KR20150142213A

KR20150142213A - 삼백초 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20150142213A
Application number: KR1020140070563A
Authority: KR
Inventors: 윤현주
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2014-06-11
Filing date: 2014-06-11
Publication date: 2015-12-22

Abstract

본 발명은 삼백초의 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 삼백초의 수용성 추출물은 염증성 사이토카인 TNF-α의 활성을 감소 또는 억제시키는 활성이 우수하고, 세포의 생존능에 영향을 미치지 않고 산화질소(NO)를 감소시키는 효과가 우수하여 염증성 장질환의 예방 또는 치료할 수 있는 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 세포독성이 일어나지 않으며, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에서도 안정한 효과가 있다.

Description

삼백초 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating inflammatory bowel disease comprising Saururus chinenesis extracts}

본 발명은 삼백초 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료를 목적으로 한 약학 조성물에 관한 것이다.

염증 반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침 윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상을 나타낸다. 정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 질환의 주요 병리현상(과민성질환, 만성 염증)이 되며, 수혈, 약물투여, 장기이식 등 치료과정에서도 장해요인이 된다.

생체에 있어서 염증 발생 원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 각종 사이토카인(cytokines)이나 외부 자극물질에 의해 급격히 과량 발생되는 NO 는 세포독성이나 각종 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있다.

이러한 염증 반응을 감소시키기 위해 제약학적 제제를 투여하는 것은 통상적인 의료 관례이며, 이러한 특성을 갖는 물질은 항염증성으로 분류된다. 항염증성 약제는 광범위한 질병의 치료에 사용되고 있고, 동일한 약제가 종종 상이한 질병의 치료에 사용되어 부작용을 공유한다.

따라서 많은 종류의 항염증성 물질이 사용되고 있음에도 불구하고, 부작용이 없고 우수한 항염 효능을 보유하는 물질의 필요성이 여전히 요구되고 있는 시점에서, 본 발명자들은 식물 종 중에서 항염 활성이 우수하고, 인체에 안전한 천연 항염제를 개발하였다.

본 발명에서 사용한 삼백초(三白草, Saururus chinensis)는 삼백초과 (Saururaceae)에 속하는 다년생 초본으로 민간에서 전초(全草) 또는 뿌리, 잎이 풍독(風毒), 이뇨(利尿), 수종(水腫), 임질(淋疾), 간염(肝炎), 폐렴(肺炎), 변독(便毒), 고혈압(高血壓) 등의 치료에 사용되어 왔으며, 전초의 성분으로는 메틸- n -노닐-케톤(methyl- n -nonyl-ketone), 줄기에는 가수분해성 탄닌이 함유되어 있고, 잎에는 쿼세틴(quercetin), 쿼시트린(quercitrin), 이소쿼시트린(isoquercitrin), 아비큘라린(avicularin), 하이페린(hyperin), 루틴(rutin) 및 가수분해성 탄닌이 함유되어 있다(정 보섭 및 신 민교, 향약대사전, 영림사, pp812-814, 1990). 그러나 이러한 삼백초가 염증성 장질환의 치료에 사용될 수 있다는 내용에 대해서는 보고된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 염증성 장질환의 새로운 치료제를 연구하던 중, 생체 내 및 생체 외 실험을 통한 미세 관찰과 더불어 분자생물학적인 실험을 통하여 삼백초 추출물의 염증성 장질환의 치료제로서의 가능성을 연구한 결과, 삼백초 추출물이 LPS로 유도된 쥐의 대식세포에서 세포 생존능에는 영향을 미치지 않고 산화질소(NO) 생성을 조절 및 억제하는 것을 확인하였고, TNBS로 염증성 장질환이 유도된 대장 조직의 검사를 통한 염증성 장질환의 치료 가능성을 확인하였다. 또한 염증 사이토카인 TNF-α의 활성을 저해하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국특허출원 제2007-0016127호

이에 본 발명자들은 삼백초 수용성 추출물이 부작용 없이 염증성 장질환을 효과적으로 치료할 수 있는 치료제로 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 삼백초의 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 삼백초의 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 삼백초의 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 삼백초의 수용성 추출물은 분자량이 1000Da 이하의 친수성 화합물을 함유하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 삼백초의 수용성 추출물은 경구투여 또는 대장 직접투여가 가능한 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 삼백초의 수용성 추출물은 물을 이용하여 수득한 추출물일 수 있다.

