CN112716933A - 7-羟基黄烷酮在制备促进青少年骨骼生长药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及增高药物技术领域。本发明提供了7‑羟基黄烷酮在制备促进青少年骨骼生长药物中的应用。本申请的实验结果表明7‑羟基黄烷酮能够明显抑制生长板软骨细胞的凋亡，从而抑制生长板增殖能力的退化，延缓骨骺闭合，延长骨骼生长过程，促进青少年骨骼继续生长，促进增高，使用效果明显优于来曲唑。

Description

7-羟基黄烷酮在制备促进青少年骨骼生长药物中的应用

技术领域

本发明涉及增高药物技术领域，尤其涉及7-羟基黄烷酮在制备促进青少年骨骼生长药物中的应用。

背景技术

哺乳动物生长板通过软骨内成骨实现长骨的线性生长，生长板内软骨细胞从静止、增殖、分化到凋亡是一个有序的过程，形成组织学上具有明显特征性的静止带、增殖带、肥大带和矿化带，并接受多种内分泌激素的调节。性成熟前生长板内软骨形成和软骨基质矿化间处于良好的平衡状态，从而在整个生长期保持生长板的正常结构并实现长骨的线性生长。多数哺乳动物在达到性成熟后，会出现生长板软骨细胞增殖能力和细胞数量逐渐降低的现象，生长板软骨细胞凋亡是线性生长速度变慢并最终因生长板闭合而停止生长的直接诱因。雌激素水平是在性成熟阶段变化最为显著的因素之一，现有的研究结果显示雌激素在生长板闭合过程中是必不可少的因素，早期少量的雌激素水平引发长骨生长，而后期增加的雌激素分泌量导致生长板软骨细胞凋亡直致骨骺闭合。

目前常使用的抑制生长板软骨细胞凋亡的药物是来曲唑。来曲唑为第三代芳香化酶抑制剂，可以选择性地与细胞色素P450酶的亚单位的血红素结合，抑制芳香化酶，有效降低雌激素水平。近年来，逐渐被应用于改善青春期矮小儿童身高及骨营养不良等。但是来曲唑存在一些副作用，来曲唑的不良反应多为轻度或中度，以恶心(2％～9％)、头疼(0％～7％)、骨痛(4％～10％)、潮热(0％～9％)和体重增加(2％～8％)为主要表现，其他少见的还有便秘、腹泻、瘙痒、皮疹、关节痛、胸痛、腹痛、疲倦、失眠、头晕、水肿、高血压、心律不齐、血栓形成、呼吸困难、阴道流血等。因此，需要一种副作用更小，又能有效抑制生长板软骨细胞凋亡，促进青少年骨骼生长的替代药物。

发明内容

本发明的目的在于提供7-羟基黄烷酮在制备促进青少年骨骼生长药物中的应用，有效抑制生长板软骨细胞凋亡，延迟骨骺闭合，促进青少年骨骼生长。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了7-羟基黄烷酮在制备促进青少年骨骼生长药物中的应用。

本发明还提供了7-羟基黄烷酮在制备延迟骨骺闭合药物中的应用。

本发明还提供了7-羟基黄烷酮在制备抑制生长板软骨细胞凋亡药物中的应用。

本发明提供了7-羟基黄烷酮在制备促进青少年骨骼生长药物中的应用。本申请的实验结果表明7-羟基黄烷酮能够明显抑制生长板软骨细胞的凋亡，从而抑制生长板增殖能力的退化，延缓骨骺闭合，延长骨骼生长过程，促进青少年骨骼继续生长，促进增高，使用效果明显优于来曲唑。

附图说明

图1为软骨细胞培养2天后的显微镜图；

图2为软骨细胞培养4天后的显微镜图；

图3为软骨细胞培养6天后的显微镜图；

图4为软骨细胞传代3次后的显微镜图；

图5为软骨细胞核经DAPI染色后在荧光中激发出蓝色荧光；

图6为软骨细胞质经Fluoromount-G染色后在荧光中激发出红色荧光；

图7为实施例3中空白对照组细胞凋亡结果；

图8为实施例3中模型对照组细胞凋亡结果；

图9为实施例3中阳性对照组细胞凋亡结果；

图10为实施例3中40μM的7-羟基黄烷酮组细胞凋亡结果；

图11为实施例3中不同组中大鼠生长板软骨细胞凋亡率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例中所用试剂

