EA031179B1 - Молочнокислые бактерии, применяемые при чревной болезни - Google Patents

Молочнокислые бактерии, применяемые при чревной болезни Download PDF

Info

Publication number
EA031179B1
EA031179B1 EA201290902A EA201290902A EA031179B1 EA 031179 B1 EA031179 B1 EA 031179B1 EA 201290902 A EA201290902 A EA 201290902A EA 201290902 A EA201290902 A EA 201290902A EA 031179 B1 EA031179 B1 EA 031179B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
lactobacillus
mer peptide
cncm
peptide
Prior art date
Application number
EA201290902A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201290902A1 (ru
Inventor
Каррерас Агусти Монтсеррат
Монтсеррат Андреу Короминас
Даниэль Рамон Видаль
Сальвадор Хеновес Мартинес
Эстер Батальер Лейва
Original Assignee
Компани Жервэ Данон
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Компани Жервэ Данон filed Critical Компани Жервэ Данон
Publication of EA201290902A1 publication Critical patent/EA201290902A1/ru
Publication of EA031179B1 publication Critical patent/EA031179B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/245—Lactobacillus casei
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

Изобретение относится к применению молочнокислых бактерий, выбранных из группы, включающей виды Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp lactis и род Streptococcus, для лечения и/или профилактики чревной болезни, причем указанные бактерии продуцируют факторы элонгации белка EF-Tu или EF-G. Изобретение также относится к молочному продукту, содержащему указанные бактерии Lactobacillus и Streptococcus, и способу отбора молочнокислой бактерии для применения при лечении и/или профилактике чревной болезни.

