ES2619185T3 - Cepas de Lactobacillus termoestables - Google Patents

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ES2619185T3 ES07716125.5T ES07716125T ES2619185T3 ES 2619185 T3 ES2619185 T3 ES 2619185T3 ES 07716125 T ES07716125 T ES 07716125T ES 2619185 T3 ES2619185 T3 ES 2619185T3
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Eva GRAHN HÅKANSSON
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Abstract

Microorganismos de la cepa de Lactobacillus elegida entre las especies Lactobacillus plantarum LB3e y Lactobacillus plantarum LB7c, que se han depositado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen y a las que se les ha asignado los números de acceso 17852 y 17853 respectivamente.

Description

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DESCRIPCION
Cepas de Lactobacillus termoestables Campo de la invencion
La presente invencion se refiere al genera Lactobacillus que tiene la capacidad de sobrevivir en ambientes de alta temperatura. Estos microorganismos termoestables tienen la capacidad de producir agentes antibacterianos viables en diferentes productos alimentarios despues del tratamiento con calor. Los microorganismos termoestables del genero Lactobacillus pueden estar incluidos en productos alimentarios que demandan alta temperatura. Un objeto adicional de la presente invencion es la capacidad de un producto alimentario que comprende los microoganismos termoestables del genero Lactobacillus de promover la inmunotolerancia y la homeostasis. Ademas, se revelan dos cepas novedosas del genero Lactobacillus.
Antecedentes de la invencion
Los probioticos se definen como “microorganismos vivos administrados en cantidades adecuadas que confieren un efecto beneficioso en la salud del hospedador”. La mayona de los probioticos son bacterias, las cuales son organismos unicelulares pequenos de los generos Lactobacillus, Lactococcus o Bifidobacterium.
Como mrnimo, los productos probioticos debenan ser seguros, eficaces y debenan conservar su eficacia y potencia hasta que se consuman. Esto requiere un planteamiento responsable de tanto el productor como el consumidor.
Al nacer las cepas de Lactobacillus junto con Bifidobacteria y Lactococcus son las primeras en colonizar los intestinos esteriles. En adultos las cepas de Lactobacillus son tambien la flora normal dominante en el intestino. Se ha sabido que es beneficioso incluir bacterias productoras de acido lactico tales como Lactobacillus en la dieta. Hoy en dfa muchos de los productos que han incluido bacterias de acido lactico se administran en productos lacteos o se administran en forma de concentrados de los microorganismos, en forma de preparaciones adecuadamente formuladas que incluyen polvos, comprimidos granulados o capsulas que contienen un numero alto de una o mas especies de los microorganismos beneficiosos. Muchas de estas aplicaciones incluyen proterna o azucar de la leche, frente a las cuales mucha gente es intolerante o alergica. Es ventajoso administrar los microorganismos beneficiosos como parte de la dieta normal. Por lo tanto, es deseable incorporar los microorganismos beneficiosos en tipos de productos alimentarios que se consumen mundialmente y regularmente en cantidades considerables por una mayona de consumidores tales como pan u otros productos de cereal. Sin embargo, diversos productos alimentarios se someten a temperaturas que con frecuencia matan los microoganismos en el producto alimentario antes de que llegue al consumidor.
Las personas que padecen de enfermedad celiaca (EC) no son capaces de comer una dieta que contenga proterna gluten que con frecuencia esta presente en el pan y los productos de cereal. Ademas, los productos alimentarios libres de gluten comercialmente disponibles tales como la pasta son de una baja calidad sensorial y de cocina y normalmente muchos mas cara que la pasta normal. Por tanto, hay una necesidad de proporcionar productos alimentarios nuevos y menos caros tales como pasta, pan y productos de cereal que se puedan consumir por personas que padecen de enfermedad celiaca.
El documento WO 94/00019 se refiere a productos horneados que contienen microorganismos viables deseables. Se concluye que los microorganismos tales como las bacterias de acido lactico se matan durante la etapa de horneado como resultado de la inactivacion por calor. Por consiguiente, un producto horneado fresco no contiene en absoluto ningun microorganismo viable. Por lo tanto, se revela un procedimiento en el que una suspension de los microorganismos viables se inyecta en el producto horneado. Es una caractenstica esencial que el producto de panadena se enfne hasta una temperatura por debajo de + 70 °C antes de que se inyecten los microorganismos viables. Hay varios problemas cuando se inyecta una suspension de microorganismos viables con una alta concentracion en un producto horneado. Los microorganismos inyectados no muestran ningun crecimiento significativo en el pan. Es diffcil conseguir una distribucion igual en el pan horneado y se podna afectar el sabor. Ademas, se necesita un equipo caro para inyectar la suspension de los microorganismos viables y no es probable que tal procedimiento pudiera ser usado fuera de un proceso de fabricacion a gran escala. El costoso equipo y la alta concentracion de la suspension con microorganismos, dara con frecuencia como resultado un producto costoso.
Por lo tanto, es un objeto de la presente invencion resolver estos problemas.
Compendio de la invencion
Sorprendentemente, los inventores de la presente invencion han descubierto que los microorganismos termoestables del genero Lactobacillus que son capaces de sobrevivir a temperaturas desde +85 °C durante mas de 25 minutos y tienen la capacidad de producir agentes antibacterianos viables en diferentes productos alimentarios despues de tal tratamiento con calor.
Particularmente, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus rhamnosus tienen la capacidad de sobrevivir a alta temperatura y en ambiente radiado con microondas y aun producen un agente antibacteriano que tambien inhibe el
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crecimiento de moho en los productos alimentarios. Ademas, se revelan dos ejemplos espedficos de cepas de Lactobacillus conocidas, Lactobacillus plantarum LB931 y Lactobacillus rhamnosus, LB21. Ademas, se revelan dos cepas novedosas de Lactobacillus, referidas como Lactobacillus plantarum LB7c y Lactobacillus plantarum LB3e.
Los inventores tambien han demostrado que los productos alimentarios que comprenden las cepas de Lactobacillus viables termoestables elegidas entre las especies Lactobacillus plantarum y Lactobacillus rhamnosus y particularmente Lactobacillus plantarum LB931, Lactobacillus rhamnosus, LB21, Lactobacillus plantarum LB7c y Lactobacillus plantarum LB3e pueden reducir la respuesta inmunologica en el intestino debido al gluten. Un producto alimentario que contiene tales cepas de Lactobacillus viables termoestables que promueven la inmunotolerancia en enfermedades autoinmunes tales como la enfermedad celiaca.
Definiciones
Tal como se describe en el presente documento, el termino “LB” se refiere a bacterias del genero Lactobacillus.
Tal como se describe en el presente documento, el termino “termoestable” se refiere a bacterias que sobreviven en temperaturas mayores que +80 °C durante mas de 25 minutos.
Tal como se describe en el presente documento, el termino “bacterias de acido lactico” se refiere a bacterias que producen acido lactico, tales como las bacterias que pertenecen a los generos Lactobacillus y Lactococcus.
Tal como se describe en el presente documento, el termino “UFC” se refiere a unidades formadoras de colonia.
Tal como se describe en el presente documento, el termino “productos alimentarios” se refiere a productos alimentarios tales como pan, masa, productos de cereal tales como papilla de avena, gachas, muesli, granola, producto basado en cereal en polvo, pasta, semiproductos tales como sopas, productos precocidos, pan corriente (plain bread) y compota.
Tal como se describe en el presente documento, el termino “fuente de calor” se refiere a fuentes de calor que calientan el producto alimentario tal como una placa de cocina, horno, ambiente radiado con microondas, horno de microondas o un bano mana.
