CN102000333B - 一种防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂，包括以下组分：0.1-0.5wt％IgY、5-15wt％抑菌剂、3-6wt％防腐剂、5-20wt％甘油、5-10wt％乙醇、0.1-1wt％食用香精、50-75wt％蒸馏水。所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂制造和使用方便，安全性高，能有效防治龋齿的发生，对变异链球菌c型的抑菌率可达80％以上，对变异链球菌d型的抑菌率85％以上，同时可有效治疗牙龈炎、牙周炎及口腔溃疡。另外，本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂在常温下可稳定保存至少三年以上。

Description

一种防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂

技术领域

本发明涉及口腔保健领域，具体涉及一种能预防龋齿、清除牙菌斑、治疗牙龈炎、牙周炎、口腔溃疡和消除口气的IgY抗体口腔喷雾剂。

背景技术

龋齿(俗称蛀牙)是指牙齿组织逐渐毁坏崩解形成缺损的一种疾病。龋病是人体最常见的牙齿疾病。病患率一般为70％左右，有些地方高达90％以上。世界卫生组织把它与癌症,心血管病一起列为重点防治的三大非传染性疾病。龋齿不仅使牙齿崩溃缺损还能继发牙髓组织根尖、周围组织的疾病，甚至使髓骨受感染引起骨髓发炎等并发症，以至影响全身健康。预防龋齿可以从两方面着手：一是增强牙齿的硬度和钙化程度，以抵御牙菌斑产酸对牙齿的腐蚀，如含氟牙膏、含氟漱口水等。由于氟有副作用，而儿童使用漱口水易将其吞下。因此，许多国家禁止儿童使用含氟漱口水。二是持续有效的抑制牙菌斑的形成，从根本上预防龋齿。医学研究人员发现引起龋齿的主要致病菌是变异链球菌，这种细菌易粘附在牙齿表面形成牙菌斑，继而通过代谢活动产生酸，酸使牙矿物质溶解形成齿洞而形成蛀牙。使用抗菌素可以杀灭变异链球菌，但也会杀灭口腔内部的正常寄生菌群，影响口腔菌群的生态平衡，经常使用抗菌素还会使细菌产生耐药性。

龋齿是由变形链球菌引起。抗变形链球菌IgY是用变形链球菌(Streptococcus mutans)免疫蛋鸡，从鸡蛋黄中提取的抗体。它对变形链球菌有特异的结合能力，它能强效抑制变异链球菌，进而抑制牙菌斑的形成，达到有效防龋的目的。它安全，无毒、无副作用，不会杀灭口腔内其他正常寄宿菌，影响口腔菌群的生态平衡。它形成的蛀牙细菌无法生存的口腔生态环境，能产生持久特效作用。用抗变形链球菌的鸡蛋黄抗体IgY喷于牙齿上，连续用两个月，作用效果可达半年。由于儿童手部肌肉发育不完全.不能有效刷牙，再加上儿童不愿意刷牙，也理解不了刷牙的好处。无论家长、老师怎样劝说，都不愿意刷牙。因而，防龋齿抗体IgY口腔喷剂特别适用于儿童防龋齿。我国儿童占人口的20％，若有30％的儿童使用，每人一只，年均销售可达24亿元。

IgY抗体作为一种具有生物活性的免疫球蛋白，在贮存、生产、加工、摄食及消化过程中保证其稳定性是非常关键的。如果IgY抗体不稳定，IgY会降解，失活，则IgY的效价会降低，则IgY的抑菌的活性会降低甚至会消失。所以如何保证产品中IgY抗体的稳定性，是急需解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂，其预防龋齿效果好，同时可辅助治疗牙龈炎、牙周炎及口腔溃疡。本发明防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂制造和使用方便，安全性高，其中，IgY抗体能在常温下稳定保存。

