-Na₂CO₃ 완충액 중에서 37℃로 1 시간 동안 배양하여 세포 활성을 측정함으로써 적절한 처리 기간 후 세포 중의 알칼리성 포스파타아제 활성을 분석하였다. 1M NaOH를 가하여 반응을 중단시킨 후, 405 nm에서의 흡수능을 측정하였다. 인산염 활성의 단위는 시간 당 1 μm의 p-니트로페놀이 유리되는 효소 활성의 양으로 정의하였다(Eichner et al., 2002).

실시예 4 : 무기화 분석

24-웰 플레이트에서 7일 처리 후 알리자린 레드(Alizarin Red; Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) 염색을 이용하여 무기화도를 측정하였다. 간략하게, 세포를 70% (v/v) 에탄올로 1 시간 동안 고정한 후, 이온화수(pH=4.2) 중 실온 에서 1 시간 동안 40 mM 알리카린 레드 S로 염색하였다. 알리자린 레드 S 용액을 흡출시켜 제거한 후, 오비탈 로테이터(orbital rotator) 상에서 교반세포를 PBS 중에서 15 분 동안 실온으로 교반하였다. 이어서 세포를 신선한 PBS로 1회 세정하고, 10 mM 인산 소듐(pH=7.0) 중에서 10% (w/v) 세틸피리디늄 클로라드로 15 분 동안 탈색시켰다. 추출된 균주를 96-웰 플레이트로 옮기고, 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 562 nm에서의 흡수능을 측정하였다.

실시예 5 : 오스테오칼신 및 BMP-2 수준 분석

오스테오칼신 및 BMP-2 ELISA 키트를 사용하여 각각 오스테오칼신 및 BMP-2 수준을 검출하였다. 간략하게, 세포를 다양한 농도의 푸코이단으로 처리하였다. 세포 배지를 수집하고, 각각 오스테오칼신 및 BMP-2를 측정하였다. 이들 시료를 모노클로날 검출 항체로 코팅된 96-웰 플레이트에 놓고, 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 미결합 물질을 세척용 완충액(50 mM Tris, 200 mM NaCl, 및 0.2% Tween 20)으로 세척한 후, 호스디쉬 퍼옥사이드 공액화된 스트렙토마이신을 가하여 항체에 결합시켰다. 호스디쉬 퍼옥사이드가 시료에 존재하는 단백질의 양에 대하여 착색 강도 비율로서 착색된 용액으로 발색성 기질(테트라메틸벤지딘)의 전환을 촉매화시켰다. 각 웰의 흡수능을 450 nm에서 측정하였다. 결과를 미처리 대조군 (Kuo et al., 2005)과 비교하여 활성 변화 %로서 나타내었다.

실시예 6 : RT-PCR 분석

RT-PCR을 이용하여 BMP-2 mRNA의 발현 수준을 조사하였다. 또한 내부 대조군으로서 GAPDH에 대한 RT-PCR을 수행하였다. TRIzol 시약으로 RNA를 분리하였다. 총 RNA의 분취액(2 μg)을 AMV 역전사효소를 이용하여 cDNA로 역전사시켰다. PCR에 이용된 올리고누클레오타이드는 다음과 같았다: 인체 ALP mRNA에 대하여 5′-CCACGTCTTCACATTTGGTG-3′(정방향 프라이머) 및 5′-AGACTGCGCCTAGTAGTTGT-3′ (역방향 프라이머), 인체 BMP-2 mRNA에 대하여 5′-ATGTTCGCCTGAAACAGAGACCCA-3′ (정방향 프라이머) 및 5′-CTTACAGCTGGACTTAAGGCGTTTC-3′ (역방향 프라이머), 인체 GAPDH에 대하여 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′ (정방향 프라이머) 및 5′-TCCACCACCCTGTTGCTTGTA-3′ (역방향 프라이머), 오스테오칼신에 대하여 5′-CCCAAAGGCTTCTTGTTG-3′ 및 5′-CTGGTAGTTGTTGTGAGCAT-3′, 및 5′-ATGAGAGCCCTCACACTCCTC-3′ (정방향 프라이머) 및 5′GCCGTAGAAGCGCCGATAGGC (역방향 프라이머)(Drissi et al., 1997). 1.5% 아가로스 한천 전기영동에 의해 PCR 산물을 검출하고, 촬영하였다.

상기와 같은 실시예 1 내지 6을 통해 다음과 같은 결과를 얻었다.

푸코이단은 해양 갈조류로부터 유래한 대표적인 설페이트화 다당류의 하나이다. 설페이트화된 다당류, 예를 들어, 글루코사민 설페이트, 키토산 설페이트, 헤파린 및 헤파란 설페이트는 세포 표면 및 세포외 메트릭스와 관련된 거대분자이다(Xiao et al., 2004; Naghata et al., 2005). 이들 다당류는 음으로 고도 충전 된 다당류 사슬을 통해 BMPs를 포함한 다수의 생장 인자와 직접 작용한다. 실제로, 헤파린-친화성 크로마토그래피는 탈염된 골 메트릭스로 제조된 추출물으로부터 BMP 활성을 측정하는데 이용되고 있다(Wang et al., 1990).

상기한 바와 같이, 본 발명에서는, 골 건강 및 무기화에 대한 푸코이단의 유익한 효과를 확인하기 위하여, 미역에서 추출된 푸코이단이 각각 초기 단계 및 말기 단계 분화에 대한 표현마커(phenotypic marker)인 알칼리성 포스파타아제(ALP)의 활성 및 오스테오칼신(OC)의 수준을 증가시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. 또한 골 형성 및 무기화에 대한 중요한 인자인 골 형태형성 단백질-2(bone morphogenic protein-2; BMP-2)의 생산에 대한 푸코이단의 양성 효과를 연구하였다.

