본 발명의 발모, 양모 촉진 및 탈모 방지를 위한 생약 조성물은 가시오가피, 송엽, 송화, 교맥, 생지황 및 지모를 포함하는 생약 추출물의 유산균 발효물과 콜 라겐을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 본 발명의 생약 조성물은 조성물의 총 중량을 기준으로 97 내지 99 중량%의 생약 추출물의 유산균 발효물과 1 내지 3 중량%의 콜라겐을 유효성분으로 함유하고, 여기서 상기 생약 추출물의 생약 함량은 생약 혼합물의 총 중량을 기준으로 42.0 내지 44.4 중량%의 가시오가피, 11.1 내지 11.6 중량%의 송엽, 11.1 내지 11.6 중량%의 송화, 11.1 내지 11.6 중량%의 교맥, 11.1 내지 11.6 중량%의 생지황 및 11.1 내지 11.6 중량%의 지모를 포함한다.
또한, 본 발명의 생약 조성물은
1) 가시오가피, 송엽, 송화, 교맥, 생지황 및 지모를 혼합하여 열수 또는 유기용매로 추출하고, 그 추출물을 감압 농축하는 단계;
2) 단계 1)에서 얻은 생약 추출물에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계;
3) 단계 2)에서 얻은 발효물을 여과하여 얻은 여과물에 콜라겐을 첨가하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
가시오가피(Aacanthopanax senticosus)는 오가피과에 속하는 가시오가피 나무의 수피 또는 뿌리껍질을 말한다. 가시오가피는 주로 강장, 강정, 신경통, 중풍, 이뇨, 식욕부진, 고혈압, 피로회복제 등으로 이용되어 왔으며, 최근 밝혀진 효능에 의하면 흥분 완화 작용, 수면시간 증가, 항산화 및 지질 개선 효과 등이 보고되고 있다. 또한, 주요 성분으로는 배당체인 8종의 엘루우테르사이드와 리그난류, 쿠마린, 탄닌류 등이 있으며, 이들은 항스트레스 작용, 항피로 작용, 항산화 면역 증강 작용 등을 나타낸다. 그 외에도, 가시오가피 잎에 존재하는 사포닌 성분인 엘레우테르사이드는 지질대사를 개선시키는 작용과 혈류를 좋게 한다고 알려져 있다.
송엽(Pini Folium)은 소나무과(Pinaceae)의 식물들 예컨대, 소나무(Pinus Densiflora), 곰솔(Pinus thunbergii), 테에다소나무(Pinus taeda), 리기다소나무(Pinus rigida), 백송(Pinus bungeana), 방크스소나무(Pinus banksiana), 구주소나무(Pinus sylvestris), 만주곰솔(Pinus tubulaeformis var. mukdensis), 잣나무(Pinus koraiensis), 눈잣나무(Pinus koraiensis), 섬잣나무(Pinus parviflora) 또는 스트로브잣나무(Pinus strobus)의 잎을 말한다. 소나무(Pinus Densiflora) 또는 곰솔(Pinus thunbergii)의 잎은 신농본초경집주에 맛은 쓰고 성질은 온순하며 무독하고, 심 또는 비경으로 들어간다고 기록되어 있으며 또한 풍습창을 치료하고, 머리카락을 자라게 하며, 장을 편하게 하고, 오래 살도록 하는 효능이 있다고 기록되어 있다(정보섭 외, 생약대사전, 영림사, 107: 1989).
송화는 소나무의 꽃으로서 동의보감의 원전에는 송화가루는 경신(輕身)하고, 이를 술이나 끊는 물에 타 먹으면 몸이 거뜬해지고, 병의 치료도 솔껍질이나 솔잎 및 송진보다 좋다고 적고 있다.
교맥은 마디풀과의 식물인 메밀에서 얻어지는 열매의 전분을 지칭하는 것으로서, 동양의학에서는 장과 위를 튼튼하게 하고, 오장에 있는 더러운 것을 몰아내고 정신을 맑게 하는 것으로 알려져 있다.
