JP5677304B2 - プロバイオティクス穀物組成物 - Google Patents
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Description
本願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2008年10月16日に出願された米国特許出願第61/106,116号の恩典を主張する。
本願は、乳酸産生菌を含有するプロバイオティクス穀物組成物(probiotic grain-based composition)に関する。
胃腸の細菌叢は、胃腸管の機能および全身の生理学的健康の維持に極めて重要な多くの役割を担う。胃腸管に生息する多くの個々の微生物種の増殖および代謝は、その多くが食事に由来する、それらにとって利用可能な基質に主に依存する。一般的にプロバイオティクスは、宿主において恒久的にはコロニーを形成しないため、何らかの健康促進特性を持続するためには定期的に摂取する必要がある。
[本発明1001]
加工穀物と単離されたバチルス・コアギュランス(Bacillus coagulans)の菌または芽胞とを含む、組成物。
[本発明1002]
パスタ、オートミール、およびグリッツからなる群より選択される、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
パスタが、スパゲッティ、ラザニア、卵入りパスタ(egg pasta)、シュペッツレ、ペンネ・リガーテ、ロティーニ、リガトーニ、およびニョッキからなる群より選択される、本発明1002の組成物。
[本発明1004]
単離されたバチルス・コアギュランスが、調理済みの前記組成物の0.01重量%から10重量%を占める、本発明1001の組成物。
[本発明1005]
単離されたバチルス・コアギュランスが、バチルス・コアギュランスhammer株アクセッション番号ATCC 31284である、本発明1001の組成物。
[本発明1006]
単離されたバチルス・コアギュランスが、GBI-30株(ATCC指定番号(Designation Number)PTA-6086)、GBI-20株(ATCC指定番号 PTA-6085)、およびGBI-40株(ATCC指定番号 PTA-6087)からなる群より選択される、本発明1001の組成物。
[本発明1007]
単離されたバチルス・コアギュランスが芽胞の形態である、本発明1001の組成物。
[本発明1008]
バチルス・コアギュランスの芽胞が、熱い液体と接触すると活性化する、本発明1007の組成物。
[本発明1009]
熱い液体が水またはミルクである、本発明1008の組成物。
[本発明1010]
単離されたバチルス・コアギュランスが栄養細胞の形態である、本発明1001の組成物。
[本発明1011]
単離されたバチルス・コアギュランスが栄養細胞と芽胞との混合物の形態である、本発明1001の組成物。
[本発明1012]
穀物と単離されたバチルス・コアギュランスの菌とを含む穀物組成物(grain-based composition)用乾燥混合物を含む、組成物。
[本発明1013]
脱水された物質と単離されたバチルス・コアギュランスの菌とを含むスープ用乾燥混合物を含む、組成物。
[本発明1014]
以下の工程を含む、穀物組成物を作製する方法:
穀物を含有する基礎混合物および液体部分を供給する工程;
前記穀物を含有する基礎混合物と前記液体部分とを混合してバッターまたはドウを形成する工程;
単離されたバチルス・コアギュランスの菌を前記バッターまたはドウと混ぜ合わせる工程;ならびに
前記バッターまたはドウを加熱処理して前記穀物組成物を調理する工程。
[本発明1015]
液体部分が、水およびミルクからなる群より選択される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
単離されたバチルス・コアギュランスが、バチルス・コアギュランスhammer株アクセッション番号ATCC 31284である、本発明1014の方法。
[本発明1017]
単離されたバチルス・コアギュランスが、GBI-30株(ATCC指定番号 PTA-6086)、GBI-20株(ATCC指定番号 PTA-6085)、およびGBI-40株(ATCC指定番号 PTA-6087)からなる群より選択される、本発明1014の方法。
[本発明1018]
単離されたバチルス・コアギュランスが芽胞の形態である、本発明1014の方法。
[本発明1019]
単離されたバチルス・コアギュランスが栄養細胞の形態である、本発明1014の方法。
[本発明1020]
単離されたバチルス・コアギュランスが、穀物組成物の1重量%から10重量%を占める、本発明1014の方法。