또한, 본 발명은 삼백초의 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.

본 발명은 삼백초 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 삼백초 수용성 추출물은 염증성 사이토카인 TNF-α의 활성을 감소 또는 억제시키는 활성이 우수하고, 세포의 생존능에 영향을 미치지 않고 산화질소(NO)를 감소시키는 효과가 우수하여 염증성 장질환의 예방 또는 치료할 수 있는 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 세포독성이 일어나지 않으며, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에서도 안정한 효과가 있다.

도 1은 삼백초의 열수 조추출물(SC0)을 세파덱스-G50 컬럼크로마토그래피하여 도출된 그래프이며, 피크 구역은 SC1으로 명명한 결과이다.
도 2는 SC0 또는 SC1이 처리된 RAW-264.7 마크로파지 세포주로부터 산화질소(NO) 생성양 비교 그래프(A)와 MTT 분석을 이용한 세포생존능(B)을 측정한 결과이고, 각 Lane에 대한 설명은 다음과 같다.
1 : LPS 비처리군
2 : LPS 처리군
3 : LPS 및 덱사메타손 처리군
4 : LPS 처리 전 SC0 1.6 mg/ml 처리군
5 : LPS 처리 전 SC0 0.16 mg/ml 처리군
6 : LPS 처리 전 SC0 0.016 mg/ml 처리군
7 : LPS 처리 전 SC1 1.0 mg/ml 처리군
8 : LPS 처리 전 SC1 0.01 mg/ml 처리군
9 : LPS 처리 전 SC1 0.001 mg/ml 처리군
도 3은 대장벽 두께(A), 대장벽 표면의 광학현미경 관찰(B), 대장 조직 단면의 HE 염색(C)를 측정한 결과이고, 각 Lane에 대한 설명은 다음과 같다.
a) 50% 에탄올 처리군
b) 2% TNBS 처리군
c) 2% TNBS 및 SC1 10 mg/ml 처리군
d) 2% TNBS 및 SC1 1 mg/ml 처리군
e) 2% TNBS 및 SC1 0.1 mg/ml 처리군
도 4는 대장벽 두께(A), 대장벽 표면의 광학현미경 관찰(B), 대장 조직 단면의 HE 염색(C)를 통한 SC1 분획물의 경구 투여에 따른 TNBS 유발 염증성 장질환 활성효과를 측정한 결과이고, 각 Lane에 대한 설명은 다음과 같다.
a) 물을 경구 투여한 쥐에 50% 에탄올을 대장 직접투여한 처리군
b) 물을 경구 투여한 쥐에 2% TNBS를 대장 직접투여한 처리군
c) 1 mg/ml SC1을 경구 투여한 쥐에 50% 에탄올을 대장 직접투여한 처리군
d) 1 mg/ml SC1을 경구 투여한 쥐에 2% TNBS를 대장 직접투여한 처리군
도 5는 TNBS가 처리된 대장 조직의 SC1 처리에 따른 TNF-α 유전자 발현 정도를 RT-PCR(A)과 Real-time PCR(B)을 통해 측정한 결과이고, 각 Lane에 대한 설명은 다음과 같다.
a) 2% TNBS 비처리군에 물을 주입한 처리군
b) 2% TNBS 비처리군에 50% 에탄올을 주입한 처리군
c) 2% TNBS 단독 처리군
d) SC1 1 mg/ml 단독 처리군
e) 2% TNBS 및 SC1 1 mg/ml 처리군

본 발명은 삼백초(Saururus chinenesis) 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함을 그 특징으로 한다.