Una masa tal como se usa en el presente documento normalmente contiene un fluido tal como leche o agua, harina y levadura.
Tal como se describe en el presente documento, el termino “una rebanada de pan” se refiere a una rebanada tfpica de pan que pesa aproximadamente 15 a 40 g.
Tal como se describe en el presente documento, el termino “productos precocidos” se refiere a productos semielaborados para los cuales se completara el horneado despues de suministrarse al consumidor.
Tal como se describe en el presente documento, el termino “sustancias solubles” se refiere a acidos organicos, acidos inorganicos, tales como acido lactico, acido succmico, acido acetico y acido propionico.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 revela la capacidad de supervivencia de LB21 liofilizado sobre granos almacenados a temperatura ambiente.
La Figura 2 revela la capacidad de supervivencia de LB21 liofilizado sobre granos almacenados a +4 °C.
La Figura 3 revela la capacidad de supervivencia de LB931 y LB21 liofilizados en barritas energeticas almacenadas a +4 °C.
La Figura 4 revela la capacidad de supervivencia de LB931 y LB21 en ambiente radiado con microondas.
La Figura 5 revela la capacidad de supervivencia de LB931, LB7c, LB3e y L1A a +80 °C.
La Figura 6 revela la capacidad de supervivencia de LB931 a +90 °C.
La Figura 7 revela la capacidad de Lactobacillus de sobrevivir al paso a traves del tracto gastrointestinal en pan
de masa fermentada.
La Figura 8 revela la expresion de acidos organicos en un Cromatograma Auto Escalado de sobrenadantes de las cepas de Lactobacillus LB931, LB3e, LB7c y LB21 (analisis completado por Steins Laboratorium).
La Figura 9 revela la expresion de acidos lacticos en un Cromatograma de Auto Escalado de sobrenadantes de las cepas de Lactobacillus LB931, LB3e, LB7c y LB21 (analisis completado por Steins Laboratorium).
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La Figura 10 revela la produccion de citoquinas por los linfocitos T activados policlonados en presencia de las cepas de bacterias probioticas LB931, LB3, LB7 y LB21.
La Figura 11 revela que tanto LB931 vivo como LB21 vivo dan las mismas respuestas de citoquina sobre linfocitos T activados.
La Figura 12 revela que el Lactobacillus no incremento los niveles de IFN-y o niveles de IL-4 de los linfocitos T en reposo.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a microorganismos termoestables del genero Lactobacillus que son capaces de sobrevivir a temperatures desde +80 °C durante mas de 25 minutos.
Se revela que las especies seleccionadas de microorganismos del genero Lactobacillus elegidas entre las especies Lactobacillus plantarum y Lactobacillus rhamnosus tienen la capacidad de producir agentes antibacterianos viables en diferentes productos alimentarios despues del tratamiento con calor.
Ademas, se revelan dos nuevas cepas de Lactobacillus, la cepa de Lactobacillus elegida entre las especies Lactobacillus plantarum LB7c y Lactobacillus plantarum LB3e.
Una realizacion esta dirigida a microorganismos de la cepa de Lactobacillus elegida entre las especies Lactobacillus plantarum LB3e y Lactobacillus plantarum LB7c que han sido depositadas en la Deutsche Sammlung von Mikroorgamismen und Zellkulturen, y se les ha asignado el numero de acceso 17852 y 17853 respectivamente que son capaces de sobrevivir a temperaturas desde +80 °C durante mas de 25 minutos.
Cualquiera de las dos cepas de Lactobacillus anteriormente mencionadas se podnan usar en productos alimentarios tales como pan, masa, productos de cereal, papilla de avena, gachas, muesli, granola, producto basado en cereal en polvo, pasta, semiproductos, sopas, productos precocidos, pan corriente, compota.
Ademas, un producto alimentico tal como pan, masa, productos de cereal, papilla de avena, gachas, muesli, granola, producto basado en cereal en polvo, pasta, semiproducto, sopas, productos precocidos, pan corriente, compota caracterizado porque dicho producto alimentico tambien contiene una cepa de Lactobacillus viable elegida entre las especies Lactobacillus plantarum LB3e y Lactobacillus plantarum LB7c que han sido depositadas en la Deutsche Sammlung von Mikroorgamismen und Zellkulturen, y se les ha asignado el numero de acceso 17852 y 17853 respectivamente.
Un producto de pan o masa en el que dicho producto de pan o masa tambien contiene una cepa de Lactobacillus viable elegida entre las especies Lactobacillus plantarum LB931 que ha sido depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen y se le ha asignado el numero de acceso DSM 11918, Lactobacillus rhamnosus LB21 que ha sido depositada en la NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibston Estate y se le ha asignado el numero de acceso NCIMB 40564, Lactobacillus plantarum LB3e (DSM 17852) y Lactobacillus plantarum LB7c (DSM 17853), en donde dichas cepas depositadas son capaces de sobrevivir a temperaturas desde +85 °C durante mas de 25 minutos y dichos lactobacilos de al menos una de dichas cepas estan incorporados en dicho producto de pan y masa antes de un tratamiento con calor.
Un producto alimentario preparado por tratamiento con calor de un material de partida del producto alimentario usando una fuente de calor que expone dicho producto alimentario a una temperatura por encima de +85 °C en donde dicho producto alimentario tambien contiene una cepa de Lactobacillus viable preferentemente elegida entre Lactobacillus plantarum LB931 (DSM11918), Lactobacillus rhamnosus LB21 (NCIMB 40564), Lactobacillus plantarum LB7c (DSM 17853) y Lactobacillus plantarum LB3e (DSM 17852) respectivamente.
En realizaciones adicionales el uso de las cepas de Lactobacillus viables conocidas elegidas entre las especies de Lactobacillus plantarum (DSM 11918), Lactobacillus rhamnosus LB21 (NCIMB 4056) para la fabricacion de un producto alimentario tal como pan, masa, productos de cereal, papilla de avena, gachas, muesli, granola, producto basado en cereal en polvo, pasta, semiproducto, sopas, productos precocidos, pan corriente, compota en donde el producto alimentario se prepara por tratamiento con calor de un material de partida de producto alimentario usando una fuente de calor que expone dicho producto alimentario a una temperatura por encima de +85 °C, y en donde los lactobacilos de al menos una de dichas cepas estan incorporados en dicho producto alimentario antes de un tratamiento con calor.
Un producto alimentario anteriormente mencionado en el que la cepa de Lactobacillus viable esta presente en una cantidad por encima de 1,0 x 103 UFC/g, preferentemente por encima de 1,0 x 104 UFC/g y lo mas preferentemente por encima de 1,0 x 105 UFC/g, bacterias vivas por gramo del producto alimentario despues del tratamiento con calor.
Un objeto adicional de la presente invencion es la capacidad de una producto alimentario anteriormente mencionado en el que la cepa de Lactobacillus viable termoestable elegida entre las especies Lactobacillus plantarum y
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Lactobacillus rhamnosus reduce la respuesta inmunologica en el intestino debido al gluten y, particularmente, Lactobacillus plantarum LB931 (DSMll918), Lactobacillus rhamnosus, LB21 (NCIMB 40564), Lactobacillus plantarum LB7c (DSM 17853) y Lactobacillus plantarum LB3e (DSM 17852).