Description

Изобретение относится к применению молочнокислых бактерий, выбранных из группы, включающей виды Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp lactis и род Streptococcus, для лечения и/или профилактики чревной болезни, причем указанные бактерии продуцируют факторы элонгации белка EF-Tu или EF-G. Изобретение также относится к молочному продукту, содержащему указанные бактерии Lactobacillus и Streptococcus, и способу отбора молочнокислой бактерии для применения при лечении и/или профилактике чревной болезни.
Область, к которой относится изобретение
Изобретение относится к молочным бактериям или стрептококкам при лечении или профилактике чревной болезни.
Уровень техники
Чревная болезнь представляет собой аутоиммунное расстройство тонкого кишечника, которое возникает у генетически предрасположенных людей всех возрастов от грудного возраста и старше. Чревная болезнь вызывается реакцией на глиадины, семейство родственных богатых пролином и глутамином белков в белке глютена, которые обнаруживаются в пшенице (и подобные белки рода Triticeae, такие как ячмень и рожь). После воздействия глиадина фермент тканевая трансглютаминаза модифицирует белок, и иммунная система индивидов, склонных к чревной болезни, реагирует и перекрестно реагирует с тканью тонкого кишечника, вызывая воспалительную реакцию. Воспаление в последующем ведет к атрофии ворсинок и препятствует всасыванию питательных веществ, включая минералы и жирорастворимые витамины. Классические симптомы чревной болезни включают вздутие живота, рвоту, диарею, потерю массы тела (или недостаточный рост у детей), анемию и усталость. Самая сильная и частая реакция иммунной системы на глиадин направлена на фрагмент а2-глиадина длиной в 33 аминокислоты (представленный в настоящем описании в виде SEQ ID NO: 1) (Shan et al., 2005 J. Proteome Res.4:1732-1741 Moron et al., 2008; Am. J. Clin. Nut 87 (2):405-14).
Распространенность клинически диагностированной чревной болезни составляет 0,05-0,27%. Однако популяционные исследования, проведенные в частях Европы, Индии, Южной Америки, Австралии и США, указывают на то, что распространенность может составлять от 0,33 до 1,06% у детей и 0,18-1,2% у взрослых. Имеются указания, что у многих людей заболевание не диагностируется, и у них имеются лишь легкие симптомы желудочно-кишечного дискомфорта.
До настоящего времени единственным известным эффективным способом лечения является не содержащий глютена рацион в течение всей жизни.
Комбинация ферментов (пропилэндопептидазы и ячменной глутаминспецифической цистеинэндопептидазы (EP-B2)), которая расщепляет предполагаемый эпитоп 33-мерного пептида а2-глиадина в двенадцатиперстной кишке, описана Siegel M. et al. (2006, Chem Biol 13 (6):649-58), Piper et al. (2004, J Pharm Exper. Therap 311:213-219) описывают применение пролилэндопептидазы для расщепления пептидов глиадина. В Международном патенте WO 2007/108763 описаны штаммы Lactobacillus plantarum и штамм Lactobacillus rhamnosus для содействия иммунотолерантности при чревной болезни или атопическом дерматите. В Международном патенте WO 2006/097415 описана смесь 8 ферментативных молочнокислых бактерий и бифидобактерий, способная расщеплять пептиды глиадинов, такие как фрагмент 6275 A-глиадина и эпитоп 33-мерного пептида, благодаря комплементарной протеолитической активности между бактериями. Печеные пищевые продукты, полученные из этих молочнокислых бактерий и бифидобактерий, могут использоваться в рационе индивида, страдающего чревной болезнью. В Международном патенте WO 03/028745 описаны штаммы молочнокислых бактерий с внутренними пептидазами, способными расщеплять экзорфин А5, 5-мерный пептид, полученный из белка глютена. Эти штаммы способны снижать концентрацию кишечных патогенных пептидов.
Краткое изложение сущности изобретения
Исследования in vitro проводили для выбора штаммов молочнокислых бактерий с пробиотическими характеристиками. Проводили скрининг большого числа штаммов, относящихся к родам Lactobacillus, Streptococcus или Bifidobacterium, для выявления в культуральном супернатанте пептидазной активности, способной расщеплять 33-мерный пептид lqlqpfpqpqlpypqpqlpypqpqlpypqpqpf (seq id no: l), который участвует в патогенезе чревной болезни.
Затем проводили скрининг первоначально выбранных штаммов для выявления из способности выживать в желудочно-кишечном тракте и устойчивости пептидазной активности супернатанта в условиях желудочно-кишечного тракта, т.е. их способности достичь и при этом сохранить пептидазную активность, расщепляющую 33-мерный пептид, в участке действия при чревной болезни, т.е. тонком кишечнике.
В последующем выбранные штаммы тестировали для выявления из способности расщеплять другие пептиды, которые, как предполагается, участвуют в патогенезе чревной болезни, а именно 20-мерный пептид из α-глиадина QQlpqpqqpqqspfqqqrpf (seq id no: 2) и 13-мерный пептид из А-глиадина, LGQQQPFPPQQPY (SEQ ID NO: 3) .
К удивлению было обнаружено, что 33-мерный пептид медленно расщеплялся в условиях, имитирующих пищеварительный тракт человека, и что появлялся продукт распада 18-мерного пептида PQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO: 4) , КОТОрЫй был ПОЛНОСТЬЮ УСТОЙЧИВЫМ ПрОТИВ Дальнейшего расщепления ферментами пищеварительного тракта человека. Эти новые данные обеспечили возможность проведения улучшенного дальнейшего выбора путем скрининга штаммов молочнокислых бактерий для выявления их способности расщеплять 18-мерный пептид.
Из большого числа штаммов, наконец, были выбраны три отдельных штамма и смесь двух штаммов. Эти штаммы устойчивы к условиям желудочно-кишечного тракта, продуцируют высокую пепти
- 1 031179 дазную активность, устойчивую в условиях желудочно-кишечного тракта, и преимущественно расщепляют 33-мерные, 20-мерные и 13-мерные пептиды, участвующие в патогенезе чревной болезни, а также расщепляют устойчивый 18-мерный пептид. Фермент, ответственный за расщепление пептидов, очищали из этих штаммов, характеризовали и секвенировали, и он был идентифицирован как белок, идентичный фактору элонгации Tu в случае Lactobacillus casei, и как фактор элонгации G в случае Streptococcus thermophilus.
Поэтому употребление этих специфических штаммов молочнокислых бактерий или обладающих пептидазной активностью ферментов, продуцируемых этими бактериями, может с успехом использоваться у индивидов, страдающих чревной болезнью, или у лиц с риском развития чревной болезни, таких как лица с семейным анамнезом чревной болезни, или индивидов с незначительными желудочнокишечными проблемами, связанными с чревной болезнью. Предпочтительно эти штаммы вводятся в свежем подвергнутом брожению продукте, предпочтительно подвергнутом брожению молочном продукте.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к применению молочнокислой бактерии, выбранной из группы, включающей виды Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus,
Lactobacillus delbrueckii subsp lactis и род Streptococcus, для лечения и/или профилактики чревной болезни у субъекта, нуждающегося в этом, где указанные молочнокислые бактерии продуцируют факторы элонгации белка EF-Tu или EF-G, которые способны расщеплять 33-мерный пептид lqlqpfpqpqlpypqpqlpypqpqlpypqpqpf (seq id no: 1), 20мерный пепТИД QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF (SEQ ID NO: 2), 13-мернЫЙ пепТИД
LGQQQPFPPQQPY (SEQ ID NO: 3) и 18-мерный пептид
PQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO: 4).
Вариант настоящего изобретения предусматривает, что расщепление указанных пептидов происходит в тонком кишечнике субъекта.
Другим вариантом заявленного изобретения является применение супернатанта культуры указанной молочнокислой бактерии для лечения и/или профилактики чревной болезни у субъекта, нуждающегося в этом.
Еще одним вариантом заявленного изобретения является указанное применение, где указанная молочнокислая бактерия выбрана из штаммов
Lactobacillus casei CNCM 1-1518,
Lactobacillus helveticus CNCM 1-4279, Lactobacillus delbrueckii subsp lactis CNCM 1-4280, Lactobacillus casei CNCM 1-4270 и Streptococcus thermophilus CNCM 1-4269.
Настоящее изобретение относится к применению смеси двух молочнокислых бактерий, выбранных Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus из группы, включающей виды bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp lactis и род streptococcus, для лечения и/или профилактики чревной болезни у субъекта, нуждающегося в этом, где указанные молочнокислые бактерии продуцируют факторы элонгации белка EF-Tu или EF-G, которые способны расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4.
Вариантом заявленного изобретения является указанное применение, где смесь бактерий содержит thermophilus CNCM 1-2776 и Lactobacillus bulgaricus CNCM IStreptococcus 2787.
Другим вариантом заявленного изобретения является указанное применение, где молочнокислую бактерию вводят субъекту в дозе по меньшей мере 1010 кое/день.
Настоящее изобретение относится к молочному продукту, содержащему штамм молочнокислой бактерии, выбранный из
Lactobacillus helveticus CNCM 1-4279, Lactobacillus delbrueckii subsp lactis CNCM 1-4280, Lactobacillus casei CNCM 1-4270, Streptococcus thermophilus CNCM 1-4269, или смесь штаммов streptococcus thermophilus CNCM 1-2776 и Lactobacillus bulgaricus cncm 1-2787, где уКазаНные штаммы продуцируют факторы элонгации белка EF-Tu или EF-G, которые способны расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, для лечения и/или профилактики чревной болезни.
Вариантом заявленного изобретения является указанный молочный продукт, представляющий собой жидкий продукт.
- 2 031179
Другим вариантом заявленного изобретения является указанный молочный продукт, представляющий собой ферментированный молочный продукт.
Еже одним вариантом заявленного изобретения является указанный молочный продукт, содержащий от 105 до 1013 кое на 1 г сухой массы.
Настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одной молочнокислой бактерии, выбранной из группы, включающей виды
Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus,
Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp lactis и род Streptococcus, где указанные молочнокислые бактерии продуцируют фактор элонгации белка EF-Tu или EF-G для расщепления 33-мерного пептида SEQ ID NO: 1, 20-мерного пептида SEQ ID NO: 2, 13-мерного пептида SEQ ID NO: 3 и 18-мерного пептида SEQ ID NO: 4, где указанные пептиды участвуют в патогенезе чревной болезни.
Настоящее изобретение относится к штамму Lactobac 11 lus casei cncm 1-4270, который продуцирует фактор элонгации белка EF-Tu, способный расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, где указанные пептиды участвуют в патогенезе чревной болезни.
Настоящее изобретение относится к штамму Lactobacillus helveticus CNCM 1-4279, к0_ торый продуцирует фактор элонгации белка EF-Tu, способный расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID nO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, где указанные пептиды участвуют в патогенезе чревной болезни.
Настоящее изобретение относится к штамму Lactobacillus delbrueckii subsp lactis CNCM 1-4280, который продуцирует фактор элонгации белка EF-Tu, способный расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, где указанные пептиды участвуют в патогенезе чревной болезни.
Настоящее изобретение относится к штамму Streptococcus thermophilus CNCM 1-277 6, который продуцирует фактор элонгации белка EF-G, способный расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, где указанные пептиды участвуют в патогенезе чревной болезни.
Настоящее
Streptococcus bulgaricus cncm 1-27 87, которые продуцируют фактор элонгации белка EF-Tu и EF-G, способные расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, для расщепления по крайней мере одного из указанных пептидов, участвующих в патогенезе чревной болезни.
Настоящее изобретение относится к способу отбора молочнокислой бактерии для применения при лечении и/или профилактике чревной болезни, включающему стадии:
a) предоставления молочнокислой бактерии, выбранной из группы, включающей виды
Lactobacillus casei, Lactobacillus изобретение относится к применению смеси thermophilus CNCM 1-2776 и Lactobacillus штаммов helveticus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp lactis и род Streptococcus
b) определения, продуцирует ли бактерия, предоставленная на стадии a), факторы элонгации белка EF-Tu или EF-G, которые способны расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, когда по меньшей мере 45% указанных пептидов гидролизируются в присутствии культурального супернатанта указанной бактерии,
c) отбора молочнокислой бактерии для ее использования при лечении и/или профилактике чревной болезни у субъекта, если определено на стадии b), что бактерия, предоставленная на стадии a), обладает способностью расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4.
Вариантом заявленного изобретения является указанный способ, где стадия b) дополнительно включает стадию определения у молочнокислой бактерии, предоставленной на стадии a), стабильной способности расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4 при pH от 4 до 6 и/или в присутствии пищеварительных ферментов, выбранных из лизоцима, пепсина, химотрипсина и трипсина.
Соответственно настоящее изобретение относится к штамму молочнокислой бактерии и/или к среде, ферментативной штаммом молочнокислой бактерии, для применения при лечении и/или профилактике чревной болезни, где указанная молочнокислая бактерия и/или среда, ферментативная штаммом молочнокислой бактерии, способны расщеплять 33-мерный пептид
LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO: 1) ,20-мерныЙ пептид
- 3 031179
QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF (SEQ ID NO: 2), 13_мерНЫЙ ПеПТИД LGQQQPFPPQQPY (SEQ ID NO: 3) и/или 18-мерный пептид pqlpypqpqlpypqpqpf (seq id no: 4), и где молочнокислая бактерия выбрана из группы, состоящей из рода Lactobacillus и Streptococcus.
В предпочтительном варианте осуществления указанные молочнокислые бактерии и/или указанная среда, ферментативная указанными молочнокислыми бактериями, способны расщеплять 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4.
Настоящее изобретение также относится к смеси двух штаммов молочнокислых бактерий и/или к среде, ферментативной смесью двух штаммов молочнокислых бактерий, для применения при лечении и/или профилактике чревной болезни, где молочнокислые бактерии и/или среда, ферментативная молочнокислыми бактериями, способны расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и/или 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, предпочтительно 13мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, и где молочнокислая бактерия выбрана из группы, состоящей из рода Lactobacillus и Streptococcus.
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей по меньшей мере один штамм, выбранный из группы, состоящей из
Lactobacillus helveticus CNCM 1-4279, L.
delbrueckii subsp lactis CNCM 1-4280, Lactobacillus easel CNCM
1-4270, Streptococcus thermophilus CNCM 1-4269 и смеси S. thermophilus CNCM 1-2776 и L. bulgaricus CNCM 1-2787.
Настоящее изобретение также относится к применению по меньшей мере одного штамма молочнокислых бактерий, выбранного из группы, состоящей из рода Lactobacillus и Streptococcus, которые продуцируют фактор элонгации белка, для расщепления 33-мерного пептида SEQ ID NO: 1, 20-мерного пептида SEQ ID NO: 2, 13-мерного пептида SEQ ID NO: 3 и/или 18-мерного пептида SEQ ID NO: 4, предпочтительно 13-мерного пептида SEQ ID NO: 3 и 18-мерного пептида SEQ ID NO: 4.
Настоящее изобретение также относится к способу выбора штамма молочнокислых бактерий для применения при лечении и/или профилактике чревной болезни, включающему стадии выбора штамма со способностью расщепления 18-мерного пептида SEQ ID NO: 4, когда по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 70% указанного пептида гидролизуется в присутствии культурального супернатанта указанного штамма.
Чревная болезнь.
Чревная болезнь иногда также именуется чревным спру, нетропическим спру, эндемическим спру, глютеновой энтеропатией, глютенчувствительной энтеропатией и непереносимостью глютена. Заболевание диагностируется врачом, как известно в данной области, и включает серологические тесты крови и обычно эндоскопию/гастроскопию и биопсию.
Чревная болезнь представляет собой расстройство тонкого кишечника, вызванное реакцией на глиадины, семейство родственных богатых пролином и глутамином белков в белке глютена, которые обнаруживаются в пшенице, ячмене и ржи. После воздействия глиадина иммунная система вызывает воспалительную реакцию, которая ведет к атрофии ворсинок, и препятствует всасыванию питательных веществ, включая минералы и жирорастворимые витамины. Пациенты с чревной болезнью часто страдают вздутием живота, рвотой, диареей, потерей массы тела (или недостаточным ростом у детей), анемией и усталостью.
Молочнокислые бактерии.
Молочнокислая бактерия, смесь молочнокислых бактерий или среда, ферментативная молочнокислыми бактериям в соответствии с настоящим изобретением, способны расщеплять пептид, как определено выше, когда по меньшей мере 45% и в порядке увеличения предпочтения по меньшей мере 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 и 90% указанного пептида гидролизуется в присутствии культурального супернатанта выбранных молочнокислых бактерий или смеси выбранных молочнокислых бактерий.
Анализ расщепления пептидов может проводиться по активности ферментного протеолиза, присутствующего в культуральном супернатанте выбранной молочнокислой бактерии, или смеси выбранных молочнокислых бактерий, полученных в культуре в логарифмической и стационарной фазе, следующим образом: анализ проводят смесью, содержащей PBS (солевой раствор с фосфатным буфером, например, 100 мМ, с pH 7,3), пептид (например, 1-2 мМ) и культуральный супернатант (например, 20-30 мкл) в течение 48 ч при 37°С; затем образец кипятят, фильтруют (например, через 0,45 мкм) и анализируют высокоэффективной жидкостной хроматографией.
Исследования in vitro проводили для выбора штаммов молочнокислых бактерий с этими свойствами. Проводили скрининг большого числа штаммов, относящихся к родам Lactobacillus, Streptococcus или Bifidobacterium, для выявления пептидазной активности в культуральном супернатанте, способной расщеплять 33-мерный пептид lqlqpfpqpqlpypqpqlpypqpqlpypqpqpf (seq id no: 1) , который участвует в патогенезе чревной болезни.
Все первоначально выбранные штаммы с этой способностью относятся к роду Lactobacillus и Streptococcus. В последующем проводили их скрининг для выявления их способности выживать в желудочно
- 4 031179 кишечном тракте и устойчивости пептидазной активности супернатанта в условиях желудочнокишечного тракта, т.е. их способности достичь и при этом сохранить пептидазную активность, расщепляющую 33-мерный пептид, в участке действия при чревной болезни, который представляет собой тонкий кишечник.
В последующем выбранные штаммы тестировали на их способность расщеплять другие пептиды, которые, как предполагают, участвуют в патогенезе чревной болезни, а именно 20-мерный пептид из аглиадина qqlpqpqqpqqspfqqqrpf (seq id no:2) и 13-мерный пептид из А-глиадина, LGQQQPFPPQQPY (SEQ ID N0: 3) .
К удивлению было обнаружено, что 33-мерный пептид медленно расщеплялся в условиях, имитирующих пищеварительный тракт человека, и что появлялся продукт расщепления 18-мерного пептида pqlpypqpqlpypqpqpf (seq id no: 4), КОТОрЫй был полностью устойчив к дальнейшему расщеплению пищеварительными ферментами человека. Эти новые данные позволили усовершенствовать дальнейший отбор путем скрининга молочнокислых бактерий для выявления их способности расщеплять 18мерный пептид.
Из большого числа штаммов, в конечном счете, были выбраны пять отдельных штаммов и смесь из двух штаммов. Эти штаммы в высшей степени расщепляют 33-мерный пептид глиадина (по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 70% указанного пептида гидролизуется в присутствии культурального супернатанта выбранного штамма молочнокислой бактерии или указанной смеси, как описано выше). Из этого выбора предпочтительна подвыборка трех отдельных штаммов и смеси двух штаммов, поскольку они имеют самую высокую резистентность к условиям в желудочно-кишечном тракте, продуцируют высокую пептидазную активность, устойчивы в условиях желудочно-кишечного тракта и расщепляют также 20-мерный и 13-мерный пептиды, участвующие в патогенезе чревной болезни, а также расщепляют резистентный 18-мерный пептид, который был образован из 33-мерного пептида.