이를 통해, 우선 MTT 분석에 의해 MG-63의 세포 증식에 대한 다양한 농도의 푸코이단의 영향을 측정하였다. 그 결과, 푸코이단이 세포주 처리 24 시간 후 이용된 농도 (10 g/mL 내지 250 g/mL)에서 세포 증식에 유의적인 영향을 미치지 못했음이 나타났다(도 1 참조). 또한 푸코이단 100 g/mL 처리가 72 시간 동안 세포 생존력에 대해 유의적인 효과를 나타내지 않았다(도 2 참조).

골아세포의 성숙에 대한 푸코이단의 효과를 MG-63 세포에서 알칼리성 포스파타아제 활성을 측정하여 연구하였다. 그 결과, 푸코이단이 각 세포를 처리한 지 48 시간 후 알칼리성 포스파타아제 활성 및 mRAN 발현을 용량의존적 방식으로 증가시켰다(도 3 참조).

또한 골아세포-형 세포의 최종 분화에 대한 푸코이단의 효과를 배양 배지에 서 골아세포의 농도를 측정함으로써 연구하였다. 오스테오칼신은 골아세포에 의해 배양 배지로 분비되는 골아세포의 최종 세포 분화에 대한 특이적 세포 마커 단백질이다. 푸코이단으로 48 시간 동안 처리된 MG-63에서 오스테오칼신 합성이 유의적으로 증가되었다. 더욱이 푸코이단이 농도-의존적 방식으로 오스테오칼신 합성을 촉진하였다(도 4 참조).

알리잘린 레드 S 염색 데이터(도 5 참조)에 따르면, 푸코이단이 세포 중 하이드로아파타이트(hydroapatite)의 양을 증가시켰다. 미네랄 세포내 수준의 양이 농도-의존적 방식으로 보다 많았다.

본 발명에서는 RT-PCR을 이용하여 골 형태형성 단백질 유전자의 발현 및 골 형태형성 단백질 ELISA 키트를 이용하여 푸코이단의 존재 또는 부재 하에서 골 형태형성 단백질 합성을 조사하였다. 그 결과, 푸코이단이 MG-63 세포에서 BMP-2 mRNA 및 단백질 합성의 유의적 증가를 야기시켰다. 푸코이단 처리 24 시간 후, BMP-2의 생산이 용량-의존적 방식으로 유의적으로 증가하였다(도 6 참조). 또한, 푸코이단의 존재 및 부재 하에서 MG-63 및 세포에서 RT-PCR을 이용하여 BMP-2 유전자의 발현을 조사하였다.

골 형태형성 단백질(BMP)는 골 형성 및 리모델링 과정에서 중요한 역할을 한다(Sykaras and Opperman, 2003). 골아세포 분화의 촉진이 주로 알칼리성 포스파타아제 및 오스테오칼신의 증진된 발현을 특징으로 한다는 사실이 밝혀진 바 있다(Xiao et al., 2004). 특히, 재조합 인체 골 형태형성 단백질(rhBMP)-2은 골 형성에서 중요한 역할을 하고, 골절 치료를 증진시킨다고 나타난 바 있다. 골절 치 료에 있어, 골절부 주위 골형성 세포, 섬유아세포-형 방추 세포 및 연골 골화에 관여하는 섬유아세포에서 BMP 수용체 발현이 증가되었다(Onishi T, et al., 1998). 흥미롭게도, BMP-2에 의한 골-치료 이점의 촉진이 중간엽 세포(mesenchymal cell) 및 간세포(osteoprogenitor cell)의 증식 및 분화를 촉진시키는 능력에 기인하며, 이들 모두는 혈관신생과 관련이 있다. 골 형태형성 단백질(BMP)는 TFG-β 상과의 일원으로서, 배 발생(embryonic development)을 조절하고, 발생단계 조직에서 정규 장소 이외의 골 형성을 유도한다 (Urist, 1965; Hogan, 1996; Hollevilleet al., 2003). 골아세포 계통의 세포에서, BMP 2, 4, 및 7은 알칼리성 포스파타아제, 제1형 콜라덴 및 분화된 골아세포와 일치하는 표현형인 골상의 다른 비콜라겐성 골 단백질의 발현을 유도한다(Cheifetz et al., 1996; Li et al., 1996; Cheng et al., 2003).

도 1은 MG-63 세포의 생존력에 대한 용량-의존적 방식으로 푸코이단의 효과를 나타낸 도이다.

도 2는 MG-63 세포의 생존력에 대한 시간-의존적 방식으로 푸코이단(100 μg/mL)의 효과를 나타낸 도이다.

도 3은 다양한 농도의 푸코이단으로 48시간 처리한 세포에 대한 알칼리성 포스파타아제 분석 결과를 나타낸 도이다.

도 4는 MG-63 세포의 오스테오칼신 분비에 대한 푸코이단의 효과를 나타낸 도이다.

도 5는 배양 후 7일 동안 알리자린 레드-S 염색 결과, 대표적인 염색된 세포 배양액 사진이다.

도 6은 푸코이단의 BMP-2 수준 증가 효과를 나타낸 도이다.

Claims

푸코이단을 유효성분으로 함유하는 골 형성 촉진 및 활성용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 골 형성 촉진 및 활성을 통해 골다공증 및 골절 질환을 예방 및 치료하는 것을 특징으로 하는 조성물.
푸코이단을 유효성분으로 함유하는 골 형성 촉진 및 활성용 건강기능식품.
제3항에 있어서, 상기 건강기능식품이 골 형성 촉진 및 활성을 통해 골다공증 및 골절 질환을 예방하는 것을 특징으로 하는 조성물.