本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂，包括以下组分：

所述抑菌剂为NISIN、三氯生、木糖醇中的一种或多种。

所述防腐剂为尼泊金酯钠、山梨醇中的一种或多种。

一种防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂，包括以下组分：

一种防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂，具体包括以下组分：

所述尼泊金酯钠为尼泊金甲酯钠、尼泊金乙酯钠、尼泊金丙酯钠、尼泊金丁酯钠中的一种或多种。

所述食用香精为水溶性水蜜桃香精、水溶性薄荷香精、水溶性留兰香香精中的一种或多种。

下面就本发明所用材料进一步作详细说明：

1)变异链球菌按其血清型可分为a、b、c、d、e、f、g和h等几类，但是对口腔中变异链球菌的检测表明，c型菌株约占口腔变异链球菌总量的60-90％，d型菌株约占口腔变异链球菌总量的10％，其它几种血清型变异链球菌的检出率很低。因此，c型和d型变异链球菌是引起龋齿的主要血清型，本发明选择c型和d型变异链球菌作为抗原菌体，将c型和d型变异链球菌免疫产蛋母鸡，然后用聚乙二醇(PEG)法纯化，得到IgY抗体。

本发明所述免疫所用的c型和d型变异链球菌通过如下方法培养：在37℃温度条件下，用BHI或TTY培养基，分别培养c型和d型变异链球菌48小时，然后将培养后的c型和d型变异链球菌分别5,000rpm离心5分钟，收集菌体，用pH值为6.0、浓度为0.2M的磷酸缓冲液洗菌3次，然后50℃热处理25分钟，分别制得c型变异链球菌(20亿/ml)和d型变异链球菌(20亿/ml)液，按体积比：c型变异链球菌：d型变异链球菌＝5：1的比例混合，制备成免疫原。

本发明所述变异链球菌免疫产蛋母鸡的方法为：每次取上述抗原1.0ml，对产蛋母鸡进行皮下注射，免疫三次，每次间隔时间为二周。

本发明所述IgY抗体的纯化步骤为：用蛋黄筛分离免疫母鸡产蛋的蛋黄，加入等体积的磷酸缓冲溶液PBS(pH7.2)，搅拌混匀制备蛋黄液，再加入与蛋黄液等体积的7％(w/w)PEG(PEG8000)搅拌混匀，室温放置30分钟。8,000rpm离心30分钟，弃沉淀，上清即为分离纯化的IgY抗体。

IgY抗体的检测：以ELISA(上海市农业科学院)测IgY抗体活性。测抗体浓度：总蛋白含量＝(OD280/1.4)；IgY含量＝总蛋白含量×IgY纯度。

2)木糖醇的防龋齿特性在所有的甜味剂中效果最好，首先是木糖醇不能被口腔中产生龋齿的细菌发酵利用，抑制链球菌生长及酸的产生；其次它能促进唾液分泌，减缓pH值下降，减少了牙齿的酸蚀，防止龋齿和减少牙斑的产生，可以巩固牙齿。

3)乳酸链球菌素(NISIN)的作用就象一个表面活性剂，它对细菌的营养细胞及孢子都有作用。NISIN对营养细胞的主要作用点是细胞质膜，抑制细胞壁中肽聚糖的生物合成，从而使细胞壁质膜和磷脂化合物合成受阻，并造成细胞膜内容物外泄，严重地引起细胞裂解，在万分之三到万分之五的浓度既有明显抑菌作用。对芽孢的作用是在孢子出现膨胀的起始阶段抑制其发芽。NISIN主要抑制大部分革兰氏阳性菌，特别是细菌的芽孢。NISIN还能抑制葡萄球菌属、链球菌属、小球菌属和乳杆菌属的某些菌种，抑制大部分梭菌属和芽孢杆菌属的芽孢。变异链球菌属于革兰氏阳性菌，从而NISIN能够抑制变异链球菌的生长，消除牙菌斑，防止龋齿。

4)三氯生对引起感染或病原性革兰氏阳性及阴性菌、真菌、酵母及病毒(如甲、乙肝、狂犬病毒、艾滋病毒HIV)等都有杀灭及抑制作用，另外，三氯生还可以治疗牙龈炎、牙周炎及口腔溃疡。因此，本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂中添加三氯生，从而能杀灭变异链球菌，消除牙菌斑，防止龋齿，同时能有效预防和治疗牙龈炎、牙周炎及口腔溃疡。

