CN1186683A - 含有牛膝或榆白皮提取物的口腔用组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于含有牛膝提取物、榆白皮提取物,或它们的混合物的口腔用组合物,不仅能抑制牙周疾病诱发物质过氧化物、前列腺素(PGE2)、白细胞介素-1β的生成,而且能抑制分解牙周组织基质胶原蛋白质的胶原酶的活性,同时,通过促进胶原蛋白质的合成,可有效地治疗牙周疾病。
Description
本发明是关于含有牛膝或榆白皮提取物的口腔用组合物,更具体讲本发明是关于从牛膝或榆白皮中提取的,对牙周疾病治疗效果优良的,含有至少一种牛膝或榆白皮提取物作为有效成分的口腔用组合物。作为本发明的组合物一例,有牙膏组合物和软膏剂组合物。
所谓牙周疾病是指,在临床上,由牙龈炎症和出血、牙周囊形成和牙槽骨破坏等而引起牙齿脱落的疾病。这样的牙周疾病要进行一连串的过程,细菌集落形成、细菌对牙周组织的浸蚀和牙周组织的破坏,首先,口腔内唾液中的唾液蛋白质吸附在象牙质和白亚质表面上,形成皮膜,在这样的皮膜表面上主要生成着链球菌属(Streptococcus)和放线菌属(Actinomyces)一类的细菌,而形成龋齿的堵塞物,随着时间的推移,这样的堵塞物向矛根的端部移动,同时生成长斑状单胞菌属(Porphyromonas)和无倾向杆菌属(Aclinobacillus)一类的厌氧性固紫阴性菌,这些细菌、细菌成分、细菌产物通过齿龈列口上皮浸入到与齿龈结合的组织内,形成牙周囊,这种细菌的代谢结果分泌出对牙周组织有害的硫化氢、氨、胺一类的细胞毒素,同时,由构成细胞壁成分的类脂多糖类内毒素直接破坏组织,同时对生物免疫体产生刺激,通过被刺激体的液性和细胞性免疫体系的种种作用,在细胞外部分泌出活性氧、前列腺素、白三烯菌素、组胺、白细胞介素等各种细胞分裂素等,并由此诱发成齿龈炎,由细菌和白细胞分泌出的胶原酶一类酶又分解牙周组织的基质胶原,引起牙床萎缩,当这样继续下去时将引起牙周病。
为予防这种牙周疾病的发生,开发研制了可在短时间内杀灭暴露出牙周疾病患菌的抗菌剂葡糖酸洗必太、西吡氯铵、血根素和三氯生和曲安奈德等消炎剂,适用于刷牙液、牙膏、软膏一类的口腔制品,实际情况是至今也没能从根本上预防牙周疾病的发生。
最近在国内非常活跃地开发使用没药、桑白皮、升麻、绿茶、甘草、黄芩、蒲公英、金银花、玉米一类生药提取物抑制牙周疾病,抑制诱发牙周疾病起决定作用的前列腺素的生成,但实际情况是不能鉴定抑制分解牙周组织的胶原酶活性的植物提取物,大多数的情况,不过是抑制了栓(プラグ)的形成,或是以抗菌、消炎、收敛、止血、促进血液循环一类中草药予防牙周疾病的发生。
现在作为广泛使用的牙周病治疗方法,是使用药理学活性成分抑制分解牙周组织胶原酶的活性,或者抑制牙周疾病诱发物质前列腺素的生成的方法。
作为这种方法的实例,在美国专利5230895号中记载,开发研制了连续送达含有四环素药效物质的系统,通过抑制分解牙周组织的胶原酶的酵活性,可治疗牙周疾病。在欧洲公开专利第528468 A1号中公开了一种治疗牙周疾病的方法,是用含有三氯生的牙膏和口腔清洁剂抑制牙周疾病诱发物质前列腺素的生成,以抑制牙周疾病。
然而,上述药理学的活性成分只具有如下二个作用中的一个作用,即,在牙周疾病治疗过程中抑制诱发牙周疾病物质的生成,同时又抑制分解牙周组织酵毒的活性,所以,不仅存在完全治疗牙周疾病的界限,而且在长期使用这种合成物质时,有种种副作用的危险。特别是四环素,通常1天4次服250mg(1片)/次,一天总计1000mg,连续服用5-7天。一般服用四环素时,临床报告,从细菌学看好转到正常状态,拨去牙齿后服用1天四环素时,可出现相当好的效果。当观察低浓度长期服用的研究报告时,报导了如下结果,一天服用1000mg四环素,服用2周后,一天一次服用250mg,连续服用48周,临床上可减少牙龈炎,牙龈吞咽牙台中活动性菌株没有了,牙周囊深度和付着度丧失也减少了。然而长期低浓度使用四环素。常常引起固紫阴性菌的出现,这种具有耐性菌株的发现,在中止了抗生剂服用时,也屡屡发生,所以必须进行观注,作为副作用也屡屡发生呕吐、肠胃器官疼痛、下痢、牙齿着色等,产妇和幼儿必须禁用,所以存在局限性。
因此,本发明者由于发现了即使长期使用几乎没有副作用和毒性,同时显示出优良的牙周疾病治疗效果的物质,将各种各样的中草药材和植物提取物作为研究对象,利用分解牙周组织胶原酶的活性测定法,诱发牙周疾病的白细胞介素-1β和前列腺素(PGE2)的定量法、过氧化物生成测定法、胶原合成定量法等科学方法,根据各植物提取物抑制胶原酶的活性,并在抑制白细胞介素-1β和前列腺素的生成方面显示出卓越的功效,将促进胶原合成的中药方和植物提取物进行筛选。其结果,如下所述,确认牛膝和榆白皮的特定提取物可抑制诱发牙周疾病物的生成,同时,抑制牙周组织分解酶的活性,有促进胶原合成的效果,至此完成了本发明。
本发明的目的是提供一种含有牛膝提取物、榆白皮提取物或它们的混合物的口腔用组合物。
用作本发明口腔用组合物中有效成分的生药提取物,可从牛膝或榆白皮中提取。
本发明的有效生药中的一种牛膝是分布在韩国各地、日本、中国黄河以南区域的植物。挖掘出牛膝的(Achyranthes japonica)根,去掉须根后,进行日晒干燥,灰黄色或黄褐色的棒状,或稍稍弯曲,长15~90cm,直径3~7cm的圆柱形,有很多纵纹痕迹和到处有胁须痕迹。折断面呈灰白色或淡褐色,扁平状,中心部位的木质部位呈黄白色,质坚易碎。几乎无嗅,味道稍甘甜、有粘液性。显微镜下观其横断面,皮部和木质部形成明显的层状,易于区别。木质部位中心处有很小的原生木质部位,柔和的细胞中含有氢氧化钙砂晶,看不到淀粉颗粒。作为其药理作用,可知对利尿、痛经、关节炎等有疗效,作为主要成分是由皂甙(Saponin)、鱼肝油醇糖甙(Oleanolicglycoside)、昆虫变态激素(inokosterone,ecdysterone)、甜菜碱水合物等构成。
进而,本发明组合物中所用的有效生药榆白皮是分布在韩国中部以北、中国、和日本的榆科植物,采取黄榆、Ulmus pumila、金丝抱榆的干部或根部的皮, 日晒干燥。作为药理作用,可知有利水、消肿、通淋、水肿、丹毒作用。作为主要成分,是由β-谷甾醇、植物甾醇和丹宁等构成。所谓“榆白皮”用语,根据国家和区域,叫做“榆根皮”或“榆白皮”,通常多叫“榆白皮”。
作为本发明中牛膝和榆白皮的提取物,可使用各种水或醇的提取物。本发明中使用的牛膝和榆白皮提取物,使用的是将干燥的牛膝和榆白皮在暗处凉干,细切后制成粉末,再用水或醇提取,过滤,将滤液减压浓缩而制得的。
作为用于牛膝和榆白皮提取的醇提取溶剂有甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等1~4个碳原子的低级醇溶剂,最好使用乙醇。
本发明的生药提取物,包含在牙膏组合物或软膏剂组合物中,具有治疗牙周疾病的作用。根据本发明的各组合物中牛膝和榆白皮提取物,将组合物的总重量作为基准,分别以0.001~5(重量)%,最好0.01~3(重量)%的比例使用,最为适当。将牛膝和榆白皮的提取物进行混合,配合在本发明的组合物中时,各提取物最好也以上述配比存在。然而,配合二种生药提取物时,将组合物的总重量作为基准,可为0.002~10(重量)%。各生药提取物的含量,低于0.001重量%时,对于牙周疾病不能获得最终的效能和效果,超过5重量%时,由于制品的稳定性降低,而不适宜。
根据本发明,具体按如下方法可制造牙膏组合物。
作为炼磨剂成分,可由如下选择1种或1种以上使用。即磷酸氢二钾、沉淀二氧化硅、硅胶、碳酸氢钠、碳酸钙、含水氧化铝、不溶性偏磷酸钠和焦磷酸钠。炼磨剂成分通常使用1-90(重量)%,本发明中,磷酸氢钙、含水氧化硅、碳酸钙,可单独使用或混合使用,为20~60(重量)%。
作为促进牙齿再石灰化,强化牙组织的药效剂氟化合物,氟化钠或第1氟化磷酸钠,可单独使用或2种以上混合使用,其含量为0.01~2.0(重量)%时较适宜。药效剂的含量,低于0.01(重量)%,效果不充分,超过2.0(重量)%时,由于对人体的安全性有影响,所以不适宜作口腔用制剂。
为维持牙膏组合物的状态和防止干燥,可使用湿润剂,作为这种湿润剂,有甘油、山梨糖醇液、聚乙二醇和丙二醇等,这些可单独使用或2种以上混合使用,用量为20~60(重量)%。
为维持牙膏成分中液体和固体成分粘合的牙膏形态,确保安全性,可使用粘合剂,作为这种粘合剂主要是褐藻酸钠或铝盐、羧甲基纤维素钠、占吨胶、阿拉伯胶等天然或合成高分子物质,其用量为0.1~5(重量)%。
气泡剂对炼磨剂的洗涤作用进行补充,药效剂可浸透到牙刷难以到达的部位,不用说,产生气泡对增大刷牙感起到了作用,协助洗涤,快速使药效剂分散和浸透,由于减少了表面张力,所以很容易清除口腔内异物。作为主要使用的气泡剂,可使用阴离子表面活性剂月桂基硫酸钠、烷基硫酸钠,辅助性的非离子表面活性剂,可使用聚氧乙烯、聚氧丙烯、共聚物、聚氧乙烯硬化蓖麻油、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸、链烷醇酰胺脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯和聚氧乙烯硬化蓖麻油衍生物。气泡剂的含量,将阴离子或非离子表面活性剂单独或2种以上混合使用时,最好0.5~5(重量)%。此外,调节到完全没有苦味,可使用香料和甜味剂,香料,大多使用天然香料欧薄荷和斯皮尔薄荷油。在牙膏中,香料用量为0.1~1(重量)%。甜味剂主要使用合成的或天然的非发酵性糖等,作为代表性物质有糖精钠、阿斯巴甜、乳糖、麦牙糖、木糖醇等,作为适宜的甜味剂,最好使用0.05~1(重量)%的糖精甜味剂等。
作为调整牙膏组合物PH的缓冲剂,有正磷酸碱金属盐,特别是磷酸一氢钠,磷酸二氢钠磷酸钠、柠檬酸和柠檬酸钠、磷酸、盐酸、氢氧化钠、还有焦磷酸钠及焦磷酸盐等,但根据本发明作为牙膏组合物中的缓冲剂,可使用磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠中的二种,进行适当混合,调整PH5~8.0。为了防止牙膏组合物的制造和使用中产生微生物污染的危险,一般使用食品和药品中许多可使用的羟基苯甲酸甲酯、苯甲酸、苯甲酸钠、水杨酸等,可单独使用或2种以上混合使用,为0.01~0.5(重量)%。在本发明的牙膏组合物中,混合使用牛膝和榆白皮提取物时的用量,最好为0.002~10(重量)%。
本发明的软膏剂组合物中,可进一步配合软膏剂制造领域中通常使用的添加剂,如,配合稳定软膏剂状态的表面活性剂、增溶剂、湿润剂、对口腔软组织传递药效的组分、缓冲剂、防腐剂、甜味剂和香料等成分。
作为本发明软膏剂组合物中,为稳定软膏剂状态的表面活性剂,可使用聚氧乙烯一聚氧丙烯共聚物,例如,可使用普路罗尼克(pluronic)F-127或普路罗尼克F-108一类的普路罗尼克衍生物。在本发明的软膏剂组合物中,可使用这样的表面活性剂,以组合物的总重量作为基准,以5~30(重量)%的比例配合。
