CN115212243A - 淫羊藿提取物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种淫羊藿提取物的应用，所述的淫羊藿提取物是指淫羊藿药材经乙醇水溶液提取得到；所述的应用是指以所述的淫羊藿提取物作为活性成分用于制备预防或/和治疗色素脱失性疾病的药物制剂或护肤品。经实验表明：本发明所述的淫羊藿提取物能够显著提高小鼠B16F10和Melan‑A细胞中黑素生成能力和酪氨酸酶的活性，且能够明显增加斑马鱼黑素的生成能力，对拓展淫羊藿药材应用具有显著价值。

Description

淫羊藿提取物的应用
技术领域
本发明是涉及淫羊藿提取物的应用，具体说，是涉及淫羊藿提取物在预防或/和治疗色素脱失性疾病中的应用，属于中药材应用技术领域。
背景技术
色素脱失性疾病，主要是指由多种原因造成的色素减退或色素脱失，主要表现为皮肤或粘膜处出现比正常皮肤色浅的斑块。色素缺失性白斑可发生于全身任何部位，主要以面部、颈部、手背等暴露部位及外生殖器等皱褶处皮肤多见。多数为局限型，孤立存在，也可呈对称分布，或沿神经呈带状分布，还可以泛发全身，只剩少数正常皮肤。根据其色素脱失的范围大小可分为全身性的皮肤色素脱失，如白癜风、结节性硬化症、斑驳病、伊藤色素减退症等；非全身性的皮肤色素脱失，包括眼皮肤白化病综合症、苯丙酮尿症。此类疾病治疗困难，疗程较长，治愈率较低。
白癜风作为色素脱失性疾病中一种最具代表性的疾病，备受关注。据报道，白癜风全球患病率为0.06％-2.28％([J].International Journal of Dermatology，2012，51(10))，我国的人群患病率约为0.1％-2.7％([M].中国临床皮肤病学，2009：1268-1270)。白癜风的病情复杂，不同患者的临床表现、病情进展和对治疗的反应也各不相同。至今，白癜风的发病机制还未完全阐释清楚，主要认为其与遗传、免疫、神经精神、代谢产物损伤、微量元素缺乏等有关([J].Qatar Medical Journal，2013，2013(2))。目前，西医治疗白癜风的手段主要包括：外用药物治疗，如糖皮质激素、钙调磷酸酶抑制剂等；系统治疗，如糖皮质激素、维生素D衍生物、辛伐他汀等；物理治疗，如308nm准分子激光治疗、光化学疗法、紫外线照射治疗等；手术治疗，如自体表皮移植法、钻孔皮肤移植法、单株毛囊移植法、自体黑素细胞培养移植法等([J].牡丹江医学院学报，2021，42(01)：164-167+171)。中医称白癜风为“白癜”“白驳”或“白驳风”，治疗原则多为疏肝补肾，祛风健脾，活血化瘀；着重于补肝血、滋肾阴、兼以活血，组方多为滋补肝肾为主，重镇安神、健脾养血及祛风除湿为辅等([J].解放军医药杂志，2020，32(08):112-116)，中医治疗手段主要包括中药内服，中药外敷(散剂、酊剂、膏剂等)以及针灸辅助治疗。
淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim.)为小檗科植物，又名仙灵脾、刚前。我国是淫羊藿的地理分布中心，拥有40个淫羊藿品种，形成药材商品的主要种类有15种，其中淫羊藿Epimedium brevicornum Maxim.、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim.和朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai被2020版中国药典收载为主要基原种。据2020版中国药典记载，其性味为辛、甘、温，归肝、肾经，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿功效，常用于肾阳虚衰所致阳痿遗精、筋骨痿软、风湿痹痛、麻木拘挛，是临床常用中药，但至今未见淫羊藿在色素脱失性疾病中的相关应用报道。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种淫羊藿提取物的应用，以拓展淫羊藿的应用价值。
本发明所述的淫羊藿提取物，是指淫羊藿药材经乙醇水溶液提取得到；所述的应用是指以所述的淫羊藿提取物作为活性成分用于制备预防或/和治疗色素脱失性疾病的药物制剂或护肤品。
一种优选方案，所述的淫羊藿提取物，是指淫羊藿药材经体积百分比浓度为45％～95％的乙醇水溶液进行回流提取得到。
进一步优选方案，所述的淫羊藿提取物，是指淫羊藿药材先经体积百分比浓度为65％～75％的乙醇水溶液进行回流提取1～3次，每次回流1～3小时，然后对合并的提取液进行减压浓缩，再将浓缩物置于50～70℃烘箱中真空干燥得到。
所述的色素脱失性疾病包括但不限于：白癜风、斑驳病、白化病综合症、苯丙酮尿症、灰发症。
与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：
本发明的研究结果表明：本发明所述的淫羊藿提取物能够显著提高小鼠B16F10和Melan-A细胞中黑素生成能力和酪氨酸酶的活性，且能够明显增加斑马鱼黑素的生成能力，故有望作为活性成分用于制备预防或/和治疗色素脱失性疾病的药物制剂或护肤品，对拓展淫羊藿药材应用具有显著价值。
附图说明
图1是体现不同浓度的淫羊藿提取物在分别作用48小时和72小时下，对B16F10细胞的毒性影响；
图2a是体现不同浓度的淫羊藿提取物对B16F10细胞中黑素生成含量的影响；
图2b是体现不同浓度的淫羊藿提取物对B16F10细胞中酪氨酸酶活性的影响；
图2c是B16F10细胞经不同浓度的淫羊藿提取物作用72小时后，在显微镜下所观察到的细胞图片；
图3a是体现不同浓度的淫羊藿提取物对Melan-A细胞中黑素生成含量的影响；
图3b是体现不同浓度的淫羊藿提取物对Melan-A细胞中酪氨酸酶活性的影响；
图3c是Melan-A细胞经不同浓度的淫羊藿提取物作用72小时后，在显微镜下所观察到的细胞图片；
图4a是体现一定浓度的淫羊藿提取物对B16F10细胞的作用时间与黑素生成含量之间的关系；
图4b是体现一定浓度的淫羊藿提取物对B16F10细胞的作用时间与酪氨酸酶活性之间的关系；
图4c是B16F10细胞经淫羊藿提取物作用72小时后，在显微镜下所观察到的细胞图片；
图5a是体现一定浓度的淫羊藿提取物对Melan-A细胞的作用时间与黑素生成含量之间的关系；
图5b是体现一定浓度的淫羊藿提取物对Melan-A细胞的作用时间与酪氨酸酶活性之间的关系；
图5c是Melan-A细胞经淫羊藿提取物作用72小时后，在显微镜下所观察到的细胞图片；
图6a和图6b体现了不同浓度的淫羊藿提取物对斑马鱼黑素生成含量的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中所用的淫羊藿药材购自上海康桥中药饮片厂，被鉴定为淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim.)
实施例1淫羊藿提取物的制备
取淫羊藿药材1kg，用体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液进行回流提取2次，每次2小时，对合并的2次提取液进行减压浓缩回收乙醇后，将浓缩物置于60℃烘箱中真空烘干，从而得到本发明所述的淫羊藿提取物。
实施例2检测淫羊藿提取物对小鼠B16F10细胞的毒性影响
使用B16F10细胞，加入淫羊藿提取物，经药物干预，随后加入CCK-8试剂，检测B16F10细胞的存活数目，进行标准化计算，所有数据均采用mean±SEM表示，n≥3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
(1)B16F10细胞培养
从液氮罐中取出冻有B16F10细胞的冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不停摇动，在1min内使其完全融化。将融化的细胞悬液加入含5mL DMEM培养基离心管中，于室温下1000r·min-1离心5min，弃去上层液，加入1mL高糖DMEM培养基重悬，转移至大皿中，再加入含10％FBS的DMEM培养基，吹匀，于37℃、5％CO2培养细胞至贴壁后更换培养基继续培养，当细胞长至80％时传代，所有实验用细胞保持在3～20代内。
(2)铺板
计数B16F10细胞，以1×104/孔的细胞密度接种于用含10％FBS的DMEM 96孔板中，于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。
(3)给药
细胞贴壁后，改换2.5％FBS的DMEM进行培养，并加入不同质量的淫羊藿提取物使配制成浓度分别为1、5、10、20、30、40μg/mL，并设置空白对照组，分别作用时间为48小时和72小时。
(4)测定细胞存活率
药效时间到后，每孔中加入10μL的CKK-8试剂反应2～4小时，再置于450nm下测定每孔吸光度值，并进行计算。
(5)数据分析
利用PRISM软件进行作图及数据分析，不同干预组的差异性比较采用ANOVA分析，p<0.05认为组间差异具有统计学意义。
(6)实验结果
图1是体现不同浓度的淫羊藿提取物在分别作用48小时和72小时下，对B16F10细胞的毒性影响；由图1所示结果可见：即使浓度达40μg/mL的淫羊藿提取物在作用72小时后，也没有对B16F10细胞产生明显毒性，说明本发明所述的淫羊藿提取物具有很高的安全性。
实施例3考察不同浓度的淫羊藿提取物在小鼠B16F10和Melan-A细胞中的促黑作用
使用B16F10和Melan-A细胞，加入经DMEM培养基配制而成的浓度分别为10、20、30、40μg/mL的淫羊藿提取物溶液进行药物干预72小时，然后分别测定细胞中黑素含量和酪氨酸酶活性，所有数据均采用mean±SEM表示，n≥3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
(1)B16F10和Melan-A细胞培养
从液氮罐中取出冻有B16F10和Melan-A细胞的冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不停摇动，在1min内使其完全融化。将融化的细胞悬液加入含5mL DMEM培养基离心管中，于室温下1000r·min-1离心5min，弃去上层液，加入1mL高糖DMEM培养基重悬，转移至大皿中，再加入含10％FBS的DMEM培养基，吹匀，于37℃、5％CO2培养细胞至贴壁后更换培养基继续培养，当细胞长至80％时传代，所有实验用细胞保持在3～20代内。
(2)铺板
计数细胞，以1.5×106/皿的细胞密度接种于用含10％FBS的DMEM 96孔板中，于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。
(3)给药
细胞贴壁后，改换2.5％FBS的DMEM进行培养，并加入淫羊藿提取物至浓度分别为10、20、30、40μg/mL，IBMX作为阳性对照药，分别作用72小时。
(4)测定细胞中蛋白含量
从培养箱中取出给药72h后的细胞，分别用PBS(pH 7.2)洗3遍后，每孔加细胞裂解液300μL，收集细胞；使收集的细胞于4℃裂解20min，然后于4℃、14,000r·min-1离心15min，收集上清用于蛋白定量，即：取BCA试剂盒中试剂A和试剂B按50:1的体积比配制成BCA 工作液备用；取标准蛋白液(0.5mg/mL)与PBS(pH 7.2)按照0:20、1:19、2:18、4:16、8:12、12:8、16:4、20:0的比例加入96孔板中，再加适当体积的由淫羊藿提取物所作用的细胞蛋白样品到96孔板中，用PBS(pH 7.2)稀释至总体积为20μL，每孔加入200μL BCA工作液，于37℃孵育30min，再于562nm处测定OD值，计算蛋白浓度。
(5)测定细胞中黑素含量
加入不同浓度的淫羊藿提取物溶液培养72h后，用PBS清洗细胞2遍，收集细胞加300μL非变性裂解液(含1nM PMSF)，于4℃裂解20min后再于4℃、14000r·min-1离心15min，取上清液用于蛋白定量，下层黑素沉淀加入200μL的NaOH(含10％DMSO)，再置于80℃恒温箱中煮2h，再于14000r·min-1离心10min，取约100μL于96孔板中测定在470nm波长下的OD值，并计算黑素/蛋白的数值。
(6)测定细胞中酪氨酸酶的活性
加入不同浓度的淫羊藿提取物溶液培养72h后，用PBS洗2遍，收集细胞于EP管中，每管加入300μL非变性裂解液(含1nM PMSF)，于4℃裂解20min后再于4℃、14000r·min-1离心15min，取上清液用于蛋白定量，计算蛋白浓度；再取含20μg蛋白的体积样品加入96孔板，用PBS(pH 6.8)定容至100μL，再加入0.01％g/mL L-DOPA 100μL，于37℃避光孵育60min，再于波长475nm处测定OD值，计算酪氨酸酶的相对活性。
(7)数据分析
利用PRISM软件进行作图及数据分析，不同干预组的差异性比较采用ANOVA分析，p<0.05认为组间差异具有统计学意义。
(8)实验结果
图2a是体现不同浓度的淫羊藿提取物对B16F10细胞中黑素生成含量的影响，图2b是体现不同浓度的淫羊藿提取物对B16F10细胞中酪氨酸酶活性的影响，由图2a和2b可见：本发明所述的淫羊藿提取物对B16F10细胞中的黑素生成和酪氨酸酶活性均具有明显促进作用，且呈现出浓度依赖性；另外，图2c是B16F10细胞经不同浓度的淫羊藿提取物作用72小时后，在显微镜下所观察到的细胞图片；由图2c也可见：与空白组相比较，给药组中黑素的含量明显增多，且随着淫羊藿提取物的作用浓度增大而增多。
图3a是体现不同浓度的淫羊藿提取物对Melan-A细胞中黑素生成含量的影响，图3b是体现不同浓度的淫羊藿提取物对Melan-A细胞中酪氨酸酶活性的影响，由图3a和3b也可见：本发明所述的淫羊藿提取物对Melan-A细胞中的黑素生成和酪氨酸酶活性均具有明显促进作用，且呈现出浓度依赖性；另外，图3c是Melan-A细胞经不同浓度的淫羊藿提取物作用72小时后，在显微镜下所观察到的细胞图片；由图3c也可见：与空白组相比较，给药组中黑素的含量明显增多，且随着淫羊藿提取物的作用浓度增大而增多。
实施例4考察不同作用时间下淫羊藿提取物在小鼠B16F10和Melan-A细胞中的促黑作用
使用B16F10和Melan-A细胞，加入经DMEM培养基配制而成的浓度为40μg/mL的淫羊藿提取物溶液分别进行药物干预12、24、48、72h，然后分别测定细胞中黑素含量和酪氨酸酶活性，所有数据均采用mean±SEM表示，n≥3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
(1)B16F10和Melan-A细胞培养
从液氮罐中取出冻有B16F10和Melan-A细胞的冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不停摇动，在1min内使其完全融化。将融化的细胞悬液加入含5mL DMEM培养基离心管中，于室温下1000r·min-1离心5min，弃去上层液，加入1mL高糖DMEM培养基重悬，转移至大皿中，再加入含10％FBS的DMEM培养基，吹匀，于37℃、5％CO2培养细胞至贴壁后更换培养基继续培养，当细胞长至80％时传代，所有实验用细胞保持在3～20代内。
(2)铺板
计数细胞，以7.2×106/皿、4.2××106/皿、2.4×106/皿、1.5×106/皿的细胞密度接种于用含10％FBS的DMEM 96孔板中，于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。
(3)给药
细胞贴壁后，改换2.5％FBS的DMEM进行培养，并加入淫羊藿提取物至浓度为40μg/mL，IBMX作为阳性对照药，分别作用12、24、48、72h。
(4)测定细胞中蛋白含量
从培养箱中取出给药12、24、48、72h后的细胞，分别用PBS(pH 7.2)洗3遍后，每孔加细胞裂解液300μL，收集细胞；使收集的细胞于4℃裂解20min，然后于4℃、14,000r·min-1离心15min，收集上清用于蛋白定量，即：取BCA试剂盒中试剂A和试剂B按50:1的体积比配制成BCA工作液备用；取标准蛋白液(0.5mg/mL)与PBS(pH 7.2)按照0:20、1:19、2:18、4:16、8:12、12:8、16:4、20:0的比例加入96孔板中，再加适当体积的由淫羊藿提取物所作用的细胞蛋白样品到96孔板中，用PBS(pH 7.2)稀释至总体积为20μL，每孔加入200μL BCA工作液，于37℃孵育30min，再于562nm处测定OD值，计算蛋白浓度。
(5)测定细胞中黑素含量
加入浓度为40μg/mL的淫羊藿提取物溶液培养12、24、48、72h后，用PBS清洗细胞2遍，收集细胞加300μL非变性裂解液(含1nM PMSF)，于4℃裂解20min后再于4℃、14000r·min-1离心15min，取上清液用于蛋白定量，下层黑素沉淀加入200μL的NaOH(含10％DMSO)，再置于80℃恒温箱中煮2h，再于14000r·min-1离心10min，取约100μL于96孔板中测定在470nm波长下的OD值，并计算黑素/蛋白的数值。
(6)测定细胞中酪氨酸酶的活性
加入浓度为40μg/mL的淫羊藿提取物溶液培养12、24、48、72h后，用PBS洗2遍，收集细胞于EP管中，每管加入300μL非变性裂解液(含1nM PMSF)，于4℃裂解20min后再于4℃、14000r·min-1离心15min，取上清液用于蛋白定量，计算蛋白浓度；再取含20μg蛋白的体积样品加入96孔板，用PBS(pH 6.8)定容至100μL，再加入0.01％g/mL L-DOPA100μL，于37℃避光孵育60min，再于波长475nm处测定OD值，计算酪氨酸酶的相对活性。
(7)数据分析
利用PRISM软件进行作图及数据分析，不同干预组的差异性比较采用ANOVA分析，p<0.05认为组间差异具有统计学意义。
(8)实验结果
图4a是体现相同浓度下的淫羊藿提取物的不同作用时间对B16F10细胞中黑素生成含量的影响，图4b是体现相同浓度下的淫羊藿提取物的不同作用时间对B16F10细胞中酪氨酸酶活性的影响，由图4a和4b可见：本发明所述的淫羊藿提取物对B16F10细胞中的黑素生成和酪氨酸酶活性均具有明显促进作用，且随着作用时间的延长作用越明显；另外，图4c是B16F10细胞经一定浓度下的淫羊藿提取物作用72小时后，在显微镜下所观察到的细胞图片；由图4c也可见：与空白组相比较，给药组中黑素的含量明显增多，且随着淫羊藿提取物的作用时间的延长而增多。
图5a是体现相同浓度下的淫羊藿提取物的不同作用时间对Melan-A细胞中黑素生成含量的影响，图5b是体现相同浓度下的淫羊藿提取物的不同作用时间对Melan-A细胞中酪氨酸酶活性的影响，由图5a和5b也可见：本发明所述的淫羊藿提取物对Melan-A细胞中的黑素生成和酪氨酸酶活性均具有明显促进作用，且随着作用时间的延长作用越明显；另外，图5c是Melan-A细胞经一定浓度下的淫羊藿提取物作用72小时后，在显微镜下所观察到的细胞图片；由图5c也可见：与空白组相比较，给药组中黑素的含量明显增多，且随着淫羊藿提取物的作用时间的延长而增多。
实施例5考察淫羊藿提取物对斑马鱼黑素生成的影响
(1)斑马鱼胚胎收集培养：
斑马鱼胚胎孵育前一天选取4条成年雌鱼和4条成年雄鱼分别置于塑料培养器中，中间用塑料透明隔板隔开，在斑马鱼房熄灯后置于暗箱中；第二天斑马鱼房开灯时置于明场中抽掉中间隔板20min后收集胚胎；挑选去除斑马鱼排泄物和发育不良的胚胎后培养于光照培养箱，条件如下：28℃、14h明亮和10h暗箱。
(2)斑马鱼幼鱼黑素含量测定：
收集经不同浓度(1、10、100μg/mL)淫羊藿提取物作用72h后的斑马鱼胚胎于1.5mLEP管中，加入细胞裂解液100μL(含1nM PMSF)超声破碎仪超声破碎30s后，于4℃、12000r·min-1离心10min后，将上清蛋白液转移至另一EP管中，向下层黑素中加入含10％DMSO的NaOH100μL于80℃水浴2h，然后吸取80μL至96孔板于405nm波长下测定OD值，计算其黑素含量。
(3)数据分析
利用PRISM软件进行作图及数据分析，不同干预组的差异性比较采用ANOVA分析，p<0.05认为组间差异具有统计学意义。
(4)实验结果
图6a和图6b体现了不同浓度(1、10、100μg/mL)的淫羊藿提取物对斑马鱼黑素生成含量的影响，由图6a和图6b所示结果可见：浓度为100μg/mL的淫羊藿提取物可显著促进斑马鱼黑素的生成。
由上所述可见：本发明所述的淫羊藿提取物能够显著提高小鼠B16F10和Melan-A细胞中黑素生成能力和酪氨酸酶的活性，且能够明显增加斑马鱼黑素的生成能力，因此，以本发明所述的淫羊藿提取物作为活性成分有望用于制备预防或/和治疗色素脱失性疾病的药物制剂或护肤品，对拓展淫羊藿药材应用具有显著价值。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种淫羊藿提取物的应用，其特征在于：所述的淫羊藿提取物是指淫羊藿药材经乙醇水溶液提取得到；所述的应用是指以所述的淫羊藿提取物作为活性成分用于制备预防或/和治疗色素脱失性疾病的药物制剂或护肤品。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的淫羊藿提取物，是指淫羊藿药材经体积百分比浓度为45％～95％的乙醇水溶液进行回流提取得到。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的淫羊藿提取物，是指淫羊藿药材先经体积百分比浓度为65％～75％的乙醇水溶液进行回流提取1～3次，每次回流1～3小时，然后对合并的提取液进行减压浓缩，再将浓缩物置于50～70℃烘箱中真空干燥得到。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的色素脱失性疾病包括白癜风、斑驳病、白化病综合症、苯丙酮尿症、灰发症中的至少一种。
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