Un producto alimentario preparado por tratamiento con calor de un material de partida del producto alimentario usando una fuente de calor que expone dicho producto alimentario a una temperature por encima de +85 °C caracterizado porque dicho producto alimentario tambien contiene una cepa de Lactobacillus termoestable viable elegida entre las especies Lactobacillus plantarum LB931 (DSM11918), Lactobacillus rhamnosus, LB21 (NCIMB 40564), Lactobacillus plantarum LB7c (DSM 17853) y Lactobacillus plantarum LB3e (DSM 17852), en donde dicho producto alimentario es para promover la inmunotolerancia en enfermedades autoinmunes tales como la enfermedad celiaca.
La identidad y los numeros de deposito de las cepas de la presente invencion se enumeran en el presente documento.
La LB931 ha sido depositada el 9 de enero de 1998 en la DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b D-38124 Braunschweig. Se la ha asignado el numero de acceso DSM11918.
La LB21 ha sido depositada el 11 de junio de 1993 en la NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, UK. Se la ha asignado el numero de acceso NCIMB 40564.
La LB3e ha sido depositada el 6 de enero de 2006 en la DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b D-38124 Braunschweig. Se la ha asignado el numero de acceso DSM 17852.
La LB7c ha sido depositada el 6 de enero de 2006 en la DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b D-38124 Braunschweig. Se la ha asignado el numero de acceso DSM 17853.
Las cepas de Lactobacillus anteriormente mencionadas podnan ser referidas como LB931 (DSM11918), LB21 (NCIMB 40564), LB3e (DSM 17852) y LB7c (DSM 17853).
Los productos alimentarios segun la presente invencion pueden comprender una o mas cepas seleccionadas entre las cepas de LB anteriormente definidas. Dentro del ambito de la presente invencion podnan usarse, de manera ventajosa, otras mezclas o cepas de LB termoestables unicas.
Las cuatro cepas de Lactobacillus termoestables anteriormente mencionadas tienen la capacidad de sobrevivir en un ambiente de alta temperatura, es decir, por encima de +80 °C durante mas de 25 minutos y producir aun sustancias (las cuales podnan ser solubles, tales como acido lactico, acido succrnico, acido acetico y acido propionico) que inhiben el crecimiento de microorganismos patogenos, tales como enterobacterias, estreptococos del grupo B, estafilococos y levaduras. La Figura 8 revela la expresion de acidos organicos y la Figura 9 revela la expresion de acidos lacticos en un Cromatograma Auto-Escalado de sobrenadantes de las cepas de Lactobacillus LB931, LB3e, LB7cy LB21.
Estas cepas son soportables y sobreviven facilmente a largos periodos de almacenamiento a temperatura ambiente. Por consiguiente, LB931, LB21, LB3e y LB7c tienen una larga vida en almacenamiento. Las cepas se pueden facilmente incluir en diferentes productos alimentarios.
Se determino la capacidad del Lactobacillus para sobrevivir en diferentes aplicaciones, vease el Ejemplo2. No se detecto mayor reduccion de UFC/g en la preparacion en polvo de gachas integrales con LB931 y LB21 liofilizados que se almacenaron a +37 °C durante 31 dfas.
Se determino la capacidad de Lactobacillus para sobrevivir en barritas energeticas cuando se ponen en granos de avena, vease el Ejemplo 3. Es posible poner cepas de Lactobacillus sobre los granos y sobreviviran durante 8 meses a temperatura ambiente y mas de 8 meses a +4 °C.
Tanto LB931 como LB21 tienen la capacidad de sobrevivir en barritas energeticas durante 25 dfas. Las barritas energeticas que contienen LB931 ternan 7,6 x 106 UFC/ml el dfa 46.
Por tanto, las cepas de LB termoestables pueden soportar el almacenamiento durante un largo periodo de tiempo, y si es posible producir la cepa en tipos diferentes de preparaciones. Se podna usar en productos precocidos.
Tambien se evaluo la capacidad de supervivencia en un ambiente radiado por microondas, vease el Ejemplo 4. Se prepararon bebidas de cereales con leche junto con las cepas de Lactobacillus en una concentracion de inicio de 107 UFC/ml. LB931 mostro una mayor UFC/ml que LB21 hasta 80 segundos. La UFC/ml de LB21 se mantuvo igual desde 30 segundos a 90 segundos. El Lactobacillus tiene la capacidad de sobrevivir en productos de cereal en ambiente radiado con microondas. Los resultados estan representados en la Figura 4.
Se investigo la muerte de las cuatro cepas diferentes de bacterias de acido lactico con luz UV y se uso un ensayo de interferencia para analizar la capacidad de inhibir el crecimiento de patogenos de las cuatro cepas de acido lactico y, por tanto, tambien su capacidad de funcionar como probioticos, los resultados se muestran en el Ejemplo 5.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Se ha investigado la resistencia a alta temperatura de las cepas de Lactobacillus, vease el Ejemplo 6. LB931, LB3e y LB7c tienen la capacidad de sobrevivir a +80 °C durante mas de 25 minutes y LB931 sobrevive durante mas de 5 minutes a +90 °C. La cepa control, L1A, incluso no sobrevive durante 5 minutes a +80 °C. Los resultados estan representados en la Figura 5 y 6.
Se ha investigado las capacidades de crecimiento del Lactobacillus en masas madre fermentadas (sourdough starter), vease el Ejemplo 7. Dos tipos diferentes de harinas, trigo y centeno, se usaron para determinar el mejor ambiente para el Lactobacillus. El tipo de harina no afecto al resultado del experimento. Las masas madre incrementaron un log y terminaron en la misma UFC/g independiente del tipo de harina. Como control, se uso el Lactococcus lactis L1A. El L1A no crecio en la masa madre (starter). La UFC/g habfa descendido desde el dfa 0 al dfa 3.
En el Ejemplo 8 se muestra la supervivencia del Lactobacillus en el pan. Se establecieron las temperaturas en diferentes panes, vease la tabla 13. La supervivencia de las bacterias en el pan se determino a diferentes tiempos, vease las tablas 14 a 16. El Lactobacillus lactis L1A se uso como control. Todas las cepas de Lactobacillus que se ensayaron sobrevivieron a todas las diferentes temperaturas y tiempos. El control, l1a, no sobrevivio. No hubo crecimiento visual de las bacterias desde el dfa 0.
Dependiendo del producto alimentario y del fin, es deseable que comprenda la cepa de Lactobacillus viable en una cantidad suficiente que es preferentemente tan alta como sea posible, para proporcionar los efectos deseados. Los resultados experimentales muestran que se pueden alcanzar cantidades por encima de 1,0 x 1010 UFC/g. En un producto alimentario la cepa de Lactobacillus viable debena estar presente en una cantidad por encima de 1,0 x 103 UFC/g, preferentemente por encima de 1,0 x 104 UFC/g y lo mas preferentemente por encima de 1,0 x 105 UFC/g, bacterias vivas por gramo del producto alimentario.
Un ejemplo es una rebanada de pan que pesa al menos 15 gramos en la que la cepa de Lactobacillus viable esta presente en una cantidad por encima de 1,0 x 103 UFC/g, preferentemente por encima de 1,0 x 104 UFC/g y lo mas preferentemente por encima de 1,0 x 105 UFC/g, de bacterias vivas por gramo de una rebanada de pan.
Por ejemplo, una cepa de Lactobacillus viable en la que la concentracion de inicio es aproximadamente 1 x 106 tiene una UFC por encima de 1 x 103 despues de estar expuesta a temperaturas desde +80 °C durante mas de 25 minutos o alternativamente durante mas de 10 s en un ambiente radiado por microondas.