プロバイオティクス生物は、非病原性で、毒性がなく、保存中に生存能力を保持し、かつ胃および小腸の通過に耐える。例としてバチルス・コアギュランスなどの非病原性の乳酸産生菌(すなわち「乳酸菌」)は、熱湯中で調理されたものなどの穀物組成物およびスープ組成物中で生存能力を維持し、かつ有益なプロバイオティクス特性を保持する。具体的には、本明細書において記載されるプロバイオティクス生物、例えば、バチルス・コアギュランス株GBI-30またはBC30、ATCC指定番号 PTA-6086は、穀物組成物およびスープ組成物を製造および調理する下記の過酷な過程に耐える。
本発明の方法および組成物における使用に適したプロバイオティクス乳酸産生菌は、酸を産生し、非病原性である。本発明は既知の細菌種に限定されるものではないが、細菌の目的および目標が記載される限りにおいて、本明細書中に記載したような同定された多くの適した細菌が存在する。酸を産生する性質は、本発明のプロバイオティクス乳酸産生菌の有効性において重要である。
細菌性病原体、真菌性病原体、病原性酵母の多くの種が、胃腸の正常な生化学機能の混乱、胃腸組織の壊死、および栄養の生体吸収の混乱、ならびに類似の状態を含むがこれらに限定されない様々な胃腸障害を引き起こす能力を有することは、臨床において十分に報告されている。プロバイオティクス生物を含む本発明に記載の組成物は、これらの病原体を阻害する。したがって、本発明の組成物は、上記の病原体による感染に関連する状態の予防的または治療的処置において有用である。
本明細書に記載のプロバイオティクス生物、例えばバチルス・コアギュランス株GBI-30またはBC30、ATCC指定番号PTA-6086は、胃腸の健康を向上させ、かつ免疫系を支える。様々な細菌性病原体を阻害するバチルス・コアギュランスの能力は、インビトロアッセイを用いて定量的に確認された。このアッセイは、規格化された細菌性病原菌スクリーニング(米国食品医薬品庁(FDA)により開発された)の一部分であり、固体支持体ディスク上で市販されている(DIFCO(登録商標)、BACTROL(登録商標)抗菌ディスク)。このアッセイを実施するために、標準的な手順を用いて、まずポテトデキストロースプレート(DIFCO(登録商標))を調製した。続いてこのプレートに細菌を個々に播種し(およそ1.5 x 106 CFU)、コンフルエントな細菌床を形成するように試験した。
一局面において、乳酸産生菌は、穀物組成物に加えられる前に、当該技術分野において周知の任意のマイクロカプセル化工程を用いてマイクロカプセルコーティング中に組み込まれる。単離されたバチルス・コアギュランスは、この細菌を周囲環境から保護するために、他の材料中に包装またはカプセル化される。本発明のカプセルの大きさは、1/1000 mmから7 mmの範囲である。マイクロカプセルの内部の成分は、カプセル壁の機械的破壊、カプセル壁の溶解、カプセル壁の融解、およびカプセル壁を通した拡散を含む様々な方法で、シェルから放出される。したがって、マイクロカプセル化により、本発明の穀物組成物の加熱工程の間、単離されたバチルス・コアギュランスに対するさらなる保護が提供される。マイクロカプセル化の物理的方法には、パンコーティング、エアサスペンションコーティング、遠心押し出し、振動ノズル、および噴霧乾燥が含まれる。マイクロカプセル化の化学的方法には、界面重合、インサイチュー重合、およびマトリックス重合が含まれる。
本発明は、乳酸産生菌、特にバチルス種が、熱湯中で調製されたものなどの穀物組成物およびスープ組成物中で生存能力を維持し、かつ有益なプロバイオティクス特性を保持するという驚くべき発見を対象とする。組成物は、乾燥物質と液体、例えば水またはミルクとを混ぜ合わせることにより調製される。一局面において、組成物は、乾燥物質と液体とを混ぜ合わせ、生じた混合物を加熱することにより調製される。任意で、この混合物は熱、炎、またはマイクロ波の適用を用いて加熱される(加熱処理される)。穀物組成物またはスープ組成物は熱湯中でボイルされる:例えば、コンロの上でボイルされるか、容器中に熱湯を加えるか、または穀物組成物またはスープ組成物を水と共に電子レンジで加熱する。好ましくは、熱湯(約100℃)を、穀物組成物とバチルス・コアギュランス菌との混合物に加える。