0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA，Gibco，货号：25200-072)，胎牛血清(iCell，货号：iCell 0500)，DMEM/F12(iCell，货号：iCell-0005)，IL-1β(CTESTINGBIO，货号：CS38907H)，来曲唑(CTESTINGBIO，货号：112809-51-5)，7-羟基黄烷酮(CTESTINGBIO，货号：6515-36-2)，MTT(碧云天，货号：ST316)，胶原蛋白酶Ⅱ(Gibco，货号：17101015)，台盼蓝染色液(0.4％，Solarbio，货号：C0040)，曲拉通(Solarbio，货号：T8200-500ml)，DAPI溶液(Solarbio，货号：C0065)，DMSO(Sigma，货号：D2650-100ML)，封闭山羊血清(Solarbio，货号：SL038)，Fluoromount-G(Thermo Fisher Scientific，货号：00-4958-02)，CollagenType II Antibody(Proteintech，货号：15943-1-AP)，ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(Solarbio，货号：CA1020)。

实施例中所用仪器

细胞培养孔板(上海卧宏生物科技有限公司，型号WHB-24)，恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司，型号：DK-600S)，电子天平(上海天美天平仪器有限公司，型号：JA2603B)，37℃恒温细胞培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂，规格型号：BC-J160S)，立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯，型号：YXQ-LS-50811)，高速离心机(ThermoFisher，货号：75004250)，高级分析倒置显微镜(Nikon，型号：DS-Ri2)，多功能酶标仪(LabsystemsMμLtiskanMS，芬兰，352型)，电热恒温震荡水槽(上海精宏实验设备有限公司，型号：DK-2B)，血球计数板(Marienfeld，型号：Neubauer improved)，德国MiltenyiMACSQuant Analyzer流式细胞仪(Miltenyi，型号：130-092-197)。

实施例1大鼠生长板软骨细胞分离培养及鉴定

2只四周龄SD大鼠脱颈椎处死，置于75％酒精中浸泡5min。于超净工作台内分离四肢，并去除皮肤及肌肉组织。剪下胫骨近端生长板软骨，冲洗，并剪碎。加入2mL 1％Ⅱ型胶原酶，37℃水浴锅振荡消化5小时后，用200目不锈钢滤网过滤，滤液1000r/min离心5钟，收集细胞沉淀，用PBS清洗2次。用DMEM/F12完全培养基(含10％的胎牛血清，pH 7.2)反复吹打混匀，制成细胞悬液。血球计数板计数，用台盼蓝染色测定细胞的活力。将细胞悬液以1×10⁵/mL浓度接种到装有含10％胎牛血清DMED/F12培养液的T25培养瓶中，置于37℃、含体积百分数为5％的CO₂培养箱中培养。每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况，每2d换液1次。当细胞汇合度达到80％时进行传代。

取传代的细胞爬片于24孔板中，每孔加入DMEM/F12完全培养基1mL，加入细胞1×10⁴个/孔，置于培养箱中过夜培养。细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入1mL 4％PFA于4℃固定30min。用PBS洗3次，每次5min。最后一次不吸出PBS，放4℃过夜。将玻片除去水分，置于玻片支撑物上。用玻璃片封闭液封闭(0.5％Trition X-100与PBS 1：1混合，再加10％山羊血清，取50μL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h)。然后取50μL一抗孵育液于防水膜上(湿盒中)，将阳性玻片有细胞的一面盖在一抗孵育液上，置于4℃过夜，阴性玻片不孵育一抗。避光孵育二抗2h后，用PBS洗3次，每次5min，染DAPI 5min，再用PBS洗3次，每次5min。玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。进行细胞鉴定。

结果：软骨细胞形态倒置相差显微镜下观察，刚接种的软骨细胞为小圆球形，悬浮在培养液中，且细胞的体积大小相似，折光性较强，随着培养，软骨细胞逐渐增大，胞核与核仁也逐渐清晰。培养2天后细胞开始逐渐贴壁，形态多呈圆形或椭圆形增大，伸长形成伪足，如图1所示。培养4天后软骨细胞呈扁平状，不规则卵圆形或三角形，有成簇及重叠生长现象出现，如图2所示。培养6天后软骨细胞90％融合形成单层，细胞形态不规则，呈多边形、星形等，胞体丰富，胞浆均匀，相互密集连接呈“铺路石”状外观，如图3所示。3代后细胞大多为长梭形，遮光性差。部分细胞由贴壁状态脱落，悬浮于培养液中，如图4所示。