Se ha investigado la capacidad de Lactobacillus de promover la inmunotolerancia en enfermedades autoinmunes tales como enfermedad celiaca en estudios in vivo. Las cepas de Lactobacillus son capaces de reducir la lesion inflamatoria en la mucosa intestinal superior y reducir los niveles de anticuerpos asociados con enfermedades autoinmunes. El Ejemplo 9a, 9b y 9c tambien indican que Lactobacillus tiene la capacidad de influir el sistema inmune de un modo positivo. Los ninos a los que se les dio Lactobacillus no experimentaron ningun smtoma relacionado con la enfermedad celiaca. Todos los ninos a los que se les dio placebo llegaron a estar enfermos despues de 1 a 3,5 meses de exposicion a gluten. La biopsia mostro tejido normal en el grupo al que se le dio Lactobacillus y el tejido mostro la indicacion de inflamacion en el grupo al que se le dio placebo. Los productos segun la invencion pueden comprender una o mas cepas seleccionadas entre el grupo anteriormente definido. Otras mezclas o cepas de LB unicas se podnan usar ventajosamente dentro del ambito de la presente invencion.
La presente invencion se describira ahora en referencia a los siguientes ejemplos, lo cual no se debena considerar como limitante para el ambito de la invencion.
Ejemplos
Ejemplo 1
Aislamiento e identificacion de las cepas de Lactobacillus.
Se aislo LB931 de una mujer sana. La cepa se clasifico como Lactobacillus plantarum segun el kit de ensayo API 50 CH (API systems, BioMerieux, FR), y se denomino LB931. Ademas, la cepa se tipifico por analisis de ADN con SDS- page en BCCM/LMG (Belgium) como Lactobacillus plantarum-pentosusparaplantarum.
Se aislo LB21 de un bebe sano. La cepa se clasifico como Lactobacillus rhamnosus segun el kit de ensayo API 50 (API systems, BioMerieux, FR) y se denomino LB21. Ademas, la cepa se tipifico por analisis de ADN con SDS-PAGE en la NCIMB (UK) como Lactobacillus rhamnosus.
Se aislo LB3e de un ser humano. La cepa se clasifico como Lactobacillus plantarum segun el kit API 50 (API systems, BioMerieux, FR), y se denomino LB3e. Ademas, la cepa se tipifico por secuencia de gen de ADNr 16S en la DSMZ (Alemania) como Lactobacillus plantarum.
Se aislo LB7c de un ser humano. La cepa se clasifico como Lactobacillus plantarum segun el kit API 50 (API systems, BioMerieux, FR), y se denomino LB7c. Ademas, la cepa se tipifico por secuencia del gen de ADNr 16S en la DSMZ (Alemania) como Lactobacillus plantarum.
5
10
15
20
25
30
Las capacidades de supervivencia de Lactobacillus en diferentes preparaciones.
a) Se liofilizaron preparaciones de leche desnatada de LB931 segun los procedimientos estandar. Para determinar la durabilidad de las preparaciones se almaceno el polvo obtenido en polvo de gachas integrales a 37 °C durante 31 dfas para simbolizar el almacenamiento a temperatura ambiente durante 6 meses. Se determino el numero de bacterias despues de 31 d^as y los resultados se revelan en la tabla 1 de a continuacion.
TABLA 1
Dfas N° de bacterias UFC/g Dfa 0 7,0 x 1011
D^a 31 1,0 x 1011
b) Se disolvio LB931 en una suspension de partes iguales de leche desnatada y NaCl al 0,9 %. A continuacion, las bacterias disueltas se incubaron a diferentes temperaturas. Se hizo un seguimiento continuo de la cantidad de bacterias mediante recuento celular. Los resultados se revelan en la tabla 2 de a continuacion.
TABLA 2
N° de bacterias UFC/ml
Temperatura, °C
Dfa 0 Dfa 2 Dfa 5 Dfa 32
4
7,8 x 1010 2,2 x 1010
20
1,8 x 1010 2,2 x 1010
27
1,8 x 1010 1,2 x 1010 3,3 x 109
Los resultados muestran que LB931 es estable en una mezcla de leche desnatada y NaCl durante un periodo de un mes a +4 °C.
c) Se liofilizo una preparacion de leche desnatada de LB931 segun los procedimientos estandar. El polvo obtenido se almaceno en placas Petri a temperatura ambiente y a +6 °C. Se determino el numero de bacterias despues de 7 dfas y 25 dfas, respectivamente. Los resultados se revelan en la tabla 3 de a continuacion.
TABLA 3
N° de UFC de bacterias/g
Temperatura, °C
Dfa 0 Dfa 7 Dfa 25
6
4,2 x 108 2,2 x 108 1,2 x 108
22
4,2 x 108 1,9 x 108 1,4 x 108
Tambien se hizo un seguimiento del numero de bacterias en el polvo liofilizado cada cuarta semana hasta 68 semanas. Despues de un ano, se pudo encontrar, a +6 °C, mas de 105 UFC/g de LB931.
d) Se liofilizo una preparacion de leche desnatada de LB21 segun los procedimientos estandar. Se almaceno el polvo obtenido en una botella de cristal a +4 °C. El numero de bacterias se determino despues de 0, 10, 40 y 365 dfas, respectivamente. Los resultados se revelan en la tabla 4 de a continuacion.
Tabla 4
Dfa 0 Dfa 10 Dfa 40 Dfa 365
LB21
2,3 x 1010 2,3 x 1010 1,0 x 1010 1,2 x 1011
Ejemplo 3
Las capacidades de supervivencia de Lactobacillus en diferentes productos de avena.
a) Se puso una preparacion liofilizada de LB21 sobre copos de avena. Se usaron seis procedimientos diferentes para poner las bacterias sobre los granos. Los LB21 liofilizados se mezclaron con maltodextrina/glucosa para que se pegaran a los granos. Las bacterias se pusieron sobre los granos a diferentes temperaturas y tambien se secaron a diferente temperatura para encontrar el mejor procedimiento. Los resultados se muestran en la Tabla 5.
5
TABLA 5
Temperatura de preparacion
Seco
Aire Aceite
Aire
LB21 25°C
+25°C - +30°C
LB21 30°C
+30°C - +38°C
LB21 33°C
+33°C - +38°C
LB21 5 %
+29°C +38°C +38°C
LB21 25 % caliente
+28°C +38°C +38°C
LB21 25 % fno
+28°C +27°C +25°C
Los granos con bacterias se almacenaron tanto a +25 °C como a +4 °C durante 244 d^as. La capacidad de supervivencia se determino una vez al mes. Los resultados se revelan en las tablas 6 a 7 de a continuacion.
TABLA 6. Almacenados a +25 °C
Tiempo (dfas)
N° de bacterias UFC/g
LB21 25°C
LB21 30°C LB21 33°C LB21 5% LB21 25 % caliente LB21 25 % fno
6
4 x 108 2 x 108 1 x 108 2 x 108 3 x 108 3 x 108
31
2 x 108 2 x 108 1 x 108 2 x 108 2 x108 2 x 108
59
3 x 108 5 x 108 2 x 108 2 x 108 3 x 108 4 x 108
90
2 x 108 3 x 108 1 x 108 1 x 108 3 x 108 1 x 108
122
2 x 108 2 x 108 7 x 107 7 x 107 1 x 108 1 x 108
144
2 x 108 2 x 108 1 x 108 8 x 107 8 x 107 8 x 107
180
2 x 107 2 x 107 3 x 107 2 x 106 3 x 106 5 x 106
219
1 x 106 2 x 106 3 x 105 8 x 104 9 x105 9 x 105
244
4 x 103 1 x 103 1 x 103 2 x 103 5 x 103 6 x 103
TABLA 7. Almacenados a +4 °C
N° de bacterias UFC/g
Tiempo ^as) LB21 25°C LB21 30°C LB21 33°C LB21 5% LB21 25 % LB21 25 %
caliente fno
6
4 x 108 2 x 108 1 x 108 2 x 108 3 x 108 3 x 108
31
2 x 108 2 x 108 2 x 108 2 x 108 2 x 108 2 x 108
59
4 x 108 2 x 108 2 x 108 3 x 108 4 x 108 3 x 108
90
4 x 108 2 x 108 2 x 108 3 x 108 4 x 108 2 x 108
122
2 x 108 2 x 108 6 x 107 2 x 108 2 x 108 1 x 108
144
2 x 108 2 x 108 8 x 107 2 x 108 2 x 108 1 x 108
180
2 x 108 2 x 108 6 x 107 1 x 108 1 x 108 1 x 108
219
2 x 108 1 x 108 4 x 107 1 x 108 1 x 108 1 x 108
244
4 x 108 2 x 108 2 x 107 2 x 108 4 x 108 3 x 107
b) Se hicieron barritas energeticas con LB931 y LB21. Cada barrita pesaba 25 g antes de se dividieran en 4 trozos. Cada trozo se puso en una bolsa esteril a +4 °C. El numero de bacterias se determino despues de 0, 10, 21 y 46 dfas. Los resultados se revelan en la tabla 8 de a continuacion.
N° de bacterias UFC/g
Tiempo (dfas)
LB931 LB21
0
8 x 108 1,2 x 107
10
2,7 x 108 1,3 x 107
21
3,8 x 108 3,0 x 105
46
7,6 x 106 0
Las cepas de LB termoestables pueden sobrevivir en alta temperatura en diferentes preparaciones de cereal. Ejemplo 4
5 Las capacidades de supervivencia de Lactobacillus en ambiente radiado con microondas.
Se incluyo una preparacion liofilizada de LB931 en el polvo de bebida de cereal con leche convencional y en copos de avena. La bebida de cereal con leche y los copos de avena se prepararon segun las instrucciones del paquete dando como resultado un volumen de aproximadamente 200 ml. Se uso un horno microondas (850 W) con la medida interna de 30x29x20 cm como fuente de calor. Por tanto, el volumen interno del horno microondas era de 10 aproximadamente de 17 dm3. Se determino el numero de bacterias despues de 30 segundos, 60 segundos, 70 segundos, 80 segundos y 90 segundos, respectivamente. La temperatura de la bebida de cereal con leche despues de 90 segundos en el horno microondas era de aproximadamente +60 °C. El procedimiento se repitio con cultivo durante la noche de LB21. Las cepas de LB termoestables son capaces de sobrevivir en el ambiente radiado con microondas. Los resultados se revelan en la tabla 9 de a continuacion.
15 TABLA9
N° de bacterias UFC/ml Tiempo (s) LB931 Lb21
0
3 ,5 x 107 1 ,1 x 107
30
2 ,2 x 107 2 ,2 x 105
60
2 ,6 x 107 1 ,0 x 105
70
1 ,3 x 107 1 ,0 x 105
80
3 ,9 x 106 1 ,0 x 105
90
1 ,1 x 103 1 ,0 x 105
Ejemplo 5
Se investigo la muerte de las cuatro cepas diferentes de bacterias de acido lactico con luz UV. Las cuatro cepas diferentes de bacterias de acido lactico de Lactobacillus plantarum; LB931 (aislada del tracto urinario de ser 20 humano), LB3e (aislada de saliva de nino), LB7c (aislada de la superficie de diente de nino) y LB21 (aislada de heces de ninos recien nacidos) usadas en este ejemplo se extendieron sobre placas de agar MRS y se incubaron durante 20 h a 37 °C, CO2 al 5 %. A continuacion, se inocularon en 3 ml de caldo MRS a 37 °C, CO2 al 5 % durante la noche lo que genera aproximadamente 109 UFC/ml. Los cultivos de toda la noche de las cepas se anadieron a un volumen final de 1 % en caldo MRS y se incubaron durante 20 h a 37 °C, CO2 al 5 %. Las bacterias se centrifugaron 25 (3.800 rpm, 20 min, +4 °C) y, a continuacion, se lavaron 2 veces en 10 ml de NaCl al 0,9 %. Las bacterias se
disolvieron en NaCl al 0,9 %. La concentracion de las bacterias se determino por recuento de unidad formadora de colonia (UFC). Las bacterias se irradiaron durante diferentes tiempos a una distancia de 5 cm de una lampara de UVC (Kendro laboratory products, 2x15W, 254 nm). Las bacterias de acido lactico LB7c y LB21 se irradiaron durante 9 h mientras que las bacterias de acido lactico LB3e y LB931 se irradiaron durante 10 h. La muerte de las bacterias 30 se controlo sobre placas de agar MRS, incubadas durante 48 h a 37 °C, CO2 al 5 %.
Ensayo de interferencia de recubrimiento de agar
Se uso un ensayo de interferencia para ensayar las cuatro cepas de acido lactico (vease la tabla 10 para su capacidad de inhibir el crecimiento de patogenos). Se inocularon las cuatro cepas de Lactobacillus en la tabla 10 en 3 ml de caldo MRS y, a continuacion, se incubaron en 37 °C, CO2 al 5% durante 20 h. Se mezclo 1 ml de los cultivos 35 con 23 ml de agar MRS junto con 2 ml de NaAc 7,5 M, despues las placas se incubaron durante 20 h a 37 °C, CO2 al 5%. Nueve cepas de ensayo de interferencia (CEI) diferentes (NUS, Umea, Suecia), aisladas de personas con infecciones urinarias, se inocularon en caldo M17 y se incubaron en 37 °C toda la noche. Se encontro una segunda capa de agar de 25 ml de M17 con 750 pl de KH2PO4 6,5 M sobre la primera. Las cepas de ensayo, en fase estacionaria, se replicaron con ayuda de un alfiler de acero de Steers (Steers y col., 1959) sobre la superficie del
agar M17 y tambien sobre una placa control y, a continuacion, se incubaron en 37 °C, CO2 al 5% durante la noche. Inhibicion de patogenos por bacterias de acido lactico
Se hizo un ensayo de interferencia para analizar la capacidad de inhibir patogenos de las bacterias de acido lactico y, por tanto, tambien su capacidad de funcionar como probioticos. El resultado de este ensayo se muestra en la tabla 5 10. LB931 inhibio totalmente todos los 8 patogenos ensayados. LB3, LB7 y LB21 mostraron inhibicion total de todos
los patogenos excepto para Candida albicans, la cual se inhibio parcialmente. Se uso Lactobacillus acidophilus como control.
TABLA 10. Inhibicion de patogenos por bacterias de acido lactico
Cepa ensayada
LB931 LB3e LB7c LB21 L. acidophilus 2060V
Candida albicans
- - - - +
Especie de Klebsiella
- ± ± +
Staphylococcus aureus
- - - - +
Staphylococcus coagulasa negativa
- - - - ?
Enterococcus faecalis
- - - - +
Especie de Enterobacteriaceae
- - - - ?
Proteus mirabilis
- - - - ?
Escherichia coli
- - - - +
+, no inhibicion; ±, inhibicion parcialmente; -, inhibicion total; ?, no hecho
10 Ejemplo 6
Las capacidades de supervivencia de Lactobacillus a diferentes temperatures.
a) Se hicieron diferentes suspensiones de Lactobacillus de LB931 liofilizado en NaCl al 0,9 % y cultivo durante la noche de LB931, LB7c, LB3e y L1A. Las suspensiones eran a 109-1011 UFC/ml. Se calento 5 ml de NaCl al 0,9 % hasta +80 °C en un bano mana. Tan pronto como el NaCl estaba a +80 °C se anadio 100 pl de la suspension de 15 bacterias. El numero de bacterias se determino despues de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos y 25 minutos, respectivamente. Los resultados se revelan en la tabla 11 de a continuacion (CNV=crecimiento no visible).
TABLA 11
N° de bacterias UFC/ml
Tiempo (min) LB931 LB7c LB3e L1A
0
2. O CO x 108 1 ,1 x 108 9 ,7 x 107 2,5 x 107
5
4 ,33 x 106 1 ,0 x 104 1 ,4 x 104 CNV
10
1 ,77 x 106 3 ,3 x 104 1 ,4 x 104 CNV
15
2 0 0 x 106 2 ,5 x 104 1 ,8 x 102 CNV
20
8 ,20 x 104 1 ,2 x 103 1 ,9 x 105 CNV
25
2. ,24 x 105 1 ,0 x 104 7 ,8 x 104 CNV
b) +80 °C en mas de 20, 30, 40, 50, 60 minutos
20 Se calentaron 5 ml de MRS a +85 °C en un bano mana. Se anadio 500 pl de un cultivo durante la noche a la suspension. La capacidad de supervivencia se determino despues de 20, 30, 40, 50 y 60 minutos respectivamente. Los resultados se muestran en la tabla 12 de a continuacion.
N° de bacterias UFC/ml
Tiempo (min)
LB3e LB7c LB931 LB21
20
CV CV CV CV
30
CV CV CV CV
40
CV CV CV CV
50
CV CV CV CV
60
CV CV CV CV
CV = crecimiento visible
c) Se preparo una suspension de LB931 poniendo en suspension LB931 liofilizado en NaCI al 0,9 % y tambien un cultivo durante la noche de LB931. El NaCl se calento hasta +90 °C en un bano mana. Tan pronto como el NaCl 5 estaba a +80 °C, se anadieron 100 pl de la suspension de bacterias. Se determino el numero de bacterias despues de 0,5 minutos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos y 5 minutos, respectivamente. Los resultados se revelan en la tabla 13 de a continuacion.
TABLA 13
N° de bacterias UFC/ml
Tiempo (min) LB931
0
1,76 x108
0,5
5,00 x 105
1
3,54 x 104
2
4,43 x 104
3
1,25 x 104
4
1,14 x 104
5
3,00 x 104
d) Se incluyo una preparacion liofilizada de LB931 y LB21 en el polvo de bebida de cereal con leche convencional y 10 en copos de avena. La bebida de cereal con leche se preparo segun las instrucciones del paquete. Se uso como fuente de calor la cocina. El numero de bacterias se determino despues de que se calentara la bebida de cereal con leche hasta + 37 °C. Los resultados se revelan en la tabla 14 de a continuacion.
TABLA 14
N° de bacterias UFC/ml
Temperatura (°C)
LB931 LB21
10
2,9 x 107 3,0 x 107
37
2,4 x 107 2,8 x 107
Ejemplo 7
15 Las capacidades de supervivencia de Lactobacillus en masa madre fermentada.
Se hicieron diferentes masas madre fermentadas de harina de trigo que conteman diferentes cepas de Lactobacillus y Lactococcus. Se mezclo harina y agua a un volumen de 3 dl. Se incluyo 10 ml de suspension de bacterias descongeladas en la masa madre. Las masas madre fermentadas se mantuvieron a temperatura ambiente durante 3 dfas. Todos los dfas a la masa madre fermentada se le daba mas miel, harina y agua. El numero de bacterias se
20 determino despues de 3 dfas. Despues de los 3 dfas a temperatura ambiente las masas madre se pusieron a 4 °C durante 6 dfas. El numero de bacterias se determino despues de 3 dfas, y 6 dfas, respectivamente. Los resultados se revelan en las tablas 15 a 16 de a continuacion.
TABLA 15
N° de bacterias UFC/g
Tiempo (dfas) LB931 +25 °C LB7c +25 °C LB3e +25 °C 0 5 x 108 2 x 107 6 x 107
3 3 x 109 9 x 108 2 x 109
5
10
15
20
25
N° de bacterias UFC/g
Tiempo (dfas)
LB931 +4 °C LB7c +4 °C LB3e +4 °C
0
3 x 109 6 x 108 3 x 109
3
2 x 109 3 x 108 9 x 108
6
2 x 109 2 x 107 8 x 108
b) Se hicieron diferentes masas madre fermentadas de harina de arroz que conternan diferentes cepas de Lactobacillus. Se mezclo harina y agua a un volumen de 3 dl. Se incluyo 10 ml de suspension de bacterias descongeladas en las masas madre. Las masas madre fermentadas se mantuvieron a temperature ambiente durante 3 dfas. Todos los d^as a las masas madre fermentadas se les dio mas miel, harina y agua. El numero de bacterias se determino despues de 3 dfas. A continuacion, las masas madre se conservaron a 4 °C durante 6 dfas. El numero de bacterias se determino despues de 3 dfas y 6 d^as, respectivamente. Los resultados se revelan en las tablas 17 a 18 de a continuacion.
TABLA 17
N° de bacterias UFC/g almacenadas a +25 °C
Tiempo (dfas)
LB931 LB7c LB3e L1A
0
2 x 108 2 x 107 6 x 107 1 x 107
3
7 x 109 9 x 108 2 x 109 8 x 105
TABLA 18
N° de bacterias UFC/g almacenadas a +4 °C
Tiempo ^as)
LB931 LB7c LB3e
0
3 x 109 6 x 108 3 x 109
3
2 x 109 3 x 108 9 x 108
6
2 x 109 2 x 107 8 x 108
Ejemplo 8
Las capacidades de supervivencia de Lactobacillus en pan, deteccion visual de moho en el pan y aislamiento de Lactobacillus en muestras de heces.
a) Se preparo una masa fermentada con 1 dl de masa madre fermentada de trigo que conterna LB931, agua, harina de trigo y arroz a un volumen total de 6 dl. La masa estuvo creciendo 2x45 minutos y se horneo a la temperatura entre 230 a 240 °C durante 25 a 30 minutos. La temperatura en el pan se midio despues de que el pan se sacara del horno, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos y 20 minutos, respectivamente. Los resultados se revelan en la tabla 19 de a continuacion.
TABLA 19
Tiempo (minutos)
Horneado a 230 °C durante 25 minutos Horneado a 230 °C durante 35 minutos Horneado a 240 °C durante 30 minutos
0
97,6 °C 99,4 °C 97,6 °C
5
No hecho No hecho 86,3 °C
10
No hecho No hecho 78,0 °C
15
No hecho No hecho 68,1 °C
20
No hecho No hecho 62,7 °C
b) El pan de masa fermentada se horneo con Lactobacillus termoestable. La supervivencia de las bacterias en el pan se determino despues de 2 dfas, 3 dfas, 4 dfas, 6 dfas y 7 dfas, respectivamente. Los resultados se revelan en las tablas 20 a 25 de a continuacion.