5)尼泊金酯钠包含尼泊金甲酯钠、尼泊金乙酯钠、尼泊金丙酯钠、尼泊金丁酯钠盐以及复合尼泊金酯钠，由于其具有酚羟基结构，抗细菌性能比苯甲酸钠、山梨酸都强，是一种高效防腐剂。其作用机制是：破坏微生物的细胞膜，使细胞内的蛋白质变性，并可抑制微生物细胞的呼吸酶系与电子传递酶系的活性。而且尼泊金酯的添加量只有山梨酸、苯甲酸钠的1/10～1/5，因此其安全性要高得多。

6)本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂还有香精和/或酒精和/或甜味剂。各种风格的香精的加入，不但可以调节产品的气味，使人用后口气清新，而且可以满足不同人群的个性化需求。甜味剂可以改善口感。

将上述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂的各组分按上述配比充分混合，用巴斯德消毒法进行病毒灭活，用0.22μm的膜过滤除菌，即制得本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂。

本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂的体外抑菌试验检测方法如下：配BHI培养基，在高压蒸汽灭菌20min；冷却后分别取700μl培养基放入微量离心管，分别加入本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂200μl，再加入变异链球菌c型和d型100μl。共做2组，对照组不加任何成分。然后，10％H₂、10％CO₂、80％N₂厌氧培养24小时，600nm测定OD值。其中，

经上述方法检测，本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂对变异链球菌c型的抑菌率80％以上，对变异链球菌d型的抑菌率85％以上。

同时，人群试验表明连续使用本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂2个月，1年后复查，结果显示对照组儿童的龋面均比使用本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂的试验组明显高，所以，使用本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂能有效预防儿童乳牙龋病的发生；牙周炎及牙龈出血、口腔溃疡人群试验表明使用本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂1个月。1个月后复查，观察到实验组病人的口腔溃疡、牙周炎及牙龈出血比对照组明显少，表明本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂能有效治疗病人的口腔溃疡、牙周炎及牙龈出血。

IgY抗体在37℃，湿度约75％恒温恒湿环境下放置一个月，如果IgY抗体没变化，说明IgY抗体在常温下可放置一年。本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂在上述条件下放置三个月，未发现变色、沉淀、分层问题，说明本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂的保质期在常温下可达三年以上。

本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂作为活性成分，再添加常规辅剂可制备成口腔清洁剂，其剂型还可以水包油(oil-in-water，O/W)乳剂，以水凝胶(Hydrogel)为载体的凝胶剂和以胶基为载体的制剂。

1)水包油乳剂，即将疏水相(如：有机相)均匀分散于水中而形成的稳定的乳状液。分散过程中可以使用乳化剂以利于疏水相的均匀分散，还可以使用匀浆器以使乳液快速形成。

2)水凝胶是水溶性或亲水性的高分子，通过一定的化学交联或物理交联，并以水为分散介质的凝胶。亲水性高分子包括多糖类，如：淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸和壳聚糖等和多肽类，如胶原、聚L-赖氨酸和聚L-谷胺酸等，以及丙烯酸及其衍生物，如：聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺和聚N-聚代丙烯酰胺等。

3)胶基的基本成分包括橡胶，如：天然橡胶，枇杷，明胶或苯乙烯－丁二烯橡胶、丁基橡胶和聚异丁烯等；酯类，如：松香甘油酯和松香等；蜡，主要有石蜡或微晶蜡；脂肪，主要为氢化植物油；乳化剂，主要为卵磷脂；填充物，主要为碳酸钙和滑石粉。

本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂和口腔清洁剂可制成各种剂型，如：配置成溶液后装入普通容器中，作为随时使用的含漱水；或装入带压力装置的瓶中作为喷雾剂，而在需要时随时随地喷入口腔；也可作刷牙液，在吃过食物之后或睡觉醒来之后用牙刷沾上刷牙；乳剂、膏剂和凝胶剂还可作为刷牙时的牙膏使用，还能杜绝牙膏中的固体粉料(既通常所说的磨料)对牙齿的磨损伤害作用；以胶基为载体制成口香糖，可含于口中咀嚼，而起到清洁口腔预防龋齿的作用。

