CN106085957B - 一种微载体三维扩增并激活自然杀伤细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种微载体三维扩增并激活自然杀伤细胞的方法，该方法包括如下步骤：(1)在含有微载体的培养基中培养重组K562细胞，得到含有包覆有重组K562细胞的微载体的培养液；(2)对所述含有包覆有重组K562细胞的微载体的培养液进行辐照灭活，然后分离辐照灭活后的物料中粒径大于100μm的颗粒，得到饲养层物料；(3)将所述饲养层物料与单个核细胞混合并进行悬浮培养；(4)去除悬浮培养后的物料中粒径大于100μm的颗粒。通过上述技术方案，本发明能够大幅度地提高NK细胞的扩增效率并提高NK细胞的活性，同时还能达到多个扩增批次间的高度一致性，并且避免了饲养物料在后续临床研究中带来的安全隐患。

Description

一种微载体三维扩增并激活自然杀伤细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种微载体三维扩增并激活自然杀伤细胞的方法。

背景技术

自然杀伤细胞(Natural Killer Cells,NK细胞)作为血液中的单个核细胞中的一种，是人体先天免疫的核心组成部分，分布于外周各淋巴器官及血液循环系统，其主要功能是参与机体先天性免疫应答；同时在免疫调节中也发挥重要的作用，它无需抗原的刺激与活化即可发挥细胞毒效应；NK细胞的靶细胞主要包括：肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织衰老细胞和细菌、寄生虫等，因此，NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素；此外，NK细胞还参与第Ⅱ型超敏反应和抑制物抗宿主反应。

目前NK细胞体外扩增培养的方法主要有以下三种：(1)使用IL-2和IL-15等白介素类细胞因子刺激培养的方法，培养成本高，往往出现数量或纯度难以满足实验要求的情况，例如NK细胞体外扩增使用纯因子共刺激体系普遍存在CD3^-CD16⁺CD56⁺表型低，且细胞数量少，培养周期较长，远远不能满足后续临床研究；(2)利用磁珠分选技术，分离纯化NK细胞后进行培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且分选后所得起始细胞数太少导致扩增速率慢，在数量上难以实现较大规模的扩增；一些使用磁珠分选出NK细胞，再结合细胞因子进行NK体外培养的体系中，往往被分选出的NK细胞增殖率低；某些使用特殊佐剂作为刺激剂的体系，成本较高，且操作复杂，只能进行小范围实验，无法应用于大规模临床研究；(3)利用基因改造的人慢性髓原白血病细胞株K562细胞做饲养细胞并进行NK细胞培养。但以K562细胞作为饲养细胞，在不同批次细胞扩增效率和NK细胞活性上存在较大差异。且以往的饲养细胞为贴壁细胞，NK细胞为具有聚团生长特性的悬浮细胞，在常规二维培养环境中底部贴壁的饲养细胞往往难以与成团生长的NK细胞达到充分的接触、刺激，导致未充分活化，培养过程中需要在7天后二次补加饲养细胞，造成培养成本高、操作污染风险增加。除此之外，常规二维培养无法兼具单层培养和悬浮培养的优势，不属于匀相培养，细胞所处环境的均一性较差，导致不同批次细胞扩增效率存在差异；另外，这种培养方式无法将大多数饲养细胞与NK细胞分离，因K562细胞为癌细胞株，在临床上存在一定的伦理问题和潜在风险。

发明内容

本发明的目的是提供一种扩增效率、细胞活性且批次间一致性均较高的扩增并激活NK细胞的方法。

本发明的发明人发现，在不同批次细胞扩增效率和NK细胞活性上存在较大差异的可能原因在于NK细胞为具有聚团生长特性的悬浮细胞，在常规二维培养环境中底部贴壁的饲养细胞往往难以与成团生长的NK细胞达到充分的接触、刺激，导致未充分活化，细胞所处环境的均一性较差，导致不同批次细胞扩增效率存在差异。本发明的发明人尝试使用微载体培养饲养细胞，并将辐照灭活后的包覆有重组K562细胞的微载体作为饲养层物料用于NK细胞的悬浮培养，出乎意料地发现其能够大幅度地提高NK细胞的扩增效率并提高NK细胞的活性，同时还能达到多个扩增批次间的高度一致性，由此得到了本发明。