5
10
Horneado a +230 °C durante 20 minutos (masa madre fermentada)
Tiempo (dfas)
N° de bacterias UFC/g
LB3e (arroz) LB7c (trigo)
0
1,1 x 105 1,2 x 104
5
1,1 x 104 2,1 x 105
TABLA 21
Horneado a +230°C durante 25 minutos (masa madre fermentada de arroz)
N° de bacterias UFC/g
Tiempo (dfas)
LB931 LB3e LB7c LB21
0
9 x 103 3 x 103 7 x 102 7 x 103
3
1 x 105 5 x 104 1 x 104 3 x 104
7
9 x 104 6 x 104 9 x 104 No hecho
TABLA 22
Horneado a +230 °C durante 35 minutos (masa madre fermentada de arroz)
N° de bacterias UFC/g
Tiempo (dfas)
LB931 LB3e LB7c
0
9 x 102 2 x 102 1 x 102
3
8 x 103 3 x 103 7 x 103
7
9 x 103 7 x 103 6 x 103
TABLA 23
Horneado a +240 °C durante 30 minutos de crecimiento N° de bacterias UFC/g
Masa madre fermentada de trigo Masa madre fermentada de arroz
Tiempo ^as)
LB931 L1A LB931
0
4 x 103 Crecimiento No Visible (CNV) 3 x 104
2
6 x 104 CNV 7 x 104
4
2 x 105 CNV 9 x 105
6
1 x 105 CNV 6 x 105
8
7 x 104 CNV 8 x 104
c) Se hizo pan de harina de trigo que contema la cepa LB21. Se combinaron agua templada, miel, levadura, sal, trigo y 5 ml de LB21 a UCF 1x109 en un bol mezclador grande a un volumen total de 1 litro. La UFC/ml de la masa era de 1x106. La masa se amaso durante 10 minutos hasta que se separo de las paredes del bol y estaba suave, flexible y lisa. La masa se cubrio y se dejo crecer durante 1 hora. La gran remesa se dividio en partes mas pequenas. La masa se cubrio de nuevo y se dejo crecer durante 45 minutos. El pan se horneo a 220 °C durante 20 minutos y se enfrio en un estante. La supervivencia de las bacterias en el pan se determino despues de 0 dfas y 3 dfas respectivamente. Los resultados se revelan en la tabla 24 de a continuacion.
TABLA 24
N° de bacterias UFC/g Tiempo (dfas) LB21
"0 2 x 103
3 6 x 103
10
15
20
25
30
35
Posiblemente la UFC/g podna ser mayor si el pan se pudiera enfriar mas rapido despues del horneado. d) Deteccion visual de moho en el pan, no crecimiento visual (CNV).
Se mantuvieron rebanadas de pan que conteman Lactobacillus en bolsas de plastico hermeticas. Las bolsas se revisaron cada dfa y se determinaron los crecimientos de moho. Los resultados se revelan en la tabla 25 de a continuacion.
TABLA 25
Pan N° de bacterias UFC/g dfa 15 Deteccion de moho
LB931
Pan de masa fermentada 5 x 104 CNV dfa 15
Pan de masa fermentada 5 x 104 CNV dfa 15
LB21
Pan de masa fermentada 7,6 x 104 CNV dfa 15
Pan con 5 ml de solucion bacteriana 1,2 x 103 CNV dfa 15
LB3e
Pan de masa fermentada 4 x 104 CNV dfa 15
LB7c
Pan de masa fermentada 6 x 104 CNV dfa 15
e) 3 individuos sanos consumieron pan que contema LB931, LB21, LB3e y LB7c durante diez dfas consecutivos, las cepas se pudieron recuperar a partir de muestras de heces en los 3 voluntarios ensayados. Los resultados se revelan en la tabla 26 de a continuacion.
TABLA 26
Dfa 0 Dfa 5 Dfa 10
Estudio persona 1
0 7 x 103 6 x 103
Estudio persona 2
0 2 x 102 4 x 103
Estudio persona 3
0 5 x 107 6 x 103
Ejemplo 9
a) Se hizo el estudio del caso de una nina de nueve anos de edad que fue diagnosticada con enfermedad celiaca (EC). Se le dio Lactobacillus (LB21) diariamente en una concentracion alta (1010 UFC/dfa) durante 3 meses antes de ser expuesta a gluten. Se midieron sus niveles de anticuerpo del endomisio, las transglutaminas y la IgA total antes y cada mes durante el primer ano y una vez al ano durante 6 anos. Puesto que habfa estado a una dieta restringida durante muchos anos antes del estudio no se detectaron anticuerpos antes de comenzar el estudio. Al principio se le dio una concentracion baja de gluten (0,1 g de glutenMa/kg peso corporal) pero despues de 4 meses estuvo comiendo una dieta normal. Los niveles de endomisio y transglutaminas fueron normales durante este tiempo y no experimento ningun smtoma celiaco. Se realizo una biopsia del intestino delgado cuando la chica tema 13 anos. Los resultados no mostraron tejido mucoso inflamado y sus niveles de anticuerpo fueron normales.
b) Se realizo un estudio piloto con 4 ninos que padedan de EC. Los ninos se dividieron en dos grupos. Al grupo 1 se le dio Lactobacillus (LB21) con 1010 uFc/dfa y al grupo 2 se le dio placebo. Ambos grupos se expusieron a gluten siguiendo una escala estandarizada. A los ninos se les dio 0,1 g de gluten/dfa/kg peso corporal durante 4 semanas y 0,2 g de gluten/dfa/kg peso corporal despues. Los niveles de anticuerpo del endomisio, transglutaminas e IgA total se midieron durante el estudio. Si los niveles de anticuerpo de los ninos incrementaban o si los smtomas de EC aumentaban, se realizaba una biopsia del intestino delgado. Los dos ninos en el grupo placebo llegaron a enfermar despues de 1 a 3,5 meses de estar expuestos a dieta con gluten. La biopsia mostro dano a la membrana mucosa del intestino delgado. Los ninos tambien habfan incrementado los niveles de endomisio, transglutaminas e IgA total. Los dos ninos en el grupo activo no experimentaron ningun smtoma y los niveles de endomisio, transglutaminas e IgA total eran normales. Despues de 7 meses de tratamiento activo se realizo una biopsia del intestino delgado. La biopsia mostro tejido intestinal normal.
c) Se realizo un estudio con 10 ninos que padedan de EC. A los ninos se les dio Lactobacillus (LB21) de 1010 UFC/dfa. Los ninos se expusieron a gluten siguiendo una escala estandarizada. A los ninos se les dio 0,025 g de gluten/dfa/kg peso corporal durante 2 meses y 0,05 g gluten/dfa/kg peso corporal despues. Se midieron los niveles de anticuerpo de endomisio, transglutaminas y IgA total durante el estudio. Si los smtomas de EC aumentaban, se realizaba una biopsia del intestino delgado para confirmar las lesiones de EC tfpicas. Los ninos no experimentaron ningun smtoma durante el estudio y despues de 12 meses de exposicion a gluten bajo intervencion de LB21 los ninos aun estaban sanos y libres de smtomas, y teman crecimiento normal.
5
10
15
20
25
30
Ejemplo 10 Procedimiento
Se hizo un ensayo in vitro para evaluar las caractensticas inmunomoduladoras potenciales de las cuatro cepas diferentes de Lactobacillus. Se recogio la sangre venosa de mujeres sanas y las celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) se aislaron usando el gradiente Ficoll-Paque. Los linfocitos T se activaron de forma policlonal usando mAb anti-CD3 y mAb anti-CD 28. A continuacion las CMSP y las bacterias probioticas se mezclaron en la relacion 1:1. Se usaron sobrenadantes vivos, muertos y aislados para investigar si es la propia bacteria o alguna sustancia que produce la que influye el sistema inmune. El montaje de muestra se hizo dos veces; un montaje se incubo durante 6 h y el otro montaje se incubo durante 18 h. Despues de 6 h de incubacion, se aislo el ARN total y se uso para la cuantificacion de citoquinas a niveles de ARNm usando la reaccion en cadena de la polimerasa por transcriptasa inversa cuantitativa a tiempo real. Los sobrenadantes de las muestras incubadas durante 18 h se aislaron y se usaron para la cuantificacion de los niveles de protema con matriz citometrica de microesferas (bead array citometric).