생지황은 현삼과의 여러해살이풀인 지황(Rehmannia glutinosa Liboschitz), 회경지황(Rehmannia glutinosa Libosch. for. hueichingensis Hshlao)의 날 뿌리를 말한다. 생지황은 당뇨병에 좋으며, 토혈, 코피, 자궁출혈을 그치게 하고, 생리불순, 변비에 좋다. 주요성분으로 β-시스토스테롤(β-sistosterol), 미량의 캄페스테롤(campesterol), 레마닌(rehmanin), 알칼로이드(alkaloid), 지방산 등이 확인되었고, 약리학적으로 혈당을 내리고, 순환기 계통에 작용하여 강심 및 이뇨 작용을 보이며, 간기능 보호작용, 항균작용 등이 있다.
지모(Anemarrhena asphodeloides)는 나리(Liliaceae)과에 속하는 식물로서, 중국이 원산지이며 한국에서는 중부지방에서 재배되는 다년초이다. 보통 근경을 건조하여 약재로 사용되어 왔으며 해열 작용, 강심 작용, 이뇨 작용, 양허증, 항균 작용, 거담 작용, 진정 작용, 혈당 강하 작용, 항암 작용이 있으며, 해열제로 사용되고 있다. 지모의 유효성분으로서 아스포닌(Asphonin), 사르사사포닌(Sarsasaponin), 마르코게닌(Markogenin; 2-hydroxy sarsasapogenin) 등의 스테로이드 사포게닌, 티모사포닌(Timosaponin), 치모닌(Chimonin), 프로코카테시산(Prococathechi acid), 판토데니카시드(Pantothenicacid), 플라보노이드(Flavonoids), 탄닌 등이 알려져 있다.
본 발명에 사용되는 생약 추출물은 42.0 내지 44.4 중량%의 가시오가피, 11.1 내지 11.6 중량%의 송엽, 11.1 내지 11.6 중량%의 송화, 11.1 내지 11.6 중량%의 교맥, 11.1 내지 11.6 중량%의 생지황 및 11.1 내지 11.6 중량%의 지모의 혼합물을 추출하여 얻어진 것으로, 천연에서 유래하여 인체에 대한 안전성이 높은 추출물이다. 상기 생약 성분들은 각 원료를 혼합한 상태에서 추출하지 아니하고 각각의 원료에 대하여 별도의 추출과정을 거쳐 수득된 추출물을 혼합하여 준비할 수 도 있다.
이러한 생약 추출물은 통상적으로 식물 추출물을 얻는 추출 방법에 의해 얻어질 수 있으며, 본 발명에서 특별히 한정하지는 않는다. 일례로 각각의 생약을 건조 또는 그대로 분쇄하여 얻어진 생약 분쇄물에, 예컨대 증류수, 유기용매 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출하여 제조될 수 있다. 이때 사용되는 유기용매는 1,3-부틸렌글라이콜, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 에틸아세테이트 또는 아세톤일 수 있으며, 상기 유기용매의 극성에 따라 순차적으로 2종 이상 사용할 수 있다.
생약 추출물은 상기한 바와 같은 중량의 가시오가피, 송엽, 송화, 교맥, 생지황 및 지모의 생약 혼합물에 5 내지 10배의 양으로 용매를 첨가한 후 50 내지 100℃에서 4 내지 10시간 동안 가열하여 추출하는 온침 방법을 사용하거나, 4 내지 25℃의 낮은 온도에서 1 내지 20일간 침적시키는 냉침 방법을 사용하여 얻어진다.
이로부터 수득된 생약 추출물을 20 내지 50 브릭스(brix)가 되도록 60 내지 105℃, 680 내지 720 mmHg 하에서 4 내지 12시간 동안 감압 농축하여 준비한다. 이때, 감압 농축된 생약 추출물을 추가적으로 90 내지 95℃, 740 내지 780 mmHg 하에서 25 내지 60분간 살균할 수도 있다.
본 발명의 생약 추출물의 양은 원료 생약의 비율, 추출액의 양 및 추출 시간 등에 따라 달라지지만, 통상적으로는 원료 생약 1,000 g에 대하여 262± 13 g의 양으로 얻어진다(수율: 26± 5%).
상기와 같이 준비된 생약 추출물을 20 내지 35℃로 항온시킨 후 유산균을 무 균상태에서 접종하고 20 내지 35℃에서 1 내지 7일간 배양하여 발효시킨다. 이때 유산균은 생약 추출물 중량의 1 내지 10 중량%, 바람직하게는 1 중량%로 접종한다.