Было обнаружено, что культуральный супернатант (ферментативная среда) следующих штаммов молочнокислых бактерий наиболее эффективен в расщеплении пептидов, участвующих в патогенезе чревной болезни:
штамм DN_114001, представляющий собой Lactobacillus casei, депонированный в соответствии с Будапештским договором в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganisms (Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов), 25 Rue du Docteur Roux, Paris) под номером I-1518 23 января 1995 г. Подробные характеристики этого штамма описаны в заявке PCT WO 96/20607;
штамм DN_114077, Lactobacillus casei, депонированный в соответствии с Будапештским договором в CNCM, под номером I-4270 16 декабря 2009 г. Этот штамм был идентифицирован как относящийся к L. casei на основании и ПЦР типирования и биохимической активности, определенной набором API 50CHL (Biomerieux, France). В соответствии с результатами определения с использованием набора Api 50CHL штамм I-4270 ферментирует следующие сахара и спирты: рибозу, галактозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, сорбозу, рамнозу (слабая реакция), маннит, сорбит, а-метил-D глюкозид, N-ацетилглюкозамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлобиозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, инулин, мелецитозу, крахмал (слабая реакция), гентиобиозу, туранозу, тагатозу, L-арабитол и глюконат;
штамм DN_1190118, Lactobacillus helveticus, депонированный в соответствии с Будапештским договором в CNCM, под номером I-4279 25 февраля 2010 г. Этот штамм был идентифицирован как относящийся к L. helveticus на основании и ПЦР типирования и биохимической активности, определенной набором API 50CHL (Biomerieux, France). В соответствии с результатами определения с использованием набора Api 50CHL штамм I-4279 ферментирует следующие сахара и спирты: галактозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, N-ацетилглюкозамин и лактозу;
штамм DN_001343, Streptococcus thermophilus, депонированный в соответствии с Будапештским договором в CNCM, под номером I-2776 24 января 2002 г. Этот штамм был идентифицирован как относящийся к S. Thermophilus на основании и ПЦР типирования и биохимической активности, определенной набором API 50CHL (Biomerieux, France). В соответствии с результатами определения с использованием набора Api 50CHL штамм I-2776 ферментирует следующие сахара и спирты: глюкозу, лактозу и сахарозу;
штамм DN_100290, Lactobacillus bulgaricus, депонированный в соответствии с Будапештским договором в CNCM, под номером I-2787 24 января 2002 г. Этот штамм был идентифицирован как относящийся к L. bulgaricus на основании и ПЦР типирования и биохимической активности, определенной набором API 50CHL (Biomerieux, France). В соответствии с результатами определения с использованием набором Api 50CHL штамм I-2787 ферментирует следующие сахара и спирты: глюкозу, фруктозу, маннозу и лактозу;
штамм DN_001546 Streptococcus thermophilus CNCM I-4269, депонированный в соответствии с Будапештским договором в CNCM, 16 декабря 2009 г. Этот штамм был идентифицирован как относящийся к S. thermophilus на основании и ПЦР типирования и биохимической активности, определенной набором API 50CHL (Biomerieux, France). В соответствии с результатами определения с использованием набора
- 5 031179
Api 50CHL штамм I-4269 ферментируют следующие сахара и спирты: глюкозу, лактозу и сахарозу; и штамм DN_1110272 Lactobacillus delbrueckii subsp lactis, депонированный в соответствии с Будапештским договором в CNCM под номером I-4280 25 февраля 2010 г. Этот штамм был идентифицирован как относящийся к L. delbrueckii subsp lactis на основании и ПЦР типирования и биохимической активности, определенной набором API 50CHL (Biomerieux, France). В соответствии с результатами определения с использованием набора Api 50CHL штамм I-4280 ферментируют следующие сахара и спирты: галактозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, N-ацетил глюкозамин, мальтозу и лактозу.
S. thermophilus CNCM I-2776 и L. bulgaricus CNCM I-2787 предпочтительно используются вместе в смеси, такой как стартовая культура для получения йогурта.
В предпочтительном варианте осуществления молочнокислая бактерия выбрана из группы, состоящей из
Lactobacillus casei,
Lactobacillus helveticusr Lactobacillus bulgaricusr
Lactobacillus delbrueckii subsp lactis и Streptococcus thermophilus .
В другом предпочтительном варианте осуществления указанный штамм молочнокислой бактерии или смесь двух штаммов выбраны из группы, состоящей из
Lactobacillus easel CNCM I1518, Lactobacillus casei CNCM 1-4270, Lactobacillus helveticus
CNCM 1-4279, Streptococcus thermophilus CNCM 1-4269, L. delbrueckii subsp lactis CNCM 1-4280 и смеси Streptococcus thermophilus CNCM 1-2776 и Lactobacillus bulgaricus CNCM I2787 .
Наиболее эффективные штаммы в условиях желудочно-кишечного тракта и поэтому предпочтительные выбираются среди
Lactobacillus casei CNCM 1-1518 (штамм DN_114001), L.
helveticus CNCM 1-4279 (штамм DN_1190118), Lactobacillus delbrueckii subsp lactis CNCM 1-4280 (штамм DN_1110272) и S. thermophilus CNCM 1-2776 (штамм DN_001343), смешанного с Lactobacillus bulgaricus CNCM 1-2787 (штамм DN 100290).
LMClllclrlrlUl U L —
Настоящее изобретение также охватывает применение упомянутых выше штаммов, но также мутантных штаммов или генетически трансформированных штаммов, полученных из любого из материнских штаммов, но все же обладающих пептидазной активностью против пептидов глютена, в целях лечения чревной болезни. Эти мутанты или генетически трансформированные штаммы могут представлять собой штаммы, в которых был(и) подвергнут(ы) мутации один или более эндогенный ген(ы) материнского штамма, например, для модификации некоторых из его метаболических свойств (например, способности ферментировать сахара, его резистентности к кислотности, его выживание для транспорта в желудочно-кишечном тракте, его последующее подкисление или продукцию его метаболитов). Они могут также представлять собой штаммы, возникающие в результате генетической трансформации материнского штамма одним или более представляющих интерес гена (генов), например, для придания указанному штамму дополнительных физиологических признаков или предоставления ему возможности экспрессировать представляющие терапевтический или вакцинный интерес белки, введение которых желательно посредством указанных штаммов.
Однако настоящее изобретение не включает штаммы Lactobacillus plantarum LB931 (DSM 11918), LB7c (DSM 17853) и LB3e (DSM 17852) и штамм Lactobacillus rhamnosus LB21 (NCIMB 40564), описанные в заявке PCT WO 2007/108763.
Пептидазная активность в культуральном супернатанте против пептидов глютена.
Пептидазная активность, которая локализовалась снаружи от клеток, была самой высокой в культурах, где клетки выращивались до середины логарифмической фазы. Это указывает на то, что пептидазная активность является частью первичного метаболизма. Пептидазная активность некоторых штаммов была высоко устойчивой (расщепление пептида по меньшей мере на 25%, предпочтительно по меньшей мере на 30%) в условиях, имитирующих желудочно-кишечный тракт человека. Пептидазная активность приводит к расщеплению lqlqpfpqpqlpypqpqlpypqpqlpypqpqpf (seq id no: 1),
QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF (SEQ ID NO: 2), LGQQQPFPPQQPY (SEQ ID N0:3) и продукта разрушения резистентного к расщеплению 18-мерного пептида pqlpypqpqlpypqpqpf (seq id no: 4), предпочтительно 13-мерного пептида SEQ ID NO: 3 и 18-мерного пептида SEQ ID NO: 4, как определено выше.
Пептидазная активность была выделена, очищена и секвенирована из штамма DN_114001, Lactobacillus casei, CNCM I-1518 и штамма DN_001343, S. thermophilus, CNCM I-2776 и к удивлению оказалось,
- 6 031179 что она представляет собой фактор элонгации. Фактор элонгации Tu в случае Lactobacillus и фактор элонгации G в случае S. thermophilus. Факторы элонгации Tu и G представляют собой ортологичные гены/белки. Факторы элонгации представляют собой белки, которые содействуют явлениям трансляционной элонгации, стадии в синтезе белка от образования первой пептидной связи до образования последней пептидной связи. Бактериальный фактор элонгации Tu может разрушать нормотермически блокированные белки. Кроме того, факторы элонгации представляют собой поверхностные белки, обладающие характеристиками фактора адгезии. Такие факторы играют роль в способности связывать муцин.
Композиция.
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей молочнокислые бактерии или смесь двух штаммов молочнокислых бактерий и/или среду, ферментативную по меньшей мере одной молочнокислой бактерией или смесью двух штаммов молочнокислых бактерий, причем молочнокислые бактерии выбраны из группы, состоящей из рода Lactobacillus и Streptococcus. Указанные молочнокислые бактерии, смесь двух штаммов молочнокислых бактерий и/или ферментативная среда, способны расщеплять 33-мерный пептид lqlqpfpqpqlpypqpqlpypqpqlpypqpqpf (seq id no: 1), 20-мерный пептид QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF (SEQ IDNO: 2), 13-МерНЫЙ пептид LGQQQPFPPQQPY (SEQ ID NO: 3) и/иЛИ 18-мерный пептид pqlpypqpqlpypqpqpf (seq id no: 4), предпочтительно 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, как определено выше.
Предпочтительно молочнокислые бактерии по настоящему изобретению со способностью расщеплять пептиды глютена используются для получения композиции, подходящей для энтерального введения.
В одном варианте осуществления композиции содержат клетки молочнокислых бактерий, как определено выше.
Предпочтительно композиция содержит по меньшей мере один штамм, выбранный из группы, состоящей из
Lactobacillus helveticus CNCM 1-4279, L. delbrueckii subsp lactis CNCM I4280, Lactobacillus casei CNCM 1-4270, Streptococcus thermophilus CNCM 1-4269 и смесь S. thermophilus CNCM 1-2776 и L. bulgaricus CNCM 1-2787, предпочтительно, Lactobacillus helveticus CNCM 1-4279, L. delbrueckii subsp lactis CNCM I4280, и смесь S. thermophilus CNCM 1-2776 и L. bulgaricus CNCM 1-2787.