Resultados
La Figura 10 muestra la produccion de citoquinas por linfocitos T activados policlonales en presencia de las cepas de bacterias probioticas LB931, LB3, LB7 y LB21. Los datos eran de tres donantes de sangre y las lmeas verticales muestran los linfocitos T activados sin ninguna estimulacion con probioticos y actuan como control negativo. Todas las cuatro cepas muestran las mismas respuestas para las cuatro citoquinas medidas a nivel de ARNm. El mismo patron tambien se ve a niveles de protema, donde se midieron dos de las cuatro cepas. Tal como se ve en la Figura 11 tanto LB931 vivo como LB21 vivo dan las mismas respuestas de citoquina sobre los linfocitos T activados. LB931 muerto y LB21 muerto tambien se siguen uno a otro cuando se viene a incrementar los niveles de citoquina. A partir de la Figura 10 y 3 se puede ver que es el Lactobacillus vivo y el Lactobacillus muerto el que incrementa o desciende las respuestas de citoquinas de linfocitos T activados. Los sobrenadantes aislados de las cinco diferentes cepas de Lactobacillus no influenciaron en absoluto las respuestas de citoquina de los linfocitos T humanos.
El Lactobacillus no incremento los niveles de IFN-y o los niveles de IL-4 de linfocitos T en reposo notablemente como se ve en la Figura 12. Eso muestra que ninguna de las cuatro cepas de bacterias de acido lactico tiene la capacidad de influir los linfocitos T en reposo.
No se encontraron diferencias estadfsticamente significativas entre las cuatro cepas de Lactobacillus usando el ensayo de Comparacion Multiple de Tukey. Este ensayo, junto con los resultados de las respuestas de citoquina, indica que las cepas LB931, lB3, LB7, LB21 son similares.

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    REIVINDICACIONES
    1. Microorganismos de la cepa de Lactobacillus elegida entre las especies Lactobacillus plantarum LB3e y Lactobacillus plantarum LB7c, que se han depositado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen y a las que se les ha asignado los numeros de acceso 17852 y 17853 respectivamente.
  2. 2. Microorganismos de la cepa de Lactobacillus elegida entre las especies Lactobacillus plantarum LB3e y Lactobacillus plantarum LB7c segun la reivindicacion 1, caracterizados porque son capaces de sobrevivir a temperatures desde +85 °C durante mas de 25 minutos.
  3. 3. El uso de una cepa de Lactobacillus segun la reivindicacion 1 en productos alimentarios tales como pan, masa, productos de cereal, papilla de avena, gachas, muesli, granola, producto basado en cereal en polvo, pasta, semiproductos, sopas, productos precocidos, pan corriente, compota.
  4. 4. Un procedimiento para prevenir el moho en productos alimentarios, en el que al menos una cepa de Lactobacillus segun la reivindicacion 1 esta incorporada en dichos productos alimentarios.
  5. 5. Un procedimiento para prevenir el moho en productos alimentarios segun la reivindicacion 4, en el que el producto alimentario se selecciona entre pan, masa, productos de cereal, papilla de avena, gachas, muesli, granola, producto basado en cereal en polvo, pasta, semiproductos, sopas, productos precocidos, pan corriente, compota.
  6. 6. Producto alimentario tal como como pan, masa, productos de cereal, papilla de avena, gachas, muesli, granola, producto basado en cereal en polvo, pasta, semiproducto, sopas, productos precocidos, pan corriente, compota, caracterizado porque dicho producto alimentario tambien contiene una cepa de Lactobacillus viable segun la reivindicacion 1.
  7. 7. Productos de pan y masa, conteniendo tambien dichos productos de pan y masa una cepa de Lactobacillus viable elegida entre las especies Lactobacillus plantarum LB931, que se ha depositado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen y a la que se la ha asignado el numero de acceso DSM 11918, Lactobacillus rhamnosus LB21, que se ha depositado en la NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate y a la que se la ha asignado el numero de acceso NCIMB 40564, Lactobacillus plantarum LB3e y Lactobacillus plantarum LB7c, que se han depositado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, y a las que se las ha asignado el numero de acceso 17852 y 17853 respectivamente, siendo dichas cepas depositadas capaces de sobrevivir a temperaturas desde +85 °C durante mas de 25 minutos y estando dichos lactobacilos de al menos una de dichas cepas incorporados en dichos productos de pan y masa antes de un tratamiento con calor.
  8. 8. Un procedimiento para prevenir el moho en los productos de pan y masa en el que una cepa de Lactobacillus segun la reivindicacion 7 esta incorporada en dichos productos de pan y masa.
  9. 9. El uso de una cepa de Lactobacillus elegida entre las especies Lactobacillus plantarum LB931, que se ha depositado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen y a la que se la ha asignado el numero de acceso DSM 11918, Lactobacillus rhamnosus LB21, que se ha depositado en la NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate y a la que se la ha asignado el numero de acceso NCIMB 40564, Lactobacillus plantarum LB3e y Lactobacillus plantarum LB7c, que se han depositado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, y a las que se las ha asignado el numero de acceso 17852 y 17853, respectivamente, para producir un producto alimentario, en el que el producto alimentario se prepara por tratamiento con calor de un material de partida del producto alimentario usando una fuente de calor que expone dicho producto alimentario, tal como pan, masa, productos de cereal, papilla de avena, gachas, muesli, granola, producto basado en cereal en polvo, pasta, semiproducto, sopas, productos precocidos, pan corriente, compota, a una temperatura por encima de +85 °C, en el que los lactobacilos de al menos una de dichas cepas estan incorporados en dicho producto alimentario antes del tratamiento con calor.
  10. 10. Un procedimiento para prevenir el moho en los productos alimentarios, en el que al menos una cepa de Lactobacillus segun la reivindicacion 9 esta incorporada en dichos productos alimentarios.
  11. 11. El producto alimentario preparado por tratamiento con calor de un material de partida del producto alimentario usando una fuente de calor que expone dicho producto alimentario a una temperatura por encima de +85 °C caracterizado porque dicho producto alimentario tambien contiene una cepa de Lactobacillus viable elegida entre las especies de Lactobacillus plantarum LB931 (DSM11918), Lactobacillus rhamnosus LB21 (NCIMB 40564), Lactobacillus plantarum LB3e (DSM 17852) y Lactobacillus plantarum LB7c (DSM 17853) respectivamente.
  12. 12. El producto alimentario segun la reivindicacion 11, en el que la cepa de Lactobacillus viable esta presente en una cantidad por encima de 1,0 x 103 UFC/g, preferentemente por encima de 1,0x104 UFC/g y lo mas preferentemente por encima de 1,0x105 UFC/g de bacterias vivas por gramo de producto alimentario despues de tratamiento con calor.
  13. 13. Un producto alimentario segun las reivindicaciones 7, 11 o 12 que comprende la cepa Lactobacillus viable termoestable elegida entre las especies Lactobacillus plantarum y Lactobacillus rhamnosus para promover la
    inmunotolerancia en enfermedades autoinmunes tales como la enfermedad celiaca.
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