CN102007110B

CN102007110B - 用于预防、治疗骨健康相关疾病的黄酮醇化合物、榆树的生物活性提取物/级分及其化合物

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Publication number: CN102007110B
Application number: CN200980113792.0A
Authority: CN
Inventors: R·莫尔亚; P·拉瓦特; K·沙兰; J·A·希迪奎; G·斯瓦恩卡; G·米沙; L·马尼卡瓦萨加姆; G·K·杰恩; K·R·阿尔亚; N·查托帕德亚
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2008-03-05
Filing date: 2009-03-03
Publication date: 2016-09-07
Anticipated expiration: 2029-03-03
Also published as: WO2009110003A8; JP5693243B2; JP5957058B2; US8669232B2; ES2546864T3; US20110112042A1; KR20100126462A; JP2015038134A; WO2009110003A1; EP2265595B1; JP2011513390A; CN102007110A; EP2265595A1; US20140213535A1

Abstract

本发明提供可用于控制或预防或治疗骨疾病的来自榆树的黄酮醇化合物和生物活性提取物/级分及其提取方法。所述提取物/级分包含通式2的标记化合物，K058：R₁＝R₂＝OH，K012：R₁＝R₂＝OH，2，3双键，K068：R₁＝R₂＝H，K100：R₁＝OH，R₂＝H，其中，醇提取物中的标记化合物K012、K058、K068、K100的范围分别为6.7‑12％、1.7‑4.5％、0.6‑1.2％、1.7‑4.5％。根据本发明的另一方面，提供了包含上述化合物的药物组合物。本发明还提供一种通过口服、静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内途径施用所述药物组合物治疗骨疾病的方法。

Description

用于预防、治疗骨健康相关疾病的黄酮醇化合物、榆树的生物活性提取物/级分及其化合物

技术领域

本发明涉及药物组合物领域，其提供从天然来源分离的新的黄酮醇化合物、新的植物提取物、其级分(fraction)和纯化合物，它们可用于预防和/或治疗与依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调相关的各种医学适应症，优选地用于预防或治疗在人类和动物中引起的依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，以及在人类和动物的骨骼生长和健康过程中达到峰值骨量(PBM)。特别地，本发明还涉及由榆科(Ulmaceae)植物榆树(Ulmuswallichiana)制备生物活性提取物、级分和分离纯化合物的方法，其药学上可接受的盐和组合物是本发明的重要方面。

发明背景

已被定义为“低骨量状态”的骨质疏松症是社会上的一个主要的老龄化问题。骨质疏松症是特征为骨组织微细结构损伤的代谢疾病，导致人口老年成员的骨脆性增加和随后的骨折风险增加。骨质疏松骨折的发生最常见于脊柱、髋关节、末端桡骨和肋骨。相比男性，女性中的风险较高，且在50岁后急剧增加。导致骨质疏松症的因素包括家族史、遗传因素、激素因素、营养不足和某些药物的摄入、不运动(immobility)和疾病。患有严重骨质疏松症的个体的生活质量受到严重影响。已知50岁以上的＞50％的女性和30％的男性受到影响。在女性中，在绝经后也立即有加速的骨质损失率并且持续不等的年数。

南亚妇女中，达到低PBM的普遍程度和骨质疏松症之间存在公认的联系(S.Adami.Osteoporosis Int.，1：S27-30，1994)。PBM被定义为由于正常增长而达到的最高骨量水平。对于骨健康，青春期是整个生命期间最关键的时期，因为超过一半的PBM在青少年期间积累。在生命的这较早几年中，骨形成大于骨再吸收，因此骨量增加。在成年早期达到的PBM是至少直至70岁的骨骼脆弱的重要决定因素(L.A.Soyka，W.P.Fairfiled，A.Klibanski.J Clin Endocrinol Metab，11：3951-3963，2000)。在达到PBM之后，再吸收快于形成，因此骨量减少。虽然逐渐的骨质损失对于老化是正常的，但是正是那些没有达到最佳PBM者和/或骨质损失加速者具有最大的骨质疏松风险。此外，低PBM容易增加脆弱性骨折的风险。

因此，由于在年轻时具有高PBM的个体可能在老年时具有高骨量，在骨骼生长时增加PBM的药剂是预防骨质疏松症的理想的目标。完成线性生长后，PBM出现数年，因为骨矿物质增加在这个时期后继续，虽然达到PBM的精确时间不确定，且在骨骼部位之间各不相同。股骨的面骨量密度(BMD)在20岁左右达到峰值，而最大总骨量发生于6-10年后，恰好在生长激素(GH)的合成代谢作用停止之后。

大部分用于骨质损失疾病的药物制剂包括钙、维生素D及其类似物、降钙素、二膦酸盐、雷洛昔芬、激素替代疗法(HRT)等，它们通过降低骨再吸收率从而减缓骨质损失率而起作用。这种抗再吸收剂的适时施用阻止骨损失。

激素替代疗法尽管可有效预防妇女卵巢切除或绝经期后的骨质损失，但与以下疾病的风险增加有关：子宫内膜增生和癌[Grady，D.Grebretsadik，T.Ernestwr，V.Petitti，D.Gynecol.85，304-313(1995)，Beresford S.A.Weiss，N.S.Voigt，L.F.McKnight，B.Lancet 349，458-461(1997)]、乳腺癌[Riggs，L.Hartmann，L.C.J.Med.348，618-629，(2003)]和血栓栓塞性疾病[Delmas，P.D.Lancet 359，2018-2026(2002)]。

钙治疗的副作用是肾结石的发展。使用降钙素的主要缺点是成本高。快速抗药反应(Tachyphylaxis)可能在降钙素治疗的一些个体中发生。

二膦酸盐吸收差，并可能导致胃肠道刺激、腹泻和便秘。据报道，雷洛昔芬增加潮热、深静脉血栓形成、肺栓塞和腿抽筋的发生率 [Clemett，D.；Spencer，C.M.Drugs 60，380-409(2000)]。

与达到PBM有关的因素包括先天性、饮食、激素、身体活动、生活方式、药物和疾病。目标在于提高PBM的治疗干预仍然仅限于控制如雌激素状态、膳食钙摄入和身体活动等因素。钙摄入量似乎与所谓的临界摄入量(1000毫克/天)有关，但较高的限额似乎并没有提供额外的优势。运动只影响机械应力下的骨骼区域。雌激素施用只在特征为严重雌激素过少(hypoestrogenism)的情况下是可行的。显然，营养缺乏是南亚人中、特别是那些在生命的后期更容易出现骨质损失的女性中PBM不足的主要原因之一。因此，促进PBM的药剂对于骨损失疾病具有治疗意义。

对于这些疗法的使用，它们的相关副作用表明对于预防和治疗骨质疏松症和不能达到PBM需要替代方案。

传统医学是在将现代科学应用于健康之前在人类社会中存在的古老的医学实践。传统医学作为初级卫生保健来源的重要性由世界卫生组织(WHO)在1976年通过在全球提出其传统医学计划而首次正式承认。在传统医学中，有许多具有治疗骨疾病的潜力的天然粗制药物。然而，除了依普黄酮(ipriflavone)(已临床用于这种适应症的一种天然的产品衍生物)之外，没有报道更多的评估其可能的发展和使用的实验室工作[Fujita，T.；Yoshikawa，S.；Ono，K.；Inoue，T.；Orimo，H.J.Clin.Exp.Med.138，113-141(1986)，Passeri，M.；Biondi，M；Costi，D.；Bufalino，L.；Castiglione，g.N.；DiPeppe，C；Abate，G.Bone Miner.19(Suppl.1)，S57-62(1992)]。据认为，草药容易获得、更便宜且比化学合成药物更安全。在印度，阿育吠陀(ayurvedic)医学在印度出现奥义书(Upanishad)、佛教和其他学派的哲学的过程中出现。草药在阿育吠陀医学中发挥重要作用。一种这样的阿育吠陀草药是榆树Planchon。在Kumaon和附近，传统治疗师使用这种植物用于促进骨折愈合[Gaur，R.D.Flora of District Garhwal，North West Himalaya.Trans Media，Srinagar(Garhwal)，India，1999，第86页；Arya，K.R.；Agarwal，S.C.Indian J.TraditionalKnowledge，印刷中]，但对于骨质疏松症和总体骨健康(osteo-health)及相关疾病的影响并没有科学探索。

因此，迫切需要发现和开发有希望的草药产品或基于单一生物活性分子的药物或植物起源的纯和生物活性分子的混合物，其在实验动物和人类中显示有希望的骨合成代谢或骨形成活性。榆树是一个用于研究和探讨有关其提取物、级分和纯生物活性标记成分的骨形成响应的真正潜力的合适的例子。实验表明，其粗提取物、丙酮可溶级分和从该提取物和级分分离的纯化合物显示有希望的骨形成活性。

榆树Planchon属于榆科，分布于从阿富汗至尼泊尔的喜马拉雅山脉[Jain，S.K编著的Dictionary of Indian Folk Medicine andEthnobotany，Deep Publications，Paschim Vihar，New Delhi，India，1991，第183页]。该植物的叶子用作饲料，树皮产生强力纤维。在印度，这种植物在Kumaon和Garhwal Himalaya发现，在当地被称为Chamarmou，是可长到35米高的落叶树。到目前为止，对这种植物还没有进行化学和药理学研究。

发明目标

本发明的主要目标是从榆树制备可用于控制或预防或治疗骨疾病的新的化合物、生物活性提取物/级分。

本发明的另一目标是确定生物活性提取物/级分的标记化合物。

本发明的再另一目标是提供分离各成分的方法。

本发明的又另一目标是提供一种药物组合物，其用于预防或治疗在人类和动物中引起的依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，以及在人类和动物的骨骼生长和健康过程中达到峰值骨量(PBM)。