本发明提供了一种微载体三维扩增并激活自然杀伤细胞的方法，该方法包括如下步骤：(1)在含有微载体的培养基中培养重组K562细胞，得到含有包覆有重组K562细胞的微载体的培养液；所述重组K562细胞表达有CD-8α，IL-21、CD14、CD19、CD86和CD137；(2)对所述含有包覆有重组K562细胞的微载体的培养液进行辐照灭活，然后分离辐照灭活后的物料中粒径大于100μm的颗粒，将得到的颗粒作为饲养层物料；(3)将所述饲养层物料与自然杀伤细胞培养基和单个核细胞混合并进行悬浮培养；(4)去除悬浮培养后的物料中粒径大于100μm的颗粒。

通过上述技术方案，本发明能够大幅度地提高NK细胞的扩增效率、纯度及提高NK细胞的杀伤活性，同时还能达到多个扩增批次间的高度一致性。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明的一种优选实施方式的流程示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种微载体三维扩增并激活自然杀伤细胞的方法，该方法包括如下步骤：(1)在含有微载体的培养基中培养重组K562细胞，得到含有包覆有重组K562细胞的微载体的培养液；所述重组K562细胞表达有CD-8α，IL-21、CD14、CD19、CD86和CD137；(2)对所述含有包覆有重组K562细胞的微载体的培养液进行辐照灭活，然后分离辐照灭活后的物料中粒径大于100μm的颗粒，将得到的颗粒作为饲养层物料；(3)将所述饲养层物料与自然杀伤细胞培养基和单个核细胞混合并进行悬浮培养；(4)去除悬浮培养后的物料中粒径大于100μm的颗粒。

其中，所述重组K562细胞只要经流式细胞术检测表达有CD-8α，IL-21、CD14、CD19、CD86和CD137即可用于本发明，对CD-8α，IL-21、CD14、CD19、CD86和CD137的表达率及其表达丰度没有特别要求。所述重组K562细胞可以通过常规的转染和筛选方法得到。

其中，优选地，所述含有微载体的培养基中，微载体的含量为4-7g/L，所述含有包覆有重组K562细胞的微载体的培养液中，重组K562细胞的含量为(1.6-2.5)×10⁹个/L。

其中，所述微载体可以是各种直径在110-250μm的适用于贴壁依赖型细胞生长的微珠；所述的微载体可以由天然支架材料和/或人工合成支架材料制备得到；所述天然支架材料可以包括如胶原、纤维蛋白和甲壳素中的至少一种，所述人工合成支架材料可以包括聚乳酸和/或壳聚糖；优选地，所述微载体为Cytodex 1微载体。其中，所述Cytodex 1微载体为购自GE公司且商品号为17-0448-01的产品。所述Cytodex 1微载体属于人工合成支架的一种，具有较高比例DEAE带电荷基团，且稳定性、均一性强，较大的表面积/体积比率，在生产和废液处理占据更少的空间，并且表面允许细胞胞外基质上分泌和堆积生长因子，较短的扩散路径有利于细胞间营养的供应。

其中，优选地，所述含有微载体的培养基中的培养基含有RPMI1640培养基和8-12体积％的胎牛血清。

其中，优选地，在所述Cytodex 1微载体上的重组K562细胞培养至12-16天时，停止摇动培养瓶，使微载体沉降，吸弃部分上清培养液，混匀微载体，取1mL微载体悬液至六孔板，加胰酶从微载体上消化细胞，完成消化后计数，并得出每毫升微载体悬液含有的重组K562细胞的数目。

其中，优选地，进行辐照灭活的辐照剂量为80-120Gy。

其中，分离辐照灭活后的物料中粒径大于100μm的颗粒可以进行冻存待用。冻存的具体操作可以为常规的细胞冻存方法。解冻的具体操作可以为常规的细胞解冻方法。

其中，优选地，将所述饲养层物料与自然杀伤细胞培养基和单个核细胞混合时，相对于每10⁵个单个核细胞，以重组K562细胞的数量计算，所述饲养层物料的用量为(4.5-5.5)×10⁵个，所述自然杀伤细胞培养基的用量为15-25mL。

其中，优选地，所述自然杀伤细胞培养基含有KBM581无血清培养基和100-300IU/mL的rhIL-2。

其中，优选地，所述悬浮培养在10-14rpm/min的搅拌速率下进行。所述悬浮培养可以在购自GE公司的WAVE Bioreactor System培养系统中进行。