Предпочтительно указанные клетки являются жизнеспособными. Альтернативно, клетки могут быть инактивированы, но активная должна происходить щадящим путем для того, чтобы в слишком высокой степени не нарушить активность ферментов. Если жизнеспособные клетки присутствуют в указанной композиции, то они предпочтительно присутствуют в количестве от 105 до 1013 колониеобразующих единиц (кое), предпочтительно по меньшей мере 106 кое, предпочтительнее по меньшей мере 107 кое, еще предпочтительнее по меньшей мере 108 кое и наиболее предпочтительно по меньшей мере 109 кое на 1 г сухой массы композиции. В случае жидкой композиции это соответствует в целом от 104 до 1012 колониеобразующих единиц (кое), предпочтительно по меньшей мере 105 кое, предпочтительнее по меньшей мере 106 кое, еще предпочтительнее по меньшей мере 107 кое и наиболее предпочтительно по меньшей мере 108 кое/мл.
Жизнеспособные клетки необязательно могут присутствовать в композиции без супернатанта, содержащего пептидазную активность. После распространения клеток в желудочно-кишечном тракте новая пептидазная активность образуется in situ. Поэтому только композиции с клетками еще обладают антиглютеновой активностью. Предпочтительно бактериальные клетки могут быть выделены и добавлены к композиции, например, в форме высушенных, замороженных или лиофилизированнных бактериальных клеток.
В одном варианте осуществления бактериальные клетки удаляются из композиции, но супернатант, содержащий пептидазную активность, присутствует в продукте. Такая композиция представляет собой предпочтительно ферментативный продукт, из которого были удалены бактериальные клетки. Подходящими способами удаления бактериальных клеток являются фильтрация или центрифугирование.
В предпочтительном варианте осуществления и клетки, и супернатант, содержащий пептидазную активность, присутствуют в композиции. Поэтому предпочтительно молочнокислые бактерии по настоящему изобретению используются для получения ферментативного продукта. Ферментативный продукт обычно имеет все внеклеточные метаболиты бактерий, продуцируемые во время закваски, включая присутствующую активность глютенпептидазы. Необязательно могут присутствовать другие штаммы молочнокислых бактерий. Ферментативный продукт может присутствовать в форме жидкости или присутствовать в форме сухого порошка, полученного сушкой ферментативной жидкости.
Предпочтительно ферментативный продукт представляет собой свежий продукт. Свежий продукт, который не был подвергнут стадиям жесткой тепловой обработки, имеет самую высокую пептидазную
- 7 031179 активность (по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 70% пептида, как определено выше, гидролизированы).
Предпочтительно ферментативный продукт представляет собой свежий продукт, предпочтительнее ферментативное молоко и/или ферментативную сыворотку. Предпочтительно питательная композиция представляет собой йогурт или ферментативное молоко в осажденной, перемешанной или питьевой форме. Предпочтительно ферментативный продукт представляет собой сыр.
Предпочтительно ферментативный продукт представляет собой ферментативный сок растения, такого как соя, злаки и/или фрукты в осажденной, перемешанной или питьевой формах.
Предпочтительно питательная композиция по настоящему изобретению представляет собой продукт для детского питания, молочную смесь для грудных детей или питательную молочную смесь для грудных детей. Предпочтительно композиция по настоящему изобретению представляет собой питательный или фармацевтический продукт, пищевую добавку или медицинский пищевой продукт.
Композиция может необязательно содержать другие штаммы молочнокислых бактерий. Эти другие штаммы бактерий могут использоваться для закваски продукта, предпочтительно молочного продукта.
Способ.
Настоящее изобретение также относится к способу выбора штаммов молочнокислых бактерий для применения при лечении и/или профилактике чревной болезни, включающему стадии выбора штаммов, способных расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и/или 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, предпочтительно 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, когда по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 70% указанных пептидов гидролизуются в присутствии культурального супернатанта указанного штамма.
В одном варианте осуществления указанного способа он дополнительно включает стадию выбора штаммов, у которых способность расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и/или 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4 является устойчивой (т.е. расщепляется более чем 25%, предпочтительно более чем 30% указанного пептида) при pH от 4 до 6, предпочтительно при pH 5 и/или устойчива (т.е. расщепляется более чем 25%, предпочтительно более чем 35% указанного пептида) в присутствии пищеварительных ферментов, выбранных из группы, состоящей из лизоцима, пепсина, химотрипсина и трипсина.
Пример 1. Скрининг супернатантов молочнокислых бактерий для выявления их способности расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1.
Были выбраны 34 штамма Lactobacillus, 10 штаммов Streptococcus и 3 штамма Bifidobacterium и оценивалась их способность продуцировать протеолитическую активность со способностью расщеплять 33-мерный пептид lqlqpfpqpqlpypqpqlpypqpqlpypqpqpf (seq id no: 1)Из а2-глиадина (который, как предполагается, ответственен за чревную болезнь).
Все включенные микроорганизмы выращивали и в общей, и в специфической среде.
Для штаммов Lactobacillus использовали общую среду MRS (20 г/л декстрозы, 10 г/л пептона, 8 г/л мясного экстракта, 5 г/л ацетата натрия, 2 г/л дикальция фосфата, 2 г/л цитрата аммония, 1 мл Твин 80, 0,2 г/л сульфата магния, 0,05 г/л сульфата марганца) и использовали специфическую среду YGBLP (10 г/л пептона, 8 г/л мясного экстракта, 3 г/л дрожжевого экстракта, 2,5 г/л монокалия сульфата, 2,5 г/л дикалия фосфата, 0,2 г/л сульфата магния, 0,05 г/л сульфата марганца, 5 г/л глюкозы, 5 г/л лактозы).
Для штамма Streptococcus использовали общую среду Elliker (5 г/л декстрозы, 20 г/л триптона, 5 г/л сахарозы, 1,5 г/л ацетата натрия, 2,5 г/л желатина, 0,5 г/л аскорбиновой кислоты, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л лактозы, 4 г/л хлорида натрия) и специфическую среду BHI (12,5 г/л твердых веществ инфузионного раствора для телячьего мозга, 5 г/л твердых веществ инфузионного раствора для бычьего сердца, 10 г/л пептона протеозы, 2 г/л глюкозы, 5 г/л хлорида натрия, 2,5 г/л динатрия фосфата).
Штаммы Bifidobacterium выращивали в общей среде, состоящей из MRS с цистеином (0,5 г/л), и в специфических средах Bifidobacterium sp (10 г/л пептона казеина, 5 г/л мясного экстракта, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л глюкозы, 1 мл Твин 80, 3 г/л дикальция фосфата и 0,5 г/л цистеина).
Выбранная температура культуры составляла для штамма Lactobacillus 25 и 37°С и для штаммов Streptococcus и Bifidobacterium 37°C. Рост проходил в аэробных и анаэробных условиях. Супернатанты, полученные после 5-минутного центрифугирования при 10000 об/мин, использовали для анализа in vitro расщепления 33-мерного пептида. Супернатанты, полученные в результате роста в общей и специфической среде, получали в культурах логарифмической и стационарной фазы для скрининга с целью выявления активности расщепления в результате первичного и вторичного метаболизмов.
Анализ расщепления 33-мерного пептида проводили по активности ферментативного протеолиза, присутствующей в культуральном супернатанте выбранных микроорганизмов. Реакцию проводили 114 мкл PBS (100 мМ, pH 7,3), 12 мкл 33-мерного пептида (1,7 мМ), который был синтезирован с использованием, и получен из GENSCRIPT (Pscataway, USA) и 24 мкл культурального супернатанта в течение 48 ч при 37°С. В последующем образцы кипятили, фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм и анализировали высокоэффективным хроматографом, оборудованным детектором из матрицы фотодиодов.
- 8 031179
Количественную оценку остаточного 33-мерного пептида проводили посредством ВЭЖХ с колонкой C18 от компании Waters. Выявление пептида проводили при 220нм и 35°С. Использованные растворители представляли собой воду, очищенную в системе mili-Q, с TFA (трифторуксусной кислотой, 0,1%) и ацетонитрил с TFA (0,1%).
Ниже в табл. 1 представлены результаты скрининга супернатантов. Оказалось, что, в частности, супернатанты штаммов, относящихся к родам Lactobacillus и Streptococcus, были способны расщеплять пептид, и что клетки, выращенные в логарифмической фазе, были более эффективны в плане расщепления пептида, чем клетки, выращенные в стационарной фазе. Кроме того, клетки, выращенные на общей среде, были в большинстве случаев лучше способны расщеплять 33-мерный пептид, чем клетки, выращенные на специфической среде.
Таблица 1
Процентная доля 33-мерного пептида lqlqpfpqpqlpypqpqlpypqpqlpypqpqpf (seq idnO: i), расщепленного культуральными супернатантами от штаммов Lactobacillus, Bifidobacterium и Streptococcus, выращенных до культуры логарифмической фазы
- 9 031179
Р02445 Bl 71,9±1,9 27,1±5,1 28,7±3,9 9,0±2,5
Н7 73,2±0,0 8,2±1,9 73,5±0,6 3,0±5,7
А8 56,4±22,3 10,3±6,6 43,1±2,9 0,7±4,1
С8 54,2±26,3 2,1±3,4 42,9±1,9 6,5±5,3
ЕЮ 62,6±1,0 27,7±3,6 0,0±3,1 27,0±4,9
В9 0,0±0,0 26,3±3,0 0,0±1,9 22,4±2,3
F8 27,4±5,4 0,0±0,2 0,0±2,3 22,7±4,5
G8 0,0±4,1 19,0±2,4 4,3±12,7 21,6±4,5
Bifidobacterium
Р02495 D1 64,2±6,9 - - -
Н1 65,9±7,4 - - -
F5 48,6±8,4 21,32±4,22 26,1±2,9 64,5±12,2
А4 32,2±7,8 23,56±8,59 2,9±23,1 1,6±14,9
G5 15,8±16,3 15,65±1,21 24,8±5,0 25,1±4,7
Streptococcus
Р02654 G1 81,1±3,5 53,4±15,3 73,7±0,4 71,8±7,5
Р02646 А7 80,9±21,2 45,2±3,2 78,6±2,5 50,4±15,6
А9 93,8±0,9 44,6±3,3 78,4±1,1 76,9±20,5
Е1 84,6±0,0 44,0±1,9 77,9±2,9 62,7±0,9
ВЗ 85,3±0,7 47,4±2,2 79,8±0,3 40,9±3,0
Р02638 Н7 87,5±2,0 49,7±2,8 62,9±0,7 86,7±3,2
F9 82,4±3,7 93,6±9,1 57,3±3,0 58,1±6,3
В10 82,9±1,2 70,4±0,3 58,5±0,9 46,0±5,4
D10 82,1±1,7 66,3±0,2 51,2±5,4 35,3±4,4
G10 76,6±3,3 83,1±1,0 59,3±0,7 49,9±1,6
Пример 2. Скрининг выбранных клеток и супернатантов молочнокислых бактерий для определения резистентности к условиям в желудочно-кишечном тракте.
Штаммы, наиболее эффективные в отношении расщепления 33-мерного пептида, штаммы Р02503 A1, P02503 A3, Р02431 C1, P02445 H7, Р02638 H7, Р02646 A9, а также смесь Р02638 Р9/Р02523 A4 были выбраны в качестве типичного йогуртового симбиоза. Они были идентифицированы на основе и ПЦР типирования и биохимической активности, определенной с использованием набора API 50CHL (Biomerieux, France).