본 발명자들은 대장성 장질환 치료를 위한 새로운 치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, 삼백초에 주목하였는데 삼백초는 제주도와 지리산 일부지역에서 나는 다년생 초본이다. 습기가 많은 계곡의 바람이 잘 통하고 공중습도가 높으며 반그늘인 곳에서 자라며, 키는 50~100cm, 잎은 길이 5~15cm, 폭은 0.3~0.8cm로 긴 타원형이며 어긋나게 난다. 잎 표면은 연한 녹색이고 뒷면은 연한 백색이며 꽃이 필 무렵에는 윗부분의 잎 2~3개가 백색으로 변하고 5~7개의 맥이 있으며 끝은 뾰족하고 가장자리는 밋밋하다. 뿌리는 백색으로 흙속으로 파고들며 옆으로 뻗으면서 자란다. 꽃은 백색으로 아래로 처지다가 끝부분은 위로 올라가며 잎과 마주나고 길이는 10~15cm이고 꼬불꼬불한 털이 있다. 열매는 9~10월경에 꽃망울에 한 개씩이 둥글게 달린다. 관상용으로 쓰이고, 꽃을 포함한 잎과 줄기 뿌리는 약재로 쓰인다.

삼백초는 해독 및 이뇨 작용을 하여 신장염과 부종 등의 치료약으로 쓰이기도 하며, 강력한 살균 작용을 하기 때문에 상처가 났을 때 생잎을 짓찧어 붙이면 좋다고도 알려져 있다.

한편 본 발명에서는 삼백초 추출물이 염증성 장질환의 예방 또는 치료를 위한 용도로 사용할 수 있다는 사실을 최초로 규명하였으며, 특히 삼백초 열수 추출물(SC1)이 염증성 사이토카인 TNF-α를 억제시킬 수 있음을 확인하였고, 염증성 장질환의 염증을 억제 및 치료하는 효과도 있음을 확인할 수 있었다.

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에 의하면, 삼백초의 열수추출물 SC0를 분획하여 SC1 분획물을 수득하였고(도 1 참조), 상기의 수득물이 염증성 장질환의 치료 및 예방에 유효한지를 RAW-264.7 마크로파지 세포주와 IBD 유발 마우스 모델을 이용하여 조사하였다.

RAW-264.7 마크로파지 세포주를 대상으로 산화질소(NO) 생성양과 세포 생존능 분석을 한 결과 농도의존적으로 산화질소 생성양이 감소함을 확인하였고, 세포독성이 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다(도 1 참조).

또한 본 발명자들은 다른 일실시예를 통해 TNBS 처리를 통한 염증성 장질환 유도 마우스를 제조하였고, 이때 삼백초 추출물의 항염증 효과를 분석하기 위해 직접 대장 주입법을 통한 항염증 효과 분석과 경구 투여를 통한 항염증 효과 분석을 실시하였으며, 직접 대장 주입법을 통한 항염증 효과 분석에서는 TNBS와 삼백초 추출물 SC1의 병용 주입효과를 확인하고자, 마우스에 0.1, 1, 10 mg/ml의 SC1과 TNBS를 병용 주입하여 측정한 결과, 대조군에 비하여 삼백초 추출물 처리군의 경우 염증 효과가 유의성 있게 감소하였음을 알 수 있었다(도 3 참조). 또한 경구 투여를 통한 항염증 효과 분석에서는 삼백초 추출물 SC1의 경구 투여 효과를 확인하고자, 마우스에 1 mg/ml의 SC1를 미리 경구 투여하고 TNBS를 주입하여 측정한 결과, 대조군에 비하여 삼백초 추출물 처리군의 경우 염증 효과가 유의성 있게 감소하였음을 알 수 있었다(도 4 참조).

나아가 본 발명자들은 TNF-α 발현에 따른 항염증 활성 억제에 대한 삼백초 추출물 SC1의 영향을 확인 한 결과, SC1을 1 mg/ml의 농도로 처리하였을 때 대조군에 비하여 발현량이 10배 정도까지 감소되었으며, 삼백초 추출물에 의해 완전히 억제되었음을 알 수 있었다(도 5 참조).

그러므로 본 발명자들은 하기 실시예에서 입증된 실험 결과를 토대로 본 발명의 삼백초의 수용성 추출물이 염증성 장질환을 치료하기 위한 약학적 용도로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

구체적으로 본 발명의 삼백초 수용성 추출물이 적용될 수 있는 상기 염증성 장질환으로는 이에 제한되지는 않으나, 궤양성 대장염, 크론병, 베체트 병 등 알 수 없는 원인으로 장에 염증이나 궤양이 생기는 만성 염증성 질환으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

나아가 이 외에도 본 발명의 삼백초 추출물은 면역과 관련된 염증제어 기능이 있고, 염증성 장질환을 포함하는 염증 질환을 예방 및 치료할 수 있다.