本发明相对于现有技术具有如下优势：

本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂不仅含有抗龋齿IgY抗体，还有NISIN、三氯生和防腐剂，有效防治龋齿的发生，对变异链球菌c型的抑菌率可达80％以上，对变异链球菌d型的抑菌率可达85％以上。同时使用本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂1个月后，病人的口腔溃疡、牙周炎及牙龈出血现象明显减少，表明本发明还能有效预防和治疗牙龈炎、牙周炎及口腔溃疡和消除口气。所述IgY抗体口腔喷雾剂制造和使用方便，安全性高，能在常温下稳定保存3年以上。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。

本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛－奥德里奇(Sigma-Aldrich)。

实施例1IgY抗体的制备与提取

用BHI或TTY培养基，在37℃温度条件下，分别培养c型和d型变异链球菌(上海交通大学口腔研究所)48小时，将培养后的c型和d型变异链球菌分别用5000rpm离心5分钟，收集菌体，用pH值为6.0、浓度为0.2M的磷酸缓冲液洗菌3次。50℃、25分钟热处理，分别制得c型变异链球菌(20亿/ml)和d型变异链球菌(20亿/ml)液，按5：1的体积比例混合，制备成免疫原。

每次取抗原1.0ml，对产蛋母鸡(来亨鸡)进行皮下注射，免疫三次，间隔二周。

第一次免疫母鸡20天后收集鸡蛋，用蛋黄筛分离蛋黄，加入等体积的PBS(pH7.2)，搅拌混匀制备蛋黄液，加入与蛋黄液等体积的7％PEG(PEG8000)搅拌混匀，室温放置30分钟。8000rpm离心30分钟，弃沉淀。上清为分离纯化的IgY。以ELISA(上海市农业科学院)测IgY抗体活性。测IgY抗体浓度：总蛋白含量＝(OD280/1.4)；IgY含量＝总蛋白含量×IgY纯度。

实施例2

1)配方：

2)制备：将上述组分分别加入容器中，用巴斯德消毒法进行病毒灭活，用0.22μm的膜过滤除菌，即得本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂。然后，将其装入小型携带式喷雾罐中喷雾使用。

3)体外抑菌试验：取2)制得的所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂200μl，按照上文的体外抑菌试验进行测试。经测试：对变异链球菌c型的抑菌率为80％，对变异链球菌d型的抑菌率为85％。

实例3

1)配方：

2)制备：同实施例2。

3)体外抑菌试验：取2)制得的所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂200μl，按照上文的体外抑菌试验进行测试。经测试：对变异链球菌c型的抑菌率为80％，对变异链球菌d型的抑菌率为85％。

实施例4

1)配方：

2)制备：将上述配方中的水溶性三氯生加入上述配方中的甘油和乙醇中，加热55℃，不断快速搅拌，直至凝胶状三氯生完全溶解，然后加入上述其余组分，用巴斯德消毒法进病毒行灭活，用0.22μm的膜过滤除菌，即得本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂。然后，将其装入小型携带式喷雾罐中喷雾使用。

3)体外抑菌试验：取2)制得的所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂200μl，按照上文的体外抑菌试验进行测试。经测试：对变异链球菌c型的抑菌率为87％，对变异链球菌d型的抑菌率为90％。

实施例5

1)配方：

2)制备：同实施例4。

3)体外抑菌试验：取2)制得的所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂200μl，按照上文的体外抑菌试验进行测试。经测试：对变异链球菌c型的抑菌率为87％，对变异链球菌d型的抑菌率为90％。

实施例6水包油乳剂的制备

1)配方：

2)制备：将上述配方中的水溶性三氯生加入上述配方中的甘油和乙醇中，加热55℃，不断快速搅拌，直至凝胶状三氯生完全溶解，然后加入上述其余组分，再加入重量百分比20wt％碳酸氢钙、油性成分(硬脂酸10wt％，甘油单硬脂酸2wt％，蜂蜡8wt％)和0.5wt％乳化剂Tween-80，最后用蒸馏水补足至100％，并制成水包油乳膏。

3)体外抑菌试验：取2)制得的水包油乳剂200μl，按照上文的体外抑菌试验进行测试。经测试：对变异链球菌c型的抑菌率为85％，对变异链球菌d型的抑菌率为90％。

实施例7水凝胶的制备

1)配方：

2)制备：将上述配方中的水溶性三氯生加入上述配方中的甘油和乙醇中，加热55℃，不断快速搅拌，直至凝胶状三氯生完全溶解，然后加入上述其余组分，再加入重量百分比40wt％碳酸氢钙，2wt％羧甲基纤维素，最后用蒸馏水补足至100wt％，并制成水凝胶。

3)体外抑菌试验：取2)制得的水凝胶剂200μg，按照上文的体外抑菌试验进行测试。经测试：对变异链球菌c型的抑菌率为80％，对变异链球菌d型的抑菌率为90％。

实施例8胶基体的制备

1)配方：

2)制备：将上述配方中的水溶性三氯生加入上述配方中的甘油和乙醇中，加热55℃，不断快速搅拌，直至凝胶状三氯生完全溶解，然后加入上述其余组分，再加入重量百分比10wt％碳酸氢钙，重量百分比25wt％胶基，最后用基料和蒸馏水补足至100％并制成胶基体。

3)体外抑菌试验：取2)制得的胶基体200μg，按照上文的体外抑菌试验进行测试。经测试：对变异链球菌c型的抑菌率为80％，对变异链球菌d型的抑菌率为85％。

实例9观察实施例2、实施例4制备的防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂临床预防乳牙龋病的效果。

1)方法：选择新沂市12所幼儿园2-5岁儿童1200名，随机各抽取其中3所幼儿园300名儿童为实施例2组、实施例4组，另各3所幼儿园300名为对照组，记录4组儿童的龋面均。其中，实施例2组、实施例4组每天分别喷3次实施例2和实施例4制备的防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂，每次喷4喷，30min内不能喝水和进食，连续2个月；对照组不做任何处理。试验初始时，4组儿童的龋面均值差异无统计学意义(P>0.05)，1年后对受试儿童口腔内患龋情况进行复查。

2)结论：1年后复查，对照组儿童的龋面均比实施例2组、实施例4组明显高，差异有统计学意义(P﹤0.05)，实施例2组儿童的龋面均比实施例4组略高。可见，本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂能有效预防儿童乳牙龋病的发生。而且，由于实施例4中添加了三氯生，三氯生能够杀灭变异链球菌，消除牙菌斑，防止蛀牙，实施例4制备的防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂效果更好。

实例10观察实施例4制备的防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂临床治疗口腔溃疡、牙周炎及牙龈出血的效果。

1)方法：选择新沂市400名口腔溃疡及牙龈出血的病人，随机分成2组，200名病人为实验组，200名病人为对照组。记录2组病人口腔溃疡、牙周炎及牙龈出血情况。实验组每天喷3次实施例4制备的IgY抗体口腔喷雾剂，每次喷4喷，30min内不能喝水和进食。连续1个月；对照组喷安慰剂。

2)结论：1个月后复查，观察到实验组病人的口腔溃疡、牙周炎及牙龈出血比对照组明显少，差异有统计学意义(P﹤0.05)。本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂能有效治疗病人的口腔溃疡、牙周炎及牙龈出血。

实例11观察实施例2、实施例4制备的防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂的稳定性。

1)方法：将实施例2、实施例4制备的防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂放在37℃、湿度为75％的恒温恒湿箱中，并设4℃对照组，进行破坏性试验。质量卫生指标每月测一次，与对照组比较。

2)结论：将实施例2、实施例4制备的防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂在上述条件下放置三个月，未发现变色、沉淀、分层问题，而且，放置三个月后，实施例2制备的防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂比实施例4制备的防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂更清澈，说明实施例4制备的防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂比实施例2制备的防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂稳定性更好。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (1)

1.一种防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂，其特征在于，由以下质量百分比的组分组成：