P02503 A1 представляет собой штамм DN_114001, Lactobacillus casei, депонированный в CNCM под номером I-1518, 23 января 1995 г.
Р02431 C1 представляет собой штамм DN_1190118, Lactobacillus helveticus, депонированный в CNCM под номером I-4279, 25 февраля 2010 г.
Р02445 Н7 представляет собой штамм DN_1110272, Lactobacillus delbrueckii subsp lactis, депонированный в CNCM под номером I-4280, 25 февраля 2010 г.
Р02638 F9 представляет собой штамм DN_301343, Streptococcus thermophilus, депонированный в CNCM под номером I-2776, 24 января 2002 г.
Р02523 А4 представляет собой штамм Lactobacillus bulgaricus DN_100290, депонированный в CNCM под номером I-2787, 24 января 2002 г. Эти два штамма используются в смеси в качестве стартовой культуры для получения йогурта.
Р02503 A3 представляет собой штамм DN_114077 Lactobacillus casei, депонированный в CNCM под номером I-4270, 16 декабря 2009 г.
Р02646 А9 представляет собой штамм DN_001546 Streptococcus thermophilus, депонированный в CNCM под номером I-4269, 16 декабря 2009 г.
Тестировали резистентность этих штаммов к низкому pH и к пищеварительным ферментам. Следует выбирать штаммы, которые устойчивы к низкому pH и устойчивы к пищеварительным ферментам, поскольку такие штаммы способны выживать при прохождении через ротовую полость, желудок и кишечный тракт, что является предварительным условием для оказания эффектов против чревной болезни in vivo. He только клетки, но также и супернатанты, обладающие пептидазной активностью в отношении 33-мерного пептида, тестировали для определения их устойчивости к низкому pH и пищеварительным ферментам. Клетки выращивали в течение 17 ч и собирали центрифугированием (4000 об/мин, 5 мин) и ресуспендировали в буфере PBS. Для анализа устойчивости к pH буфер имел pH 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8. Результаты показаны в табл. 2. Показаны только результаты при pH 3 и 5, которые типичны для устойчивости к pH. Для анализа устойчивости к пищеварительным ферментам клетки ресуспендировали в буфере PBS при pH 3 (пепсин), pH 7 (химотрипсин и трипсин) и pH 6 (лизоцим). Клетки инкубировали в течение 2 ч при 37°C, кроме случая лизоцима. Когда тестировали лизоцим, то клетки инкубировали в течение 5 мин.
В случае тестирования супернатанта клетки культивировали в течение 17 ч, и клетки удаляли центрифугированием (4000 об/мин). Супернатант лиофилизировали и ресуспендировали в таких же услови
- 10 031179 ях, как описано выше для клеток.
Таблица 2
Устойчивость клеток молочнокислых бактерий к низкому pH и к присутствию пищеварительных ферментов и пептидазная активность культуральных . супернатантов
pH Пищеварительные ферменты
Штамм pH 5 рНЗ Лизоцим Пепсин Химотрипсин Трипсин
Р02503 А1 Клеткиа 100 91 100 100 100 95
Супернатант ь 34,9 42,7 36,7 63,2 47,1 56,2
Р02503 АЗ Клетки 100 100 100 26,2 42,6 24,9
Супернатант ndc nd nd nd nd nd
Р02431С1 Клетки 86 81 65,9 101 63,8 38,2
Супернатант 36,1 33,1 69,9 67,8 59,1 56,2
Р02445 Н7 Клетки 80 47 4,5 62 88,1 99,1
Супернатант 32,6 35,7 61,2 60,1 37,4 86,4
Р02638 Н7 Клетки 3 4 42,6 3,0 3,3 4,0
Супернатант nd nd nd nd nd nd
Р02646 А9 Клетки 3 3 2,0 100 4,3 52,9
Супернатант nd nd nd nd nd nd
Р02638 F9/ Клетки 100 97 29,1 66,7 82,7 100
Р02523 А4 Супернатант 39,2 39,3 85,6 55,5 54,0 81,8
a - жизнеспособность в %;
b - остаточная активность расщепления 3-мерного пептида в %; c, nd - не определялось.
Большинство выбранных клеток и супернатантов проявляли высокий процент выживания в условиях низкого pH и в присутствии пищеварительных ферментов. Что касается пищеварительных ферментов, то большинство из них были способны расщеплять 33-мерный пептид in vitro.
Пример 3. Скрининг супернатантов выбранных штаммов для выявления их способности расщеплять 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2 и 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3.
В последующем выполняли скрининг для определения способности расщеплять другие пептиды, участвующие в патогенезе чревной болезни, а именно 20-мерный и 13-мерный пептиды.
Таким же образом, как в примере 1, анализировали способность различных супернатантов (Р02503 A1, P02431 C1, Р02445 H7 и смеси Р02523 A4 - Р02638 F9) расщеплять другие пептиды, участвующие в патогенезе чревной болезни, такие как 20-мерный пептид из ос-глиадина (QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF) и 13мерный пептид из A-глиадина (lgqqqpfppqqpy) .
Было выявлено высокое расщепление обоих образцов выбранными штаммами (табл. 3). Эти данные подчеркивают важную роль протеолитической активности культуральных супернатантов выбранных штаммов в отношении не только основных пептидов, связанных с чревной болезнью, но также других пептидов, участвующих в патогенезе этого расстройства.
Таблица 3
Расщепление 13-мерного и 20-мерного пептидов в процентах выбранными штаммами
Штамм 13-мерный пептид 20-мерный пептид
P02503 Al 74,86+1,31 61,08+2,22
P02431 Cl 52,46±0,00 50,54+0,87
P02445 H7 72,05+1,93 47,06+0,36
P02523 A4 - P02638 F9 71,38+1,10 63,13+5,22
Пример 4. Идентификация других более устойчивых пептидов, потенциально участвующих в патогенезе чревной болезни.
Хотя 33-мерный пептид из α-глиадина в качестве основного фактора иммунотоксичности глютена, и ответственного за чревную болезнь, была разработана модель ферментативного переваривания in vitro пищеварительного тракта in vivo для имитации физиологических условий для контроля и подтверждения того, что пептид не расщепился в результате пищеварительного процесса при прохождении через желудочно-кишечный тракт. Концентрации пепсина, панкреатина и желчи оптимизировали с использованием экспериментального конструирования (Granato-Lorencio, et al. (2007). J. Agric. Food Chem., 55, 63876394).
Посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии было показано, что 33-мерный пептид lqlqpfpqpqlpypqpqlpypqpqlpypqpqpf полностью расщеплялся в конце процесса, что является репрезентативным для дистальной части тонкого кишечника. К удивлению, с помощью масс/масс спектрометрии (MS/MS) было идентифицировано присутствие 18-мерного пептида (pQlpypQPQLpypQFQPp) в качестве основного продукта расщепления, который был способен неизмененным проходить через пищеварительный тракт без дальнейшего расщепления.
По этой причине супернатанты были также выбраны за их способность расщеплять 18-мерный пептид. Результаты показаны в табл. 4.
- 11 031179
Таблица 4
Способность расщеплять 18-мерный пептид
Штамм Расщепление 18-мерного пептида в %
Р02503 А1 100
Р02638 F9 100
Пример 5. Очистка и характеристика протеазы, способной расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, участвующие в патогенезе чревной болезни.
Очищали протеазу, способную расщеплять in vitro 33-мерный, а также 18-мерный пептид двух выбранных штаммов из Lactobacillus (Р02503 Al) и Streptococus (P02638 F9).
л выбранных штаммов Lactobacillus Al и Streptococcus F9 выращивали без перемешивания соответственно в средах MRS с цистеином и BHI, и фермент супернатанта, обладающий протеолитической активностью, очищали до однородности преципитацией сульфатом аммония. Остаточный сульфат аммония, который был связан с белком, диализировали против буфера с низкой концентрацией соли.
Очистку протеаз A1 и F9 осуществляли анионообменной хроматографией колонкой HiPrep 16/10 Q XL в хроматографической системе AKTA Explorer. Фракции десорбировали буфером 20 мМ Трис-HCl, pH 8,5, 5 мМ CaCl2 с линейным градиентом от 0 до 1М NaCl и затем тестировали in vitro при 37°C в течение 48 ч для оценки протеазной активности в отношении 33-мерного и 18-мерного пептидов.
Фракции с протеазной активностью в отношении 33-мерного и 18-мерного пептидов дополнительно очищали хроматографией гидрофобных взаимодействий (HIC) с колонкой HiPrep 16/10 Phenyl FF (high sub), и фракции десорбировали буфером 100 мМ фосфата натрия при pH 7 с линейным градиентом от 1,5 до 0М (NH4)2SO4. Все фракции хроматографии гидрофобных взаимодействий анализировали in vitro, и те, которые имели протеазную активность, объединяли и выделяли с использованием мембраны с отсечкой молекулярной массы 10 кДа (Amicon Ultra, Millipore). 1-D нативный электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) использовали для разделения отдельных белков, и очищенные ферменты Lactobacillus Al и Streptococcus F9 секвенировали и идентифицировали как фактор элонгации Tu из Lactobacillus casei и фактор элонгации G из Streptococcus thermophilus с молекулярной массой соответственно 45,3 кДа и 76,6 кДа. При характеристике и определении кинетических параметров фактора элонгации Tu фермента из Lactobacillus Al и фактора элонгации G фермента из Streptococcus F9 было обнаружено, что их максимальная протеазная активность в отношении 18-мерного пептида наблюдалась при pH 7,3 и 37°C, и микромолярные концентрации Zn2+ вызывали ингибирование протеолиза 18-мерного пептида. Величины Km и Vmax для протеазы Lactobacillus Al составили соответственно 0,643 мг 18-мерного пептида/мл и 1,272 мг 18-мерного пептида/мл, и величины Km и Vmax для протеазы Streptococcus F9 составили соответственно 0,794 мг 18-мерного пептида/мл и 1,5022 мг 18-мерного пептида/мл.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> COMPAGNIE GERVAIS DANONE MONTSERRAT CARRERAS, Agusti ANDREU COROMINAS, Montserrat RAMON VIDAL, Daniel GENOVES MARTINEZ, Salvador BATALLER LEIVA, Esther
<120> <130> МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ПРИ ЧРЕВНОЙ БОЛЕЗНИ MJP/XRN/ah-F0191CAS241
<160> 4
<170> Patentin version 3.3
<210> <211> <212> <213> 1 33 PRT Искусственная
<220> <223> 33-мерный пептид
<400> 1
- 12 031179
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro
1 5 10 15
Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Pro
20 25 30
Phe <210>
<211>
<212>
<213>
PRT
Искусственная <220>
<223>
20-мерный пептид <400>
Gln Gln Leu
Gln Arg Pro
Pro Gln Pro
Phe
Gln
Gln
Pro
Gln
Gln
Ser
Pro
Phe
Gln
Gln <210>
<211>
<212>
<213>
PRT
Искусственная <220>
<223>
13-мерный пептид <400>
Leu Gly Gln Gln Gln Pro
Phe
Pro
Pro
Gln
Gln
Pro
Tyr
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> 18-мерный пептид
<400> 4
Pro Gln Leu Pro Tyr Pro
1 5
Pro Phe
Gln
Pro
Gln
Leu
Pro
Tyr
Pro
Gln
Pro
Gln