其中，所述悬浮培养可以进行3-20天。

其中，所述方法还可以包括：去除悬浮培养后的物料中粒径大于100μm的颗粒后，分离悬浮培养后的物料中的NK细胞。例如，完成悬浮培养后，用100μm滤网过滤培养液，将自然杀伤细胞与微载体及包覆于微载体上的重组K562细胞进行分离，避免了饲养物料在后续临床研究中带来的安全隐患。

以下，通过实施例进一步详细说明本发明。

实施例1

参考图1所示的流程扩增并激活NK细胞。

参照文献(Imai等Leukemia，2004,18,676-684)中采用的蛋白稳定表达系统，首先在K562中转入CD8α-IL-21-4B-1BBL基因，流式细胞技术检测目的蛋白是否表达，用含300ng/ml潮霉素、600ng/ml G418、10％FBS的1640培养基筛选14天，存活下来的即为转染成功的K562细胞，有限稀释法克隆K562-CD8α-IL-21-4-1BBL细胞，扩大培养获得较大单克隆；再次转入CD14-CD19-CD86表达基因，用同样的方法筛选出阳性表达单克隆，即为K562-CD8α-IL21-CD137-CD14-CD19CD86细胞，也就是本发明的重组K562细胞。

按照Cytodex 1微载体(购自GE，货号17-0448-01)的说明书进行预处理，具体操作包括：称取5g干燥的微载体至硅化后的玻璃瓶内，用500ml无Mg²⁺、Ca²⁺的PBS(每g的Cytodex1用50-100mL)室温浸泡膨胀至少3小时，弃上清；加入250mL无Mg²⁺、Ca²⁺的PBS(每g的Cytodex1用30-50mL)搅拌洗涤5min，弃上清；再加入250ml无Mg²⁺、Ca²⁺的PBS(每g的Cytodex1用30-50mL)；将微载体溶液高压灭菌(121℃、30min、15psi)。

无菌微载体使用前先弃上清，后用35-37℃的20-200ml培养基润洗，减少残留PBS对培养基的稀释，沉降后弃上清；将微载体转移至培养瓶。

向WHEATON Magna Flex培养瓶(IFNORS，356834)加入300mLRPMI-1640+10％FBS培养液，将5g预处理好的Cytodex 1微载体(GE，17-0448-01)溶于培养液中。30min后，将上述重组K562细胞以1×10⁵细胞/mL的浓度接入含有微载体的培养液中，以20rpm/min速度搅拌15min，静置15min的间隔搅拌方式培养6至8小时。待细胞附着于微载体表面时，维持40rpm/min的转速进行培养3天。3天后补充RPMI-1640+10％FBS200mL，继续扩大培养。第7天补充RPMI-1640+10％FBS 500mL，至培养终体积为1L，培养至第14天。

无菌条件下，将贴附于Cytodex 1上的重组K562细胞培养至14天，停止摇动培养瓶，使微载体沉降，吸弃上清培养液至剩余100mL，混匀微载体，取1mL微载体悬液至六孔板，加1mL的0.25％胰酶从微载体上消化细胞，完成消化后计数，并得出培养终体积为1L的体系中含有2×10⁹个重组K562细胞。

将与微载体培养至第14天K562细胞同培养瓶及培养液一起进行剂量为100Gy的辐照，灭活细胞。

在超净台用100μm滤膜过滤收集辐照灭活后的物料中粒径大于100μm的颗粒，以含有10⁸个重组K562细胞的物料作为一份进行分装，加入含10体积％的DMSO的冻存液至-80℃或液氮保存，作为饲养层物料。

采集50mL(肝素钠抗凝)人外周血血液，于离心管内离心(800×g、10min)，取上层血浆灭活离心后取上清备用，血液下层沉淀用20-30ml生理盐水重悬，得到生理盐水血样混合液，在新离心管内加入15ml淋巴细胞分离液，淋巴细胞分离液的密度为1.077g/mL，再将生理盐水血液混合液缓慢加至淋巴细胞分离液上层(800g、20min缓升缓降)离心，取中间白膜层，清洗两遍，即为单个核细胞(PBMCs)，取样计数并作CCK8试验检测其中NK细胞对Hela、HepG2和SKOV3杀伤活性，最后平均分为两份，其中一份作为对照试验；