本发明的软膏剂组合物中,作为对牛膝和榆白皮提取物的增溶剂,可使用低级醇溶剂。为此目的使用的低级醇溶剂有乙醇、异丙醇等,二种以上醇溶剂可混合使用。本发明组合物中,低级醇溶剂,以软膏剂组合物的总重量为基准,最好以1~20%的比例配合。
本发明的软膏剂组合物中,可进一步使用为维持软膏剂状态和防止干燥的湿润剂,作为这样的湿润剂,可单独使用选自如下的1种成分,或2种以上成分混合使用,即、甘油、山梨糖醇液、聚乙二醇-200、聚乙二醇400、聚乙二醇600和聚乙二醇1000一类的聚乙二醇、丙二醇、泊洛沙姆(Poloxamer)407和精制脂肪酸单甘油酯(Myverol)18-99。湿润剂的用量,以组合物的总重量为基准,最好为5~40(重量)%。
作为粘着在口腔软组织上可传达有效成分药效的药效传递组分,可单独使用或配合使用凝胶或果胶,以组合物的总重量为基准,以1~30(重量)%的比例使用,作为调整软膏组合物PH的缓冲剂,可使用选自如下的1种或2种以上的缓冲剂,即,正磷酸的碱金属盐、特别是磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、柠檬酸和柠檬酸钠、磷酸、盐酸、氢氧化钠和焦磷酸钠和焦磷酸盐,本发明的软膏组合物中,适当混合磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠中的2种,最好将PH值调整为5.0~8.0。
此外,考虑到本发明的组合物适用于口腔内这一点,多少调节苦味,可使用香料和甜味剂,作为香料,可一般使用通常作为天然香料的欧薄荷或斯皮尔薄荷油,以组合物的总重量为基准,使用0.1~1(重量)%。作为甜味剂,一般使用合成的或天然的非发酵性糖等。作为可使用的甜味剂代表例,有糖精钠、阿斯巴甜、乳糖、麦芽糖、木糖醇等,特别是使用糖精钠。本发明组合物中的甜味剂,以组合物的总重量为基准,最好使用0.05~1(重量)%的比例。
本发明的软膏剂组合物,为防止软膏剂的制造和使用中出现微生物污染的危险,一般可使用如下食品和医药品中许可使用的防腐剂,即例如选自羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、苯甲酸钠、水杨酸中的1种或1种以上成分,以组合物的总重量为基准使用0.01-0.5(重量)%的比例。
本发明的软膏剂组合物应用于临床时,以上述配比的组合物,1日内适用于牙周疾病患部50~500mg,最好100~300mg,但考虑到牙周疾病的轻重程度、患部大小等原因,可适当增减用量。
本发明通过以下实施例和比较例进行更详细地说明,但本发明并不仅限于这些实例。
制造例1
将干燥的牛膝制成粉末,称取50g,加入500ml 95%的乙醇,浸泡提取3天后,利用1号瓦特曼(Whatman No.1)过滤后,减压下浓缩,得到15g干燥的牛膝提取物。
制造例2
将干燥的榆白皮制成粉末。称取50g,加入500ml 95%的乙醇,浸泡提取3天后,用1号瓦特曼(Whatman No.1)过滤,减压下浓缩,得到20g干燥的榆白皮提取物。
实施例1-18和比较例1-18
按照下述表1~9所示组成成分制造实施例和比较例的牙膏组合物。
表1 (单位:重量%)
区 分 | 成 分 | 实施例1-1 | 实施例1-2 | 比较例1-1 | 比较例1-2 |
湿润剂 | 甘油 | 20 | 20 | ||
非结晶性山梨糖醇液 | 23 | 23 | |||
粘合剂 | 角叉菜胶 | 0.8 | 0.8 | ||
羧甲基纤维素 | 1 | 1 | |||
表面活性剂 | 月桂基硫酸钠 | 1 | 2 | 1 | 2 |
山梨糖醇酐单油酸酯 | 0.2 | 0.4 | 0.2 | 0.4 | |
炼磨剂 | 磷酸氢钙 | 40 | 40 | ||
沉淀二氧化硅 | 25 | 25 | |||
碳酸钙 | - | - | - | - | |
甜味剂 | 糖精钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
缓冲液 | 磷酸二氢钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
磷酸钠 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
药效成分 | 牛膝提取物 | 0.001 | |||
榆白皮提取物 | 0.001 | ||||
氟化钠 | 0.22 | 0.22 | |||
第1氟化磷酸钠 | 0.76 | 0.76 | |||
香料 | 0.75 | 0.6 | 0.75 | 0.6 | |
食用色素 | 0.00025 | 0.00025 | |||
精制水 | 余量 | 余量 | 余量 | 余量 |
表2 (单位:重量%)
区 分 | 成 分 | 实施例1-3 | 实施例1-4 | 比较例1-3 | 比较例1-4 |
湿润剂 | 甘油 | 20 | 20 | ||
非结晶性山梨糖醇液 | 23 | 23 | |||
粘合剂 | 角叉菜胶 | 0.8 | 0.8 | ||
羧甲基纤维素 | 1 | 1 | |||
表面活性剂 | 月桂基硫酸钠 | 1 | 2 | 1 | 2 |
山梨糖醇酐单油酸酯 | 0.2 | 0.4 | 0.2 | 0.4 | |
炼磨剂 | 磷酸氢钙 | 40 | 40 | ||
沉淀二氧化硅 | 25 | 25 | |||
碳酸钙 | - | - | - | - | |
甜味剂 | 糖精钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
缓冲液 | 磷酸二氢钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
磷酸钠 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
药效成分 | 牛膝提取物 | 0.01 | |||
榆白皮提取物 | 0.01 | ||||
氟化钠 | 0.22 | 0.22 | |||
第1氟化磷酸钠 | 0.76 | 0.76 | |||
香料 | 0.75 | 0.6 | 0.75 | 0.6 | |
食用色素 | 0.00025 | 0.00025 | |||
精制水 | 余量 | 余量 | 余量 | 余量 |
表3 (单位:重量%)
区 分 | 成 分 | 实施例1-5 | 实施例1-6 | 比较例1-5 | 比较例1-6 |
湿润剂 | 甘油 | 20 | 20 | ||
非结晶性山梨糖醇液 | 23 | 23 | |||
粘合剂 | 角叉菜胶 | 0.8 | 0.8 | ||
羧甲基纤维素 | 1 | 1 | |||
表面活性剂 | 月桂基硫酸钠 | 1 | 2 | 1 | 2 |
山梨糖醇酐单油酸酯 | 0.2 | 0.4 | 0.2 | 0.4 | |
炼磨剂 | 磷酸氢钙 | 40 | 40 | ||
沉淀二氧化硅 | 25 | 25 | |||
碳酸钙 | - | - | - | - | |
甜味剂 | 糖精钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
缓冲液 | 磷酸二氢钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
磷酸钠 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
率效成分 | 牛膝提取物 | 0.01 | |||
榆白皮提取物 | 0.01 | ||||
氟化钠 | 0.22 | 0.22 | |||
第1氟化磷酸钠 | 0.76 | 0.76 | |||
香料 | 0.75 | 0.6 | 0.75 | 0.6 | |
食用色素 | 0.00025 | 0.00025 | |||
精制水 | 余量 | 余量 | 余量 | 余量 |
表4 (单位:重量%)
区 分 | 成 分 | 实施例1-7 | 实施例1-8 | 比较例1-7 | 比较例1-8 |
湿润剂 | 甘油 | 20 | 20 | ||
非结晶性山梨糖醇液 | 23 | 23 | |||
粘合剂 | 角叉菜胶 | 0.8 | 0.8 | ||
羧甲基纤维素 | 1 | 1 | |||
表面活性剂 | 月桂基硫酸钠 | 1 | 2 | 1 | 2 |
山梨糖醇酐单油酸酯 | 0.2 | 0.4 | 0.2 | 0.4 | |
炼磨剂 | 磷酸氢钙 | 40 | 40 | ||
沉淀二氧化硅 | 25 | 25 | |||
碳酸钙 | - | - | - | - | |
甜味剂 | 糖精钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
缓冲液 | 磷酸二氢钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
磷酸钠 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
药效成分 | 牛膝提取物 | 1 | |||
榆白皮提取物 | 1 | ||||
氟化钠 | 0.22 | 0.22 | |||
第1氟化磷酸钠 | 0.76 | 0.76 | |||
香料 | 0.75 | 0.6 | 0.75 | 0.6 | |
食用色素 | 0.00025 | 0.00025 | |||
精制水 | 余量 | 余量 | 余量 | 余量 |
表5 (单位:重量%)
区 分 | 成 分 | 实施例1-9 | 实施例1-10 | 比较例1-9 | 比较例1-10 |
湿润剂 | 甘油 | 20 | 20 | ||
非结晶性山梨糖醇液 | 23 | 23 | |||
粘合剂 | 角叉菜胶 | 0.8 | 0.8 | ||
羧甲基纤维素 | 1 | 1 | |||
表面活性剂 | 月桂基硫酸钠 | 1 | 2 | 1 | 2 |
山梨糖醇酐单油酸酯 | 0.2 | 0.4 | 0.2 | 0.4 | |
炼磨剂 | 磷酸氢钙 | 40 | 40 | ||
沉淀二氧化硅 | 25 | 25 | |||
碳酸钙 | - | - | - | - | |
甜味剂 | 糖精钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
缓冲液 | 磷酸氢二钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
磷酸钠 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
药效成分 | 牛膝提取物 | 2 | |||
榆白皮提取物 | 2 | ||||
氟化钠 | 0.22 | 0.22 | |||
第1氟化磷酸钠 | 0.76 | 0.76 | |||
香料 | 0.75 | 0.6 | 0.75 | 0.6 | |