Ⅱ型胶原是软骨细胞分泌的特异性胶原，可利用其免疫荧光对软骨细胞进行鉴定。大鼠生长板软骨细胞经培养72小时后进行免疫荧光实验，结果显示，在荧光倒置相差显微镜下，细胞核经DAPI染色后在不同波段荧光激发出蓝色荧光，如图5所示，细胞质经Fluoromount-G染色后被激发出清晰红色荧光，如图6所示，表明分离培养的细胞表达特征性Ⅱ型胶原，符合软骨细胞的生物学特征，证明本实验方法能够分离培养出纯度较高的软骨细胞，可供进一步实验研究使用。

实施例2 MTT法初步观察7-羟基黄烷酮对生长板软骨细胞培养的影响

取对数期生长的大鼠生长板软骨细胞消化处理后，按1×10⁴/孔接种于96孔板，置于37℃、5％CO₂培养箱，以正常培养的细胞为正常对照组；以20ng/ml IL-1β诱导每孔细胞凋亡，为模型对照组；以含有5μM来曲唑的培养液为阳性对照组，另外四组加入20ng/ml IL-1β的同时分别加入浓度为10μM、20μM、40μM、60μM的7-羟基黄烷酮的培养基，分别编号为实验1～4组，每孔200μL，每组设6个复孔。置于37℃、5％CO₂培养箱分别培养24h和48h后，取出96孔板，将20μL MTT(5mg/mL)溶液加入到每个培养孔中，继续培养4h后，取出96孔板，吸除培养基，每孔加入150μL Formazan溶液，置摇床上振荡30min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在OD 570nm处测量各孔的吸光值。结果如表1所示。

表1

注：与正常对照组比较，a为P<0.01。与模型组比较，b为P<0.01。与阳性对照组比较，c为P<0.05，d为P<0.01。

结果显示，培养24h的10μM、20μM、40μM、60μM的7-羟基黄烷酮组均对生长板软骨细胞有增殖作用，与模型对照组比较均有统计学意义(P<0.01)，且作用均比阳性对照组好10μM、20μM、40μM、60μM的7-羟基黄烷酮组与阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01)。

实施例3 7-羟基黄烷酮对IL-1β引起细胞凋亡的抑制作用

培养的对数期生长板软骨细胞，按实施例2的方法加入各种药物，培养24小时。先用胰酶消化，再用PBS洗涤1遍。用1mL Binding Buffer悬浮细胞，300g离心10min，弃上清。然后用1mL Binding Buffer重悬细胞，使细胞的密度达到1×10⁶个/ml。每管加入100μL细胞(1×10⁵个)。再向管中加入5μL Annexin V-FITC。室温，避光，轻轻地混匀，10min。加入5μL PI，室温，避光，孵育5min。加入PBS至500μL，轻轻混匀。在1小时内用流式细胞仪检测。观察细胞凋亡情况，并统计细胞凋亡率。

7-羟基黄烷酮对大鼠生长板软骨细胞凋亡的影响如图7～10所示，空白对照组几乎全部为正常活细胞(如图7所示)，模型对照组早期凋亡和中晚期凋亡细胞较多(如图8所示)，而5μM来曲唑的阳性对照组可以抑制生长板软骨细胞凋亡(如图9所示)，40μM的7-羟基黄烷酮抑制细胞凋亡的效果略优于阳性对照组(如图10所示)。

不同组中大鼠生长板软骨细胞凋亡率如图11所示，其中*为与正常对照组比较P<0.05，**为与正常对照组比较P<0.01，△△为与模型对照组比较P<0.01，▲▲为与阳性对照组比较P<0.01。结果显示IL-1β可以很明显的引起细胞凋亡，大鼠生长板软骨细胞在40μM7-羟基黄烷酮刺激24h情况下，抑制细胞凋亡作用明显，且效果优于阳性对照来曲唑。

由以上实施例可知，本发明提供了7-羟基黄烷酮在制备促进青少年骨骼生长药物中的应用。本申请的实验结果表明7-羟基黄烷酮能够明显抑制生长板软骨细胞的凋亡，从而抑制生长板增殖能力的退化，延缓骨骺闭合，延长骨骼生长过程，促进青少年骨骼继续生长，促进增高，使用效果明显优于来曲唑。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.7-羟基黄烷酮在制备促进青少年骨骼生长药物中的应用。

2.7-羟基黄烷酮在制备延迟骨骺闭合药物中的应用。

3.7-羟基黄烷酮在制备抑制生长板软骨细胞凋亡药物中的应用。

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