取上述含10⁸个贴附于微载体的重组K562细胞，按照常规复苏细胞的方法复苏，离心去除冻存液后，用37℃预温的KBM581无血清培养基(corning，88-581-CM)润洗一遍，作为饲养层物料，转移至WHEATONMagna Flex培养瓶(IFNORS，356834)；用20mL的含200IU/mL的rhIL-2的KBM581无血清培养基重悬1份单个核细胞，使其浓度为1×10⁶个/mL；将细胞悬液接入含10⁸个重组K562细胞的饲养层物料的WHEATON MagnaFlex培养瓶(IFNORS，356834)内，以12rpm/min的搅拌速率维持贴附K562细胞的Cytodex 1微载体悬浮液，以利于NK细胞与饲养细胞空间接触。第五天，补充700mL的含200IU/mL的rhIL-2的KBM581无血清培养基，培养液量达1000mL，继续培养至第12天，取样流式检测细胞表型(CD3^-CD16/56⁺)及CCK8试验检测NK细胞对Hela、HepG2和SKOV3细胞在E:T为1:1的比例下的杀伤率，并计算扩增倍数。

对比例1

按照实施例1中的方法进行操作，不同的是，取实施例1中的重组K562细胞，不使用微载体，仅经平板培养至铺满瓶底(1.0×10⁸)且收集后进行辐照，作为饲养层物料与单个核细胞混匀(重组K562细胞与单个核细胞的数量比为5：1，单个核细胞的接种浓度为1.0×10⁶个/ml)，置于WAVEBioreactor System培养系统(GE，Wave Bioreactor)上共培养，以12rpm/min一次间隔摇动培养瓶，每隔一天补充一次培养液，补充的培养液的量使得培养液中细胞浓度保持在1.0-2.0×10⁶个/mL；培养十二天后，取样流式检测细胞表型(CD3^-CD16/56⁺)及CCK8试验检测NK细胞对Hela、HepG2和SKOV3细胞在E:T为1:1的比例下的杀伤率，并计算扩增倍数。

测试实施例1

分别进行实施例1和对比例1的操作20次，计算CD3^-CD16/56⁺细胞的扩增率、纯度以及对Hela、HepG2和SKOV3杀伤活性的平均值，并计算20次操作中各指标的变异系数(coefficient of variation，CV值，标准偏差与平均值之比)，结果如表1所示。

表1

根据表1的数据可见，本发明能够大幅度地提高NK细胞的扩增效率并提高NK细胞的活性，同时还能达到多个扩增批次间的高度一致性。

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种微载体三维扩增并激活自然杀伤细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)在含有微载体的培养基中培养重组K562细胞，得到含有包覆有重组K562细胞的微载体的培养液；所述重组K562细胞表达有CD-8α，IL-21、CD14、CD19、CD86和CD137；所述微载体为Cytodex 1微载体；

(2)对所述含有包覆有重组K562细胞的微载体的培养液进行辐照灭活，然后分离辐照灭活后的物料中粒径大于100μm的颗粒，将得到的颗粒作为饲养层物料；

(3)将所述饲养层物料与自然杀伤细胞培养基和单个核细胞混合并进行悬浮培养；

(4)去除悬浮培养后的物料中粒径大于100μm的颗粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述含有微载体的培养基中，微载体的含量为4-7g/L，所述含有包覆有重组K562细胞的微载体的培养液中，重组K562细胞的含量为(1.6-2.5)×10⁹个/L。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述含有微载体的培养基中的培养基含有RPMI1640培养基和8-12体积％的胎牛血清。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，进行辐照灭活的辐照剂量为80-120Gy。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述饲养层物料与自然杀伤细胞培养基和单个核细胞混合时，相对于每10⁵个单个核细胞，以重组K562细胞的数量计算，所述饲养层物料的用量为(4.5-5.5)×10⁵个，所述自然杀伤细胞培养基的用量为15-25mL。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其中，所述自然杀伤细胞培养基含有KBM581无血清培养基和100-300IU/mL的rhIL-2。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述悬浮培养在10-14rpm/min的搅拌速率下进行。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括：去除悬浮培养后的物料中粒径大于100μm的颗粒后，分离悬浮培养后的物料中的NK细胞。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述悬浮培养进行3-20天。