상기에서 발효를 위해 사용가능한 유산균으로는 분리균주 또는 시판 중인 다양한 유산균을 제한없이 사용할 수 있으며, 예컨대 락토코커스(Lactococcus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속 및 페디오코커스(Pediococcus) 속을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 사용가능한 유산균은 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카세이(L. casei), 락토바실러스 가세리(L. gasseri), 락토바실러스 델브루엑키(L. delbrueckii), 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus), 엔테로코커스 파에시엄(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 파에칼리스(E. faecalis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptocuccus thermophilus), 스트렙토코커스 락티스(S. lactis), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레베(B. breve), 비피도박테리움 롱검(B. longum), 비피도박테리움 인판티스(B. infantis), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 페디오코커스 세레비지애(Pediococcus cerevisiae) 중에서 선택될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 류코노스톡 속의 미생물을 사용하여 생약 추출물을 발효시킨다.
이로부터 수득된 발효물을 90 내지 105℃, 740 내지 760 mmHg 하에서 15 내 지 60분간 살균한 후 여과하여 얻은 여과물에 생약 조성물의 총 중량을 기준으로 1 내지 3 중량%의 콜라겐을 첨가하여 최종적으로 생약 조성물을 준비한다. 이때, 여과물을 40 내지 80℃로 가온한 상태에서 콜라겐을 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용될 수 있는 콜라겐은 불용성 콜라겐과 가용성 콜라겐을 모두 포함한다. 또한, 본 발명의 콜라겐은 소와 같은 포유동물로부터 유래하거나 경골어류의 피부와 같은 해양생물로부터 유래한 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 무색소 피부를 갖는 어류, 가장 바람직하게는 어류의 비늘로부터 유래한 어린(魚鱗) 콜라겐이 이용될 수 있다.
어린 콜라겐은 해수나 담수에 서식하는 각종 어류의 비늘로부터 추출된 고순도이면서도 500 내지 10,000 달톤의 저분자량을 갖는 콜라겐으로서 분자량이 낮아 인체의 소화흡수가 용이할 뿐만 아니라 가용성이 뛰어나 건강식품, 건강음료, 미용, 의약품 및 화장품 소재 등 다양한 분야에 적용되고 있다. 어린 콜라겐은 상업적으로 시판되고 있는 제품을 구입하여 사용할 수도 있고, 대한민국 특허공개 제2004-0108147호에 기재된 방법에 따라 어류의 비늘로부터 직접 추출하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 생약 조성물이 함유하는 성분들은 오랫동안 임상에 적용되어 인체 안정성이 입증되어 있는 성분들이며, 장기간에 걸쳐 사용하여도 부작용을 유발하지 않는다.
본 발명의 생약 조성물은 두피 및 모발 상태의 개선을 통해 양모, 발모 촉진 및 탈모 방지를 위한 화장품, 의약품, 또는 의약외품으로 유용하게 사용될 수 있 다.
본 발명에 따라 상기와 같이 준비된 생약 조성물은 모발 성장 개선 원료로서 탈모 방지 및 발모, 양모 촉진효과를 위해서 당업자가 어려움 없이 적합하게 선정하여 사용할 수 있다. 본 발명의 생약 조성물은 50 브릭스를 기준으로 2 내지 10 중량%의 농도로 두발 또는 피부에 적용할 수 있는 헤어토닉, 헤어트리트먼트, 헤어샴푸, 헤어크림, 일반 연고제, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 클렌징크림, 클렌징폼 또는 파우더 등의 피부외용제 제형에 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 화장수와 같은 수상성분으로만 이루어진 제형은 상기 생약 조성물을 이들의 통상적인 제형화 성분과 혼합하여 제조할 수 있고, 로션과 같이 수상성분과 유상성분으로 이루어진 제형은 유화제에 어유(fish oil) 및 식물성 오일을 혼합하여 유상성분을 제조한 후 상기 생약 조성물을 함유하는 수상성분과 혼합하여 유화시켜 제조할 수 있다. 또한, 비누와 샴푸 등의 세정제는 통상적으로 이들의 제조에 사용되는 계면활성제와 생약 추출물 및 식물성 오일을 혼합하여 제조할 수 있다. 상기에서, 식물성 오일로는 올리브유, 포도씨유, 카모밀유, 해바라기유, 옥수수유, 대두유, 아보카도유, 참깨유, 호호바유, 너트유 등이 사용될 수 있다. 이때 식물성 오일은 전체 제형의 중량을 기준으로 4 내지 8 중량%로, 어유는 4 내지 8 중량%로 첨가되는 것이 바람직하다.
본 발명의 생약 조성물은 탈모 방지 및 발모 촉진용 약학 조성물로 사용될 수 있다. 본 발명의 생약 조성물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 및 발모 촉 진용 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 생약 조성물을 50 브릭스 기준으로 2 내지 10 중량%로 포함한다.
본 발명의 생약 조성물을 포함하는 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 생약 조성물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 생약 조성물을 유효성분으로 함유하는 발모 촉진용 또는 탈모 방지용 약학 조성물은 두발 또는 피부에 적용할 수 있는 피부 외용제 제형으로서 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학 조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학 조성물은 유효성분인 생약 조성물을 기준으로 1일 100 내지 1,000 ㎎/㎏ 체중으로, 바람직하게는 300 내지 600 ㎎/㎏ 체중으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 그러나 상기 투여량이 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
동물 실험 결과, 본 발명의 생약 조성물은 독성을 유발하지 않으면서 유의적인 모발 생장 촉진 효과를 나타내고, 기존에 모발 성장 촉진제로 알려진 제품보다 더욱 우수하게 모발 성장을 촉진할 수 있음을 확인한다(도 1a 내지 1c 참조).
또한 조직학적 검사에서, 본 발명의 생약 조성물 처리군에서 대조군 및 기존 발모 촉진제와 비교할 때 뚜렷하게 모낭의 수가 증가하고 모발의 성장주기(anagen)에 해당하는 모낭의 수가 현저히 증가할 뿐만 아니라(표 1 및 도 2a 내지 2c 참조), 염증반응에 관여하는 비만세포가 음성으로 확인되어 염증에 대한 우려가 나타나지 않음을 확인한다(표 2 및 도 3a 내지 3c 참조).
면역조직화학적 검사를 통해 본 발명의 생약 조성물 처리군에서 임파구의 모낭 침윤 현상이 유발되지 않으며, CD4+ 및 CD8+ 세포가 검출되지 않음을 확인한다(도 4a 내지 4c 참조).
아울러 본 발명의 생약 조성물은 TGF-β의 발현량을 증가시키는데(도 5 참조), 이는 본 발명의 생약 조성물이 발모에 중요한 역할을 하는 발모 촉진 인자인 TGF-β의 발현을 증가시키고 그 결과로 모근 생성을 촉진함으로써 발모 촉진 효과를 나타냄을 제시하는 결과이다.
상기 결과들로부터, 가시오가피, 송엽, 송화, 교맥, 생지황, 지모, 어린 콜라겐 등의 천연 생약성분을 주성으로 하는 본 발명의 생약 조성물은 발모 촉진 인자인 TGF-β의 발현을 증가시키고 모낭 세포의 증식을 촉진하며 모발 성장을 향상 시키는 효과가 뛰어나므로 이를 첨가하여 피부 외용제를 제조하는 경우 발모 촉진 및 탈모 치료용 의약 또는 화장료로 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
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실시예
1> 탈모 방지 및 발모 촉진 생약 조성물의 제조
<1-1> 생약 추출물의 제조
생약 원료로서 건조된 가시오가피 44.440 중량%, 송엽 11.112 중량%, 송화 11.112 중량%, 교맥 11.112 중량%, 생지황 11.112 중량% 및 지모 11.112 중량%를 각각 깨끗이 세척한 후 혼합하였다. 이때 가시오가피는 열매, 나무껍질 또는 줄기를 혼용하거나 단독으로 사용할 수 있다. 상기 생약 혼합물에 7배 부피의 물을 첨가하고 80 내지 100℃에서 10시간 이상 추출하였다. 이로부터 얻은 생약 추출물을 60℃, 700 ㎜Hg 하에서 15 브릭스(brix) 이상이 되도록 농축한 후 121℃에서 30분간 살균하였다.
<1-2> 유산균
발효물의
제조
생약 추출물의 발효를 위해 류코노스톡 메센테로이드 균주(YD-3, ㈜예당바이오)를 유산균 배양용 영양배지인 MRS 액체배지(broth)(Difco, Becton Dickinson, USA) 100 ㎖에 접종하여 30℃에서 O.D(600 ㎚)가 1이 될 때까지 정치 배양하였다. 상기 배양액 1 ㎖을 4℃에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리를 하여 상등액을 버리고, 이로부터 수득된 세포 침전물에 0.9% NaCl 용액 1 ㎖를 첨가하여 잘 현탁한 후 멸균 증류수로 2회 세척하였다. 세척된 세포에 MRS 액체배지 0.5 ㎖과 50% 글리세롤 0.5 ㎖를 첨가하고 잘 혼합한 후 -70℃에서 사용하기 전까지 보관하였다.
상기 실시예 <1-1>에서 준비된 생약 추출물(50 브릭스) 1 ℓ를 28℃로 항온시키고 여기에 류코노스톡 속 균주 배양물을 추출물 부피비의 1/10인 100 ㎖을 무균상태에서 접종하였으며, 이를 30℃로 유지되는 인큐베이터에서 5일간 발효시켰다. 이때, 류코노스톡 속 균주 배양물은 냉동 보관하였던 류코노스톡 속 균주를 최적 배양배지(수크로오스 30 g, 효모 추출물 5 g, 펩톤 10 g, 시트르산 2 g, MgSo4 0.1 g 및 HK2O4P 2 g, 1 ℓ 기준)에 접종하여 30℃에서 20시간 이상 배양하여 준비하였다. 발효가 종료된 후 발효물을 100℃에서 30분간 살균하고 4℃에서 15,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 사균체와 불용성 침전물을 제거하였다. 이로부터 분리된 상등액을 1 ㎛ 필터로 여과하여 잔류 불순물을 제거하고 생약 발효물을 수득하였다.
<1-3> 생약 조성물의 제조
상기 실시예 <1-2>에서 준비된 생약 발효물을 70℃로 가온한 상태에서 어린 콜라겐(분자량 1,000 달톤,(주)이제)을 1 중량%로 첨가하여 최종적으로 발모 촉진 및 탈모 방지용 생약 조성물을 제조하였다.
이와 같이 제조된 생약 조성물의 발모 촉진 및 탈모 방지효과를 조사하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
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실험예
1> 발모 촉진 동물 실험
실험동물은 일반적으로 발모 촉진 실험에 가장 많이 사용되는 6주령의 C57BL/6NCrjBgi 마우스 수컷(체중 16 내지 18 g, 오리엔탈 바이오) 15 마리를 이용하여 1주일간 사육조건에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험 개시 전까지 실험동물의 유지 및 관리는 독립된 동물 실험실에서 최적의 조건을 유지하여 사육하였다. 실험군은 생리식염수 처리군인 대조군(음성대조군), 본 발명의 생약 조성물 처리군 및 기존 발모 촉진제 처리군(양성대조군)의 3개 군으로 구분하여 각 군당 5마리씩 배치하였다.
실험이 개시되기 전에 실험동물을 다이에틸에테르(dietylether)를 이용하여 마취시킨 후 등쪽 피부색이 붉은 색으로 보이는 휴지기에 체모를 클리퍼(clipper)를 이용하여 1차로 제거하였고, 2차로 제모 크림(Veet, Reckitt Benckiser France)을 이용하여 남은 털을 완전히 제거하였다. 피부에 남은 제모 크림은 에탄올로 닦아내었다.
제모된 부위에 부드러운 브러쉬를 이용하여 실시예 1에서 제조된 본 발명의 생약 조성물과 기존에 발모 촉진제로 시판되고 있는 닥터모(㈜태평양) 및 생리식염수를 각각 0.2 ㎖씩 매일 1회, 약 3주간 도포하였고, 1일, 5일, 10일, 15일 및 20일째에 발모 정도를 육안으로 관찰하였다.
그 결과, 도 1a 내지 1c에 나타난 바와 같이, 실험 5일째까지는 모든 실험군에서 발모에 대한 특별한 변화가 관찰되지 않았고, 대조군과 닥터모 처리군에서는 실험 10일째까지도 여전히 발모가 관찰되지 않았지만 본 발명의 생약 조성물 처리군에서는 실험 10일째부터 발모가 진행됨을 확인할 수 있었다. 실험 15일째에는 본 발명의 생약 조성물 처리군에서 발모율이 점점 빨라졌는데, 특히 두 마리의 마우스는 10일째 발모 진행 시작점이 빨랐던 점을 감안하면 전체 마우스 중에서 가장 빠른 발모 상태를 나타내는 것으로 확인되었다. 반면, 대조군은 본 발명의 생약 조성물 처리군보다 다소 더딘 발모 진행을 나타내었고, 닥터모 처리군은 상당히 저조한 발모율을 나타내었는데, 닥터모 처리군의 발모율은 대조군에 비해서도 현저히 낮은 수준이었다. 실험 종료일인 20일째에는, 본 발명의 생약 조성물 처리군에서 대조군과 닥터모 처리군보다 더 우수한 발모 상태가 확인되었다.
한편, 상기 실험기간 동안에 발모 촉진 효과를 제외한 본 발명의 생약 조성물의 영향을 살펴보고자 시험물질 처리 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 실험동물의 체중은 시험물질 도포 직전부터 육안 평가 시점, 즉 1일, 5일, 10일, 15일 및 20일째에 측정하였다.
그 결과, 실험기간 동안 본 발명의 생약 조성물이 처리된 실험동물 중에 대조군에 비하여 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.
상기 결과로부터 본 발명의 생약 조성물은 독성을 유발하지 않으면서 유의적인 모발 생장 촉진 효과를 나타내고, 기존에 모발 성장 촉진제로 알려진 제품보다 더욱 우수하게 모발 성장을 촉진할 수 있음을 확인하였다.
<
실험예
2> 조직학적 검사
본 발명에 따른 생약 조성물의 발모 촉진 효과를 조직학적으로 확인하기 위하여, 상기 실험예 1과 동일한 마우스를 대상으로 등의 털을 제모한 후 대조군에는 생리식염수를, 양성 대조군으로는 미녹시딜 5%를, 실험군으로는 실시예 1에서 제조된 본 발명의 생약 조성물을 1일 1회씩 0.2 ㎖을 총 3주간 충분히 도포하였다. 마우스는 실험기간 동안 자유롭게 사료와 물을 섭취하도록 하였으며, 항온 항습의 조건에서 사육하였다.
3주 경과 후, 실험동물을 에테르로 마취시킨 후 약물 처리 부위로부터 2×3 cm 크기의 조직을 떼어 내어 티슈-텍 OCT 화합물(Tissue-Tek OCT Compound, Ted Pella, USA)로 충분히 포매한 후 즉시 -80℃로 동결하였다. 이 조직을 통상적인 조직 처리 및 파라핀 포매 과정을 거쳐 약 6 ㎜ 두께로 모낭의 결과 평행하게 초냉동 박절기(cryostat microtome)를 이용하여 절편하여 조직 슬라이드(slide)를 제작하였다.
조직 내 모낭의 상태 및 모낭의 활성 정도를 조사하기 위하여 상기 조직 슬라이드를 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하였고, 염증 반응에 관여하는 세포와의 연관성을 조사하기 위하여 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색한 후 광학현미경으로 관찰하였다. 이때 각 실험군에서 성장주기에 있는 모낭과 염증세포의 수를 세어(× 100배, 0.34 ㎟) 각각 하기 표 1 및 2에 나타내었다. 모든 결과는 평균치±표준편차로 표시하였고, 실험군간의 통계학적 유의차는 스튜던츠 테스트(Student's t-test)와 원-웨이 아노바(One-way ANOVA)에 의하여 p<0.05 이하를 유의한 차이가 있는 것으로 인정하였다.
도 2a 내지 2c는 각각 대조군, 미녹시딜 처리군 및 본 발명의 생약 조성물 처리군의 조직 슬라이드를 헤마톡실린/에오신으로 염색하여 관찰한 결과이고, 도 3a 내지 3c는 각각 대조군, 미녹시딜 처리군 및 본 발명의 생약 조성물 처리군의 조직 슬라이드를 톨루이딘 블루로 염색하여 관찰한 결과이다.
|
대조군 |
미녹시딜 처리군 |
생약 조성물 처리군 |
성장기 평균 모낭 수 |
15 |
6.5 |
27 |
표준편차 |
5.6 |
6.3 |
1.4 |
|
대조군 |
미녹시딜 처리군 |
생약 조성물 처리군 |
염증세포 |
**- |
*+ |
**- |
*+: 검출됨, **-: 검출되지 않음. |
상기 표 1 및 도 2a 내지 2c에 나타난 바와 같이, 모든 실험군에서 헤마톡실린/에오신 염색으로 모낭의 상태가 정확히 관찰되었는데, 특히 대조군과 비교할 때 본 발명의 생약 조성물 처리군에서 뚜렷하게 모낭의 수가 증가하였고 모발의 성장주기(anagen)에 해당하는 모낭의 수가 현저히 증가하였음을 확인하였다. 그러나 미녹시딜 처리군에서는 대조군에 비하여 오히려 모낭의 수가 감소하였음을 알 수 있다.
톨루이딘 블루 염색으로 확인한 각 실험군의 염증반응은 헤마톡실린/에오신 염색과 동일한 양상을 나타내었다. 상기 표 2 및 도 3a 내지 3c에 나타난 바와 같이, 대조군과 본 발명의 생약 조성물 처리군에서는 염증반응에 관여하는 비만세포가 음성으로 확인되어 염증에 대한 우려가 나타나지 않았으나, 미녹시딜 처리군에서는 염증세포가 양성으로 확인되어 제제 또는 기타의 원인에 의한 염증을 의심할 수 있었다.
<
실험예
3> 면역조직화학적 검사
원형 탈모증 등의 탈모 현상은 자가면역질환으로서 모낭에 임파구의 침윤이 나타나는데(Gilhar 등, J. Investig . Dermatol . Symp . Proc. 4: 207-210, 1999), 원형 탈모증에서 발모의 기전은 면역질환에 관여하는 임파구의 감소와 관련이 있다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 생약 조성물이 임파구의 모낭 침윤을 야기하는지, 이러한 임파구의 침윤에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 탈모와 관련된 면역세포인 CD4+ 및 CD8+ 세포를 면역조직화학적인 방법으로 조사하였다. 이러한 면역조직화학적 검사는 본 발명에 따른 생약 조성물의 발모 촉진 효과와 함께 피부 자극으로 인한 부작용을 검색하는 방법으로도 응용될 수 있다.
문헌(Tang 등, J. Biol . Chem. 275: 9106-9109, 2003)에 기재된 방법에 따라, 상기 실험예 2와 같이 준비된 대조군, 미녹시딜 처리군 및 본 발명의 생약 조성물 처리군의 조직 절편을 실온에서 약 30분간 건조시키고 아세톤으로 10분간 고정한 후 다음의 일반적인 면역조직화학적인 방법으로 처리하였다.
먼저 고정된 각각의 조직 절편을 PBS(phosphate-buffered saline)로 재수화시킨 후 내인성 퍼옥시다제(peroxidase)의 활성을 소실시키기 위하여 과산화수소(hydrogen peroxide)로 30초간 처리하였다. 처리된 조직 절편을 바이오틴으로 표지된 랫트 항-마우스 CD4(biotin-labeld rat anti-mouse CD4, clone GK1.5, PharMigen, Sandiego, USA) 및 바이오틴으로 표지된 CD8a(clone 53-6.7, PharMigen, Sandiego, USA)를 각각 1차 항체로 사용하여 5 ㎎/㎖의 농도로 4℃에서 1시간 동안 처리하고 PBS로 세척하였다. 이 조직 절편을 SA-HRP(Vector Laboratories, Burlingame, USA)로 4℃에서 30분간 처리한 후 벡타스타틴 ABC-AP 킷트(Vectastatin ABC-AP kit, Vector Laboratries)를 사용하여 염색하였다.
그 결과, 도 4a 내지 4c에 나타난 바와 같이, 본 발명의 생약 조성물 처리군에서는 대조군과 동일하게 임파구의 모낭 침윤 현상이 유발되지 않으며, CD4+ 및 CD8+ 세포가 검출되지 않음을 확인하였다.
<
실험예
4>
웨스턴
블롯팅
분석
진피세포의 세포사멸을 조절하는 단백질의 발현을 확인하기 위하여 ERK와 AKT의 발현과 활성을 웨스턴 블롯팅 분석으로 조사하였다(Xia 등, Science 270: 1326-1331, 1995; Tang 등, J. Biol . Chem. 275: 9106-9109, 2000). 또한, 모낭에서 발모를 촉진시키는 작용을 하는 사이토카인인 TGF-β의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 분석하여 그 관련성을 확인하였다.