发明概述

本发明涉及药物组合物领域，其提供从天然来源分离的新的黄酮醇化合物、新的植物提取物、其级分和纯化合物，它们可用于预防和/或治疗与依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调相关的各种医学适应症，优选地用于预防或治疗在人类和动物中引起的依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，以及在人类和动物的骨骼生长和健康过程中达到峰值骨量(PBM)。特别地，本发明还涉及由榆科植物榆树制备生物活性提取物、级分和分离纯化合物的方法，其药学上可接受的盐和组合物是本发明的重要方面。

附图说明

图1：显示从榆树茎皮提取、分级和分离粗制提取物和纯级分的流程图。

图2：榆树的乙醇提取物降低大鼠中的Ovx诱导的骨质损失。在切离的骨中通过DEXA测量BMD(骨量密度)。用750mg/kg体重的C002治疗90天的Ovx大鼠与用载体(对照)治疗的Ovx大鼠和假手术(sham operated)的大鼠比较。(A)股骨球(Femur global)，(B)股骨颈(femur neck)，(C)股骨轴(femur shaft)，和(D)第四腰椎(fourthlumber vertebra)(与假手术大鼠的BMD相比，***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05；与ovx对照的BMD相比，a-P＜0.001，b-P＜0.01，c-P＜0.05)。

图3：在子宫水平上，榆树的乙醇提取物在大鼠中不是雌激素性的。用750mg/kg体重的C002治疗90天的大鼠的子宫重量与对照假手术的大鼠和Ovx大鼠比较。与假手术对照大鼠的子宫重量相比，***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05；与ovx大鼠的子宫重量相比，c-P＜0.001，b-P＜0.01，a-P＜0.05。

图4：榆树的乙醇提取物和级分促进未成熟大鼠的PBM。在切离的骨中通过DEXA测量BMD(骨量密度)。(A)用750mg/kg的C002和50mg/kg的914/F006(914/C002的级分)治疗的生长的雌性大鼠股骨与用载体(对照)治疗的大鼠比较。(B)对照大鼠和用750mg/kg的914/C002治疗的大鼠的第四腰椎。(***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05)。

图5：榆树的乙醇提取物和级分增加未成熟大鼠中的骨祖细胞。用750mg/kg的914/C002治疗的生长的雌性大鼠的BMC(骨髓细胞)与用载体(对照)治疗的大鼠比较。(A)碱性磷酸酶试验(对于成骨细胞的分化)，(B)茜素红-S染色的细胞的显微照片(对于成骨细胞的矿化作用)，和(C)提取后茜素红染色的量化(***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05)。

图6：来自榆树的4种纯化合物在体外促进颅骨成骨细胞的分化。用1和100nM浓度的K012、K058、K068和K100处理颅骨成骨细胞，并定量ALP(碱性磷酸酶)的产生。***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05；N＝3。

图7：来自榆树的4种纯化合物在体外促进颅骨成骨细胞的矿化。用1和100nM浓度的K012、K058、K068和K100处理颅骨成骨细胞。(A)茜素红-S染色的成骨细胞的显微照片。(B)提取后茜素红染色的量化(***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05)。(C)通过von Kossa法染色的成骨细胞的显微照片。

图8：K058促进颅骨成骨细胞的增殖。用1和100nM浓度的K058处理颅骨成骨细胞，并进行BrdU细胞增殖试验。***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05；N＝3。

图9：来自榆树的4种纯化合物在体外促进BMC(骨髓细胞)的矿化。用1和100nM浓度的K012、K058、K068和K100处理BMC，并进行矿化。(A)茜素红-S染色的细胞的显微照片。(B)提取后茜素红-S染色的量化(***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05)。

图10：K068和K100抑制3T3-L1鼠的前脂肪细胞的成脂分化。(A)用1μM、100nM和1nM浓度的K068和K100处理3T3-L1细胞，并进行油红O染色。提取和量化染色。***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05；N＝3。(B)在用100nM和1nM浓度的K068和K100处理3T3-L1前脂肪细胞8天(脂肪细胞分化的时间)后，各种脂肪细胞分化特异性基因的半定量RT PCR。GAPDH用作RNA负载对照。三个独立实验的代表性的凝胶图片具有类似的结果。

图11：K058提高各种成骨细胞特异性基因的mRNA水平。在不同时间点用100nM的K058处理颅骨成骨细胞后，各种成骨细胞 mRNA的半定量RT PCR。GAPDH用作内部负载对照。三个独立实验的代表性的凝胶图片具有类似的结果。

图12：K058和K012在体外不具备雌激素性(estrogenicity)和抗雌激素性。用17β-雌二醇处理的Ishikawa细胞刺激ALP的产生。(A)相比对照，用10^-8M的17β-雌二醇处理的细胞中的ALP(碱性磷酸酶)强劲增长。不同浓度的K058、K012和雷洛昔芬没有任何反应。(B)在10^-8M的17β-雌二醇的存在下，用各种浓度的K012、K058和雷洛昔芬处理的细胞中的ALP水平。

图13：K058降低大鼠中的Ovx诱导的骨损失。在切离的骨中通过DEXA测量BMD。用1.0和5.0mg/kg的K058治疗90天的Ovx大鼠与用载体(对照)治疗的Ovx大鼠和假手术的大鼠比较。(A)股骨球，(B)股骨颈，(C)股骨轴，(D)第四腰椎，和(E)胫骨头(与假手术大鼠的BMD相比，***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05；与ovx对照的BMD相比，a-P＜0.001，b-P＜0.01，c-P＜0.05)。

图14：在子宫水平上，K058在大鼠中不是雌激素性的。用1.0和5.0mg/kg体重的K058治疗90天的大鼠的子宫重量与对照假手术的大鼠和Ovx大鼠的子宫重量比较。与假手术对照大鼠的子宫重量相比，***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05。与ovx大鼠的子宫重量相比，c-P＜0.001，b-P＜0.01，a-P＜0.05。

图15：K058促进未成熟大鼠中的PBM。在切离的骨中通过DEXA测量BMD。用5mg/kg的K058治疗的生长的雌性大鼠与用载体(对照)治疗的大鼠比较。显示股骨轴中的BMD。(***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05)。

图16：K058增加未成熟大鼠中的骨祖细胞。用5mg/kg的K058治疗30天的生长的雌性大鼠的BMC与用载体(对照)治疗的大鼠比较。(A)碱性磷酸酶试验，(B)茜素红-S染色的细胞的显微照片，和(C)提取后茜素红-S染色的量化(***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05)。

图17：K012降低大鼠中的Ovx诱导的骨质损失。在切离的骨中通过DEXA测量BMD。用1.0和5.0mg/kg的K012治疗90天的Ovx 大鼠与用载体(对照)治疗的Ovx大鼠和假手术大鼠比较。(A)股骨颈，(B)胫骨球，(C)胫骨头，和(D)胫骨-腓骨分离点，(E)腰椎球，和(F)第二腰椎(与假手术大鼠的BMD相比，***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05；与ovx对照的BMD相比，a-P＜0.001，b-P＜0.01，c-P＜0.05)。

图18：在子宫水平上，K012在大鼠中不是雌激素性的。用1.0和5.0mg/kg体重的K012治疗90天的大鼠的子宫重量与对照假手术的大鼠和Ovx大鼠的子宫重量比较。(与假手术对照大鼠的子宫重量相比，***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05。与ovx大鼠的子宫重量相比，c-P＜0.001，b-P＜0.01，a-P＜0.05。)

发明详述

因此，本发明提供了通式1的黄酮醇化合物，其中，R1和R2选自H、OH。

K058：R₁＝R₂＝OH

K100：R₁＝OH，R₂＝H

在本发明的一种实施方式中，通式1的化合物是从榆树中分离的。

在本发明的另一实施方式中，所述化合物可用于骨疾病的治疗。

因此，本发明提供可用于控制或预防或治疗骨疾病的来自榆树的生物活性提取物/级分，其中，所述提取物/级分包含通式2的标记化合物

K058：R₁＝R₂＝OH

K012：R₁＝R₂＝OH，2，3双键

K068：R₁＝R₂＝H

K100：R₁＝OH，R₂＝H

通式2

其中，标记化合物K012、K058、K068、K100的范围分别为6.7-12％、1.7-4.5％、0.6-1.2％、1.7-4.5％。

在本发明的一种实施方式中，提取物可从包含标记化合物K012(6.7-9％)、K058(3.3-4.5％)、K068(0.6-0.7％)和K100(1.7-2.6％)的榆树的醇提取物获得。

在本发明的另一实施方式中，丙酮可溶级分从包含标记化合物K012(7.9-12％)、K058(1.7-3.0％)、K068(0.7-1.2％)和K100(2.5-4.5％)的醇提取物获得。

在本发明的又另一实施方式中，醇级分/丙酮可溶级分在雌激素缺乏时具有骨保护作用(bone sparing action)。

在本发明的再另一实施方式中，醇级分通过提高骨髓中的骨祖细胞增强达到PBM。

在本发明的一个实施方式中，生物活性提取物/级分可以从选自榆树的茎皮、小枝的植物部分获得。

从榆树获得的生物活性提取物/级分或其通式1的标记化合物，单独或其组合，用于控制或预防或治疗骨疾病。

醇提取物的有效剂量的范围可为500-750mg/kg，丙酮可溶级分的范围为25mg/kg至100mg/kg。

K058：R₁＝R₂＝OH

K012：R₁＝R₂＝OH，2，3双键

K068：R₁＝R₂＝H

K100：R₁＝OH，R₂＝H

通式2

通式2的药学上可接受的盐可包括钠盐、钾盐、钙盐、草酸盐、富马酸盐(fumerate)、琥珀酸盐和酒石酸盐。

在用0.1nm至1.0μM的浓度处理的颅骨成骨细胞中，通式2的化合物K012、K058、K068、K100在ALP活性方面显示比对照(载体)提高70％至100％(图6)。

在用K012、K058、K068、K100处理的成骨细胞中，发现通式2的化合物比对照(载体)增加10％至25％的新生钙沉积(图7A和B)。

式1的化合物增强BMC的矿化，BMC的矿化是其在骨骼生长和维持中的成骨作用所需的。

式1的化合物可以以0.25-1.0(K068)：1.0-5.0(K100)：2.5-7.5(K058)：5.0-12.5(K012)的比例结合使用。

式2的化合物K012、K058促进成骨细胞的增殖、分化和矿化。

式2的化合物K068和K100促进成骨细胞的分化、矿化，且在3T3L1细胞系中具有抗成脂活性。

通式1的化合物K058通过上调促进成骨细胞功能和抑制破骨细胞功能的各种基因的合成发挥成骨作用。

10nM至1.0μM浓度的式1的化合物K058刺激颅骨成骨细胞半汇合培养物(semi-confluent culture)的BrdU掺入(细胞增殖的量度)达25％至75％(图8)。

式1的化合物K058通过上调促进成骨细胞功能和抑制破骨细胞功能的各种基因的合成发挥成骨作用。

因此，本发明提供一种药物组合物，其单独或组合地包含有效量的来自榆树的生物活性提取物/级分或其通式2的标记化合物，任选地还包含一种或多种药学上可接受的添加剂、载体和稀释剂。

在本发明的一个实施方式中，所述组合物包含：单独或组合的选自通式2代表的K012、K058、K068和K100的化合物，任选地还包含一种或多种药学上可接受的添加剂、载体和稀释剂。

在本发明的另一实施方式中，使用的稀释剂可选自淀粉、乳糖、磷酸二钙。

在本发明的一个实施方式中，润滑剂形式的药学上可接受的添加剂可以选自单独或适当组合的滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或steorotes、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠或任何其他类似性质的成分。

在本发明的又另一实施方式中，对于醇提取物以至少500至750mg/Kg体重、对于丙酮可溶级分以25至100mg/Kg体重的单位剂量施用所述的组合物。

在本发明的一种实施方式中，醇提取物(C002)源自榆树，在雌激素缺乏时具有骨保护作用，在子宫水平上没有雌激素拮抗作用，在发育的雌性大鼠中通过增加骨髓中的骨祖细胞增强达到PBM。

治疗受试者的骨疾病的方法，其中，所述方法包括向需要的受试者施用药物组合物的步骤。

在本发明的再另一实施方式中，组合物可以通过口服、静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内途径施用。

因此，本发明提供了由榆树制备提取物/级分和化合物的方法，其中，所述方法包括：

(a)获得榆树植物，

(b)粉碎植物材料，

(c)在室温下用质子溶剂提取粉碎的植物材料，

(d)过滤提取物，

(e)减压浓缩提取物，

(f)用己烷研磨提取物，以除去非极性组分，

(g)真空干燥残留物以获得自由流动的粉末而产生所需的提取物，

(h)用水溶解步骤(g)中获得的提取物，

(i)通过添加正丁醇沉淀水提取物，

(j)过滤白色沉淀以获得K058，

(k)用甲醇和乙酸乙酯的混合物结晶化合物，

(l)过滤化合物，

(m)干燥化合物以获得自由流动白色粉末状的K058，

(n)浓缩滤液并用丙酮研磨，

(o)通过常规的色谱方法从丙酮可溶级分分离化合物K012、K068和K100，

(p)量化提取物和丙酮可溶级分中的K058、K012、K068、K100。

在本发明的一种实施方式中，用于提取的醇选自甲醇、乙醇、丙醇或其适当组合。在本发明的另一实施方式中，用于研磨的溶剂可选自丙酮、乙基甲基酮、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇或其适当组合。

本发明提供了一种从天然来源提取、分级和分离纯化合物的方法，所述化合物用于预防或治疗与在人类和/或动物中引起的依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征相关的各种医学适应症的症状。

制备榆树提取物的方法包括用醇提取植物材料，通过用己烷研磨去除脂肪非极性组分。

这样获得的提取物可用作营养产品、食品补充剂或药物组合物，且可以以任何适于口服的剂型制备。

从榆树提取物中分离有效成分的方法包括：用水溶解提取物和用正丁醇沉淀化合物。可替代地，从该方法得到的化合物可以从水基溶液获得。由此获得的活性化合物可用作营养产品、食品补充剂或药物组合物，且可以以任何适于口服的剂型制备。

预防或治疗本文提到的失调或疾病状态的方法包括向需要这种治疗的个人或任何其他哺乳动物或任何其他动物施用治疗有效量的本发明的一种或多种药剂。

施用本发明的药剂或药学上可接受的盐或其与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂等的药学上可接受的组合物的剂量方案和给药模式根据本文所述的失调或疾病状态的类型而变化，且由有关医生判断。

本发明的药剂或药学上可接受的盐或其与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂等的药学上可接受的组合物可以以如下剂量有效施用：0.1mg至5000mg，更优选0.5至1000mg，或再更优选1mg至500mg，每周一次或每两周一次，或每天一次或一天两次或一天三次或更细分的剂量。

这种剂量可以通过任何途径施用，例如，口服、全身、某一部位的或某一局部的输送，例如、静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、皮肤内、口腔、鼻内、吸入、阴道、直肠、透皮或任何其他合适的方法，以任何常规的液体或固体剂型来实现本发明的化合物或药学上可接受的盐或其与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂等的药学上可接受的组合物的常规输送、控制输送或靶向输送。

本发明的药剂或药学上可接受的盐或其药学上可接受的组合物的一种优选给药方式是口服。口服组合物一般由本发明的药剂或其药学上可接受的组合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂组成。

口服组合物，如片剂、丸剂、胶囊、粉剂、颗粒剂等，可包含任一种以下药学上可接受的赋形剂：

1.稀释剂，如单独或适当组合的乳糖、甘露醇、山梨醇、微晶纤维素、蔗糖、柠檬酸钠、磷酸二钙或任何其他类似性质的成分；

2.粘合剂，如单独或适当组合的黄蓍胶(gum tragacanth)、阿拉伯胶、甲基纤维素、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉或任何其他类似性质的成分；

3.崩解剂，如单独或适当组合的琼脂-琼脂、碳酸钙、碳酸钠、硅酸盐、藻酸、玉米淀粉、马铃薯木薯淀粉、羧甲基淀粉钠(primogel) 或任何其他类似性质的成分；

4.润滑剂，如单独或适当组合的硬脂酸镁、硬脂酸钙或steorotes、滑石、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠或任何其他类似性质的成分；

5.助流剂，如单独或适当组合的胶态二氧化硅或任何其他类似性质的成分；

6.甜味剂，如单独或适当组合的蔗糖、糖精或任何其他类似性质的成分；

7.芳香剂，如单独或适当组合的薄荷、水杨酸甲酯、橙味剂、香草味剂或任何其他药学上可接受的香味剂；

8.润湿剂，如单独或适当组合的十六醇、甘油单硬脂酸酯或任何其他药学上可接受的成分；

9.吸收剂，如单独或适当组合的高岭土、膨润土粘土或任何其他药学上可接受的成分；

10.溶液阻滞剂，如单独或适当组合的蜡、石蜡或任何其他药学上可接受的成分。

因此，本发明寻求克服与治愈和控制依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，优选预防或治疗在人类和动物中引起的依赖或不依赖雌激素的疾病，尤其是骨健康失调或综合征相关的现有问题。本发明还寻求在青春期发生的骨骼生长过程中促进达到峰值骨量。本发明所述的来自榆树的粗提取物和丙酮可溶级分和纯化合物K012、K058、K068和K100可用于控制、预防、治疗和治愈依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，优选预防或治疗在人类和动物中引起的依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，以及在人类和动物的骨骼生长和健康过程中达到PBM。

本发明的一个主要目标是提供药学上可接受形式的来自榆树的粗提取物，以加强其在以下方面的应用潜力：控制或预防或治疗或治愈依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，优选预防或治疗在人类和动物中引起的依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，和在人类和动物的骨骼生长和健康过程中达到PBM。

本发明的另一目标是提供药学上可接受形式的来自榆树的丙酮可溶级分，以加强其在以下方面的应用潜力：控制或预防或治疗或治愈依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，优选预防或治疗在人类和动物中引起的依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，和在人类和动物的骨骼生长和健康过程中达到PBM。

本发明的再另一个目标是提供药学上可接受形式的来自榆树的单独的纯化合物，以加强其在以下方面的应用潜力：控制或预防或治疗或治愈依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，优选预防或治疗在人类和动物中引起的依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，和在人类和动物的骨骼生长和健康过程中达到PBM。

本发明的又另一个目标是提供药学上可接受形式的源自榆树的两种或两种以上纯化合物的适当比例的混合物，以加强其在以下方面的应用潜力：控制或预防或治疗或治愈依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，优选预防或治疗在人类和动物中引起的依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，和在人类和动物的骨骼生长和健康过程中达到PBM。

因此，本发明通过本发明所述的工艺和方法，提供药学上可接受形式的来自榆树的粗提取物或丙酮可溶级分或单独的纯化合物或两种或两种以上纯化合物的适当比例的混合物，以加强其在以下方面的应用潜力：控制或预防或治疗或治愈依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，优选预防或治疗在人类和动物中引起的依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，和在人类和动物的骨骼生长和健康过程中达到PBM。

在本发明的一种实施方式中，可用于控制或预防或治疗或治愈依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，优选预防或治疗在人类和动物中引起的依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，和在人类和动物的骨骼生长和健康过程中达到PBM的粗提取物，由榆树植物的茎皮和小枝制备。

在本发明的另一实施方式中，可用于控制或预防或治疗或治愈依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，优选预防或治疗在人类和动物中引起的依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，和在人类和动物的骨骼生长和健康过程中达到PBM的丙酮可溶级分，由从榆树植物的茎皮和小枝制备的粗提取物制备。

在本发明的再另一实施方式中，可用于控制或预防或治疗或治愈依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，优选预防或治疗在人类和动物中引起的依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，和在人类和动物的骨骼生长和健康过程中达到PBM的单独的纯化合物，由榆树植物的茎皮和小枝的粗提取物或丙酮可溶级分获得。

在本发明的再另一实施方式中，可用于控制或预防或治疗或治愈依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，优选预防或治疗在人类和动物中引起的依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，和在人类和动物的骨骼生长和健康过程中达到PBM的榆树粗提取物或丙酮可溶级分中的单独纯化合物的比例和绝对浓度，使用基于HPLC的定量方法获得。

在本发明的再另一实施方式中，榆树的粗提取物或丙酮可溶级分中的单独的纯化合物在体外和体内使用已良好证实的方案和程序评价，以确定和证明其在以下方面的有用性：控制或预防或治疗或治愈依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，优选预防或治疗在人类和动物中引起的依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，和在人类和动物的骨骼生长和健康过程中达到PBM。

给出下面的实施例是为了说明，而不应解释为限定本发明的范围。

实施例

1.从茎皮提取

将粉碎的榆树茎皮(植物编号914，5kg)放置在具有乙醇(20升)的玻璃渗滤器中，并在室温下静置大约16小时(过夜)。收集渗滤液。重复这一提取过程4次。过滤合并的提取液，在45℃浓缩；获得的提取物的重量为660g(13.2％，914-C002)。

2.从小枝提取

将粉碎的榆树小枝(植物编号4669，4kg)放置在具有乙醇(18升)的玻璃渗滤器中，并在室温下静置大约16小时(过夜)。收集渗滤液。重复这一提取过程4次。过滤合并的提取液，在45℃浓缩；获得的提取物的重量为350g(8.7％，C002)。

3.分级分离

用己烷(200毫升x5)研磨乙醇提取物(914-C002，100克)。然后在40℃下减压浓缩己烷可溶级分，获得的己烷级分重量为10克(10％，F003)。然后将用己烷研磨后获得的残留物溶于水(500毫升)，通过添加正丁醇(500毫升)沉淀。过滤获得的固体，用蒸馏水洗涤。通过用甲醇和乙酸乙酯的混合物结晶获得纯化合物，获得2.6克(2.6％，K058)。在45℃下，使用旋转蒸发仪(rotavapour)浓缩滤液。用丙酮(200毫升×4)研磨残留物。减压浓缩合并后的丙酮可溶级分。获得重量为69.0克的丙酮可溶级分(F004)，并获得18.4克丙酮不溶级分(F005)。

图1代表表明从榆树中提取、分级和分离的策略的流程图。

图1：显示从榆树茎皮中提取、分级和分离粗制提取物和纯级分的流程图。

4.从榆树的丙酮可溶级分(F004)分离化合物

使用CHCl₃至CHCl₃∶MeOH((5％)水溶液)的混合物，通过硅胶(230-400目)对丙酮可溶级分(69.0克)进行色谱分离：使用CHCl₃∶(5％)MeOH水溶液(93∶7)作为洗脱液产生K068(0.200克，0.2％)，使用CHCl₃∶(5％)MeOH水溶液(90∶10)作为洗脱液产生K100(0.20克，0.20％)，使用CHCl₃∶(5％)MeOH水溶液(87∶13)作为洗脱液产生K012(2.5克，2.5％)。由详细的光谱学研究表征这些化合物。K058和K100为新化合物，K068和K012是已知化合物。

分离的化合物的物理和光谱数据

5.K012、K058、K068和K100的表征

K058：(2S，3S)-(+)-3′，4′，5，7-四羟基二氢黄酮醇-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷

产量：2.6g.(2.6％)；无定形；UVλ_max MeOH：290，327nm；[α]_D ²⁵+1.330(c，0.098；MeOH)；CD(MeOH)Δε₃₀₄+36.27Δε₃₃₂-12.21。FAB-MS：m/z467[M+1]⁺；C₂₁H₂₂O₁₂；¹H NMR：(DMSO-d₆，300MHz)δ：4.92(1H，d，J＝10.1Hz，H-2)，4.49(1H，m，H-3)，5.92(1H，s，H-8)，6.87(1H，s，H-5′)，6.74(2H，s，H-2′，6′)，4.87(1H，m，H-1″连同OH信号)，3.14(2H，m，H-2″，5″)，3.48(1H，m，H-3″)，3.67(1H，m，H-4″)，4.01(1H，m，H-6″a)，4.47(1H，m，H-6″b)，12.48(1H，s，OH-5)，9.11(1H，s，OH-3)，9.05(1H，s，OH-3′)，4.84(1H，brs，OH)，4.62(1H，brs，OH)。¹³C NMR：(DMSO-d₆，75MHz)δ：83.0(C-2)，71.63(C-3)，197.9(C-4)，162.6(C-5)，106.0(C-6)，166.0(C-7)，94.8(C-8)，161.3(C-9)，100.2(C-10)，128.0(C-1′)，115.3(C-2′)，145.8(C-3′)，145.0(C-4′)，115.3(C-5′)，119.4(C-6′)，72.9(C-1″)，70.7(C-2″)，79.1(C-3″)，70.3(C-4″)，81.5(C-5″)，61.6(C-6″)。

K012(6-吡喃葡萄糖基-3，3′，4′，5，7-五羟基黄酮)：

产量：2.5g.(2.5％)；无定形；UVλ_max MeOH：----nm；[α]_D ²⁵+9.79⁰(c，0.0612；DMSO)；FAB-MS：m/z 465[M+1]⁺；C₂₁H₂₀O₁₂；¹H NMR：(DMSO-d₆，300MHz)δ6.48(1H，s，H-8)，7.65(1H，d，J＝2.1Hz，H-2′)，6.88(1H，d， J＝8.5Hz，H-5′)，7.54(1H，dd，J＝8.5，2.1Hz，H-6′)，4.59(1H，d，J＝9.6Hz，H-1″)，其他糖质子信号位于4.05-3.20(5H，m，H-2″-6″)，13.06(1H，s，OH-12)，9.35(1H，s，OH-3)。¹³C NMR：(DMSO-d₆，75MHz)δ：144.2(C-2)，134.7(C-3)，175.2(C-4)，159.0(C-5)，107.2(C-6)，162.2(C-7)，92.2(C-8)，154.2(C-9)，101.8(C-10)，121.0(C-1′)，114.7(C-2′)，145.7(C-3′)，146.8(C-4′)，114.1(C-5′)，119.2(C-6′)，72.2(C-1″)，69.7(C-2″)，78.1(C-3″)，69.3(C-4″)，80.7(C-5″)，60.6(C-6″)。

K068(6-吡喃葡萄糖基-4′，5，7-三羟基黄酮)：

产量：0.200g.(0.2％)；mp：195-196℃；UV λ_max MeOH：292，328nm；[α]_D ²⁵+29.320(c，0.133；MeOH)；FAB-MS：m/z 435[M+1]⁺；C₂₁H₂₂O₁₀；¹HNMR：(CD₃OD，300MHz)δ：5.35(1H，dd，J＝12.4，2.3Hz，H-2)，2.75(1H，dd，J＝2.3，17.1Hz，H-3a)，3.14(1H，dd，J＝12.4，17.1Hz，H-3b)，5.98(1H，s，H-8)，7.32(2H，d，J＝8.4Hz，H-2′，6′)，6.82(2H，d，J＝8.4，H-3′，5′)，4.79(1H，d，J＝9.4Hz，H-1″)，4.11(1H，m，H-2″)，3.45(1H，m，H-3″)，3.30(2H，m，H-4″，5″)，3.86(1H，dd，J＝2.2，12.3Hz，J＝5.2，12.3Hz，H-6″b)，3.73(1H，m，H-6″a)；¹³C NMR：(CD₃OD，75MHz)δ：82.9(C-2)，44.0(C-3)，198.2(C-4)，164.3(C-5)，106.1(C-6)，167.4(C-7)，96.5(C-8)，159.1(C-9)，103.4(C-10)，131.0(C-1′)，129.1(C-2′)，116.1(C-3′)，164.6(C-4′)，116.1(C-5′)，129.1(C-6′)，75.3(C-1″)，72.7(C-2″)，80.2(C-3″)，71.9(C-4″)，80.0(C-5″)，63(C-6″)。

K100：(2S，3S)-(+)-4′，5，7-三羟基二氢黄酮醇-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷

产量：0.20g.(0.20％)；无定形；UVλ_max MeOH：296，334nm；[α]_D ²⁵+48.69⁰(c，0.115；MeOH)；CD(MeOH)Δε₂₉₉+27.35Δε₃₂₈-15.56。FAB-MS：m/z 451[M+1]⁺；C₂₁H₂₂O₁₁；¹H NMR：(CD₃OD，300MHz)δ：4.95(1H，d，J＝11.3Hz，H-2)，4.55(1H，d，J＝11.3Hz，H-3)，5.95(1H，s，H-8)，7.34(2H，d，J＝8.5Hz，H-2′，6′)，6.83(2H，d，J＝8.5Hz，H-3′，5′)，4.82(1H，m，H-1″连同OH信号)，4.13(1H，t，J＝9.1Hz，H-2″)，3.86(1H，dd，J＝2.1，12.3Hz，H-6″a)，3.71(1H，dd，J＝4.9，12.3Hz，H-6″b)，3.45-3.35(3H，m，H-3″，4″，5″)，¹³CNMR：(CD₃OD，75MHz)，δ：85.0(C-2)，72(C-3)，198.9(C-4)，163.9(C-5)， 106.3(C-6)，167.4(C-7)，96.4(C-8)，159.2(C-9)，101.8(C-10)，129.2(C-1′)，130.4(C-2′)，116.2(C-3′)，164.1(C-4′)，116.2(C-5′)，130.4(C-6′)，75.2(C-1″)，72.6(C-2″)，80.2(C-3″)，71.9(C-4″)，82.6(C-5″)，62.9(C-6″)。

6.粗提取物和丙酮可溶级分中K058、K012、K068、K100的量化

使用基于HPLC-PDA的分析方法对粗提取物和丙酮可溶级分中的K012、K058、K068、K100进行绝对定量。使用甲醇∶水作为流动相以0.5毫升/分钟的流速在C-18柱上进行分析。各个标记物K012、K058、K068、K100在色谱图中分别出现在15±0.8、8.3±0.8、14.3±0.8和10±0.8分钟处。在0.5-16μg/ml的浓度范围内，采用0.99或更高的相关系数，通过日内和日间分析建立各个纯标记物K058、K012、K068、K100的准确度和精度。利用上述方法对粗提取物和丙酮可溶级分进行分析，从线性图推断粗提取物和丙酮可溶级分中的这四种标记成分的绝对浓度。发现K012、K058、K068、K100分别以以下浓度范围存在：在粗提取物中为6.7-9％、3.3-4.5％、0.6-0.7％和1.7-2.6％，在丙酮可溶级分中为7.9-12％、1.7-3.0％、0.7-1.2％和2.5-4.5％。

7.生物学评价

评价本发明的植物提取物和纯化合物在以下方面的用途：依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，优选地预防或治疗在人类和动物中引起的依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，和在哺乳动物的骨骼生长和健康过程中获得PBM。随后描述评价本发明的茎皮乙醇提取物和分离的化合物的详细程序。但是，下面的实施例中说明的活性测试不应被解释为限制本发明的范围。

7.1测定成骨或骨形成活性的测试程序

在二甲基亚砜中制备本发明的测试提取物的测试溶液(10mM的储备溶液)，并在培养基中稀释为1nM和100nM的浓度用于评估在体外的骨形成活性。在对照实验中，用等浓度的DMSO代替测试试剂。

7.2成骨细胞培养

成骨细胞起源于多能间充质干细胞。前成骨细胞最丰富的来源之一是新生大鼠或小鼠的颅骨。成骨细胞也存在于骨髓中。在培养过程中，前成骨细胞经历成骨细胞的三个特征性阶段，其中具有阶段特异性基因的表达。它们是：

■增殖和分化：第1-12天

基因-碱性磷酸酶、胶原-I，骨钙蛋白等

■细胞外基质成熟：第12-18天

基因-骨钙蛋白、骨桥蛋白、纤连蛋白

■矿化：第14-35天

特征-钙化(结节形成)

体外研究中未包括乙醇提取物，因为发现它甚至在0.0025％稀释度时仍在培养基中沉淀，最有可能由于富含非极性基团。因此，我们测试纯化合物对于成骨细胞和前脂肪细胞的作用。

7.3榆树粗提取物(C002)对切除卵巢的Sprague Dawley大鼠的治疗

在双侧卵巢切除术(Ovx)后，通过口服途径向Sprague Dawley(180-200g)每天给予500和750mg/kg体重剂量的C002的乙醇提取物。这是使用最广泛的模拟绝经后骨损失的人体条件的骨质减少(骨损失)动物模型。将提取液在阿拉伯胶(载体)中给予。假手术大鼠和Ovx大鼠用作对照，且只给予阿拉伯胶。每组由10只大鼠组成，且分组如下：假手术完整、Ovx、Ovx+500mg/kg的提取物和Ovx+750mg/kg的提取物。手术后24小时治疗开始，持续进行90天。经过90天后，首先使大鼠适应，然后将它们放置在只有水没有食物的代谢笼中24小时来收集尿液样品。24小时后，将大鼠送回具有随意获取的食物和水的笼子里，像以前一样再口服提取物24小时。然后对大鼠施行无痛致死术，并解剖以收集血液、骨(胫骨、股骨、L1-L4椎骨)和子宫。

7.4骨矿密度(BMD)的测量

通过DEXA测定股骨(球、头、颈)、胫骨(球、头、胫腓骨分离点)和腰椎(LV1、LV2、LV3、LV4)的骨矿密度。

7.5C002和F004(C002的级分)对生长的Sprague Dawley大鼠的治疗

将21天大的雌性Sprague Dawley大鼠分为三组，每组由10只组成；对照(载体处理的)、750mg/kg的C002粗提取物、50mg/kg的914/F004。每日通过口服给予阿拉伯胶中的载体或进行治疗30天。经过30天完成后，对大鼠施行无痛致死术，并收集骨(股骨、胫骨、L1-L4椎骨)。

7.6骨矿密度(BMD)的测量

7.7为了ALP(碱性磷酸酶)定量的骨髓的离体培养和C002治疗的未成熟大鼠的体外矿化

在大鼠解剖过程中，在PBS中无菌收集对照和C002治疗的大鼠的右股骨。除去软组织，使用无菌剪刀剪去股骨末端，用针在每个骨的膝关节末端造成一个洞，并用由补充有10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素(Sigma，Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)的α-MEM组成的对照培养基(CM)从轴冲出骨髓。将细胞悬浮于这种培养基中，并以800rpm离心悬浮液5分钟。将细胞再悬浮于新鲜的CM中，并使用血球计数器计数。在含有5％二氧化碳的潮湿气氛中、37℃下、在补充有10mM-β-甘油磷酸酯、50μg/ml的L-抗坏血酸和10^-8M的地塞米松的CM中，分别在48孔和12孔板中培养100000和200000细胞/孔。每隔一天更换该培养基(John等人2002；Connolly，1995：Gebhart和Lane.1991；Gurpinar等人2003；Lan和 Wang.2003)。保持这些细胞9天来测试ALP活性。如Akiyama等人所述(经过修改)测定ALP活性。简单地说，用PBS洗细胞一次，然后通过加入ALP缓冲液(1M的二乙醇胺、0.5M的MgCl₂、1mg/ml PNPP、pH 9.0)、在37℃孵育，并使用微孔板分光光度计读取吸光度(405nm)，来测定ALP活性。通过配对双尾Student t-检验确定统计学显著性。

对于体外矿化，如上述保持细胞21天，接着固定(在PBS中的4％HCHO中进行20分钟)。然后用超纯(nanopure)水冲洗样品，并在室温下，用40mM的茜素红-S(pH 4.2)染色10分钟。样品用水冲洗5次。获得染色的孔的显微照片。随后，在室温下使用pH7.0的10nM磷酸钠中的10％(w/v)氯化十六烷基吡啶(CPC)提取茜素红-S染色15分钟，并相对于620nm参考波长在540nm测试波长下用微孔板读数器读取由此产生的溶液的读数。

7.8初级成骨细胞培养

如前所述(Chattopadhyay等人，Endocrinology 145：3451-62，2004)(略有修改)准备新生大鼠颅骨细胞培养。简单地说，对于颅骨成骨细胞培养，用α-MEM中的0.1％胶原酶/0.1％分散酶消化新生Sprague-Dawley大鼠(1-3天大)的额骨和顶骨以获得5个连续消化物。将第二至第五消化物合并，并于37℃和含5％二氧化碳的空气中，在补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素-链霉素、非必需氨基酸溶液和丙酮酸钠的α-MEM中生长至汇合。

7.9BrdU细胞增殖试验

采用BrdU试验根据增殖细胞中的DNA合成过程中的BrdU掺入测量细胞增殖(Chattopadhyay等人，Endocrinology 145：3451-62，2004)。在96孔板中接种颅骨成骨细胞(2000细胞/孔)。使细胞附着24小时，之后将细胞在含0.5％FCS的α-MEM培养基中饥饿，接着用不同浓度的K058处理24小时，之后通过制造商(Roche Biochemicals，Rotkreuz，Switzerland)所述的BrdU ELISA法测定细胞增殖。反应完成前4小时，加入BrdU溶液。BrdU孵育进行4小时，固定细胞并使其变性，随后用抗-BrdU抗体处理，并通过底物反应检测免疫复合物。在370nm读取吸光度。

7.10碱性磷酸酶活性测定

对于碱性磷酸酶(ALP)测定，将成骨细胞接种于96孔(2000细胞/孔)板中的正常生长培养基中。24小时后，当细胞形成融合单层时，用补充有10％FBS、10mM β-甘油磷酸酯和50μg/ml抗坏血酸的α-MEM代替培养基。以1nM和100nM的浓度，给予不同浓度的测试化合物K012、K058、K068和K100的治疗。诱导后48小时，如Akiyama等人所述(Exp Cell Res 235：362-369，1997)(略有修改)测定成骨细胞的ALP活性。简单地说，用PBS洗细胞一次，然后通过加入ALP缓冲液(1M的二乙醇胺、0.5M的MgCl₂、1mg/ml PNPP、pH 9.0)、在37℃孵育，并使用微孔板分光光度计读取吸光度(405nm)，来测定ALP活性。通过配对双尾Student t-检验确定统计学显著性。