Claims (19)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение молочнокислой бактерии, выбранной из группы, включающей виды Lactobacillus ca- sei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp lactis и род Streptococcus, для лечения и/или профилактики чревной болезни у субъекта, нуждающегося в этом, где указанные молочнокислые бактерии продуцируют факторы элонгации белка EF-Tu или EF-G, которые способны расщеплять 33-мерный пептид lqlqpfpqpqlpypqpqlpypqpqlpypqpqpf (seq id no: l), 20-мерный пептид QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF (SEQ ID NO: 2), 13-мерный пептид
LGQQQPFPPQQPY (SEQ ID NO: 3) и 18-мерный пептид PQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO: 4).
2. Применение по п.1, где расщепление указанных пептидов происходит в тонком кишечнике субъекта.
3. Применение супернатанта культуры молочнокислой бактерии, охарактеризованной в п.1, для лечения и/или профилактики чревной болезни у субъекта, нуждающегося в этом.
4. Применение по любому из предыдущих пунктов, где указанная молочнокислая бактерия выбрана из штаммов Lactobacillus casei CNCM I-1518, Lactobacillus helveticus CNCM I-4279, Lactobacillus delbrueckii subsp lactis CNCM I-4280, Lactobacillus casei CNCM I-4270 и Streptococcus thermophilus CNCM I4269.
5. Применение смеси двух молочнокислых бактерий, выбранных из группы, включающей виды Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp lactis и род Streptococcus, для лечения и/или профилактики чревной болезни у субъекта, нуждающегося в этом, где указанные молочнокислые бактерии продуцируют факторы элонгации белка EF-Tu или EF-G, которые способны расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4.
6. Применение по п.5, где смесь бактерий содержит Streptococcus thermophilus CNCM I-2776 и Lactobacillus bulgaricus CNCM I-2787.
7. Применение по любому из пп.1-6, где молочнокислые бактерии вводят субъекту в дозе по меньшей мере 1010 КОЕ/день.
8. Молочный продукт, содержащий штамм молочнокислой бактерии, выбранный из Lactobacillus helveticus CNCM I-4279, Lactobacillus delbrueckii subsp lactis CNCM I-4280, Lactobacillus casei CNCM I4270, Streptococcus thermophilus CNCM I-4269, или смесь штаммов Streptococcus thermophilus CNCM I2776 и Lactobacillus bulgaricus CNCM I-2787, где указанные штаммы продуцируют факторы элонгации белка EF-Tu или EF-G, которые способны расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, для лечения и/или профилактики чревной болезни.
9. Молочный продукт по п.8, представляющий собой жидкий продукт.
10. Молочный продукт по любому из пп.8 и 9, представляющий собой ферментированный молочный продукт.
11. Молочный продукт по любому из пп.8-10, содержащий от 105 до 1013 КОЕ на 1 г сухой массы.
12. Применение по меньшей мере одной молочнокислой бактерии, выбранной из группы, включающей виды Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp lactis и род Streptococcus, где указанные молочнокислые бактерии продуцируют фактор элонгации белка EF-Tu или EF-G для расщепления 33-мерного пептида SEQ ID NO: 1, 20-мерного пептида SEQ ID NO: 2, 13-мерного пептида SEQ ID NO: 3 и 18-мерного пептида SEQ ID NO: 4, где указанные пептиды участвуют в патогенезе чревной болезни.
13. Штамм Lactobacillus casei CNCM I-4270, который продуцирует фактор элонгации белка EF-Tu, способный расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, где указанные пептиды участвуют в патогенезе чревной болезни.
- 13 031179
- 14 031179 мере 45% указанных пептидов гидролизируются в присутствии культурального супернатанта указанной бактерии,
с) отбор молочнокислой бактерии для ее использования при лечении и/или профилактики чревной болезни у субъекта, если определено на стадии b), что бактерия, предоставленная на стадии а), обладает способностью расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4.
14. Штамм Lactobacillus helveticus CNCM I-4279, который продуцирует фактор элонгации белка EFTu, способный расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, где указанные пептиды участвуют в патогенезе чревной болезни.
15. Штамм Lactobacillus delbrueckii subsp lactis CNCM I-4280, который продуцирует фактор элонгации белка EF-Tu, способный расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, где указанные пептиды участвуют в патогенезе чревной болезни.
16. Штамм Streptococcus thermophilus CNCM I-2776, который продуцирует фактор элонгации белка EF-G, способный расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, где указанные пептиды участвуют в патогенезе чревной болезни.
17. Применение смеси штаммов Streptococcus thermophilus CNCM I-2776 и Lactobacillus bulgaricus CNCM I-2787, которые продуцируют факторы элонгации белка EF-Tu и EF-G, способные расщеплять 33мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18мерный пептид SEQ ID NO: 4, для расщепления по крайней мере одного из указанных пептидов, участвующих в патогенезе чревной болезни.
18. Способ отбора молочнокислой бактерии для применения при лечении и/или профилактике чревной болезни, включающий стадии:
a) предоставление молочнокислой бактерии, выбранной из группы, включающей виды Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp lactis и род Streptococcus,
b) определение, продуцирует ли бактерия, предоставленная на стадии a), факторы элонгации белка EF-Tu или EF-G, которые способны расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4, когда по меньшей
19. Способ по п.18, где стадия b) дополнительно включает стадию определения у молочнокислой бактерии, предоставленной на стадии a), стабильной способности расщеплять 33-мерный пептид SEQ ID NO: 1, 20-мерный пептид SEQ ID NO: 2, 13-мерный пептид SEQ ID NO: 3 и 18-мерный пептид SEQ ID NO: 4 при pH от 4 до 6 и/или в присутствии пищеварительных ферментов, выбранных из лизоцима, пепсина, химотрипсина и трипсина.
EA201290902A 2010-03-12 2010-03-12 Молочнокислые бактерии, применяемые при чревной болезни EA031179B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB2010/000699 WO2011110884A1 (en) 2010-03-12 2010-03-12 Lactic acid bacteria for coeliac disease