상기 실험예 2와 같이 마우스를 생리식염수(음성대조군), 미녹시딜(양성대조군) 및 본 발명의 생약 조성물(실험군)로 3주간 처리한 후 등 쪽의 조직을 떼어내었다. 떼어낸 조직 절편을 PBS로 세척한 후 50 mM 트리스-완충용액(Tris-buffer, pH 7.4), 2 mM EDTA, 100 ㎎/㎖ 류펩틴(leupetin), 20 ㎎/㎖ 아프로티닌(aprotinin) 및 100 mM NaCl이 들어있는 완충용액에 담가 100℃에서 2분간 처리하여 조직으로부터 단백질을 추출하였다. 이 단백질 추출액을 15,000 rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 분리한 후 -70℃에서 분석 전까지 보관하였다.
상등액의 단백질 농도는 DC 단백질 분석 키트(Bio-Rad Laboratories, Inc. USA)를 이용하여 결정하였다. 동량의 단백질(50 ㎎)을 10 내지 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 로우딩하고 전기영동으로 분리한 후 니트로셀룰로오스 막에 전이시켰다. 상기 막을 0.1% 트윈 20(tween 20) 함유 TBS 용액으로 2회 세척하고 5% 탈지 우유가 함유된 TBS 차단(blocking) 용액에 담가 실온에서 60분간 처리하였다. 1:1000으로 희석된 마우스 다중클론 항-ERK 항체, 항-AKT 항체 및 항-TGF-β 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)와 상기 막을 각각 블롯킹 용액에 담그고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응 후, 상기 막을 TBS로 2회 세척하고 1:1000으로 희석된 항-마우스 IgG-HRP 접합 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)와 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 상기 막을 화학발광 플러스 킷트(chemiluminescence plus kit, Amersham International, Little Chalfont, UK)를 사용하여 검출하고 그 발광의 세기를 측정하였다.
그 결과, 대조군, 미녹시딜 처리군 및 본 발명의 생약 조성물 처리군 모두에서 활성화된 AKT 및 인산화된 활성 ERK의 발현을 확인할 수 있었으나 이들 간에 유의미한 차이는 관찰되지 않았다. 반면, 도 5에 나타난 바와 같이, TGF-β는 대조군과 미녹시딜 처리군에 비하여 본 발명의 생약 조성물 처리군에서 발현량이 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터 본 발명의 생약 조성물 처리군에서 확인된 발모 촉진 효과는 발모에 중요한 역할을 하는 발모 촉진 인자인 TGF-β의 증가로 인한 모근 생성의 증가에 의한 것임을 알 수 있었다.
본 발명의 생약 조성물은 아래와 같은 피부외용제 제형으로 제조될 수 있으며, 아래의 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.
<
제형예
1> 로션
성분 |
중량(g) |
유상 |
아라셀(aracell) 65 |
1.2 |
제르말(germall) 115 |
0.12 |
포도씨유 |
4 |
어유 |
4 |
방향제 |
0.1 |
수상 |
트윈 80 |
2.5 |
잔탄 검 |
0.16 |
메틸파라벤(methyl paraben) |
0.20 |
TEA |
0.13 |
EDTA-2Na |
0.02 |
어린 콜라겐 |
1 |
생약 추출물 |
10 |
정제수 |
잔액 |
계 |
100 |
<
제형예
2>
스킨
성분 |
중량(g) |
트윈 80 |
2.0 |
잔탄 검 |
0.16 |
메틸파라벤 |
0.20 |
TEA |
0.13 |
EDTA-2Na |
0.02 |
알코올 |
3.0 |
생약 추출물 |
10 |
어린 콜라겐 |
1 |
방향제 |
0.1 |
정제수 |
잔액 |
계 |
100 |
<
제형예
3> 비누
성분 |
중량(g) |
포도씨유 |
78 |
NaOH |
8.7 |
생약 추출물 |
2.0 |
어린 콜라겐 |
1 |
방향제 |
0.2 |
정제수 |
잔액 |
계 |
100 |
<
제형예
4> 샴푸
성분 |
중량(g) |
포도씨유 |
18 |
NaOH |
2.0 |
트윈 80 |
2.0 |
생약 추출물 |
2.0 |
어린 콜라겐 |
1 |
방향제 |
0.2 |
정제수 |
잔액 |
계 |
100 |
이상으로 본 발명 내용의 특정 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아님은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 이의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.