7.11颅骨成骨细胞的体外矿化

细胞产生矿化基质的能力对于骨再生材料的发展是重要的。使用与氯化十六烷基吡啶(CPC)提取相结合的茜素红-S(AR-S)试验测定成骨细胞对细胞外基质的矿化(Stanford等人，J.Biol.Chem.270：9420-9428；1995)。茜素红是一种选择性结合新生钙盐的染料并广泛用于钙矿物质组织化学中。将细胞接种于6孔板中，在补充有10mMβ-甘油磷酸酯和50μg/ml的抗坏血酸及1nM和100nM浓度的测试化合物K012、K058、K068和K0100的培养基中含有10000个细胞/孔。给予处理21天，处理完成后，用PBS冲洗样品，接着固定(在4％HCHO中进行20分钟)。获得染色的孔的显微照片。随后，在室温下使用pH7.0的10nM磷酸钠中的10％(w/v)氯化十六烷基吡啶(CPC)提取茜素红-S染色15分钟，并相对于620nm参考波长在540nm测试波长下用微孔板读数器读取由此产生的溶液的读数。

也通过Von Kossa染色程序(A.M.Chou等人Materials Science andEngineeringC 20(2002)77-83)观察矿化小结。21天的培养后，用PBS洗组织培养孔中的细胞，并在5％(w/v)硝酸银溶液中浸泡45分钟。用蒸馏水漂洗后，将它们在5％(w/v)的碳酸氢钠福尔马林中固定8分钟。最后，将它们浸泡在5％(w/v)的硫代硫酸钠溶液中5分钟，用水彻底清洗15分钟，并获得显微照片。

7.12小鼠骨髓的体外矿化

成年balb/c小鼠用于这项研究。如别处描述(Maniatopoulos等人Cell Tissue Res 1988；254：317-30；Ishaug等人J Biomed Mater Res 1997；36：17-28)，从动物的股骨和胫骨收获骨髓细胞(BMC)。简单地说，用醚致无痛苦死亡之后，从小鼠后肢上无菌切下骨。除去软组织，使用无菌剪刀剪去股骨近端和胫骨远端，用针在每个骨的膝关节末端造成一个洞，并用由补充有10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素(Sigma，Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)的α-MEM组成的对照培养基(CM)从轴冲出骨髓。将细胞悬浮于这种培养基中，并将来自所有骨的细胞悬浮液在离心管中合并。以800rpm离心悬浮液5分钟。使用血球计数器对细胞计数。吸取上清液，并将沉淀物再悬浮于新鲜的CM中，然后接种于12孔板中。将200000细胞/孔在12孔板中、在含5％二氧化碳的潮湿气氛中、37℃下、在补充有10mMβ-甘油磷酸酯、50μg/ml的L-抗坏血酸和10^-8M的地塞米松及不同浓度的测试化合物的相同培养基中培养。每隔一天更换这种培养基(John等人Trends Biomater.Artif.Organs 2002；16(1)：28-33.；Connolly.ClinOrthop 1995；313：8-18.；Gebhart和Lane.Acta Orthop Belg1991；57(2)：130-43.；Gurpinar等人J Biomater Appl 2003；18(1)：25-33；Lan和Wang.Blood Substitutes.Biotechnol 2003；31(1)：59-68.)。给予1nM和100nM浓度的K012、K058、K068和K0100的处理21天，处理完成后，用PBS冲洗样品，接着固定(在4％HCHO中20分钟)。然后用超纯水冲洗样品，并在室温下，用40mM的AR-S(pH 4.2)染色10分钟。给予处理21天，处理完成后，用PBS冲洗样品，接着固定(在4％HCHO中20分钟)。获得染色的孔的显微照片。随后，在室温下使用pH7.0的10nM磷酸钠中的10％(w/v)CPC提取茜素红-S染色15分钟，并相对于620nm参考波长在540nm测试波长下用微孔板读数器读取由此产生的溶液的读数。

7.13A体外脂肪形成

将3T3-L1前脂肪细胞培养至汇合。将细胞达到汇合的2天后视为第0天。在第0天，用诱导培养基[10％胎牛血清/DMEM，含有1μg/ml的胰岛素、1μM的地塞米松和500μM的异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)]处理细胞。诱导培养基处理2天后(第2天)，用胰岛素[10％胎牛血清/DMEM，含有1μg/ml的胰岛素]处理细胞。通常在从第0天起的8天后实现完全分化。为了检验测试化合物对于3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化的效果，1μM、100nM和1nM浓度的测试化合物K068和 K100在整个分化过程中以不同浓度使用(从第0天开始持续8天)。对于脂肪形成的评估，将分化的细胞于4％的多聚甲醛(w/v)中固定20分钟，用PBS洗涤，并用60％异丙醇中的0.34％的油红O染色15分钟。然后用PBS洗涤3次，通过在室温下在定轨振荡器中保持30分钟，用80％异丙醇提取染色。在520nm处获得提取的染料的OD。

7.13B逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)

进行RT-PCR以评估PPAR-γ(过氧化物酶体增殖物激活受体)和脂联素(adiponectin)的表达。看家基因GAPDH用作本研究的内部对照。在10^-6、10^-7和10^-9M浓度的K068和K100的存在下，在分化条件下，培养3T3-L1前脂肪细胞8天，以形成脂肪细胞。培养后，提取细胞RNA，并根据制造商的说明使用试剂盒(Fermentas)进行RT-PCR。使用表1中列出的寡核苷酸进行PCR。

表1.用于RT-PCR的引物序列

半定量RT PCR

7.14逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)

进行RT-PCR以评估Coll(I型胶原蛋白)、Cbfa-1(核心结合因子-1)、ALP(碱性磷酸酶)、OPN(骨桥蛋白)、BMP 2(骨形态发生蛋白2)、OPG(骨保护素)和OCN(骨钙蛋白)的mRNA水平。看家基因GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)用作本研究的内部对照。在0、4、8、12、24和48小时提取RNA。使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA。根据制造商的说明，使用单一步骤RTPCR试剂盒(Qaigen)进行RT-PCR。使用以下的基因特异性引物对(见表2)。

表2：用于RT-PCR的引物序列

7.15体外雌激素性

在Ishikawa细胞中响应雌激素或雌激素样物质诱导碱性磷酸酶的表达(Littlefield等人，Endocrinology.1990 Dec；127(6)：2757-62)。以5000细胞/孔的密度将Ishikawa细胞接种于96-孔平底微滴定板中，并在含有10％木炭处理的FCS而无酚红的DMEM中培养。接种24小时后，将细胞进行血清饥饿12小时。此后，为了测试化合物的雌激素性，用不同浓度(10^-6至10^-11M)的纯化合物K058和K012处理细胞。相同浓度的雷洛昔芬也用于比较。10^-8M浓度的雌激素用作阳性对照。在37℃下、在CO₂培养箱中进行化合物处理72小时。实验重复4次。对于抗雌激素性的研究，10^-6至10^-11M的化合物K012和K058连同10^-8M的雌激素一起加入。孵育72小时后，除去培养基，用PBS洗板两次，并轻轻拍干。通过将板放置在-70℃下15分钟接着恢复到室温下实现细胞的冷冻断裂。然后将板放在冰上，并将50μl冰冷的二乙醇胺溶液(1M二乙醇胺中的5mM的对硝基苯磷酸盐(PNP)和0.25mM的MgCl₂)添加到每个孔中。然后将板置于37℃下30分钟进行显色(黄色)，颜色是ALP活性的函数。在405nm下测量吸光度。

7.16K058对去卵巢Sprague Dawley大鼠的治疗

在双侧卵巢切除术(Ovx)后，每天通过口服途径向Sprague Dawley(180-200g)给予1至10mg/kg体重剂量的K058。这是使用最广泛的模拟绝经后骨损失的人体条件的骨质减少(骨损失)动物模型。提取液在阿拉伯胶(载体)中给予。假手术大鼠和Ovx大鼠用作对照，且只给予阿拉伯胶。每组由10只大鼠组成，且各组如下：假手术完整、Ovx、Ovx+1mg/kg的K058和Ovx+5mg/kg的K058。手术后24小时治疗开始，持续进行90天。经过90天后，首先使大鼠适应，然后将它们置于只有水没有食物的代谢笼中24小时来收集尿液样品。24小时后，将大鼠送回具有随意获得的食物和水的笼子里，像以前一样再口服提取物24小时。然后对大鼠施行无痛致死术，并解剖以收集血液、骨(胫骨、股骨、L1-L4椎骨)和子宫。

7.17骨矿密度(BMD)

7.18K058对未成熟Sprague Dawley大鼠的治疗

将断奶的雌性Sprague Dawley大鼠(大约21天大)分为2组，每组由10只组成。对照大鼠用阿拉伯胶(载体)治疗，另一组用5mg/kg体重的K058治疗。所有对照和治疗的大鼠每日口服阿拉伯胶中的K058或载体30天。经过30天完成后，对大鼠施行无痛致死术，并收集骨(股骨、胫骨、L1-L4椎骨)。

a)骨矿密度(BMD)

b)为了ALP定量的骨髓的离体培养和K058治疗的未成熟大鼠的体外矿化

在大鼠解剖过程中，在PBS中无菌收集对照和K058治疗的大鼠的右股骨。除去软组织，使用无菌剪刀剪去股骨末端，用针在每个骨的膝关节末端造成一个洞，并用由补充有10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素(Sigma，Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)的α-MEM组成的对照培养基(CM)从轴冲出骨髓。将细胞悬浮于这种培养基中，并以800rpm离心悬浮液5分钟。将细胞再悬浮于新鲜的CM中，并使用血球计数器计数。在含有5％二氧化碳的潮湿气氛中、37℃下、在补充有10mMβ-甘油磷酸酯、50μg/ml的L-抗坏血酸和10^-8M的地塞米松的CM中，分别在48孔和12孔板中培养100000和200000细胞/孔。每隔一天更换这种培养基(John等人2002；Connolly，1995：Gebhart和Lane.1991；Gurpinar等人2003；Lan和 Wang.2003)。将这些细胞保持9天用于测定ALP活性。如Akiyama等人所述(经过修改)测定ALP活性。简单地说，用PBS洗细胞一次，然后通过加入ALP缓冲液(1M的二乙醇胺、0.5M的MgCl₂、1mg/ml PNPP、pH 9.0)、在37℃孵育，并使用微孔板分光光度计读取吸光度(405nm)，来测定ALP活性。通过配对双尾Student t-检验确定统计学显著性。

7.19K012对卵巢切除的Sprague Dawley大鼠的治疗

在双侧卵巢切除术(Ovx)后，每天通过口服途径向Sprague Dawley(180-200g)大鼠给予1和5mg/kg体重剂量的K012。提取液在阿拉伯胶(载体)中给予。假手术大鼠和Ovx大鼠用作对照，且只给予阿拉伯胶。每组由10只大鼠组成，且各组如下：假手术完整、Ovx、Ovx+1mg/kg的K012和Ovx+5mg/kg的K012。手术后24小时治疗开始，持续进行90天。经过90天后，首先使大鼠适应，然后将它们置于只有水没有食物的代谢笼中24小时来收集尿液样品。24小时后，将大鼠送回具有随意获取的食物和水的笼子里，像以前一样再口服提取物24小时。然后对大鼠施行无痛致死术，并解剖以收集血液、骨(胫骨、股骨、L1-L4椎骨)和子宫。

7.20骨矿密度(BMD)

8.C002预防Ovx诱导的骨损失

在用榆树的乙醇提取物(C002)(750mg/kg体重)治疗Ovx大鼠90天时，通过DEXA测量切离的骨的BMD。数据显示，以750mg/kg的乙醇提取物治疗的Ovx大鼠相比用载体治疗的Ovx组大鼠，股骨(球、颈和轴区域)具有显著更高的BMD(图2A、B、C)。此外，以750mg/kg的乙醇提取物治疗的Ovx大鼠相比用载体治疗的Ovx组大鼠，LV4椎骨(承重椎骨)具有显著更高的BMD(图2D)。从这些结果，可以得出结论：C002在雌激素缺乏时具有骨保护作用。

图2：榆树的乙醇提取物降低大鼠中的Ovx诱导的骨质损失。在切离的骨中通过DEXA测量BMD。用750mg/kg体重的C002治疗90天的Ovx大鼠与用载体(对照)治疗的Ovx大鼠和假手术的大鼠比较。(A)股骨球，(B)股骨颈，(C)股骨轴，和(D)第四腰椎(与假手术大鼠的BMD相比，***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05；与ovx对照的BMD相比，a-P＜0.001，b-P＜0.01，c-P＜0.05)。

9.C002的雌激素激动(agonistic)效应的评估

卵巢切除术导致子宫重量减轻，具有雌激素样作用的药剂增加子宫重量。用榆树的乙醇提取物(C002)(750mg/kg体重)治疗90天的Ovx大鼠与用载体治疗的假手术的大鼠(与用载体治疗的Ovx大鼠相当)相比具有明显的子宫重量减轻(图3)。因此，可以得出结论：C002在子宫水平上没有雌激素激动作用。

10.在Sprague Dawley大鼠中达到PBM

a)获取21天大的(断奶)雌性大鼠，以研究C002对达到PBM的效应。在以750mg/kg体重的C002治疗30天后，发现C002治疗的大鼠的股骨轴的BMD值显著高于用对照(载体)治疗的大鼠(图4A)。750mg/kg体重的C002也增加未成熟大鼠第四腰椎的BMD(图4B)。我们的结论是C002增强发育的雌性大鼠中达到PBM。

b)获取21天大的(断奶)雌性大鼠，以研究C002的级分(F004)对达到PBM的效应。在以50mg/kg体重的F004治疗30天后，发现F004治疗的大鼠的股骨轴的BMD值显著高于用对照(载体)治疗的大鼠(图4A)。我们的结论是，F004(C002的级分)促进生长的雌性大鼠中达到PBM。

图4：榆树的乙醇提取物和级分促进未成熟大鼠中的PBM。在切离的骨中通过DEXA测量BMD。用750mg/kg的C002和50mg/kg的914/F004(级分)治疗的生长的雌性大鼠与用载体(对照)治疗的大鼠进行比较。(A)股骨轴(B)第四腰椎。(***-P＜0.001，---P＜0.01，*-P＜0.05)。

11.C002对骨祖细胞的刺激

如上所述，在生长的大鼠中用C002治疗后根据ALP活性和BMC的矿化评估骨髓中骨祖细胞的增加。发现与对照相比，在从C002治疗的大鼠获得的BMC中，ALP活性(成骨细胞分化的量度)显著较高(图5A)。此外，来自C002治疗的大鼠的BMC的矿化明显多于对照(载体)(图5B和C)。我们的结论是，C002通过增加骨髓中的骨祖细胞增强达到PBM。

图5：榆树的乙醇提取物和级分促进未成熟大鼠中的骨祖细胞。用750mg/kg的C002和50mg/kg的914/F004治疗的生长的雌性大鼠的BMC与用载体(对照)治疗的大鼠比较。(A)碱性磷酸酶试验(对于成骨细胞的分化)，(B)茜素红-S染色的细胞的显微照片(对于成骨细胞的矿化作用)，和(C)提取后茜素红-S染色的量化(***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05)。

12.从F004分离的4种纯化合物对成骨细胞分化的刺激

测试从F004分离的4种纯化合物K012、K058、K068和K100刺激成骨细胞分化的能力。用各种浓度(0.1nm至1.0μM)的这四种化合物处理的颅骨成骨细胞与对照(载体)相比，显示ALP活性提高70％至100％(图6)。我们的结论是，所有4种分离的纯化合物刺激成骨细胞的分化，能够使成骨细胞骨行使其骨形成功能和重要的骨合成代谢功能。

图6：来自榆树的4种纯化合物在体外促进颅骨成骨细胞的分化。用1和100nM浓度的K012、K058、K068和K100处理颅骨成骨细胞，并定量ALP的产生。***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05；N＝3。

13.从F004分离的4种纯化合物对颅骨成骨细胞矿化的刺激

通过茜素染色和提取与Von Kossa染色，分析大鼠颅骨(膜状骨)成骨细胞在体外对细胞外基质的矿化。所有4种化合物(1nM和100μM浓度)使矿化显著增加(图7)。发现在用K012、K058、K068、K100处理的成骨细胞中相比对照(载体)处理的细胞，茜素红染色(新生钙沉积的量度)增加10％至25％(图7A和B)。还发现，在酸性条件下与磷酸盐反应、不与钙反应且是矿化结节的量度的Von kossa，在用K012、K058、K068、K100处理的成骨细胞中相比对照(载体)处理的细胞增加(图7C)。我们得出结论，所有4种化合物都促进由膜状(颅)骨衍生的成骨细胞中的钙化和矿化骨结节形成的量，这是重要的骨合成代谢作用。

14.K058对颅骨成骨细胞增殖的刺激

10nM至1.0μM的K058刺激颅骨成骨细胞的半融合培养物的BrdU掺入(细胞增殖的量度)达25至75％(图8)。我们的结论是：K058对成骨细胞发挥促有丝分裂效应，这是重要的骨合成代谢作用。

图8：K058促进颅骨成骨细胞的增殖。用1和100nM浓度的K058处理颅骨成骨细胞，并进行BrdU细胞增殖试验。***-P＜0.001，**-P ＜0.01，*-P＜0.05；N＝3。

15.从F004中分离的4种纯化合物对BMC矿化的刺激

研究表明，植物雌激素染料木黄酮(genistein)能提高BMC向成骨细胞谱系的定向和分化(Heim等人，Endocrinology.2004 Feb；145(2)：848-59.)。骨生长(塑建)和维持(重建)在包含骨髓的骨皮质和骨小梁中发生。我们观察到，通过茜素红染色法评估，1nM至100nM浓度的K012、K058、K068和K100刺激骨髓成骨细胞矿化(图9A和B)。我们的结论是，所有4种化合物都增强BMC的矿化，这是它们在骨骼生长和维持中的成骨作用所需的。

图9：来自榆树的4种纯化合物在体外促进BMC的矿化。用1和100nM浓度的K012、K058、K068和K100处理BMC，并进行矿化。(A)茜素红-S染色的成骨细胞的显微照片。(B)提取后茜素红染色的量化(***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05)。

16A.在体外K068和K100对3T3 L1细胞中脂肪形成的抑制

绝经后和老化引起的骨质损失的一个公认的方面是骨髓脂肪形成的增加，因为由骨髓中的间充质干细胞的公共池(common pool)形成脂肪细胞增加将导致形成较少的成骨细胞。因此，抑制脂肪细胞分化是对于骨质疏松症的一种主要的治疗方法。3T3-L1是用于研究K068和K100在脂肪细胞分化中的效应的鼠前脂肪细胞。数据显示，1μM、100nM和1nM浓度的K068和K100显著抑制脂肪细胞的分化(图10A)。我们的结论是K068和K100具有抗脂肪形成作用。

16B.K068和K100对3T3 L1中成脂基因的mRNA水平的下调

用10^-7和10^-9M浓度的K068和K100处理3T3-L1细胞持续8天(脂肪细胞形成的时间)。半定量RT-PCR显示PPAR-γ和脂联素的mRNA水平下降(图10B)。我们的结论是，K068和K100通过下调促进脂肪细胞分化的各种基因的表达发挥抗脂肪形成作用。

图10：K068和K100抑制3T3-L1鼠前脂肪细胞的成脂分化。(A)用1μM、100nM和1nM浓度的K068和K100处理3T3-L1细胞，并进行油红O染色。提取和量化染色。***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P ＜0.05；N＝3。(B)在用100nM和1nM浓度的K068和K100处理3T3-L1前脂肪细胞8天(脂肪细胞分化的时间)后，各种脂肪细胞分化特异性基因的半定量RT PCR。GAPDH用作RNA负载对照。三个独立实验的代表性的凝胶图片具有类似的结果。

表3：从榆树分离的纯化合物的体外作用的概述

17.K058对成骨细胞中成骨基因的mRNA水平的上调

用10^-7M浓度的K058处理颅骨成骨细胞0至48小时。半定量RT-PCR显示胶原I(COL-1)、核心结合因子-1(Cbfa-1)、碱性磷酸酶(ALP)和骨桥蛋白(OPN)及骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的mRNA水平升高(图11)。骨保护素(OPG)是最有效的抗骨诱裂发生(osteoclastogenic)的细胞因子，由成骨细胞分泌。10^-7M浓度的K058在颅骨成骨细胞中增加OPG的mRNA水平(图11)。我们的结论是，K058通过上调促进成骨细胞功能和抑制破骨细胞功能的各种基因的合成发挥成骨作用。

图11：K058增加各种成骨细胞特异性基因的mRNA水平。在不同时间点用100nM的K058处理颅骨成骨细胞后，对各种成骨细胞的mRNA进行半定量RT PCR。GAPDH用作内部负载对照。三个独立实验的代表性的凝胶图片具有类似的结果。

18.K012和K058的体外雌激素性或抗雌激素性

Ishikawa细胞是表达高水平雌激素受体并通过增加ALP水平响应雌激素的人类子宫内膜癌细胞。用浓度提高的K012和K058(10^-11至10^-6M)处理的Ishikawa细胞的ALP水平没有表现出增加，而10^-8M的17β-雌二醇刺激ALP活性超过对照(载体处理的细胞)大约25.0 倍(图12A)。此外，10^-11至10^-6M浓度范围的K012和K058没有抑制17β-雌二醇刺激的ALP活性增加(图12B)。我们的结论是K012和K058不具有雌激素激动或抗雌激素作用。

图12：K058和K012在体外不具备雌激素性和抗雌激素性。用17β-雌二醇处理的Ishikawa细胞刺激ALP的产生。(A)相比对照，用10^-8M的17β-雌二醇处理的细胞中的ALP强劲增长。不同浓度的K058、K012和雷洛昔芬没有反应。(B)在10^-8M的17β-雌二醇的存在下，用各种浓度的K058、K012和雷洛昔芬处理的细胞中的ALP水平。

19.K058降低Ovx诱导的骨损失

在用K058(1.0-5.0mg/kg体重)治疗Ovx大鼠90天时，通过DEXA测量切离的骨的BMD。数据显示，以1.0-5.0mg/kg治疗的Ovx大鼠相比用载体治疗的Ovx大鼠，股骨(球、颈和轴区域)具有显著更高的BMD(图13A、B和C)。此外，相比用载体治疗的Ovx组，1.0和5.0mg/kg体重剂量的K058也显示在承重LV4椎骨中具有更高的BMD(图13D)，5mg/kg体重剂量的K058显示胫骨头的BMD增加(图13E)。从这些结果可以得出结论：K058在雌激素缺乏时具有骨保护作用。

20.K058的体内雌激素激动性质

卵巢切除术导致子宫重量减轻，具有雌激素样作用的药剂增加子宫重量。用K058(1.0和5.0mg/kg体重)治疗90天的Ovx大鼠与用载体治疗的假手术的大鼠(与用载体治疗的Ovx大鼠相当)相比具有明显的子宫重量减轻(图14)。因此，可以得出结论：K058在子宫水平上没有雌激素激动作用。

图14：在子宫水平上，K058在大鼠中不是雌激素性的。用1.0和5.0mg/kg体重的K058治疗90天的大鼠的子宫重量与对照假手术的大鼠和Ovx大鼠比较。与假手术对照大鼠的子宫重量相比，***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05。与ovx大鼠的子宫重量相比，c-P＜0.001，b-P＜0.01，a-P＜0.05。

21.K058在未成熟大鼠中达到骨量峰值

获取21天大的(断奶)雌性大鼠，以研究K058对达到PBM的效应。在以5mg/kg体重的K058治疗30天后，发现相比用对照(载体)治疗的大鼠，大鼠的股骨轴区域的BMD值显著更高(图15)。我们的结论是K058增强在发育的雌性大鼠中达到PBM。

图15：K058促进未成熟大鼠中的PBM。在切离的骨中通过DEXA测量BMD。用5mg/kg的K058治疗的生长的雌性大鼠与用载体(对照)治疗的大鼠比较。显示股骨轴中的BMD(***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05)。

22.K058对骨祖细胞的刺激

如上所述，在生长的大鼠用K058治疗(5.0mg/kg体重)后，根据ALP活性和BMC的矿化评估骨髓中骨祖细胞的增加。发现相比用对照治疗的大鼠，在从K058治疗的大鼠(5.0mg/kg体重)获得的BMC中，ALP活性(成骨细胞分化的量度)显著更高(图16A)。此外，来自K058治疗的大鼠的BMC的矿化明显多于对照(载体)(图16B和C)。我们的结论是，K058通过增加骨髓中的骨祖细胞增强达到PBM。

23.K012降低Ovx诱导的骨损失

在用K012(1.0-5.0mg/kg体重)治疗Ovx大鼠90天时，通过DEXA测量切离的骨的BMD。数据显示，以5.0mg/kg治疗的Ovx大鼠相比用载体治疗的Ovx组大鼠，股骨颈、胫骨球、胫骨头和胫骨-腓骨分离点(TFSP)具有显著更高的BMD(图17A、B、C和D)。相比用载体治疗的Ovx组，5.0mg/kg体重剂量的K012也显示在胫骨球和第二腰椎具有更高的BMD(图17E和F)。相比用载体治疗的Ovx组，用1.0mg/kg体重的K012治疗的大鼠的TFSP中也可见BMD增加(图17D)。从这些结果可以得出结论：K012在雌激素缺乏时具有骨保护作用。

图17：K012降低大鼠中的Ovx诱导的骨质损失。在切离的骨中通过DEXA测量BMD。用1.0和5.0mg/kg的K012治疗90天的Ovx大鼠与用载体(对照)治疗的Ovx大鼠和假手术大鼠比较。(A)股骨颈，(B)胫骨球，(C)胫骨头，(D)胫骨-腓骨分离点，(E)腰椎球，和(F)第二腰椎(与假手术大鼠的BMD相比，***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05；与ovx对照的BMD相比，a-P＜0.001，b-P＜0.01，c-P＜0.05)。

24.K012的体内雌激素激动性质

卵巢切除术导致子宫重量减轻，具有雌激素样作用的药剂增加子宫重量。用K012(1.0和5.0mg/kg体重)治疗90天的Ovx大鼠与用载体治疗的假手术的大鼠(与用载体治疗的Ovx大鼠相当)相比具有明显的子宫重量减轻(图18)。因此，可以得出结论：K012在子宫水平上没有雌激素激动作用。

图18：在子宫水平上，K012在大鼠中不是雌激素性的。用1.0和5.0mg/kg体重的K012治疗90天的大鼠的子宫重量与对照假手术的大鼠和Ovx大鼠的子宫重量比较。(与假手术对照大鼠的子宫重量相比，***-P＜0.001，**-P＜0.01，*-P＜0.05；与ovx大鼠的子宫重量相比，c-P＜0.001，b-P＜0.01，a-P＜0.05)。

Claims

1.通式1的黄酮醇化合物或其药学可接受盐，其中，R1为OH，R2为OH或H：

2.权利要求1所述的通式1的化合物或其药学可接受盐，单独或其组合作为活性成分，在制备控制、预防或治疗骨疾病的药物中的用途，其中所述药物不含其它活性成分。

3.根据权利要求2所述的化合物的用途，其中，所述药学上可接受盐选自钠盐、钾盐、钙盐、草酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐和酒石酸盐。

4.根据权利要求2所述的用途，其中，通式1的化合物K058通过上调促进成骨细胞功能和抑制破骨细胞功能的选自COL-1、Cbfa-1、ALP、OCN、BMP-2的各种基因的合成发挥成骨作用。

5.根据权利要求2所述的用途，其中，10nM至1.0μM浓度的通式1的化合物K058刺激颅骨成骨细胞半汇合培养物的BrdU掺入达25％至75％。

6.根据权利要求2所述的用途，其中，通式1的化合物K058通过上调促进成骨细胞功能和抑制破骨细胞功能的各种基因的合成发挥成骨作用。