따라서 염증성 장질환과 같은 염증 질환의 치료를 위해서는 사이토카인의 발현을 억제하는 물질이 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 점에서 본원의 삼백초 추출물은 사이토카인 TNF-α의 발현을 억제할 수 있어 항염증 효과가 있고, 세포독성이 없이 산화질소(NO) 생성을 감소시킬 수 있어 염증성 장질환의 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 삼백초(Saururus chinenesis)은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된추출물은 적절한 용매를 이용하여 삼백초로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 삼백초의 열수추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함할 수 있다.

삼백초로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 당업계에서 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 삼백초 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 삼백초 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.

따라서 본 발명에 있어서 삼백초 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

이러한 삼백초 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 삼백초 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ug/ml 내지 500 ug/ml의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 삼백초 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 삼백초 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 삼백초 수용성 추출물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 염증성 장질환의 예방 및 치료를 위한 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 염증성 장질환의 예방 및 치료를 위한 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 건강기능식품이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 삼백초 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 삼백초 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 삼백초 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 삼백초 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 삼백초 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 추가적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

통계처리

본 실험의 하기 실험결과들은 차이를 분석하기 위하여 Student's t-test를 이용하여 분석하였고, p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

<실시예 1>

시약 및 실험 동물의 준비

1-1. 시약

세포 배양에 사용된 시약과 화학약품인 TNBS, 덱사메타손(dexamethasone), LPS(lipopolysaccharide), 그리스 시약(Griess reagent), DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)는 시그마 화학회사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

또한, FBS(Fetal bovine serum)는 Gibco(Grand Island, NY, USA)에서, TACS MTT Assay kit는 R&D systems(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였고, SV Total RNA Isolation System 및 SYBR Green master mix는 Promega(Madison, WI, USA)로부터 입수하였다. cDNA 합성을 위한 Omniscript Reverse Transcriptase는 Qiagen (Hilden, Germany)으로부터 구입하였고, PCR(polymerase chain reaction)을 위한 프라이머(primer)는 바이오닉스(서울, 대한민국)에서 합성하였다.

조직 섹션을 위한 OCT(Optimal cutting temperature) 조성물은 Sakura(Tokyo, Japan)로부터 구입하였고, 조직 염색을 위한 Harris hematoxylin 과 eosin은 영동제약(용인, 대한민국)과 시그마 화학회사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

1-2. 실험동물의 준비

6주령의 암컷 ICR 마우스는 효창사이언스(대구, 대한민국)에서 구입하였고, 본 발명에서 SC1 분획물의 항염증 활성 분석을 위해 사용된 마우스는 IBD (Inflammatory Bowel Disease, 염증성 장질환) 유발 마우스 모델로 하기와 같은 방법으로 제조되었다.

IBD 유발 마우스 모델을 제조하기 위해서 마우스를 마취한 뒤, 마취된 마우스의 항문에 고무 카눌라(cannula)의 삽입을 통해 130μl의 2% TNBS의 대장 주입을 하였다. 상기의 마우스는 30초 동안 수직자세(vertical position)를 취한 뒤 사육장으로 돌려보내졌고 TNBS 주입 이틀 후에 상기의 마우스는 대장 조직의 염증변화 확인을 위해 실험에 사용되었다.

<실시예 2>

삼백초 수용성 추출물의 제조

건조된 삼백초(Saururus chinenesis)의 잎과 줄기를 120℃ 고압 하에서 3시간동안 열수 추출하여 열수 조추출물(SC0)을 수득하였다. 열수 조추출물은 이후 증류수를 이용하여 세파덱스 G-50 사이즈 배제 크로마토그래피(Amersham, Sweden)를 사용하여 분획하였고 증류수를 전개액으로 하여 추출물을 분획한 후 분획된 분획물은 흡광도 260nm에서 자외선분광흡수법(UV absorption spectroscopy)을 통해 조사되었다. 260nm의 흡광도에서 특히 높은 흡광도를 보이며 높은 피크 구역을 형성하는 부분이 발생하였는데, 260nm에서 높은 피크 구역을 나타낸 분획물을 SC1이라 명명하였다. 상기 SC1 분획물의 분자 평균 사이즈는 Zorbax PSM 60 column (Agilent, Santa Clara, California, USA)과 함께 고성능 액체크로마토그래피(high-performance size exclusion chromatography)로 확인한 결과 그 분자량이 1000Da 이하인 친수성을 띄는 작은 화합물들을 다수 함유하고 있는 것을 확인하였다(도 1 참조). 이러한 방법으로 수득한 삼백초의 수용성 분획물(물을 이용하여 추출한 수용성 추출물)을 하기 실험에서 시료로 사용하였다.

또한, 상기 건조된 국산 삼백초(Saururus chinenesis)는 본초원(김해, 대한민국)에서 구입하였고, 상기의 삼백초는 인제대학교 생물과학부에 대조표본으로 보관하고 있다.

<실험예 1>

SC1 분획물의 항염증 활성 분석(생체 외 실험(in vitro))

실시예 1에서 수득한 삼백초의 수용성 추출물에 대해 항염증 효과를 알아보기에 앞서, 실험에 사용되는 삼백초 추출물을 농도를 달리하여 첨가하였을 때, 항염증 활성을 나타내는지 관찰하기 위하여 하기와 같이 생체 외 실험을 수행하였다.

SC1 분획물의 항염증 활성 분석을 위해 생체 외 실험을 하고자 RAW 264.7 마크로파지 세포주를 10% FBS 페니실린을 포함한 웰플레이트에 분주하여 준비하였다. 준비된 상기의 세포는 1.6, 0.16, 0.016 mg/ml 농도의 SC0 열수 조추출물 또는 1.0, 0.10, 0.010 mg/ml SC1 분획물을 처리하였고, 양성 대조군으로는 0.01μM 덱사메타손(dexamethasone)을 처리한 군을 사용하였다. 실험을 위해 처리한 각 시험군은 하기 표 1에 나타내었다.

상기의 세포들은 시료 처리 1시간 후 LPS 1μg/ml를 처리하여 15시간 배양한 후, 배지 내에서 생성된 산화질소(NO) 양을 그리스 반응(Griess reaction, Green et al. 1982)을 이용하여 측정하였는데, 배양한 상층액 100μl를 동일한 양의 그리스 시약(Griess reagent)과 섞고 상온에 10분간 반응시킨 후 산화질소(NO) 농도를 sodium nitrite standard curve를 이용하여 계산하였다.

또한, 세포생존능을 측정하기 위해, 각 웰의 배양 상층액을 깨끗한 DMEM으로 교체하고, MTT 시약이 보라색으로 변할 때까지 처리한 후, detergent solution으로 침전물을 제거한 뒤 595nm에서 흡광도를 측정하는 TACS MTT Assay(R&D systems)를 이용하여 확인하였다.

분석 결과, 생성된 산화질소(NO)의 양은 SC0 또는 SC1을 처리한 군에서 농도의존적으로 산화질소(NO)의 생성이 억제되는 것으로 나타났으며, 1.6 mg/ml SC0와 1.0 mg/ml SC1을 처리한 군은 덱사메타손이 처리된 군에 비해 더 효과적으로 산화질소의 생성이 억제되는 것으로 나타났다(도 2 참조).

또한 RAW 264.7의 세포생존능을 확인한 결과, SC0와 SC1은 세포 생존에 영향을 미치지 않고 LPS에 유발된 산화질소(NO) 생성과정을 조절하는 것으로 확인하였다(도 2B 참조).

따라서, SC0 조추출물과 SC1 분획물은 LPS에 의해 생산되는 염증인자인 산화질소(NO)를 유의하게 억제하는 결과를 나타냈으며 반면 세포에는 아무런 독성을 유발시키지 않는 것을 알 수 있었다.

<실험예 2>

SC1 분획물의 항염증 활성 분석(생체 내 실험(in vivo))

삼백초 수용성 추출물의 항염증 효과를 알아보기에 앞서, 실험에 사용되는 농도의 삼백초 추출물을 첨가 시 항염증 활성을 나타내는지 관찰하기 위해 실시예 1-2의 IBD 유발 마우스 모델을 사용하였고, SC1 분획물의 투여 방법에 따른 효과를 확인하기 위해 직접 대장 투입법과 경구 투여법으로 나누어 실험하였다.

또한, 상기의 투여법으로 실험된 마우스를 이용한 항염증 활성 분석을 위해 항문 기부 4cm로부터 떨어진 대장 구획을 절개하였고, 절개된 대장 조직은 10% 포름알데히드에 보존하고, 고정된 조직은 cryosat으로 절단하기 이전에 OCT 화합물에 고정시켰다. 상기의 방법으로 절개된 대장 조직은 대장벽의 두께, 대장 표면의 괴저성 손상의 존재를 확인하였고, 5㎛ 단면은 헤마톡실린과 에오신과 함께 염색하여 조직 단면의 조직학적 분석을 위한 대장 조직의 상피점막구조의 분열과 염증세포의 침투는 광학현미경으로 확인하였다.

<2-1> 직접 대장 주입법을 통한 TNBS와 SC1의 병용 투여

TNBS 유발 염증성 장질환 모델에서 SC1를 직접 대장으로 투여한 후 대장 조직의 염증 변화 수준을 확인하였는데, 이를 위해 하기 표 2과 같이 5그룹으로 나누어 실험하였고, 대장 벽 두께 측정, 대장 벽 표면 조사, 대장 단면염색 실험을 수행하였다

대장 벽의 두께를 측정한 결과, TNBS로 염증성 장질환이 유도된 군의 대장벽의 두께가 염증으로 인해 두꺼워진 반면, SC1를 병용 주입한 마우스(sample-treated group)은 염증성 장질환이 유도된 군에 비해 대장 벽의 두께가 얇아진 것으로 확인되었고, 가장 우수한 효과를 보인 실험그룹은 TNBS와 1mg/ml SC1, TNBS와 10mg/ml SC1 마우스 그룹으로 TNBS 비처리군(control group), 즉 정상수준과 비슷한 수준을 보이는 것을 확인하였다(도 3A 참조).

또한, 대장 벽의 표면을 조사한 결과, TNBS가 처리되어 염증성 장질환이 유도된 대장 표면은 출혈성 괴사로 인하여 매우 어둡게 보이나(도 3Bb), TNBS와 SC1이 함께 주입된 마우스(sample-treated group)의 대장벽은 TNBS 비처리 마우스(control group)의 대장벽 상태처럼 깨끗하게 나타난 것으로 확인되었고 TNBS와 SC1의 병용 주입이 TNBS에 의해 유발된 괴저성 손상을 억제할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다(도 3B 참조).

또한 대장 단면 염색을 통한 대장 조직 상피점막구조의 손상 정도를 실험한 결과, TNBS 단독 처리 마우스(TNBS control group)의 대장 조직 상피점막구조는 강하게 궤양성 손상을 받은 것으로 나타났다(도 3C b). 반면에 TNBS와 SC1이 함께 주입된 마우스(sample-treated group)의 대장 조직 상피점막구조가 TNBS 비처리 쥐(control group)와 같이 온전하게 남아 있는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 SC1이 면역조절활성을 통해 염증손상의 진행을 억제 및 감소시켜 궁극적으로 염증성 장질환을 예방 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다(도 3C 참조).

<2-2> 경구투여를 통한 TNBS와 SC1의 병용 투여

TNBS 유발 염증성 장질환 모델에서의 SC1 경구 투여를 통한 대장 조직의 염증 변화 수준을 확인하기 위해, SC1을 4일간 지속적으로 식이한 뒤 마지막 식이가 끝난 후 2시간 뒤에 상기 실시예 1-2와 같이 2% TNBS를 직접 대장 주입법을 이용하여 모델을 제조하였다. 마우스 실험군을 표 3과 같이 4그룹으로 나누어 실험하였고, 상기의 그룹을 이용하여 대장 벽 두께 측정, 대장 벽 표면 조사, 대장 단면염색 실험을 수행하였다.

대장 벽의 두께를 측정한 결과, SC1을 미리 경구 투여한 마우스(sample-treated group 2)는 TNBS가 비처리된 마우스(control group)와 거의 유사한 대장벽 두께 감소율을 보여 유의한 결과를 나타냈다(도 4A 참조).

대장 벽의 표면을 조사한 결과, SC1을 미리 경구 투여한 마우스(sample-treated group 2)의 대장벽 표변에서는 괴저성 손상이 없음을 확인하였고, 이를 통해 SC1 경구투여에 의한 TNBS 처리로 유발된 출혈성 괴저의 억제를 확인하였다(도 4B 참조).

또한 대장 단면 염색을 통한 대장 조직 상피점막구조의 손상 정도를 실험한 결과, SC1의 경구투여는 TNBS에 의한 대장 조직에서의 대장 상피 점막의 궤양성 손상과 leucocyte infiltration 모두를 억제하는 것으로 나타났다(도 4C 참조).

따라서, SC1 분획물의 경구투여 효과는 TNBS에 의해 유발된 대장의 염증 발전과 대장 조직의 조직 손상을 억제 및 조절하는 것을 확인하였다(도 4 참조).

<실험예 3>

대장 조직에서 SC1 분획물에 의한 염증성 인자인 TNF-α 발현억제 효과

삼백초 수용성 추출물(SC1)의 TNF-α 발현 조절 효과를 확인하기 위하여 표 4와 같이 마우스 실험군을 5그룹으로 나누어 하기와 같이 실험을 수행하였다. TNBS로 유발된 염증 유발 대장세포에서의 TNF-α 발현 정도는 RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction)과 realtime PCR을 이용하여 측정하였다. Total RNA는 2% TNBS 단독 처리 마우스와 2% TNBS 및 1mg/ml SC1을 병용 처리한 마우스로의 대장 조직을 절단하여 준비하였다. RNAs는 SV total RNA Isolation System을 이용하였고, cDNA(complementary DNA) 합성은 Omniscript RT kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 준비하였다. cDNA 증폭을 위한 프라이머는 TNF-α 및 β-actin에 특이적인 프라이머 세트를 사용하였다. TNF-α를 증폭하기 위한 프라이머는 ATGAGCACAGAAAGCATGATC 과 TACAGGCTTGTCCGAATT를 사용하였고, β-actin을 증폭하기 위한 프라이머는 GGCACCAGGGTGTGATGG 와 ACGGTTGGCCTTAGGGTTC를 사용하였다(표 5 참조). PCR 반응은 표 6와 같은 증폭 조건 아래에서 수행하였다. TNF-α의 발현 수준은 SYBR Green과 ABI PRISM 7300 Real Time PCR System을 이용한 real-time PCR을 이용하여 측정하였다. TNF-α 및 β-actin 프라이머 세트 모두 RT-PCR에 사용되었고, cDNA는 표 7와 같은 증폭 조건 아래에서 수행하였다. TNF-α 발현 수준의 상관관계는 C_Tmethod(C_T) 비교를 이용하여 계산되었다.

TNF-α 유전자의 전사수준에서의 SC1 효과를 확인한 결과, 2% TNBS 단독 처리 마우스의 대장조직에서 매우 증가된 TNF-α 발현도를 보인 것을 확인하였고, 반면에 2% TNBS 및 1mg/ml SC1을 병용 처리한 마우스의 대장조직에서는 TNBS에 의해 상향조절된 TNF-α가 병용처리에 의해 하향조절되었음을 확인하였다. 또한 이러한 발현 양상은 TNBS 비처리 마우스의 TNF-α 발현수준과 비슷한 수준임을 확인하였다(도 5A 참조).

또한 Realtime PCR을 이용한 TNF-α 발현량 조사에서, 2% TNBS 및 1mg/ml SC1을 병용 처리한 마우스의 대장 조직(도 5Be)은 2% TNBS 단독 처리 마우스의 TNF-α 전사량의 10배 감소효과가 있음을 보였다. 이는 TNBS가 미처리된 쥐의 수준과 거의 비슷한 수준으로 확인되었다(도 5B 참조).

따라서, SC1 분획물은 TNF-α의 발현을 억제하는 작용을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다(도 5 참조).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

삼백초의 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 삼백초의 수용성 추출물은 분자량이 1000Da 이하의 친수성 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 삼백초의 수용성 추출물은 경구투여 또는 대장 직접투여가 가능한 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 삼백초의 수용성 추출물은 물을 이용하여 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
삼백초의 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품.
제5항에 있어서,
상기 삼백초의 수용성 추출물은 분자량이 1000Da 이하의 친수성 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 건강기능성 식품.
제5항에 있어서,
상기 삼백초의 수용성 추출물은 물을 이용하여 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 건강기능성 식품.