バチルス・コアギュランスのHammer菌(ATCCアクセッション番号31284)を、標準的なエアリフト発酵容器を用いて30℃で、ペプトン5 g、肉エキス3 g、MnSO4 10〜30 mg、および蒸留水1,000 mlを含有するpH 7.0に調整した栄養ブロス中に播種し、約108から109細胞/mlの細胞密度まで増殖させた。芽胞形成が許容可能なMnSO4の範囲は1 mg/lから1 g/lである。栄養細胞は45℃まで活発に繁殖でき、芽胞は90℃まで安定である。発酵後、バチルス・コアギュランス菌の細胞または芽胞を標準的な方法(例えば、濾過、遠心分離)を用いて収集し、収集した細胞および芽胞を凍結乾燥、噴霧乾燥、風乾、または凍結することができる。本明細書において記載するように、細胞培養物由来の上清を収集し、バチルス・コアギュランスから分泌された細胞外物質として使用する。
乾燥バチルス・コアギュランス芽胞の培養物を以下のように調製した。1000万個の芽胞を、ポテトデキストロースエキス24 g、鶏肉組織および魚組織の酵素消化物10 g、FOS 5 g、およびMnSO4 10 gを含有する1リットルの培養物に播種した。この培養物を、高酸素環境下37℃で72時間維持し、培養物1グラムあたり約1500億個の細胞を有する培養物を作製した。その後、この培養物を濾過して培養液を取り除き、細菌ペレットを水に再懸濁して凍結乾燥した。続いて、凍結乾燥した粉末を、標準的な優良医薬品製造基準(GMP)を用いて挽いて微粉末にした。
本研究は、胃を通過する際のバチルス・コアギュランス芽胞の生存率を決定するために実施した。バチルス・コアギュランス芽胞の試料を、生存率を得るために様々な長さの時間で擬似胃環境に供した。まず、未処理の(raw material)バチルス・コアギュランスの均質な試料少なくとも12グラムを調製した。3N HCl(250 mlの溶媒容器6個へ150 mlずつ)を用いてpH 1の食塩水を調製し、滅菌した。pH 2およびpH 3のさらなる食塩水を同様に調製し、pH調整した食塩水150 mlをそれぞれ含有する滅菌した250 ml容器6個を得た。生理食塩水150 mlをそれぞれ含有する滅菌した250 mlの溶媒容器6個を調製し、滅菌した。リン酸緩衝液(約400 ml)をpH 7.2で調製した。pH 7.2のリン酸緩衝液9 mlをそれぞれ含有する試験管(24本)を調製し、滅菌した。生理食塩水9 mlをそれぞれ含有する試験管(120本)を調製した。GYE(グルコース-酵母抽出物)寒天培地を調製して滅菌し、水浴中で45℃まで冷却した。未処理の試料(24個)を、それぞれ約500ミリグラム(理論上、芽胞100億個に相当)秤量した。この試料を37℃で溶媒容器に入れ、半分を20分間、もう半分を120分間インキュベートした。それぞれ20分間および120分間のインキュベーションの後、試料を均一にかき混ぜ、1 mlをpH 7.2の滅菌リン酸緩衝液9 ml中へピペットで移した。各時点からの12個の試料全てを、滅菌リン酸緩衝液を含有する試験管に入れた後、各試料について試験管6本を使用するまで段階希釈を行った。最終的な2本の試験管についての最終希釈液は3 x 107 および3 x 108 であり、これはそれぞれほぼ300 CFUおよび30 CFUと計数された。各試料からの最終的な2本の試験管を、70℃の水浴に30分間置いた。30分後、それらを直ちに45℃まで冷却した。試験管1本あたり3つの滅菌ペトリ皿を用意した。熱処理した試験管からの1.0 mlを各ペトリ皿に加え、続いて溶融した滅菌GYE寒天培地(45℃で)15 mlを各ペトリ皿に注ぎ、十分に混合した。凝固したら、ペトリ皿を逆さにして40℃で48時間インキュベートした。個々のコロニーを計数した。結果を、以下の表1に示すようにグラムあたりのCFUで表した。1.0E+10 = 1 x 1010。
以下の研究の目的は、調理および殺菌後のニョッキ(ジャガイモのパスタ)中のGBI-30(バチルス・コアギュランス-30;BC30)の生存率を決定することであった。BC30を、食品マトリックス1 gあたり5 x 107 CFUの量でニョッキ(ジャガイモのパスタ)中に混合し、噴霧乾燥し、100℃で1分30秒間湯の中でボイルした。続いてジャガイモのパスタを95℃で1時間20分殺菌した。殺菌の後、ジャガイモのパスタを家庭での調理を模して100℃で1分30秒間調理した。パスタを4℃で30日間保存し(貯蔵期間は60日間)、およそ80℃で約5分間熱ショックを与え、GYE寒天培地に置いた。結果は、食品マトリクス1グラムあたりおよそ1.3 x 107 CFUのバチルス・コアギュランスが、約30日間の保存後も生き延びたことを示した。熱ショック(サーミゼーション(thermiz))の後も同様の結果が観察され、これは、調理過程の後にパスタが主にバチルス・コアギュランス芽胞を含み、栄養細胞はほとんど含まないことを示唆している。ジャガイモのパスタを調整雰囲気中で包装した。組成物の水分活性(Aw)は、およそ0.95%であった。図1のデータは、事前ボイル、殺菌、および調理の後、ジャガイモのパスタ中のBC30の量が食品マトリクス1 gあたり3 x 106 CFUであったことを示し、これは、ニョッキ100 g中のプロバイオティクスのおおよその一日量は約1.3 x 109 CFUまたは100% RDA(EUガイドラインにおける所要量は、生菌10億個)であることを示唆している。
この研究は、殺菌後の卵入り生パスタ中のGBI-30(バチルス・コアギュランス-30;BC30)の生存率を決定するために実施した。BC30を、チーズ、野菜、および肉の詰め物の入った卵入り生パスタに、食品マトリックス1 gあたり5 x 107 CFUの量で混合した。続いて、卵入り生パスタを噴霧乾燥し、100℃でおよそ5分間殺菌した。卵入り生パスタの貯蔵期間は50日間であった。パスタを調整雰囲気中で包装した。組成物の水分活性(Aw)は、およそ0.92〜0.97%であった。図2に図示した結果は、およそ2 x 107 CFUのBC30が、上記の殺菌後も生き延びたことを示し、これは、バチルス・コアギュランスが卵入り生パスタ中で生存能力を保持することを示している。
オートミール中のGBI-30(バチルス・コアギュランス-30;BC30)の、電子レンジによる加熱に耐える能力を決定した。表2は、およそ82%のBC30が単独で1分50秒間の電子レンジ加熱に耐えたことを示す。表2に示すように、オートミール中の当初のバチルス・コアギュランスのおよそ79%が、1分50秒間の電子レンジ加熱後に生き延び、これは、バチルス・コアギュランスが調理後のオートミール中で生存能力を保持することを示唆している。表2は、様々な条件下での加熱処理後のBC30の生存を示す。
B:BC30 1 g+水250 ml、1分50秒間電子レンジ加熱、段階希釈、総プレート計数。
C:BC30 1 g+オートミール1食分(35.6 g)+水250 ml、1分50秒間電子レンジ加熱、段階希釈、総プレート計数。
本発明のプロバイオティクスであるバチルス・コアギュランスを、表3に示した量でTurtle Islandの乾燥スープ混合物に加えた。表3は、乾燥スープ混合物1食あたりのBC30のコロニー形成単位(CFU)の数を示している表である。
以下の研究の目的は、調理後のデュラム小麦のセモリナのパスタ中のGBI-30(バチルス・コアギュランス-30;BC30)の生存率を決定することであった。BC30を、デュラム小麦のセモリナのパスタに、1食あたり4 x 108 CFU(食品マトリクス1 gあたり約7 x 106 CFU(BC30 約30 mg);1食の量は約56グラム)の量で混合した。組成物を37〜38℃で押し出し、続いて50℃で20時間乾燥させた。表4は、乾燥パスタの製造後および当該乾燥パスタを約8分間ボイルすることで調理した後のBC30の生存を示す。表4に示す結果は、およそ55%のBC30が製造過程に耐え、およそ30%のBC30が調理過程に耐えることを示し、これは、バチルス・コアギュランスBC30がデュラム小麦のセモリナのパスタ中で生存能力を保持することを示している。
Claims (9)
- 加工穀物と単離されたバチルス・コアギュランス(Bacillus coagulans)の栄養細胞または芽胞とを含む、食品組成物であって、該組成物がパスタを含み、該バチルス・コアギュランスがGBI-30株(ATCC指定番号(Designation Number)PTA-6086)である組成物。
- パスタが、スパゲッティ、ラザニア、卵入りパスタ(egg pasta)、シュペッツレ、ペンネ・リガーテ、ロティーニ、リガトーニ、およびニョッキからなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
- 単離されたバチルス・コアギュランスが、調理済みの前記組成物の0.01重量%から10重量%を占める、請求項1記載の組成物。
- 単離されたバチルス・コアギュランスが芽胞の形態である、請求項1記載の組成物。
- バチルス・コアギュランスの芽胞が、熱い液体と接触すると活性化する、請求項4記載の組成物。
- 熱い液体が水またはミルクである、請求項5記載の組成物。
- 単離されたバチルス・コアギュランスが栄養細胞の形態である、請求項1記載の組成物。
- 単離されたバチルス・コアギュランスが栄養細胞と芽胞との混合物の形態である、請求項1記載の組成物。
- 穀物と単離されたバチルス・コアギュランスの栄養細胞または芽胞とを含む穀物組成物(grain-based composition)用乾燥混合物を含む、食品組成物であって、該穀物組成物がパスタを含み、該バチルス・コアギュランスがGBI-30株(ATCC指定番号(Designation Number)PTA-6086)である組成物。
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