食用色素 | 0.00025 | 0.00025 | |||
精制水 | 余量 | 余量 | 余量 | 余量 |
表6 (单位:重量%)
区 分 | 成 分 | 实施例1-11 | 实施例1-12 | 比较例1-11 | 比较例1-12 |
湿润剂 | 甘油 | 20 | 20 | ||
非结晶性山梨糖醇液 | 23 | 23 | |||
粘合剂 | 角叉菜胶 | 0.8 | 0.8 | ||
羧甲基纤维素 | 1 | 1 | |||
表面活性剂 | 月桂基硫酸钠 | 1 | 2 | 1 | 2 |
山梨糖醇酐单油酸酯 | 0.2 | 0.4 | 0.2 | 0.4 | |
炼磨剂 | 磷酸氢钙 | 40 | 40 | ||
沉淀二氧化硅 | 25 | 25 | |||
碳酸钙 | - | - | - | - | |
甜味剂 | 糖精钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
缓冲液 | 磷酸二氢钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
磷酸钠 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
药效成分 | 牛膝提取物 | 5 | |||
榆白皮提取物 | 5 | ||||
氟化钠 | 0.22 | 0.22 | |||
第1氟化磷酸钠 | 0.76 | 0.76 | |||
香料 | 0.75 | 0.6 | 0.75 | 0.6 | |
食用色素 | 0.00025 | 0.00025 | |||
精制水 | 余量 | 余量 | 余量 | 余量 |
表7 (单位:重量%)
区 分 | 成 分 | 实施例1-13 | 实施例1-14 | 比较例1-13 | 比较例1-14 |
湿润剂 | 甘油 | 20 | 20 | ||
非结晶性山梨糖醇液 | 23 | 23 | |||
粘合剂 | 角叉菜胶 | 0.8 | 0.8 | ||
羧甲基纤维素 | 1 | 1 | |||
表面活性剂 | 月桂基硫酸钠 | 1 | 2 | 1 | 2 |
山梨糖醇酐单油酸酯 | 0.2 | 0.4 | 0.2 | 0.4 | |
炼磨剂 | 磷酸氢钙 | ||||
沉淀二氧化硅 | 25 | 25 | |||
碳酸钙 | 38 | - | 38 | - | |
甜味剂 | 糖精钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
缓冲液 | 磷酸二氢钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
磷酸钠 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
药效成分 | 牛膝提取物 | 0.001 | 0.01 | ||
榆白皮提取物 | 0.001 | 0.01 | |||
氟化钠 | 0.22 | 0.22 | |||
第1氟化磷酸钠 | 0.76 | 0.76 | |||
香料 | 0.75 | 0.6 | 0.75 | 0.6 | |
食用色素 | 0.00025 | 0.00025 | |||
精制水 | 余量 | 余量 | 余量 | 余量 |
表8 (单位:重量%)
区 分 | 成 分 | 实施例1-15 | 实施例1-16 | 比较例1-15 | 比较例1-16 |
湿润剂 | 甘油 | 20 | 20 | ||
非结晶性山梨糖醇液 | 23 | 23 | |||
粘合剂 | 角叉菜胶 | 0.8 | 0.8 | ||
羧甲基纤维素 | 1 | 1 | |||
表面活性剂 | 月桂基硫酸钠 | 1 | 2 | 1 | 2 |
山梨糖醇酐单油酸酯 | 0.2 | 0.4 | 0.2 | 0.4 | |
炼磨剂 | 磷酸氢钙 | 40 | 40 | ||
沉淀二氧化硅 | 25 | 25 | |||
碳酸钙 | - | - | - | - | |
甜味剂 | 糖精钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
缓冲液 | 磷酸二氢钠 | 0.1 | 1 | 0.1 | 1 |
磷酸钠 | 0.1 | 1 | 0.1 | 1 | |
药效成分 | 牛膝提取物 | 0.1 | 1 | ||
榆白皮提取物 | 0.1 | 1 | |||
氟化钠 | 0.22 | 0.22 | |||
第1氟化磷酸钠 | 0.76 | 0.76 | |||
香料 | 0.75 | 0.6 | 0.75 | 0.6 | |
食用色素 | 0.00025 | 0.00025 | |||
精制水 | 余量 | 余量 | 余量 | 余量 |
表9 (单位:重量%)
区 分 | 成 分 | 实施例1-17 | 实施例1-18 | 比较例1-17 | 比较例1-18 |
湿润剂 | 甘油 | 20 | 20 | ||
非结晶性山梨糖醇液 | 23 | 23 | |||
粘合剂 | 角叉菜胶 | 0.8 | 0.8 | ||
羧甲基纤维素 | 1 | 1 | |||
表面活性剂 | 月桂基硫酸钠 | 1 | 2 | 1 | 2 |
山梨糖醇酐单油酸酯 | 0.2 | 0.4 | 0.2 | 0.4 | |
炼磨剂 | 磷酸氢钙 | 40 | 40 | ||
沉淀二氧化硅 | 25 | 25 | |||
碳酸钙 | - | - | - | - | |
甜味剂 | 糖精钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
缓冲液 | 磷酸二氢钠 | 0.1 | 1 | 0.1 | 1 |
磷酸钠 | 0.1 | 1 | 0.1 | 1 | |
率效成分 | 牛膝提取物 | 2 | 5 | ||
榆白皮提取物 | 2 | 5 | |||
氟化钠 | 0.22 | 0.22 | |||
第1氟化磷酸钠 | 0.76 | 0.76 | |||
香料 | 0.75 | 0.6 | 0.75 | 0.6 | |
食用色素 | 0.00025 | 0.00025 | |||
精制水 | 余量 | 余量 | 余量 | 余量 |
实验例1-1:本发明的牙膏(实施例1-1~1-18)对过氧化物生成的抑制效果
从无疾病健康成人,使用柠檬酸作抗凝固剂,将采集的静脉血液,以12000rpm进行离心分离后,一次回收中层的白细胞浓缩液,接着和RPMI 1640培养基以1∶1的比例稀释后,装入50ml离心管内,加入12ml Ficoll Paque后。将30ml稀释的血液,小心添加使之成为中层,以1600rpm离心分离30分钟后,除去含有血清的上层,注意稀释含有单核细胞的中层后,添加3倍的RPMI 1640培养基,以80rpm离心分离后,弃去上清液,添加10ml RPMI 1640培养基和缓慢送入管(PiPelling)后,以800rpm离心分离10分钟后,弃去上清液,添加HBSS(hanks’bala nced Salt Solution)缓冲液,进行移液后,在24-孔(well)板上以106细胞/孔(well),分注0.45ml的人的单核白细胞、在95%空气、5% CO2、100%湿度条件下无菌培养2小时后,再以0.05ml FMLP(N-Formyl-Mel-Leu phe)进行处理成10-6M,在370℃下培养15分钟,对细胞刺激后,以0.1ml细胞色素C形成80μM,以0.1ml过氧化物歧化酶(Superoxude dismutase)形成30μg,添加将细胞性的某种表面活性剂除外的0.1ml实施例和比较例的3倍稀释的牙膏组合物。添加HBSS(hank’s balanced salt solution),使残留的总反应液成0.9ml后,在37℃下保温10分钟,添加0.1ml作为刺激物质的食菌化的Zymosan A成最终浓度为1.3mg/ml,边振荡边在37℃下保温90分钟后。在4℃下10分钟内停止反应后,4℃下,以1500rpm,离心分离10分钟,此后,以550nm测定上清的光密度(Optical density),并按下式计算出过氧化物阴离子的生成量。 ΔO.D.=(B-D)-(A-C)=(B+C)-(D+A)测定结果示于表10。
A | B | C | D | |
单核白细胞细胞色素CSODFMLPZYMOSAN实验组反应液 | 0.5ml0.1ml---0.4ml | 0.45ml0.1ml-0.05ml0.1ml0.1ml0.2ml | 0.5ml0.1ml0.1ml0.3ml | 0.45ml0.1ml0.1ml0.05ml0.1ml0.2ml |
总合 | 1.00ml | 1.00ml | 1.00ml | 1.00ml |
表10
牙膏组合物 | 实施例 | 比较例 |
1-11-21-31-41-51-61-71-81-91-101-111-121-131-141-151-161-171-18 | 3.5717.4203.4257.4152.4147.4160.9257.4280.2647.1250.2347.1003.2643.2452.4140.9240.2450.242 | 8.4768.4758.4708.5128.5038.4778.4528.4828.4528.3838.2418.4548.3848.4668.5028.4758.4548.510 |
从以上实验结果,显示出含有0.001%以上牛膝提取物的实施例1-1、5、7、9及11中,过氧化物的生成抑制效果,随着牛膝提取物浓度的增加呈上升趋势,反之,含有榆白皮提取物的实施例1-2、4、6、8、10和12中,显示出对过氧化物的生成无抑制效果。含有牛膝提取物和榆白皮提取物的实施例1-13、14、15、16、17和18,显示出对于过氧化物生成的抑制效果,随着牛膝提取物的浓度呈上升趋势。
实施例1-2:本发明牙膏(实施例1-1至1-18)对牙周组织分解酶胶原酶的活性抑制效果
本发明的牙膏对牙周组织分解酶胶原酶的抑制效果实施的实验结果如下。
本试验方法是模仿人体口腔环境的实验方法,在其进行过程中,通过在从牙周病原菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)和分叶核白细胞(Polymorphonuclear leukocytes)和中性白细胞(Neutrophil)分泌的牙周病患者的唾液和齿龈裂口液中所含胶原酶的作用,分解牙周组织基质胶原而引起牙床萎缩。
在25个1.5ml Eppendorf管中,分别添加100μl 2%的作为红色胶原基质的Azocoll溶液,一个Eppendorf管用作空白,三个管中分别添加从Sigma购买的胶原酶I型的标准酶溶液(胶原分解活性:315units/mg),使之成为10、100、200ppm,其余的管中分别添加100μl利用Sephacryl S-200色谱仪由牙周病患者唾液和齿龈裂口液中分离出的胶原酶,再用一个管作对照样,其余各管中,加入将具有细胞毒性的表面活性剂除外的实验牙膏组(实施1-1~1-18)和比较牙膏组(比较例1-1~1-18)和蒸馏水以1∶2的比例完全混合均匀的5000g离心分离10分钟后得到的上清液10μl,进行处理后,添加缓冲液(0.05M Tris-Hcl,InM CaCl2 7.8)使总反应液为500μl,在37℃的恒温器中反应18小时,将Eppendorf管以10000g离心分离5分钟,使没有分解的胶原沉淀出,取含有被分解胶原的上清液,在540nm下测定吸光度,制作成标准活性曲线,从标准曲线换算出酶的活性浓度,比较评价实验组和对照组的酶活性,得到如下结果(参照表11和表12)。
表11 (单位:%=实验组的酶活性×100÷对照组的酶活性)
牙膏组合物 | I-1 | I-2 | I-3 | I-4 | I-5 | I-6 | I-7 | I-8 | I-9 | I-10 |
比较例 | 98 | 98 | 97 | 95 | 98 | 98 | 97 | 97 | 100 | 98 |
实施例 | 98 | 97 | 77 | 75 | 66 | 65 | 25 | 27 | 12 | 9 |
表12 (单位:%=实验组的酶活性×100÷对照组的酶活性)
牙膏组合物 | I-11 | I-12 | I-13 | I-14 | I-15 | I-16 | I-17 | I-18 |
比较例 | 97 | 96 | 97 | 100 | 98 | 98 | 97 | 97 |
实施例 | 0 | 0 | 84 | 65 | 43 | 7 | 0 | 0 |
从以上实验结果可知,含有0.01%牛膝提取物的实施例1-1、5、7、9和11中,对胶原酶活性的抑制效果随着牛膝提取物浓度的增加呈上升趋势,含有榆白皮提取物的实施例1-2、4、6、8、10和12中,对于胶原酶活性的抑制效果随着榆白皮浓度的增加呈上升趋势,牛膝提取物和榆白皮提取物两种对胶原酶活性的抑制效果非常好,含有牛膝提取物和榆白皮提取物两种的实施例1-13、14、15、16、17和18,显示出上升的效果。
实验例1-3:本发明牙膏(实施例1-1~1-18)对单核白细胞的白细胞介素(1L-1β)生成的抑制效果
在24孔(well)板上添加0.8ml由血液中分离的血液单核白细胞,形成106细胞/孔(well),将添加了200μl RPMI 1640培养基的对照孔、添加了100μl E.Coli LPS(250ppm)的孔和添加了100μlLPS(250ppm)和100μl除去具有细胞毒性的表面活性剂的实施例(1-1~1-18)和比较例(1-1~1-18)的3倍稀释的牙膏组合物的孔作为实验组,培养24小时后,添加50μl花生四烯酸(Arachidonicacid),再培养30分钟。在付着有白细胞介素(1L-1β)抗体的96-孔(Well)板的孔上,添加50μl上述细胞培养液,在整个孔上添加50μl生物素抗体试剂后,在25℃下保持30分钟后,用洗涤缓冲液洗涤3次,再向整个孔上添加抗生蛋白链菌素-HRP结合物(Coniugate),再在25℃下保持30分钟后,再用洗涤缓冲液洗涤3次,立即添加100μl的酶基质,25℃暗室中,打开板盖,保持30分钟,添加100μl 0.18M硫酸后,用微板判读机,在450nm下测定吸光度,以标准溶液的吸光度值制作标准曲线计算出实验组的白细胞介素生成量。测定结果示于下表13。
表13
牙膏组合物 | 实施例1L-1β(pg) | 比较例1L-1β(pg) |
Blank(空白)Control(对照)I-1I-2I-3I-4I-5I-6I-7I-8I-9I-10I-11I-12I-13I-14I-15I-16I-17I-18 | 624190815971871881172172417236381734625172562417211582871723632624624 | 62410982196188119211880178761854192118511907190319051906190419871911192419311905 |
对用大肠杆菌(E.coli)LPS刺激的人体单核白细胞的1L-1β生成的功效、效果的试验结果,可知含有0.01%浓度以上的牛膝提取物的1-3、5、7、9和11中的抑制效果,随着牛膝提取物浓度的增加,呈现出上升趋势,反之,含有榆白皮提取物的实施例1-2、4、6、8、10和12中没有1L-1β生成抑制效果。含有牛膝提取物和榆白皮提取物两种的实施例1-13、14、15、16、17和18中,对过氧化物生成的抑制效果随着牛膝提取物浓度而呈上升趋势。
实验例1-4:本发明牙膏(实施例1-1~1-18)对单核白细胞的前列腺素(PGE2)生成的抑制效果
用本发明的牙膏实施对牙周病诱发物质前列腺素生成的抑制效果,实验结果如下。
本试验方法是用牙周病进行过程中牙周病原菌牙龈叶啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的细胞壁构成成分类脂多糖类(lipopolysacch-aride)刺激人的单核白细胞,诱发前列腺素(PGE2)的生成,用抗原-抗体免疫诊断法,除去具有细胞毒性的表面活性剂的实验组牙膏(实施例1-1~1-18)和比较组牙膏(比较例1-1~1-18)和蒸馏水以1∶2的比例完全混合均匀,以5000g离心分离10分钟,处理上清液后,比较评价抑制效果。
具体的试验方法,在付着了山羊的抗-鼠1gG的96-孔(well)板的空白(Blank)孔(well)上,添加50μl缓冲溶液(含有0.9%NaCl,0.1%牛血清蛋白、0.5% Kathon的0.1M磷酸缓冲液),在标准(0,2.5,5,10,20,40,80,160,320pg)孔上添加50μl适当浓度的标准溶液后,将如上述所述制造的除去具有细胞毒性的表面活性剂的实验组牙膏(实施例1-1~1-18)和比较组牙膏(比较例1-1~1-18)50μl添加到实施例和比较例组中设定的孔中,除了空白孔外,全部孔中添加50μl对于PGE2的抗体,除了空白孔外,所有孔添加50μl的PGE2共轭合物过氧化酶(Conjugate peroxidase),用96-孔板盖住,在25℃下,保持1小时后,用洗涤缓冲溶液(含有0.05 Tween 20的磷酸缓冲溶液:PH7.5)洗涤4次,常温下直接添加150μl酶基质(在20%的二甲基甲酰胺中溶解了3,3’,5,5’-四甲基联苯胺/过氧化氢),25℃下保持30分钟,添加100μl 1M硫酸后,用微板判读机,在450nm下测定吸光度,以标准液的吸光度值制作标准曲线,计算出实验组的前列腺素生成量。测定结果示于表14和15。
表14 (单位:pg)
牙膏组合物 | I-1 | I-2 | I-3 | I-4 | I-5 | I-6 | I-7 | I-8 | I-9 | I-10 |
比较例 | 250 | 254 | 232 | 238 | 245 | 250 | 246 | 247 | 239 | 251 |
实施例 | 194 | 245 | 154 | 232 | 112 | 231 | 74 | 225 | 57 | 224 |
表15 (单位:pg)
牙膏组合物 | I-11 | I-12 | 1-13 | I-14 | I-15 | I-16 | I-17 | I-18 |
比较例 | 242 | 248 | 238 | 239 | 242 | 245 | 246 | 254 |
实施例 | 56 | 234 | 192 | 145 | 110 | 75 | 56 | 55 |
实施对用大肠杆菌(E.coli)LPS刺激的人单核白细胞的PGE2生成的功能、效果,从结果可知,含有牛膝提取物的1-3、5、7、9和11中的抑制效果,随着牛膝提取物的浓度显示出上升趋势,反之,含有榆白皮提取物的实验例1-2、4、6、8、10和12中,对PGE2生成没有抑制效果。含有牛膝提取物和榆白皮提取物两种的实施例1-13、14、15、16、17和18,PGE2生成抑制效果随着牛膝提取物浓度呈上升趋势。
实施例1-5:本发明牙膏(实施例1-1~1-18)对牙龈纤维牙细胞的胶原蛋白质生成的效果
将初步培养的牙龈纤维牙细胞以106细胞/孔分注在24-孔板上,在含有10%FBS的DMEM培养基中培养一天,第2天将该培养基换成新鲜的培养基上,培养24小时后,用HBSS缓冲液洗涤附着于底部的洗涤层后,添加0.8ml不含有血清和脯氨酸的MEM培养基后,将除去具有细胞毒性的表面活性剂的实验组牙膏(实施例1-1~1-18)和比较组牙膏(比较例1-1~1-18)和蒸馏水以1∶2比例完全混合均匀,以5000g离心分离10分钟,处理上清液后,在含有14C-脯氨酸(10Ci)100μl的培养液中培养细胞。经过24小时后,测定总蛋白质和胶原蛋白质。首先,为测定细胞外蛋白质的总合成量,将各孔的培养液装入一端封口的透析管内,再封口另一端,用冷缓冲液(cold Buffer)(Tris-Hcl 0.05mol/l、Nacl 0.2mol/l、Cacl2 0.05mol/l、苯甲基磺酰氟化物0.3mN)24小时内完成透析后,分别取100μl,装入计量瓶内,再装入10ml闪烁Coctail,用液体闪烁计数器(LSC)测定1分钟的放射能。为测定细胞内蛋白质总合成量,在去除了细胞培养液的各个孔中添加0.1N NaOH和苯甲基磺酰氟化物0.3mN后,60℃下保持30分钟,待破坏掉细胞膜后,将细胞均质液装入一端封口的透析管内,再封口另一端,用冷缓冲液(Trls-Hcl 0.05mol/l、Nacl 0.2mol/l、Cacl2 0.05mol/l、苯甲基磺酰氟化物0.3mN)24小时内完成透析后,各自取100μl装入计量瓶内,再装入10ml闪烁Coctail,用LSC测定1分钟放射能。为测定细胞内.外胶原蛋白质的合成量,将透析完的细胞培养液和细胞均质液各取100μl装入1.5ml微型管内,再添加Collagenase缓冲液(0.05M Tris-Hcl 1mM Cacl2,0.03mN苯甲基磺酰氟化物)、胶原酶(100ppm)100μl后。37℃下保持3小时,待胶原完全分解后,为去除没分解的蛋白质,添加500μl含有50%的三氯醋酸和1%的单宁酸的溶液后,4℃下,沉淀30分钟,以1000Xg离心分离5分钟后,取100μl上清液装入计量管内,再装入10ml的闪烁Coctail,用LSC测定1分钟放射能。测定结果示于下表16。
表16
牙膏组合物 | 实施例(cpm/106cell) | 比较例(cpm/106cell) |
I-1I-2I-3I-4I-5I-6I-7I-8I-9I-10I-11I-12I-13I-14I-15I-16I-17I-18 | 266035402320452026504940265052402420525021205250210052603540453049505230 | 265026402650264026302630261025402590262026102660264026502640253026202630 |
为了研究对人的纤维牙细胞胶原合成的功能和效果,按以上用本发明牙膏组合物处理包含14C-脯氨酸的细胞培养液的结果,含有榆白皮提取物的1-2、4、6、8、10和12中促进胶原合成效果,随着榆白皮浓度的增加而呈现上升趋势,反之,含有牛膝提取物的实施例1-3、5、7、9和11中,没有促进胶原合成效果。含有牛膝提取物和榆白皮提取物两种的实施例1-13、14、15、16、17和18中,促进胶原合成效果,随着榆白皮提取物的浓度呈现出上升趋势。
实施例1-6:对本发明牙膏(实施例1-1~1-18)的功能和效果的临床实验
用本发明的牙膏对牙周病治疗临床实验的实施结果如下。
将牙列整齐没有损缺牙齿的牙周疾病患者作为实验对象,年龄从30岁到50岁,以10岁为一年龄段,按性别,每30名实施精密口腔检查诊断,共选择120名实验对象,每60名一组分开,按如下方法,对实验组牙膏(实施例1-1~1-18)和比较组牙膏(比较例1-1~1-18)的牙周疾病患者治疗效果的临床实验。
首先,按如下方法进行本发明牙膏的临床实验。
将实验对象组分成实验组和比较组后,教授口腔保健教育和正确刷牙方法后,对整个实验对象组供给同样的对照牙刷实施牙面细磨,将初期牙龈炎指数点数化,供给实验组牙膏和比较组牙膏使用1周、1个月、3个月、6个月后,实施口腔检查诊断,检查齿龈炎指数,齿龈炎指数的测定方法,将牙周膜试验片(Periodental prove)插入齿龈列口内,在加力的状态下,连续针刺各牙齿周围,测定30秒后的出血状态,按如下方法记录点数,获得结果。
点数 | 内 容 |
0点1点2点3点4点 | 无出血状态点状出血状态线状出血状态齿间部位三角形出血状态齿龈整体出血状态 |
测定结果示于下述表17。
表17
牙膏组合物 | 初期 | 1周 | 1月 | 3月 | 6月 | |||||
实施例 | 比较例 | 实施例 | 比较例 | 实施例 | 比较例 | 实施例 | 比较例 | 实施例 | 比较例 | |
I-1I-2I-3I-4I-5I-6I-7I-8I-9I-10I-11I-12I-13I-14I-15I-16I-17I-18 | 1.041.051.041.051.041.051.041.051.041.051.041.051.071.051.061.071.051.07 | 1.051.021.031.011.031.041.031.021.031.011.031.021.041.051.031.031.051.06 | 1.261.201.281.211.261.251.261.201.261.201.261.201.091.061.071.071.051.07 | 1.431.351.441.371.431.381.451.371.431.391.431.381.351.351.421.351.361.38 | 1.641.831.651.801.721.861.681.451.431.831.421.831.241.141.111.091.061.08 | 2.452.372.422.392.452.422.422.382.392.372.442.382.372.362.422.452.372.38 | 1.892.251.852.201.802.191.792.181.752.251.892.251.341.251.241.151.101.09 | 3.243.113.343.223.253.313.353.413.533.413.343.423.323.353.433.523.453.34 | 2.542.822.432.622.342.542.212.542.022.431.922.422.343.021.721.211.151.09 | 3.563.413.543.453.643.483.573.473.533.493.523.433.463.453.483.523.533.56 |
从上述实验结果,可知,含有抑制诱发牙周疾病的1L-1和白细胞介素生成和过氧化物,可抑制分解牙周组织的胶原酶活性的牛膝提取物,和或促进胶原合成,可抑制胶原酶活性的榆白皮提取物的本发明牙膏(实施例1-1~1-12)的牙周疾病治疗效果,从1周到6个月,比不含有牛膝提取物或榆白皮提取物的比较例(1~18)显示出优良的功能,比较例齿龈炎指数,从1个月以后,随着时间的延长,不断地上升,反之,使用本发明开发研制的牙膏时,抑制牙周疾病发生的牙龈炎指数,随着时间的延长,显示出显著减少的趋势。含有牛膝提取物和榆白皮提取物两种的实施例1-13、14、15、16、17和18,对牙周疾病抑制显示出上升的效果。
实施例2-1~2-18和比较例2-1~2-18
按下述表18~26中记载的成分配比,以通常软膏剂制造方法。将各成分溶解在缓冲液中,并形成凝胶,根据本发明制造软膏剂组合物(实施例2-1~2-18)和比较组合物(比较例2-1~2-18)。
表18
区分 | 成分 | 实施例2-1(重量%) | 实施例2-2(重量%) | 比较例2-1(重量%) | 比较例2-2(重量%) |
湿润剂 | 甘油 | 5 | 5 | ||
聚乙二醇 | 5 | 5 | |||
羧甲基纤维素 | |||||
poloxamer 407 | 0.1 | 0.1 | |||
甘油单酸酯(ミベロ-ル18-99) | 10 | 15 | 10 | 15 | |
药效传递组分 | 明胶 | 5 | 5 | 5 | 5 |
果胶 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
表面活性剂 | Pluronic F-127 | 20 | 20 | ||
Pluronic F-108 | 20 | 20 | |||
低级醇 | 乙醇 | 5 | 5 | ||
异丙醇 | 5 | 5 | |||
防腐剂 | 对羟基苯甲酸甲酯 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
对羟基苯甲酸丙酯 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
甜味剂 | 糖精钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
缓冲液 | 磷酸二氢钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
磷酸钠 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
药效成分 | 牛膝提取物 | 0.001 | |||
榆白皮提取物 | 0.001 | ||||
香料 | 0.75 | 0.75 | 0.75 | 0.75 | |
食用色素 | 0.0002 | 0.0002 | |||
精制水 | 余量 | 余量 | 余量 | 余量 |
表19
区分 | 成分 | 实施例2-3(重量%) | 实施例2-4(重量%) | 比较例2-3(重量%) | 比较例2-4(重量%) |
湿润剂 | 甘油 | 10 | 10 | ||
聚乙二醇 | 5 | 5 | |||
羧甲基纤维素 | 0.5 | 0.1 | 0.5 | 0.1 | |
poloxamer 407 | 10 | 10 | |||
甘油单酸酯(ミベロ-ル18-99) | 20 | 20 | |||
药效传递组分 | 明胶 | 3 | 2 | 3 | 2 |
果胶 | 3 | 2 | 3 | 2 | |
表面活性剂 | Pluronic F-127 | 15 | 15 | ||
Pluronic F-108 | 15 | 20 | |||
低级醇 | 乙醇 | 5 | 5 | ||
异丙醇 | 5 | 5 | |||
防腐剂 | 对羟基苯甲酸甲酯 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
对羟基苯甲酸丙酯 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
甜味剂 | 糖精钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
缓冲液 | 磷酸二氢钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
磷酸钠 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
药效成分 | 牛膝提取物 | 0.01 | |||
榆白皮提取物 | 0.01 | ||||
香料 | 0.75 | 0.75 | 0.75 | 0.75 | |
食用色素 | 0.0002 | 0.0002 | |||
精制水 | 余量 | 余量 | 余量 | 余量 |
表20
区分 | 成分 | 实施例2-5(重量%) | 实施例2-6(重量%) | 比较例2-5(重量%) | 比较例2-6(重量%) |
湿润剂 | 甘油 | 15 | 15 | ||
聚乙二醇 | 5 | 5 | |||
羧甲基纤维素 | 0.5 | 0.5 | |||
poloxamcr 407 | 5 | 1 | 5 | 1 | |
甘油单酸酯(ミベロ-ル 18-99) | 5 | 5 | |||
药效传递组分 | 明胶 | 1 | 10 | 1 | 10 |
果胶 | 1 | 5 | 1 | 5 | |
表面活性剂 | Pluronic F-127 | 10 | 10 | ||
Pluronic F-108 | 10 | 20 | |||
低级醇 | 乙醇 | 5 | 5 | ||
异丙醇 | 5 | 5 | |||
防腐剂 | 对羟基苯甲酸甲酯 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
对羟基苯甲酸丙酯 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
甜味剂 | 糖精钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
缓冲液 | 磷酸二氢钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
磷酸钠 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
药效成分 | 牛膝提取物 | 0.01 | |||
榆白皮提取物 | 0.01 | ||||
香料 | 0.75 | 0.75 | 0.75 | 0.75 | |
食用色素 | 0.0002 | 0.0002 | |||
精制水 | 余量 | 余量 | 余量 | 余量 |
表21
区分 | 成分 | 实施例2-7(重量%) | 实施例2-8(重量%) | 比较例2-7(重量%) | 比较例2-8(重量%) |
湿润剂 | 甘油 | 20 | 20 | ||
聚乙二醇 | 5 | 5 | |||
羧甲基纤维素 | |||||
poloxamer 407 | 10 | 10 | |||
甘油单酸酯(ミベロ-ル18-99) | 20 | 20 | |||
药效传递组分 | 明胶 | 5 | 20 | 5 | 20 |
果胶 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
表面活性剂 | Pluronic F-127 | 5 | 5 | ||
Pluronic F-108 | 5 | 5 | |||
低级醇 | 乙醇 | 10 | 10 | ||
异丙醇 | 10 | 10 | |||
防腐剂 | 对羟基苯甲酸甲酯 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
对羟基苯甲酸丙酯 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
甜味剂 | 糖精钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
缓冲液 | 磷酸二氢钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
磷酸钠 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
药效成分 | 牛膝提取物 | 1 | |||
榆白皮提取物 | 1 | ||||
香料 | 0.75 | 0.75 | 0.75 | 0.75 | |
食用色素 | 0.0002 | 0.0002 | |||
精制水 | 余量 | 余量 | 余量 | 余量 |
表22
区分 | 成分 | 实施例2-9(重量%) | 实施例2-10(重量%) | 比较例2-9(重量%) | 比较例2-10(重量%) |
湿润剂 | 甘油 | 10 | 10 | ||
聚乙二醇 | 10 | 10 | |||
羧甲基纤维素 | |||||
poloxamer 407 | |||||
甘油单酸酯(ミベロ-ル 18-99) | |||||
药效传递组分 | 明胶 | 10 | 10 | 10 | 10 |
果胶 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
表面活性剂 | Pluronic F-127 | 15 | 15 | 15 | 15 |
Pluronic F-108 | 15 | 15 | 15 | 15 | |
低级醇 | 乙醇 | 10 | 10 | ||
异丙醇 | 10 | 10 | |||
防腐剂 | 对羟基苯甲酸甲酯 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
对羟基苯甲酸丙酯 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
甜味剂 | 糖精钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
缓冲液 | 磷酸二氢钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
磷酸钠 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
药效成分 | 牛膝提取物 | 2 | |||
榆白皮提取物 | 2 | ||||
香料 | 0.75 | 0.75 | 0.75 | 0.75 | |
食用色素 | 0.0002 | 0.0002 | |||
精制水 | 余量 | 余量 | 余量 | 余量 |
表23
区分 | 成分 | 实施例2-11(重量%) | 实施例2-12(重量%) | 比较例2-11(重量%) | 比较例2-12(重量%) |
湿润剂 | 甘油 | 10 | 10 | ||
聚乙二醇 | 10 | 10 | |||
羧甲基纤维素 | |||||
poloxamer 407 | 20 | 20 | |||
甘油单酸酯(ミベロ-ル 18-99) | 20 | 20 | |||
药效传递组分 | 明胶 | 2 | 2 | 2 | 2 |
果胶 | 3 | 3 | 3 | 3 | |
表面活性剂 | Pluronic F-127 | 10 | 10 | ||
Pluronic F-108 | 10 | 10 | |||
低级醇 | 乙醇 | 10 | 10 | ||
异丙醇 | 10 | 10 | |||
防腐剂 | 对羟基苯甲酸甲酯 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
对羟基苯甲酸丙酯 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
甜味剂 | 糖精钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
缓冲液 | 磷酸二氢钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
磷酸钠 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
药效成分 | 牛膝提取物 | 5 | |||
榆白皮提取物 | 5 | ||||
香料 | 0.75 | 0.75 | 0.75 | 0.75 | |
食用色素 | 0.0002 | 0.0002 | |||
精制水 | 余量 | 余量 | 余量 | 余量 |
表24
区分 | 成分 | 实施例2-13(重量%) | 实施例2-14(重量%) | 比较例2-13(重量%) | 比较例2-14(重量%) |
湿润剂 | 甘油 | 5 | 5 | ||
聚乙二醇 | |||||
羧甲基纤维素 | 1 | 1 | |||
poloxamer 407 | 15 | 20 | 15 | 20 | |
甘油单酸酯(ミベロ-ル 18-99) | 20 | 20 | |||
药效传递组分 | 明胶 | 5 | 5 | 5 | 5 |
果胶 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
表面活性剂 | Pluronic F-127 | 10 | 10 | ||
Pluronic F-108 | 10 | 10 | |||
低级醇 | 乙醇 | 10 | 10 | ||
异丙醇 | 10 | 10 | |||
防腐剂 | 对羟基苯甲酸甲酯 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
对羟基苯甲酸丙酯 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
甜味剂 | 糖精钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
缓冲液 | 磷酸二氢钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
磷酸钠 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
药效成分 | 牛膝提取物 | 0.001 | 0.01 | ||
榆白皮提取物 | 0.001 | 0.01 | |||
香料 | 0.75 | 0.75 | 0.75 | 0.75 | |
食用色素 | 0.0002 | 0.0002 | |||
精制水 | 余量 | 余量 | 余量 | 余量 |
表25
区分 | 成分 | 实施例2-15(重量%) | 实施例2-16(重量%) | 比较例2-15(重量%) | 比较例2-16(重量%) |
湿润剂 | 甘油 | 10 | 10 | ||
聚乙二醇 | 10 | 10 | |||
羧甲基纤维素 | |||||
poloxamer 407 | 15 | 15 | 15 | 15 | |
甘油单酸酯(ミベロ-ル 18-99) | |||||
药效传递组分 | 明胶 | 2 | 2 | 2 | 2 |
果胶 | 2 | 2 | 2 | 2 | |
表面活性剂 | Pluronic F-127 | 15 | 15 | ||
Pluronic F-108 | 15 | 15 | |||
低级醇 | 乙醇 | 10 | 10 | ||
异丙醇 | 10 | 10 | |||
防腐剂 | 对羟基苯甲酸甲酯 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
对羟基苯甲酸丙酯 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
甜味剂 | 糖精钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
缓冲液 | 磷酸二氢钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
磷酸钠 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
药效成分 | 牛膝提取物 | 0.01 | 1 | ||
榆白皮提取物 | 0.01 | 1 | |||
香料 | 0.75 | 0.75 | 0.75 | 0.75 | |
食用色素 | 0.0002 | 0.0002 | |||
精制水 | 余量 | 余量 | 余量 | 余量 |
表26
区分 | 成分 | 实施例2-17(重量%) | 实施例2-18(重量%) | 比较例2-17(重量%) | 比较例2-18(重量%) |
湿润剂 | 甘油 | 15 | 15 | ||
聚乙二醇 | 15 | 15 | |||
羧甲基纤维素 | |||||
poloxamer 407 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
甘油单酸酯(ミベロ-ル 18-99) | |||||
药效传递组分 | 明胶 | 5 | 5 | 5 | 5 |
果胶 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
表面活性剂 | Pluronic F-127 | 10 | 10 | ||
Pluronic F-108 | 10 | 10 | |||
低级醇 | 乙醇 | 10 | 10 | ||
异丙醇 | 10 | 10 | |||
防腐剂 | 对羟基苯甲酸甲酯 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
对羟基苯甲酸丙酯 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
甜味剂 | 糖精钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
缓冲液 | 磷酸二氢钠 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.2 |
磷酸钠 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
药效成分 | 牛膝提取物 | 2 | 5 | ||
榆白皮提取物 | 2 | 5 | |||
香料 | 0.75 | 0.75 | 0.75 | 0.75 | |
食用色素 | 0.0002 | 0.0002 | |||
精制水 | 余量 | 余量 | 余量 | 余量 |
实验例2-1:本发明软膏剂抑制过氧化物生成效果
按如下方法测定本发明软膏剂组合物对诱发牙周病物质过氧化物生成的抑制效果。
使用柠檬酸作抗凝剂,从全身无疾患健康成人采集静脉血液,以1200转/分分离离心10分钟后,一次性地回收中层的白细胞浓缩液,一次性地用RPMI 1640培养基以1∶1的比例稀释。在50ml的离心管中加入12ml Ficoll Paque后,小心添加30ml稀释的血液,使之成为中层,以1600转/分(rpm)离心分离30分钟。除去含有血清的上层,用灭过菌的吸管将含有单核细胞的中层小心取出装入新的离心分离管中,添加3倍量的RPMI 1640培养基,以800rpm离心分离10分钟。弃去上清液,再添加10ml RPMI 1640培养液,缓慢进行移液后,以800rpm离心分离10分钟,弃去上清液,添加HBSS(hanks’balancedSalt Solution)缓冲液,进行移液后,将人的单核白细胞,以106细胞/well,向24-well板上分别注入0.45ml,在95%的空气、5%的CO2、100%湿度条件下,无菌培养2小时后,用FMLP(N-Formyl-Met-Leu-Phe)0.05ml(10-6M)进行处理,在37℃下培养15分钟,刺激细胞。再分别添加0.1ml(80μM)细胞色素(Cytochrome)C、0.1ml(30μM)过氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)、和0.1ml用HBSS稀释3倍的实施例和比较例的软膏组合物后,添加HBSS使总反应液达到0.9ml,37℃下保温10分钟,再添加0.1ml作为刺激物质的食菌化的ZymosanA,使最终浓度为1.3mg/ml。一边振荡反应混合物,一边在87℃下保温90分钟后,在4℃冷库内放10分钟,将反应停止后,在4℃下,以1500rpm离心分离10分钟。以550nm测定上清液的吸光度,按下式计算出过氧化物阴离子的生成量。 ΔO.D.=(B-D)-(A-C)=(B+C)-(D+A)
A | B | C | D | |
单核白细胞细胞色素CSODFMLPZYMOSAN实验组反应液 | 0.5ml0.1ml---0.4ml | 0.45ml0.1ml-0.05ml0.1ml0.1ml0.2ml | 0.5ml0.1ml0.1ml---0.3ml | 0.45ml0.1ml0.1ml0.05ml0.1ml-0.2ml |
总合 | 1.00ml | 1.00ml | 1.00ml | 1.00ml |
表27
牙膏组合物 | 实施例 | 比较例 |
2-12-22-32-42-52-62-72-82-92-102-112-122-132-142-152-162-172-18 | 3.5727.5203.4257.4152.4147.4160.9257.4280.2647.1250.2437.1003.2643.2452.4140.9240.2450.242 | 8.4768.4758.4708.5128.5038.4778.4528.4828.4528.3838.2418.4548.3848.4668.5028.4758.4548.510 |
从上述表27中记载的结果可知,含有0.001%以上牛膝的实施例2-1、5、7、9和11中,过氧化物生成抑制效果,随着牛膝浓度的增加呈现出上升趋势,反之,含有榆白皮的实施例2-、2、4、6、8、10和12中,却没有显示出过氧化物生成抑制效果。含有牛膝和榆白皮两种的实施例2-13、14、15、16、17和18,对过氧化物生成的抑制效果,随着牛膝浓度呈上升趋势。
实验例2-2:本发明软膏剂对胶原酶活性的抑制效果
按如下方法实验本发明软膏剂组合物对牙周组织分解酶胶原酶的抑制效果。
本实验方法是模拟人体口腔环境的实验方法。从牙周疾病进行过程中,牙周疾病病原菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)和分叶核白细胞(Polymorphonuclear leukocytes)和中性白细胞(Neutrophil)分泌的牙周疾病患者的唾液和齿龈列口液中所含的胶原酶作用,分解牙周组织基质胶原,而引起牙床退缩。
在25个1.5ml Eppendorf管内,分别添加100μ1 2%的红色胶原基质Azocoll溶液,一个Eppendorf管用作空白,三个管中分别加入10、100、200ppm的从Sigma社购买的I型胶原酶标准酶溶液(胶原分解活性:315units/mg)。其余的管中分别添加100μl利用Sephacryl S-200色谱柱由牙周疾病患者的唾液和齿龈裂口液中分离出的胶原酶,其中的一个管作为对照样品使用,其余的管中用微细管添加10μl,将本发明的实验组软膏(实施例2-1~2-18)和比较组软膏(比较例2-1~2-18)与蒸馏水以1∶2的比例混合完全均质化5000g离心分离10分钟的上清液,再添加缓冲溶液(0.05M Tris-Hcl,InMCaCl2,7.8)使总反应液为500μl。将各Eppendorf管装入37℃恒温器内反应18小时后,以10000g进行分离5分钟,沉淀出没有分解的胶原,取含有分解的胶原的上清液。在540nm下测定吸光度,由添加了标准酶溶液的管获得的结果作成标准活性曲线,再从标准曲线中换算出其余管中的酶活性浓度,将实验组和对照组的酶活性进行比较评价。测定结果示于表28。
表28
软膏组合物 | 实施例 | 比较例 |
2-12-22-32-42-52-62-72-82-92-102-112-122-132-142-152-162-172-18 | 989763695455231911800925438500 | 989493959695979495959596979998969797 |
从上述表28中记载的结果可知,含有0.001%以上牛膝的实施例2、1、5、7、9和11中,对胶原酶活性的抑制效果,随着牛膝浓度的增加呈现上升趋势,含有榆白皮提取物的实施例2-2、4、6、8、10和12中,对胶原酶活性的抑制效果,随着榆白皮浓度的增加显示上升趋势,牛膝提取物和榆白皮提取物两种对胶原酶活性的抑制效果非常好,含有牛膝提取物和榆白皮提取物两种的实施例2-13、14、15、16、17和18中,显示出上升效果。
实施例2-3:本发明的软膏剂对单核白细胞的白细胞介素(1L-1β)生成的抑制效果
按如下方法测定用本发明的软膏剂组合物对牙周疾病诱发物质白细胞介素(1L-1β)生成的抑制效果。
将0.8ml从血液中分离的血液单核白细胞加入到24-孔板中,分注成106细胞/孔的浓度,将添加了200μl RPMI 1640培养基的孔作对照组、将添加了100μl大肠杆菌(E.coli)LPS(250ppm)的孔和添加了100μl LPS(250ppm)和100μl用RPMI 1640培养基稀释3倍的软膏剂的孔作实验组,培养24小时后,分别添加50μl花生四烯酸,再培养30分钟。在付着了1L-1β抗体的96-Well板的孔中,添加50μl 1L-1β标准溶液(0、10、24、25、6、64、160、400pg/孔后,在实验组孔(well)上添加50μl的上述细胞培养液,在所有的孔中分别添加50μl生物素(Biotinyl)化的抗体试剂后,25℃下保持30分钟后,用洗涤缓冲液(含有0.05(重量)%(TWeen20的0.01M磷酸盐缓冲液、PH7.5)洗涤3次。在所有的孔(Well)中添加100μl抗生蛋白链菌素(streptavidin)-HRP结合物(Conjugate),再在25℃下保持30分钟后,再用洗涤缓冲溶液洗涤3次,直接添加100μl的酶基质,在25℃暗室内打开板盖,保持30分钟,添加100μl 0.18M硫酸后,用微板判读机,在450nm下测定吸光度,由标准溶液的吸光度值制作标准曲线,以该曲线为基准计算出实验组的白细胞介素生成量。测定结果如表29所示。
表29
牙膏组合物 | 实施例1L-1β(pg) | 比较例1L-1β(pg) |
空白对照2-12-22-32-42-52-62-72-82-92-102-112-122-132-142-152-162-172-18 | 621213115841741865172470117116241725624171062417151672863715629624624 | 62121312042194119111941192119451921192419151924319161906191019241911192419311911 |
从上述表29中记载的结果可知,本发明软膏剂对用大肠杆菌(E.col)LPS刺激的人单核白细胞1L-1β生成抑制效果的试验结果,可知含有0.01%浓度以上的牛膝提取物的2-3、5、7、9和11中,抑制效果随着牛膝提取物浓度的增加,呈现上升趋势,反之,含有榆白皮提取物的实施例2-2、4、6、8、10和12中,对1L-1β的生成没有抑制效果。含有牛膝和榆白皮两种的实施例2-13、14、15、16、17和18中对于1L-1β生成的抑制效果随着牛膝浓度而上升。
实验例2-4:本发明软膏剂对单核白细胞的前列腺素(PGE2)生成的抑制效果
按如下方法实验本发明软膏剂组合物对牙周疾病诱发物质前列腺素生成的抑制效果。
本试验方法是,用牙周疾病进行过程中的牙周病原菌Porphyromonas gingivalis的细胞壁构成成分类脂多糖类刺激人的单核白细胞诱发PGE2的生成,以抗原-抗体免疫诊断法,将实验组软膏剂(实施例2-1~2-8)和比较组牙膏及软膏剂(比较例2-1~2-18)与蒸馏水,以1∶2的比例完全均质混合,以5000g离心分离10分钟,处理上清液后,比较评价抑制效果。具体的实验方法如下。
在付着山羊抗-鼠IgG的96-Well板的空白孔(Well)中添加50μl缓冲溶液(含有0.9%Nacl,0.1%牛血清蛋白、0.5% Kathon的0.1M磷酸缓冲溶液),在标准孔中添加50μl适当浓度(0、2.5、5、10、20、40、80、160、320pg)的PGE2标准溶液后,将50μl如上制造的实验组软膏剂(实施例2-1~2-18)和比较组软膏剂(比较例2-1~2-18)添加到设定为实施例和比较例组的孔(Well)中,除了空白孔(Well)外,所有的孔(Well)中添加50μl对PGE2的抗体后,除了空白(Well)外,在所有的(well)中添加50μl PGE2Conjugate Peroxidase,用96-孔Well板复盖,在25℃下维持1小时后,用洗涤缓冲溶液(含有0.05% Tween 20的磷酸缓冲溶液:PH7.4)洗涤4次,在常温下直接加入150μl酶基质(在20%的二甲基甲酰胺中溶解3,3’,5,5’-四甲基联苯胺/过氧化氢),在25℃下保持30分钟,添加100μl 1M硫酸后,用微板判读机,在450nm下测定吸光度,由标准溶液的吸光度值制作标准曲线,再由该标准曲线计算出实验组的前列腺素生成量(单位pg)。测定结果示于表30。
表30
软膏组合物 | 实施例 | 比较例 |
2-12-22-32-42-52-62-72-82-92-102-112-122-132-142-152-162-172-18 | 184234142223109225762275822655225182134108735452 | 243242243238240241246247239248225248238230245248246244 |
从上述表30中记载的结果可知,本发明软膏剂组合物对用大肠杆菌(E.Coli)LPS进行刺激的人的单核白细胞PGE2生成的抑制效果,试验结果是含有牛膝提取物的2-3、5、7、9和11中,抑制效果随着牛膝提取物浓度的增加,显示出上升趋势,反之,含有榆白皮提取物的实施例2-2、4、6、8、10和12中,没有显示出PGE2生成抑制效果。含有牛膝和榆白皮两者的实施例2-13、14、15、16、17和18,PGE2生成抑制效果随着牛膝浓度呈上升趋势。
实验例2-5:本发明软膏剂对齿龈纤维牙细胞的胶原蛋白质生成的效果
按如下方法测定本发明软膏剂组合物对齿龈纤维牙细胞的胶原蛋白质生成的影响。
将一次培养的齿龈纤维细胞,以106细胞/孔,注入到24-孔板中,并在各孔中注入1ml含有10%FBS的DMEM培养基,培养一天,次日,将既存的培养基交换到新的培养基上,培养24小时后,用HBSS缓冲液洗涤付于底部的洗涤层后,再添加0.8ml不含有血清和(脯氨酸)脯氨酸的MEM培养基后,直接将实验组软膏剂(实施例2-1~2-18)和比较组软膏剂(比较例2-1~2-18)用DMEM培养基以1∶2的比例进行稀释完全均质化,以5000g离心分离10分钟,处理100μl所得上清液后,直接在含有100μl14C-脯氨酸(10μ Ci)的培养液中培养细胞。经过24小时后,测定胶原蛋白质。首先,为测定细胞外蛋白质总合成量,将各孔的培养液装入封住一端的透析管内,将另一端封口,用冷缓冲液(Tris-Hcl 0.05mol/l、Nacl 0.2mol/l Cacl20.05mol/l,苯甲基磺酰氟化物0.3mN)透析24小时后,分别取100μl,装入计量管内,加入10ml闪烁Coctail,用液体闪烁计数器(LSC)测定1分钟放射能。为测定细胞内蛋白质总合成量,在除去细胞培养液的各个孔(well)中,分别添加0.1N NaOH和0.3mN苯甲基磺酰氟化物后,在60℃下保持30分钟,待细胞膜破坏后,将细胞菌质液装入封住一端的透析管内,再封住另一端,用冷缓冲液(Tris-Hcl0.05mol/l、Nacl 0.2mol/l,Cacl2 0.05mol/l、苯甲基磺酰氟化物0.3mN)透析24小时后,分别取100μl,装入计量管内,加入10ml闪烁Coctail,用LSC测定1分钟放射能。为测定细胞内-外胶原蛋白质的总合成量,将透析完的细胞培养液和细胞均质液各取100μl装入1.5ml微细管内,添加胶原酶缓冲液(0.05M Tris-Hcl 1mM Cacl20.03mM苯甲基磺酰氟化物)、100μl胶原酶(100ppm)后,37℃下保持3小时,待胶原分解完全后,为去除没分解的蛋白质,添加500μl含有50%三氯醋酸和1%旦宁酸的溶液后,在4℃下沉淀30分钟后,以1000Xg,离心分离5分钟后,取100μl上清液,装入计量管内,再加入10ml闪烁Coctail,用LSC测定1分钟放射能。测定结果示于表31。
表31
牙膏组合物 | 实施例(cpm/106 cell) | 比较例(cpm/106cell) |
2-12-22-32-42-52-62-72-82-92-102-112-122-132-142-152-162-172-18 | 267036402340463026704840264052402320534022205260214052603540454049605240 | 275027402540264026302620261026402570263026202630265026302590263026502640 |
从表31中记载的结果可知,用本发明的软膏组合物处理含有14C-脯氨酸的细胞培养液的结果,含有榆白皮提取物的2-2、4、6、8、10和12中,促进胶原合成效果,随着榆白皮浓度的增加而显示出上升趋势,反之,含有牛膝提取物的实施例2-3、5、7、9和11中,没有显示出促进胶原合成效果。含有牛膝和榆白皮两者的实施例2-13、14、15、16、17和18中,促进胶原合成效果随着榆白皮浓度而呈上升趋势。
实施例2-6:本发明的软膏剂对治疗牙周疾病的效果(临床实验)
按如下临床实验方法,确认本发明软膏剂对治疗牙周疾病的治疗效果。
将实验对象分成实验组和比较组后,实施牙面细磨,测定初期齿龈炎指数,供给实验组软膏剂和比较组软膏剂,一次200mg,每天3次,饭后服用,1周和1个月后,实施口腔检查诊断,检查齿龈炎指数。各情况的齿龈炎指数,是将牙周膜试验片(Periodental prove)插入齿龈裂口内,在不加力的状态下,连续刺探各牙齿周围,30秒后,测定出血状态,以下表32中的基准记录点数,得到的结果。测定结果示于表33。
点数 | 内 容 |
0点1点2点3点4点 | 无出血状态点状出血状态线状出血状态齿间部位三角形出血状态齿龈全体出血状态 |
表33
软膏剂组合物 | 初期 | 1周 | 1月 | |||
实施例 | 比较例 | 实施例 | 比较例 | 实施例 | 比较例 | |
2-12-22-32-42-52-62-72-82-92-102-112-122-132-142-152-162-172-18 | 1.091.031.041.071.091.041.061.061.071.081.081.061.071.061.071.071.081.09 | 1.041.061.081.051.071.061.061.041.061.071.071.081.051.051.061.061.041.07 | 1.211.361.271.341.241.281.221.261.201.251.281.21.181.151.131.091.081.09 | 1.451.371.381.361.411.401.411.391.401.381.431.391.401.381.421.391.381.39 | 1.421.521.381.481.341.321.241.301.181.361.181.321.251.211.171.111.081.09 | 2.542.422.482.492.432.442.452.432.432.422.452.462.432.422.472.482.482.52 |
从表33中记载的结果可知,含有抑制诱发牙周疾病的1L-1β和前列腺素的生成及过氧化物、可抑制分解牙周组织的胶原酶酯素活性的牛膝提取物,和或含有促进胶原合成、抑制胶原酶活性的榆白皮提取物的本发明软膏(实施例2-1~2-12)的牙周疾病治疗效果,从1周到1个月,比不含有牛膝或榆白皮的比较例(2-11~2-18),显示出优良的效能,比较例的齿龈炎指数,1个月以后,随着时间的延长不断上升,反之,使用根据本发明研制的软膏时,抑制牙周疾病发生的齿龈炎指数,随着时间的延长明显地降低,含有牛膝和榆白皮两者的实施例2-13、14、15、16、17和18中,对抑制牙周疾病显示出上升的效果。
根据本发明的牙膏组合物和软膏剂组合物,不仅能抑制牙周疾病诱发物质过氧化物(Superoxide)、前列腺素(PGE2)、白细胞介素-1β的生成,而且能抑制分解牙周组织基质胶原蛋白质的胶原酶的活性,同时,通过促进胶原蛋白质合成,可有效地治疗牙周疾病。
Claims (18)
1、一种口腔用组合物,含有牛膝提取物、榆白皮提取物或它们的混合物。
2、根据权利要求1记载的组合物,其特征是提取溶剂是甲醇、乙醇、丙醇或丁醇。
3、根据权利要求1记载的组合物,口腔用组合物是牙膏组合物。
4、根据权利要求3记载的组合物,其特征是牛膝提取物和榆白皮提取物分别含有0.001~5(重量)%。
5、根据权利要求4记载的组合物,其特征是牛膝提取物和榆白皮提取物分别含有0.01~3(重量)%。
6、根据权利要求3记载的组合物,其特征是含有牛膝提取物和榆白皮提取物的混合物0.002~10(重量)%。
7、根据权利要求3记载的组合物,其特征是进而含有20~60(重量)%的磷酸氢钙、沉淀二氧化硅或碳酸钙作为炼磨剂。
8、根据权利要求3记载的组合物,其特征是进而含有0.1~2(重量)%的氟化钠或第1氟化磷酸钠作为含氟化合物。
9、根据权利要求1记载的组合物,口腔用组合物是治疗牙周疾病的软膏剂。
10、根据权利要求9记载的组合物,其特征是以组合物的总重量为基准,含有0.001~5(重量)%的牛膝提取物。
11、根据权利要求9记载的组合物,其特征是以组合物的总重量为基准,含有0.001~5(重量)%的榆白皮提取物。
12、根据权利要求9记载的组合物,其特征是以组合物的总重量为基准,含有0.002~10(重量)%的牛膝提取物和榆白皮提取物的混合物。
13、根据权利要求9~11的任一项记载的组合物,可进一步配合表面活性剂、增溶剂、湿润剂、药效传递组分、缓冲剂、防腐剂、甜味剂和香料。
14、根据权利要求13中记载的组合物,以组合物的总重量为基准,配合5~30(重量)%的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物作为表面活性剂。
15、根据权利要求13记载的组合物,以组合物的总重量为基准,配合1~20%的低级醇作为增溶剂。
16、根据权利要求13记载的组合物,以组合物的总重量为基准,配合5~40(重量)%的选自甘油、山梨糖醇液、聚乙二醇-200、聚乙二醇400、聚乙二醇600和聚乙二醇1000、丙二醇、泊洛沙姆407和甘油单油酸酯Myverol 18-99中的1种或1种以上的成分,作为湿润剂。
17、根据权利要求13记载的组合物,以组合物的总重量为基准,配合1~30(重量)%的明胶或果胶作为药效传递组分。
18、根据权利要求13记载的组合物,配合选自磷酸二氢钠,磷酸氢二钠、磷酸钠、柠檬酸和柠檬酸钠、磷酸、盐酸、氢氧化钠和焦磷酸钠和焦磷酸盐中的1种或1种以上成分作为缓冲剂,将PH值调整为5.0~8.0。
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