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201290902A1 EA201290902A1 (ru) 2013-04-30
EA031179B1 true EA031179B1 (ru) 2018-11-30

Family

ID=42983265

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201290902A EA031179B1 (ru) 2010-03-12 2010-03-12 Молочнокислые бактерии, применяемые при чревной болезни

Country Status (7)

Country Link
US (2) US20130121976A1 (ru)
EP (1) EP2545160B1 (ru)
CN (1) CN103097513B (ru)
BR (1) BR112012023028B1 (ru)
EA (1) EA031179B1 (ru)
ES (1) ES2691301T3 (ru)
WO (1) WO2011110884A1 (ru)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MY171851A (en) 2011-06-20 2019-11-04 Heinz Co Brands H J Llc Probiotic compositions and methods
US10245300B2 (en) * 2012-06-18 2019-04-02 H.J. Heinz Company Brands Llc Gluten-related disorders
WO2014044281A1 (en) 2012-09-19 2014-03-27 Rigshospitalet Inhibition of a 33-mer gliadin peptide for treatment of diabetes
RU2015132368A (ru) * 2013-02-19 2017-03-27 Данон, С.А. Функциональные пептиды для расстройств, связанных с ожирением
PL2994150T3 (pl) 2013-05-10 2019-09-30 H.J. Heinz Company Brands Llc Probiotyki i sposoby zastosowania
WO2015177366A1 (en) * 2014-05-23 2015-11-26 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) New strain of lactobacillus casei with ability to degrade the immunotoxic peptide from gluten
FI127483B (en) 2014-06-11 2018-07-13 Gut Guide Oy Microbial marker for celiac disease and related product
MX2017013974A (es) * 2015-05-07 2018-03-07 Gervais Danone Sa Fabricacion de productos lacteos fermentados concentrados.
IT201900014550A1 (it) * 2019-08-09 2021-02-09 Abiogen Pharma Spa Uso di colecalciferolo come agente attivo nel trattamento della celiachia
BR112022012571A2 (pt) 2019-12-23 2022-09-06 Evonik Operations Gmbh Processo para identificar consórcios de cepas probióticas adequadas para degradação de glúten
CN112056496A (zh) * 2020-09-09 2020-12-11 中国农业大学 一种利用乳酸菌降低面团麸质蛋白含量的方法
CN114657091B (zh) * 2022-03-03 2023-08-11 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种弯曲菌增菌培养液及其制备方法、应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2809312B1 (fr) * 2000-05-25 2002-07-12 Gervais Danone Sa Utilisation de l. casei dans des compositions immunostimulantes
US7320788B2 (en) * 2002-02-14 2008-01-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enzyme treatment of foodstuffs for Celiac Sprue
WO2006097949A1 (en) * 2005-03-16 2006-09-21 Actial Farmacêutica, Lda. Mixture of at least 6 species of lactic acid bacteria and/or bifidobacteria in the manufacture of sourdough
ITMI20051910A1 (it) * 2005-10-11 2007-04-12 Anidral Srl Metodo per la preparazione di colture batteriche probiotiche anallergiche e relativo impiego
ES2619185T3 (es) * 2006-03-17 2017-06-23 Probi Aktiebolag Cepas de Lactobacillus termoestables
EP2065048A1 (en) * 2007-11-30 2009-06-03 Institut Pasteur Use of a L. casei strain, for the preparation of a composition for inhibiting mast cell activation
FR2937252B1 (fr) * 2008-10-17 2011-05-20 Pf Medicament Association d'un extrait de sureau et d'une souche de l. paracasei.
MY147929A (en) * 2009-03-13 2013-02-15 Chan Yap Kee Camera flash reflector assembly

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DI CAGNO RAFAELLA ET AL: "Sourdough bread made from wheat and nontoxic flours and started with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients.", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 70, no. 2, 1 February 2004 (2004-02-01), US, pages 1088 - 1096, XP002461845, ISSN: 0099-2240, DOI: 10.1128/AEM.70.2.1088-1096.2004 *
DI CAGNO RAFFAELLA, ET AL: "Proteolysis by sourdough lactic acid bacteria: Effects on wheat flour protein fractions and gliadin peptides involved in human cereal intolerance", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 68, no. 2, 1 February 2002 (2002-02-01), US, pages 623 - 633, XP002607419, ISSN: 0099-2240, DOI: 10.1128/AEM.68.2.623-633.2002 *
Fiori M.S.: "Role of lab peptidases in the hydrolysis of antigenic gliadins and gliadin-like fragment deriving from the 33-mer peptide", 14th Workshop on the Developments in the Italian PhD Research on Food Science Technology and Biotechnology September 2009 (2009-09), XP002607418, Retrieved from the Internet:URL:http://www.consorziouno.it/consorzi ouno/export/sites/default/Workshop/Contributi/ IIIAnno/Fiori.pdf [retrieved on 2010-10-25] the whole document *
GEREZ C L, FONT DE VALDEZ G, ROLLAN G C: "Functionality of lactic acid bacteria peptidase activities in the hydrolysis of gliadin-like fragments", LETTERS IN APPLIED MICROBIOLOGY, WILEY-BLACKWELL PUBLISHING LTD., GB, vol. 47, no. 5, 1 November 2008 (2008-11-01), GB, pages 427 - 432, XP002607421, ISSN: 0266-8254, DOI: 10.1111/J.1472-765X.2008.02448.X *
GOBBETTI, M. GIUSEPPE RIZZELLO, C. DI CAGNO, R. DE ANGELIS, M.: "Sourdough lactobacilli and celiac disease", FOOD MICROBIOLOGY., ACADEMIC PRESS LTD, LONDON., GB, vol. 24, no. 2, 25 September 2006 (2006-09-25), GB, pages 187 - 196, XP005874591, ISSN: 0740-0020, DOI: 10.1016/j.fm.2006.07.014 *
GRANATO DOMINIQUE, ET AL: "Cell surface-associated elongation factor Tu mediates the attachment of Lactobacillus johnsonii NCC533 (La1) to human intestinal cells and mucins", INFECTION AND IMMUNITY, vol. 72, no. 4, 1 April 2004 (2004-04-01), pages 2160 - 2169, XP002607423, ISSN: 0019-9567 *
LAPARRA J M, ET AL: "Bifidobacteria Inhibit the Inflammatory Response Induced by Gliadins in Intestinal Epithelial Cells via modifications of Toxic Peptide Generation During Digestion", JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY, A.R. LISS, vol. 109, no. 4, 5 January 2010 (2010-01-05), pages 801 - 807, XP002607422, ISSN: 0730-2312, DOI: 10.1002/JCB.22459 *
MAMONE, G. FERRANTI, P. MELCK, D. TAFURO, F. LONGOBARDO, L. CHIANESE, L. ADDEO, F.: "Susceptibility to transglutaminase of gliadin peptides predicted by a mass spectrometry-based assay", FEBS LETTERS., ELSEVIER, AMSTERDAM., NL, vol. 562, no. 1-3, 26 March 2004 (2004-03-26), NL, pages 177 - 182, XP004829576, ISSN: 0014-5793, DOI: 10.1016/S0014-5793(04)00231-5 *
RIZZELLO CARLO G, ET AL: "Highly efficient gluten degradation by lactobacilli and fungal proteases during food processing: New perspectives for celiac disease", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 73, no. 14, 1 July 2007 (2007-07-01), US, pages 4499 - 4507, XP002607417, ISSN: 0099-2240, DOI: 10.1128/AEM.00260-07 *
ROLLAN G, ET AL: "Proteolytic activity and reduction of gliadin-like fractions by sourdough lactobacilli", JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY., WILEY-BLACKWELL PUBLISHING LTD., GB, vol. 99, no. 6, 1 January 2005 (2005-01-01), GB, pages 1495 - 1502, XP002607420, ISSN: 1364-5072, DOI: 10.1111/J.1365-2672.2005.02730.X *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2545160B1 (en) 2018-07-18
BR112012023028A2 (pt) 2017-02-07
WO2011110884A1 (en) 2011-09-15
CN103097513B (zh) 2018-01-30
US20170145379A1 (en) 2017-05-25
EA201290902A1 (ru) 2013-04-30
EP2545160A1 (en) 2013-01-16
US10603342B2 (en) 2020-03-31
US20130121976A1 (en) 2013-05-16
BR112012023028B1 (pt) 2020-12-08
CN103097513A (zh) 2013-05-08
ES2691301T3 (es) 2018-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10603342B2 (en) Lactic acid bacteria for coeliac disease
US11130938B2 (en) Compositions comprising live probiotic bacterial cultures of Lactobacillus, Bifidobacterium, Lactococcus, Streptococcus, or Staphylococcus
Sashihara et al. An analysis of the effectiveness of heat-killed lactic acid bacteria in alleviating allergic diseases
CN101983237B (zh) 改善与谷蛋白摄入相关之病症个体健康状况的微生物
KR101950187B1 (ko) 건강상의 이익을 갖는 다중 박테리아 제조물: 항산화 효과, 콜레스테롤 농도의 감소, 항염증 면역조절 효과 및 안지오텐신-전환 효소를 저해하는 생물활성 펩타이드의 방출
US7498162B2 (en) Lactic acid bacteria capable of reducing an individual&#39;s tendency to develop allergic reactions
AU2002220561A1 (en) Lactic acid bacteria capable of reducing an individual&#39;s tendency to develop allergic reactions
Matar et al. β-casomorphin 4 from milk fermented by a mutant of Lactobacillus helveticus
Tzvetkova et al. Hydrolysis of major dairy proteins by lactic acid bacteria from Bulgarian yogurts
CN105733983A (zh) 分离的微生物菌株格氏乳杆菌mcc2 dsm 23882及其用途
US7662371B2 (en) Composition for lowering the concentration of intestinal pathogenic peptides
Nur et al. Isolation of lactic acid bacteria as a potential probiotic in dangke, a traditional food from Enrekang, Indonesia
Yang et al. Isolation of probiotic piliated lactobacillus rhamnosus strains from human fecal microbiota using SPaA antiserum-based colony immunoblotting
Dubná et al. Growth of bifidobacteria in a fermented wheat germ medium
Ng Enhancement of macrophage cytokine production by cell-free fractions of fermented milk
Ng KWOK-YU NG

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM