DE2930859C2 - Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzymen oder Mikroorganismen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzymen oder MikroorganismenInfo
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Description
3 4
und dann das organische Lösungsmittel zu entfernen, tung Streptomyces, wie S. olivochromogenus, S. kitaza-
um in dieser Weise die die Enzyme oder Mikroorganis- waensis, S. archidaceus, S. garyphalus, S. lavendulae, S.
men enthaltenden Eisstückchen in der hochmolekularen 5 roseochromogenus, S. griseus, S. bikiniensis, S. mashu-
Es hat sich gezeigt, daß man die Enzyme oder Mikro- erythraeus, S. alboniger, S. chrysomallus, S. noursei, S.
Organismen durch Einschließen in Eisstückchen vor der hachijoensis, S. venezuelae, S. phaeochromogenus var.
Immobilisierung während langer Zeitdauern in einem chloromyceticus, S. thioluteus und S. cellubflavus; und
stabilen Zustand halten kann, selbst wenn sie in einem io der Gattung Fusarium, wie F. liniorganischen
Lösungsmittel gehandhabt werden, so daß Die Mikroorganismen werden in Kulturmedien gees
möglich ist, diese Eisstückchen ohne weiteres in der züchtet und dann in lebendem Zustand verwendet Der
hochmolekularen Substanz einzuschließen. Ausdruck »lebender Zustand« bedeutet, daß der Mikro-
zyme verwenden, die man aus Tier- oder Pflanzengewe- is sitzt, wobei die Feststellung, ob er in lebendem Zustand
ben erhalten hat, oder die von Mikroorganismen gebil- oder nicht vorliegt, dadurch festgestellt wird, daß man
del worden sind. Diese Enzyme können in gereinigter die Mikroorganismen in eine Umgebung einbringt, die
oder ungereinigter Form verwendet werden; beispiels- für das Wachstum der Mikroorganismen geeignet ist
weise in Form von Homogenisaten von enzymhaltigen Die für das Wachstum der Mikroorganismen feeeignete
findungsgemä$«n Verfahren eingesetzten besonderen Mikroorganismus ab und wird experimentell ermittelt
Enzyme sind für die Erfindung nicht kritisch. Sie schiie- Die bei dem erfindungsgernäßen Verfahren einge-
Enzyme sind für die Erfindung nicht kritisch. Sie schiie- Die bei dem erfindungsgernäßen Verfahren einge-
ßen jedoch beispielsweise Oxidoreduktasen, wie Aiko- setzten Eisstücke, Eismassen oder Eisklumpen, die En-
hol-dehydrogenase, Glucose-oxidase, Katalase, Chole- zyme oder Mikroorganismen enthalten, sind Eisstück-
sterin-oxidase oder Uricase; Transfasern, wie Aspartat- 25 chen, die in ihrem Inneren Enzyme oder Mikroorganis-
transcarbamytase, Hexokinase oder Ribonuclease; Hy- men enthalten und die dadurch gebildet worden sind,
drolasen, wie Λ-Amylase, ^Amyktse, Gluco-Amylase, daß man eine wäßrige Lösung, die die Enzyme oder
^-Galactosidase, Invertase, Lipase, Urease, Pepsin, Mikroorganismen enthält, in einer tiefgekühlten Atmo-
amidase: Abspaltenzyme, wie Asparaginsäure-decar- 30 gekühltes Gas oder eine gekühlte Flüssigkeit sein, wo-
boxylase. Aldolase, Citronensäure-lyase, Fumarase oder bei man vorzugsweise ein gekühltes flüssiges Kühlmedi-
re-synthetase oder Glutathinn-syntetase, ein. stigungspunkt nicht höher als 0° C
bilisicrenden Mikroorganismen können in Schimmelpil- nol. Äthanol, Aceton, Äthylacetat Methylendichlorid,
ze. Hefen, Bakterien, Strahlenpilze and Fungi imperfects Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthyläther, Tetrah-
eingeteilt werden, wenngleich die Art des Mikroorga- ydrofuran, Toluol, η-Hexan, Petroläther, flüssiger Stick-
nismus nicht kritisch ist stoff und flüssiger Sauerstoff. Man kühlt diese Substan-
der Gattung Rhizopus, wie R. nigricans und R. japoni- 45 zu kühlen.
cus; der Gattung Monascus, wie M. major, M. anka und Wenn das flüssige Kühlmedium dazu verwendet wird,
M. rubiginosus; der Gattung Saccharomyces, wie S. ce- eine Enzyme oder Mikroorganismen enthaltende wäßrirevisiae.
S. rouxii und S. ludwigii; der Gattung Schizo- ge Lösung zu gefrieren, kann man die wäßrige Lösung
saccharomyces, wie S. pombe; der Gattung Hansenula, in einen Behälter oder dergleichen einbringen, um sie
wie H. miso: der Gattung Pichia, wie P. membranaefa- 50. indirekt zu gefrieren oder man kann sie zum Zwecke des
cicns und P. glabrate; der Gattung Candida, wie C utilis; Gefrierens direkt in das flüssige Kühlmedium eintragen,
der Gattung Pseudomonas, wie P. ovalis, P. stutzen, P. Wenn die Lösung direkt in dem Kühlmedium gefroren
dentrificans. P. aeruginosa, P. gravolens und P. fluoeres- v, ird, ist es erwünscht, die Kühltemperatur des Kühlmecens;
der Gattung Escherichia, wie E. coli; der Gattung diums möglichst niedrig zu halten und weiterhin die
Aerobacter. wie A. aerogenes; der Gattung Corynebac- 55 wäßrige Lösung mit Hilfe einer Zerstäubungseinrichtermm,
wie C. glutamicus, C. acetophilum und C. hydro- tung oder dergleichen in kleine Wassertröpfchen umzucarbcclastus;
der Gattung Bacillus, wie B. subtilis, B. wandeln, die schnell gefrieren, um in dieser Weise die
megüterium. B. brevis, B. coagulans. B. licheniformis;der Deaktivierung der Enzyme oder das Absterben der Mi-Gattung
Brevibacterium, wie B. flavum und B. thiogeni- kroorganismen möglichst niedrig zu halten. Wenn die
talis; der Gattung Microbacterium, wie M. ammoniaphi- 60 Enzyme oder Mikroorganismen erst einmal in den Eislum;
der Gattung Serratia, wie S, marcescens; der Gat- Stückchen eingeschlossen sind, sind sie stabil, selbst
tung Alcaligenes, wie A. marshallii; der Gattung Acet- wenn man sie bei einer Temperatur unterhalb des
obactcr, wie A. aceti, A. melanogenum und A. suboxyd- Schmelzpunkts des Eises in verschiedenen organischen
ans: der Gattung Nitrosomonas, wie N. eurpaea und N. Lösungsmitteln stehenläßt.
monocella; der Gattung Nitrosococcus, wie N. nitrosus; 65 Man kann verschiedenartige Substanzen, die dazu
der Gattung Nitrosopia, wie N. breviensis und N. an- dienen, die Enzyme oder Mikroorganismen zu schützen,
tarctica; der Gattung Nitrosocystis, wie N. javanesis; zusammen mit den Enzymen oder Mikroorganismen
der Gattung Thiobacillus, wie T. dentrificans; der Gat- verwenden. Beispiele hierfür sind wasserlösliche hoch-
molekulare Substanzen, wie Polyvinylalkohol, Polyäthylenglykol.
Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylamid, PoIyacrylsäuresalze,
Polyäthylenimin, Carboxymethylcellulose, Proteine, Nucleinsäuren oder Polysaccharide;
mehrwertige Alkohole, wie Glycerin oder Äthylenglykol;
organische polare Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid. Dimethylformamid, Dymethylacetamid oder Dioxan;
Oligosaccharide wie Saccharose, Lactose oder Maltose; Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure;
oiganische Säuren, wie «-Ketoglutarsäure
oder Apfelsäure; und Metallsalze, wie die Salze von Magnesium, Mangan, Kobalt oder Calcium. Man kann
irgendwelche Substanzen dieser Art zusammen mit den Enzymen oder Mikroorganismen in die Eisstückchen
einbringen, indem man sie zunächst zu einer wäßrigen Lösung zusetzt, die die Enzyme oder Mikroorganismen
enthält, und dann die wäßrige Lösung schnell in einer gekühlten Atmosphäre einfriert.
Die wasserunlöslichen hochmolekularen Substanzen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet
werden, sind Polyacrylnitril, Polyacrylsäureester, Polymethacrylsäureester,
Polystyrol, Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid oder Polycarbonat oder Coporymere, die
aus den Monomeren dieser Homopolymeren aufgebaut sind, oder Celluloseacetat oder Äthylcellulose.
Das organische Lösungsmittel, das die oben definierten wasserunlöslichen hochmolekularen Substanzen bei
einer Temperatur von nicht mehr als 00C in einer Menge von 0,1 Gew.-% oder mehr löst, wird aus der Gruppe
von organischen Lösungsmitteln ausgewählt, die bei einer Temperatur von nicht oberhalb 00C in flüssiger
Form vorliegen. Beispiele für hierfür geeignete organische Lösungsmittel sind Methanol, Äthanol, Propanol,
Aceton, Methyläthylketon, Äthylacetat, Methylendichlorid.
Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Diäthyläther. Toluol, Xylol, η-Hexan, Petroläther, Tetrahydrofuran,
Cydohexan, N,Nf-Dimethylformamid, ^-Butyrolacton
und Acetonitril. Man löst die wasserunlösliche hochmolekulare Substanz in einem solchen organischen Lösungsmittel
und verwendet sie unter Kühlen auf eine Temperatur von nicht oberhalb 00C.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das organische Lösungsmittel entfernt, wodurch die Eisstückchen,
die die Enzyme oder Mikroorganismen enthalten, von der wasserunlöslichen hochmolekularen Substanz
eingeschlossen werden. Das Verfahren besteht darin, daß man die Eisstückchen in Form einer Suspension bei
einer Temperatur von nicht oberhalb 00C in einem organischen
Lösungsmittel dispergiert, in dem die wasserunlösliche hochmolekulare Substanz gelöst ist, und dann
das organische Lösungsmittel entfernt, was zur Folge hat, daß d<e wasserunlösliche hochmolekulare Substanz
auf den Eisstückchen abgeschieden wird, wodurch die Eisstückchen von der wasserunlöslichen hochmolekularen
Substanz eingeschlossen werden. Wenn die die Enzyme oder Mikroorganismen enthaltenden Eisstückchen
in einem organischen Lösungsmittel, in dem die wasserunlösliche hochmolekulare Substanz gelöst ist,
dispergiert werden sollen, kann man einen zusätzlichen Schritt durchführen, der darin besteht, die wasserunlösliche
hochmolekulare Substanz in einem organischen Lösungsmittel zu lösen und dann die Eisstückchen, die
getrennt hergestellt worden sind, zuzugeben, worauf man schnell rührt, um in dieser Weise die Eisstückchen
in suspendierter Form zu dispergieren. Alternativ kann man eine Maßnahme anschließen, die darin besteht, direkt
eine wäßrige LöffJig, die ein Enzym oder einen
Mikroorganismus enthält, in Form von kleinsten Wassertröpfchen in dem organischen Lösungsmittel zu dispergieren,
das abgekühlt ist und die wasserunlösliche hochmolekulare Substanz in gelöster Form enthält, un
in dieser Weise die Dispersion schnell unter Bildung von Eismassen zu gefrieren, die die Enzyme oder Mikroorganismen
enthalten. Um die Eismassen homogen in dem organischen Lösungsmittel zu dispergieren, verwendet
man Eismassen oder Eisstückchen, die einen Teilchendurchmesser von nicht mehr als 1 mm aufweisen, da der
ίο Effekt um so größer ist, je geringer die Teilchengröße
der Eisstückchen ist
Um die einmal dispergierten Eisstückchen in stabilem
Zustand in dem organischen Lösungsmittel zu halten, kann man beim Dispergieren der Eisstückchen gieichzeitig
eine geeignete Menge eines Nicht-Lösungsmittels für die wasserunlösliche hochmolekulare Substanz zusetzen.
Insbesondere, wenn sich die Dichte der Eisstüekchen von der Dichte des organischem Lösungsmittels, in
dem die wasserunlösliche hochmolekulare Substanz gelöst ist, unterscheidet, trennen sich die bereits dispergierten
Eisstückchen von dem orga ->chen Lösungsmittel,
wenn man das Rohren unterbricht.'Jm dies zu vermeiden,
kann man ein Nicht-Lösungsmittel zusetzen, wodurch die Eisstückchen stabil in dem organischen Lösungsmittel
dispergiert werden können. Die Zugabe eines Nicht-Lösungsmittels für die wasserunlösliche
hochmolekulare Substanz zusammen mit den Eisstückchen wird vorzugsweise in der Weise durchgeführt daß
man die Eisstückchen zunächst in dem Nicht-Lösungsmittel für die wasserunlösliche hochmolekulare Substanz
aufschlämmt und anschließend die gebildete Aufschlämmung unter heftigem Rühren in das organische
Lösungsmittel einträgt in dem die wasserunlösliche hochmolekulare Substanz gelöst ist In diesem Fall werden
die Eisstückchen zusammen mit dem Nicht-Lösungsmittel
in dem die wasserlösliche hochmolekulare Substanz enthaltenden organischen Lösungsmittel dispergiert
Demzufolge wird die wasserunlösliche hochmolekulare Substanz um die Eisstückchen hei um koaguliert
oder niedergeschlagen, und es wird der Zustand erreicht in dem die koagulierte wasserunlösliche hochmolekulare
Substanz halb in dem überschüssigen organischen Lösungsmittel gelöst ist Als Ergebnis davon
können die Eisstückchen stabil in dem die wasserunlösliehe
hochmolekulare Substanz enthaltenden organischen Lösungsmittel dispergiert werden. Um diese Verfahrensweise
noch wirksamer durchzuführen, ist es weiterhin möglich, in die Eisstückchen eine wasserlösliche
hochmolekulare Substanz, wie Polyvinylalkohol oder
so Polyäthylenglykol, oder einen mehrwertigen Alkohol,
wie Glycerin oder Kthylenglykol, einzubringen. Das zur
Steigerung der Dispergierbarkeit der Eisstückchen verwendete Nicht-Lösungsmittel wird aus jenen Lösungs-TiiLjlr.
ausgewählt die die wasserunlösliche hochmolekulare Substanz nicht lösen, die bei einer Temperatur
von nicht oberhaio 00C flüssig sind und die Jem organischen
Lösungsmittel mischbar sind, in dem die wasserunlösliche hochmolekulare Substanz gelöst ist
Um die eingeschlossenen Eisstückchen aus der die wasserunlösliche hochmolekulare Substanz enthaltenden Lösung, in der die Eisstückchen dispergiert sind, zu gewinnen, kann man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampfen, oder man kann eine anders Methode anwenden, die darin besteht die wasserunlösliehe hochmolekuhre Substanz auszufällen oder zu koagulieren.
Um die eingeschlossenen Eisstückchen aus der die wasserunlösliche hochmolekulare Substanz enthaltenden Lösung, in der die Eisstückchen dispergiert sind, zu gewinnen, kann man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampfen, oder man kann eine anders Methode anwenden, die darin besteht die wasserunlösliehe hochmolekuhre Substanz auszufällen oder zu koagulieren.
Die Enzyme oder Mikroorganismen sind dann, wenn sie in den Eisstückchen eingeschlossen sind, selbst in
Gegenwart des organischen Lösungsmittels stabil.
Wenn das Eis schmilzt, kann das organische Lösungsmittel
jedoch eine Deaktivierung der Enzyme oder eine Abtötung der Mikroorganismen bewirken. Daher ist es
bevorzugt, das organische Lösungsmittel von der einschließenden Substanz zu entfernen, bevor die Eisstückchen
schmelzen. Die Entfernung des organischen Lösungsmittels wird beispielsweise durch Verdampfen unter
vermindertem Druck erreicht
Die eingeschlossenen Eisstückchen, von denen das organische Lösungsmittel entfernt worden ist, werden zur
Aufbewahrung gefroren und vor ihrer Verwendung geschmolzen, worauf sie als immobilisierte Enzyme oder
immobilisierte Mikroorganismen verwendet werden können. Man kann die eingeschlossenen Eisstückchen
auch durch Sublimieren des Eises gefriertrocknen, um das Material in eine für die Aufbewahrung und den
Transport geeignete Form zu bringen. Das Gefriertrocknen wird unter Verwendung einer Vakuumgefriertrocknungsvorrichtung
bewirkt
Mit der vorliegenden Erfindung wird somit ein völlig neues Verfahren zur Herstellung von immobilisierten
Enzymen oder Mikroorganismen geschaffen, das u.a. darin besteht die Enzyme oder Mikroorganismen in
Eisstückchen einzuschließen, um die Deaktivierung der Enzyme oder die Abtötung der Mikroorganismen zu
verhindern, die sonst durch das organische Lösungsmittel bewirkt würde und die Enzyme oder Mikroorganismen
in einem organischen Lösungsmittel in einer wasserunlöslichen hochmolekularen Substanz einzuschließen.
Da es mit den herkömmlichen Verfahren nicht möglich ist dieses Einschließen der Enzyme oder Mikroorganismen
zu bewirken und sie gleichzeitig in dem organischen Lösungsmittel zu stabilisieren, leiden die
herkömmlichen Verfahren an den oben diskutierten verschiedenen Nachteilen, die mit der vorliegenden Erfindung
überwunden werden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es fernerhin, verschiedenartige wasserunlösliche
hochmolekulare Substanzen einzusetzen, die in großem Umfang in technischem Maßstab verwendet
werden und immobilisierte Enzyme mit stabiler Enzymaktivität oder immobilisierte Mikroorganismen in lebensfähigem
Zustand zu bilden. Weiterhin können die mit Hilfe des ertindungsgemäßen Verfahrens gebildeten
immobilisierten Enzyme oder immobilisierten Mikroorganismen in Form von Kugelchen, Pulvern, Fasern, Stäben,
Folien etc. gebildet werden und können in großem Umfang als Katalysator für die Herstellung der verschiedenartigsten
chemischen Substanzen verwendet werden. Man kann sie auch zur Abwasserbehandlung
oder für Analysf\zwecke einsetzen. Weiterhin kann
man im Fall von immobilisierten Mikroorganismen, bei denen die Mikroorganismen in einem lebensfähigen Zustand
eingeschlossen sind, diese Materialien bei Reaktionen anwenden, bei denen man eine Selbstregenerierung
bewirken kar.u indem man sie in einem Kulturmedium verwendet
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Man suspendiert Schimmelpilz-Glucoamylase in entmineralisiertem
Wasser und trennt die unlöslichen Materialien mit einem Filterpapier ab, wodurch man ein
Filirat mit einem Proteingehalt von 32 mg/ml erhält Man löst Glycerin in einer Menge von 5,0 Gew.-% in
dem Filtrat und sprüht die Lösung in Form von feinen Tröpfchen in η-Hexan ein, das mit Trockeneis auf eine
Temperatur von -75°C abgekühlt worden ist. In dieser
Weise werden die Tröpfchen schnell zu kleinen Glucoamylase enthaltenden Eisstückchen gefroren. Die Eis-
s Stückchen werden schnell durch Absaugen über einem Büchner-Trichter abgetrennt, worauf man 55 g der Eisstückchen
in 70 ml einer Lösungsmittelmischung aus n-Hexan und Methylendichlorid (mit einem Mischungsverhältnis
von n- Hexan zu Methylendichlorid von 2 :1
ίο (Volumen/Volumen), die auf —50°C abgekühlt worden
ist) aufschlämmt. Diese Aufschlämmung gibt man nach und nach unter heftigem Rühren zu 1000 g Methylenchlorid,
das auf -15° C abgekühlt ist und in dem l,0Gew.-% Cellulosetriacetat gelöst ist. wodurch die
is Eisstückchen dispergiert werden. Man läßt die Dispersion
in Form von Flüssigkeitströpfchen auf einem auf -50° C abgekühlten Toluolhad absitzen, wodurch das
Cellulosetriacetat koaguliert. Dann entfernt die in dem kopagulierten Material enthaltenen organischen Lösungsmittel,
wie Toluol, unter vermindertem Druck und gefriertrocknet den Rückstand anschließend während
eines Tages, so daß man Cellulosetriacetatteilchen erhält, in denen Glucoamylase eingeschlossen ist.
Man klassiert die Teilchen und wäscht 1,0 g der Teilchen mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1,0 mm mit einer 0,1 m-Essigsäure-Pufferiösung (mit einem pH-Wert von 4,5) über Nacht unter Entlüftung bei vermindertem Druck. Dann gibt man 150 ml einer 0,1 m-Essigsäure-Pufferlösung (mit einem pH-Wert von 4,5), die 5Gew.-% Maltose enthält, zu und schüttelt die Mischung zum Zwecke der Hydrolyse der Maltose bei 40° C. Man bestimmt die als Hydrolyseprodukt gebildete, in der Reaktionsmischung enthaltene Glucose mit einem Glucosereagens. wobei sich zeigt, daß nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde 271Og Glucose gebildet worden sind. Die eingeschlossene Glucoamylase zeigt somit eine Aktivitätsbeibehaltung in Bezug auf nicht eingeschlossene Glucoatnylase νοη 15,8%.
Man klassiert die Teilchen und wäscht 1,0 g der Teilchen mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1,0 mm mit einer 0,1 m-Essigsäure-Pufferiösung (mit einem pH-Wert von 4,5) über Nacht unter Entlüftung bei vermindertem Druck. Dann gibt man 150 ml einer 0,1 m-Essigsäure-Pufferlösung (mit einem pH-Wert von 4,5), die 5Gew.-% Maltose enthält, zu und schüttelt die Mischung zum Zwecke der Hydrolyse der Maltose bei 40° C. Man bestimmt die als Hydrolyseprodukt gebildete, in der Reaktionsmischung enthaltene Glucose mit einem Glucosereagens. wobei sich zeigt, daß nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde 271Og Glucose gebildet worden sind. Die eingeschlossene Glucoamylase zeigt somit eine Aktivitätsbeibehaltung in Bezug auf nicht eingeschlossene Glucoatnylase νοη 15,8%.
Man bereitet das ausgefällte Material nach der Verfahrensweise von Beispiel 1. Dann entfernt man das das
koagulierte Material imprägnierende Toluol durch Extraktion mit auf -50° C gekühltem Petroläther, worauf
man diesen durch Verdampfen unter vermindertem Druck abzieht, so daß man Eisstückchen erhält die in
ausgefälltes Cellulosetriacetat eingeschlossen sind. Man läßt das Material in einem bei etwa 5° C gehaltenen
so Kühlschrank stehen, um die Eisstückchen zu schmelzen, wobei man Teilchen erhält, in denen kleine W^ssertröpfchen
eingeschlossen sind, die Glucoamylase enthalten.
Die Teilchen werden klassiert um Teilchen mit einem Durchmesser von 03 bis 1,0 mm auszusieben. Diese Teilchen (1,0 g, Trockengewicht 0,15 g) werden gewaschen und anch der in Beispiel 1 beschriebenen Weise hinsichtlich ihrer Aktivität untersucht. Es zeigt sich, daß im Verlauf der einstündigen Reaktion 746 mg Glucose gebildet werden. Die eingeschlossene Glucoamylase zeigt eine Aktivitätsbeibehaltung in bezug auf die nicht eingeschlossene Glucoamylase von 32,7%.
Die Teilchen werden klassiert um Teilchen mit einem Durchmesser von 03 bis 1,0 mm auszusieben. Diese Teilchen (1,0 g, Trockengewicht 0,15 g) werden gewaschen und anch der in Beispiel 1 beschriebenen Weise hinsichtlich ihrer Aktivität untersucht. Es zeigt sich, daß im Verlauf der einstündigen Reaktion 746 mg Glucose gebildet werden. Die eingeschlossene Glucoamylase zeigt eine Aktivitätsbeibehaltung in bezug auf die nicht eingeschlossene Glucoamylase von 32,7%.
Man dispergiert giucoamyiasehakige Eisstückchen,
die man nach der in Beispiel 1 angegebenen Verfahrensweise gebildet hat in der Verfahrensweise von Beispiel
t in Methylendichlorid. in dem Cellulosetriacetat gelöst ist. Man vergießt die Dispersion auf einer gekühlten
Glasplatte zu einer dünnen Schicht. Dann verdampft man das Methylendichlorid nach und nach unter vermindertem
Druck, worauf man die Schicht über Nacht gefriertrocknet, so daß man eine Cellulosetriacetatfolie
erhält, in die Glucoamylase eingeschlossen ist. Die Folie wird Λΐ kleinen quadratischen Stückchen mit einer Kantenlänge
von 0,5 mm zerschnitten, worauf man 0,5 g der Schnittprodukts wäscht, wie es in Beispiel 1 beschrieben
ist. Die Messung der Aktivität dieses Ma'irials nach der
Verfahrensweise von Beispiel t zeigt, daß im Verlaufe der einstündigen Reaktion 978 mg Glucose gebildet
werden. Die Rechnung zeigt, daß die eingeschlossene Glucoamylase eine Aktivitätsbeibehaltung in bezug auf
die nicht eingeschlossene Glucoamylase von 15,7% aufweist.
Man wiederholt die Maßnahmen des Beispiels 2, verwendet jedoch anstelle von Glucoamylase Invertase,
Catalase, /?-Galactosidase bzw. Urease. Man erhält teilchenförmiges
Cellulosetriacetat, das jeweils Invertase, Catalase, /?-Galactosidase bzw. Urease enthält Die teilchenförmigen
Produkte werden klassiert, um Teilchen mit einem Durchmesser von 0.5 bis 1.0 mm auszusieben.
Dann wäscht man jeweils 1,0 g (Naßgewicht) der teilchenförmigen Substanz mit entmineralisiertem Wasser
und ermittelt die Aktivität der gewaschenen Substanz nac'·. der weiter unten angegebenen Methode.
Invertase
Nach dem Waschen bringt man die eingeschlossene Invertase in 150 ml einer 0,1 m-Essigsäure-Pufferlösung
(mit einem pH-Wert von 4,5) ein, die 5,0 Gew.-% Saccharose
enthält, worauf man die Reaktion während 1 Stunde unter Schütteln bei 40° C ablaufen läßt Man
bestimmt die gebildete Glucose mit dem Glucostat-Reagens. Dk Einheit der Aktivität wird als die Menge
des Materials festgelegt, die dazu ausreicht, 1 μΜοΙ Saccharose
pro Minute bei 40° C und einem pH-Wert von 4,5 zu zersetzen.
30
Catalase
45
Nach dem Waschen bringt man die eingeschlossene Catalase in 100 ml einer 0,05 m-Phosphorsäure-Pufferlösung
(mit einem pH-Wert von 7.0) ein, die 40 ml Wasserstoffperoxid enthält und bewirkt die Reaktion bei
25°C. Man bestimmt die Zersetzungsgeschwindigkeit des Wasserstoffperoxids durch Messen der Geschwindigkeit
der Abnahme der Extinktion bei 240 mum mit Hilfe eines UV-Spektrophotometers, wobei man die
Messungen alle 2 Minuten vornimmt Eine Einheit ist als die Menge definiert, die dazu αικΓβϊεηΐ,Ι,ΟμΜΌΙ Wasserstoffperoxid
pro Minute bei 25° C und einem pH-Wert von 7,0 zu zersetzen.
Glucostat-Reagens. Eine Einheit ist als die Menge definiert,
die dazu ausreicht, 1 μΜοΙ Lactose pro Minute bei 400C und einem pH-Wert von 5,2 zu zersetzen.
Urease
Nach dem Waschen bringt man die eingeschlossene Urease in 150 ml einer 0,5 m-Phosphorsäure-Puffcrlösung
(mit einem pH-Wert von 7,0) ein, der 3,0 GcW1-1Vi)
Harnstoff enthält, worauf man die Reaktion während 10 Minuten bei 25°C ablaufen läßt Man bestimmt das gebildete
Ammoniak mit Nessler-Reagens. Eine Einheit ist als die Menge definiert, die dazu ausreicht, 1 μΜοΙ
Harnstoff pro Minute bei 25°C und einem pH-Wert von
is 7,0 zu zersetzen.
In der nachstehenden Tabelle I ist die Aktivität pro Gramm (Trockengewicht) der Invertase, Catalase, ft-Galactosidase
und Urease, die jeweils in Cellulosetriacetat eingeschlossen sind, ebenso wie die Aktivitätsbcibehaltung
des eingeschlossenen Enzyms in bezug auf die Aktivität des nicht eingeschlossenen Enzyms, angegeben.
25 Beispiel
Nr.
Nr.
Eingeschlossenes
Enzym
Enzym
(Einheiten/g) beibchaltung O)
Invertase
Catalase
^-Galactosidase
Urease
Catalase
^-Galactosidase
Urease
310,7
710.0
1592
1693
710.0
1592
1693
35.9
25,0
30^
29.0
25,0
30^
29.0
^-Galactosidase
Nach dem Waschen bringt man die eingeschlossene /9-Gaiactosidase in 150 ml einer 0,1 m-Phosphorsäure-Pufferlösung
mit einem pH-Wert von 52) ein. die 5,0 Gew.-% Lactose enthält worauf man die Reaktion
während 1 Stunde bei 40° C unter Schütteln der Lösung bewirkt Man bestimmt die gebildete Glucose mit dem
60 Man schlämmt etwa 30 g Glucoamylase enthaltende Eisstückchen, die man nach der Verfahrensweise von
Beispiel 1 erhalten hat, in 50 ml einer auf -50° C abgekühlten Lösungsmittelmischung aus n-Hcxan und Methylendichlorid
(mit einem Mischungsverhältnis von n-Hexan : Methylendichlorid von 1 :2 (Volumen/Volumen)
auf. Dann gibt man die Aufschlämmung langsam unter heftigem Rühren zu 400 mg auf -10° C abgekühltem
Methylendichlorid, das Z5 Gew.-% Polymethylmethacrylat
in gelöster Form enthält, um die Eisstückchen zu dispergieren. Man läßt die Dispersion in Form von
Tröpfchen in auf — 50°C abgekühltem η-Hexan absinken, um in dieser Weise das Polymethylmethacrylat auszufällen.
Die das ausgefällte Material imprägnierenden organischen Lösungsmittel werden unter vermindertem
Druck abgezogen, worauf man das Material während eines Tages gefriertrocknet, um Polymethylmethacrylatteilchen
zu erhalten, die Glucoamylase eingeschlossen enthalten. Die Teilchen werden klassiert um Teilchen
mit einer Teilchengröße von 0,5 bis 1,0 mm auszusieben. Dann wäscht man 1,0 g der Teilchen in der in
Beispiel 1 beschriebenen Weise und bestimmt deren Aktivität nach der Methode, die in Beispiel 1 angegeben ist.
Es zeigt sich, daß bei der während 1 Stunde durchgeführten Reaktion 712 mg Glucose gebildet werden. Die
eingeschlossene Glucoamylase zeigt eine Aktivitätsbcibehaltung in bezug auf nicht eingeschlossene Glucoamylase
von 9,5%.
11
Beispiel 9
Beispiel 9
Mun schlämmt etwa 30 g glucoamylasehaltige Eisstückchen,
die man nach der Verfahrensweise von Beispiel I gebildet hat, in 50 ml einer auf —45°C abgekühlten
Lösungsmittelmischung aus N1N'- Dimethylformamid und Methanol (Mischungsve-hältnis von Ν,Ν'-Dimethylformamid
: Methanol=4 :.' (Volumen/Volumen)) auf. Dam, gibt man die Aufschlämmung nach und
nach unter heftigem Rühren zu 700 g N,N'-Dimethylformamid, das auf -100C abgekühlt ist und t,0Gew.-%
eines Acrylnitril/Vinylacetat-Copolymeren (Acrylnitril/ Vinylacetat-Gewichtsverhältnis-91 :9) gelöst enthält,
um die Eisstückchen zu dispergieren. Dann vergießt man die Dispersion in Form einer dünnen Schicht auf
eine gekühlte Glasplatte, die man dann in ein auf - 60° C
abgekühltes Methanolbad taucht, um das Copolymere auszufällen. Die in dem Copolymeren noch enthaltenen
Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck entfern' worauf man das Cono!vmere während eines c*anzen
Tages gefriertrocknet, um ein folienartiges Copolymeres zu bilden, in das Glucoamylase eingeschlossen ist
Das folienartige Copolymere wird zu quadratischen Stückchen mit einer Seitenlänge von 04 mm zerschnitten,
worauf 1,0 g des zerschnittenen Produkts Ober Nacht unter Entlüftung bei vermindertem Druck in entmincralisiertem
Wasser gewaschen werden. Dann ermittc · man die Aktivität nach der Verfahrensweise von
Beispiel 1. Es zeigt sich, daß nach der einstündigen Reaktion 1420 mg Glucose gebildet worden sind. Die eingeschlossene
Glucoamylase zeigt im Vergleich zu der nicht eingeschlossenen Glucoamylase eine Aktivitätsbcibehaltung
von 18,7%.
Man wiederholt die Verfahrensweise von Beispiel 9 mit dem Unterschied, daß man anstelle von Glucoamylase
Invertase und anstelle des Acrylnitril/Vinylacetat-Copolymeren
ein Acrylnitril/Styrol-Copolymeres (Acrylnitril/Styrol-Gewichtsverhältnis=29:71l) verwendet.
In dieser Weise erhält man eine Copolymerfolie, die Invertase eingeschlossen enthält Die Folie wird
zu 0,5-mm-Quadraten zerschnitten, worauf man 1,0 g des zerschnittenen Produkts über Nacht in entmineralisiertem
Wasser wäscht, wobei man unter vermindertem Druck entlüftet Dann bestimmt man die Aktivität nach
der in Beispiel 4 angegebenen Verfahrensweise. Es zeigt
sich, daß sich im Verlaufe der einstündigen Reaktion 187! mg Glucose gebildet haben. Somit zeigt die eingeschlossene
Invertase im Vergleich zu nicht eingeschlossener Invertase eine Aktivitätsbeibehaltung von 15,1%.
Man inokuliert Corynebacterium glutamicum in einem Kulturmedium (mit einem Anfangs-pH-Wert von
7,0), das 4,5 Gew.-% Glucose, 0,5 Gew.-% Harnstoff, 0,5
Gew.-% (NH4J2SO4, 0,1 Gew.-% Hefeextrakt, 0,05
Gew.-% KH2PO4,0,05 Gew.-% K2HPO4,0,025 Gew.-%
MgSO4 - 7 H2O, 0,001 Gew.-% FeSO4 · 7 H2O, 0,0008
Gew.-% MnSO4 - H20,10 μΐ Biotin pro Liter des Kulturmediums
und 25 Tropfen Sojabohnenöl pro Liter des Kulturmediums enthält, und züchtet das Material während
24 Stunden bei 300C unter Schütteln. Dann versetzt
man die Kulturbrühe mit 5,0Gew.-% Glycerin, 3,0Gew.-% Saccharose und i,0Gew.-% Nstrium-L-giutamat
Man versprüht die Mischung in Form von kleinen Tröpfchen in η-Hexan, das man mit Trockeneis
auf —75° C abgekühlt hat, um das Material schnell zu gefrieren, wobei iich Eisstückchen bilden, die Corynebakterium
glutamicum enthalten. Die Eisstückchen werden schnell auf einem Büchner-Trichter gesammelt,
worauf man 30 g der Eisstückchen in 40 ml einer auf -500C abgekühlten .Lösungsmittelmischung aus n-Hexan
und Methylendichlorid (Mischungsverhältnis von n-Hexan : Methylendichlorid = 1:1 (Volumen/Volumen))
aufschlämmt. Man gibt die Aufschlämmung langsam unter heftigem Rühren zu 500 g auf - 100C abgekühltem
Methylendichlorid, das 0,5 Gew.-% Polymethylmethacrylat und 1,5 Gew.-% Cellulosetriacetat in gelöstem
Zustand enthält, um in dieser Weise die Eisstückchen zu
t5 dispergieren. Dann läßt man die Dispersion sich in Form von Flüssigkeitströpfchen in einem auf -500C abgekühlten
n-Hexanbad abkühlen, wodurch man die Ko agulation des Materials bewirkt.
Die in dem koagulieren Material eingeschlossenen organischen Lösungsmittel entfernt man unter vermindertem Druck, worauf man den Rückstand während eines ganzen Tages gefriertrocknet unter Bildung einer Trockensubstanz, die Corynebakterium glutamicum eingeschlossen enthält. Das in der trockenen Substanz eingeschlossene Corynebakterium glutamicum lebt unmittelbar nach dem Gefriertrocknen und sogar nach der Aufbewahrung im Vakuum während eines Monats bei 100C, was durch die in der nachfolgenden Weise durchgeführte Untersuchung festgestellt wird.
Die in dem koagulieren Material eingeschlossenen organischen Lösungsmittel entfernt man unter vermindertem Druck, worauf man den Rückstand während eines ganzen Tages gefriertrocknet unter Bildung einer Trockensubstanz, die Corynebakterium glutamicum eingeschlossen enthält. Das in der trockenen Substanz eingeschlossene Corynebakterium glutamicum lebt unmittelbar nach dem Gefriertrocknen und sogar nach der Aufbewahrung im Vakuum während eines Monats bei 100C, was durch die in der nachfolgenden Weise durchgeführte Untersuchung festgestellt wird.
Man zerschneidet 1,0 g der trockenen Substanz fein und suspendiert das Material in 100 ml sterilem Wasser.
Dann schüttelt man die Suspension während etwa 30 Minuten bei einer Temperatur von 100C, um die Zellen
freizusetzen. Man gießt 1 ml der Zellenlösung in 10 ml des oben erwähnten Kulturmediums ein, das zuvor sterilisiert
worden ist Dann züchtet man das Material unter Schütteln, wobei festzustellen ist, daß das Wachstum
der Mikroorganismen in beiden Fällen zu beobachten ist, nämlich in der trockenen Substanz unmittelbar nach
dem Gefriertrocknen und in der trockenen Substanz, die während etwa eines Monats nach dem Gefriertrocknen
bei 100C im Vakuum aufbewahrt worein ist. Die
gezüchteten Mikroorganismen werden mikroskopisch mit nicht eingeschlossenem Corynebacterium glutamicum
verglichen, wobei sich zeigt, daß die Mikroorganismen identisch sind. Hierdurch zeigt sich, daß das in der
Trockensubstanz eingeschlossene Corynebacterium glutamicum in lebensfähigem Zustand vorliegt.
Beispiel 12
Man impft ein Kulturmedium (mit einem AnfangspH-Wert von 7,0). das 10 Gew.-% Glucose, 03 Gew.-%
Harnstoff, 0,1 Gew.-% K2HPO4, 0,05Gew.-%
MgSO4 · 7 H2O. 2 Gew.-% CaCO3 und 0,7 Gew.-%
Maisquellwasser enthält mit Serratia marcescens und züchtet den Mikroorganismus unter Schütteln während
24 Stunden bei 300C Nach der Zugabe von 5,0 Gew.-% Glycerin, l,0Gew.-% Polyäthylenglykol, 2,0Gew.-%
Dextran und 03 Gew.-% Natrium-L-glutamat versprüht
man die Kulturbrühe in Form von feinen Tröpfchen in η-Hexan, das mit Trockeneis auf —75° C abgekühlt
worden ist, um die Tropfen schnell zu gefrieren. In dieser Weise erhält man Eisstückchen, die Serratia marcescens
enthalten. Man schlämmt etwa 30 g der Eisstückchen in der im Beispiel 11 beschriebenen Lösungsmittelmischung
aus η-Hexan und Methylendichlorid auf und gibt die Aufschlämmung nach und nach unter hefti-
gem führen zu 500 g auf -10° C abgekühltem Methylendichlorid,
das 0,5Gew.-% Polycarbonat und 1,5 Gew.-% Cellulosetriacetat in gelöstem Zustand enthält,
um i:> dieser Weise die Eisstückchen zu dispergieren. Dann tropft man die Dispersion in Form von Tröpfchen
in ein auf -500C abgekühltes n-Hexaw-Bad ein,
um in dieser Weise die polymere Substanz auszufällen. Die in der ausgefällten Substanz enthaltenen organischen
Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck entfernt, worauf man den Rückstand während
eines ganzen Tages gefriertrocknet, um eine Trockensubstanz zu bilden, die Serratia marcescens in eingeschlossenem
Zustand enthält
Die Bestätigung der Lebensfähigkeit des in der Trokkensubstpnz
eingeschlossenen Mikroorganismus Serratia marcescens wird nach der Verfahrensweise von Beispiel
11 bestätigt. Es zeigt sich, daß der in der Trockensubstanz
eingeschlossene Mikroorganismus Serratia mcrcescens in lebensfähigem Zustand vorliegt.
Beispiel 13
Man impft ein Kulturmedium (mit einem AnfangspH-Wert von 7,0), das l,0Gew.-% Fleischextrakt,
l,0Gew.-% Pepton, 0,25Gew.-% Glucose und
0,5 Gew.-% Natriumchlorid enthält, mit Escherichia coli an und züchtet den Mikroorganismus während 24 Stunden
unter Schütteln bei 30° C. Nach dem Einbringen von 5,0 Gew.-% Glucose, 5,0 Gew.-% Serumalbumin,
3,0 Gew.-% Polyäthylenglyko' und 4,0 Gew.-% Glycerin sprüht man die Kulturbrühe in Form von kleinen
Tröpfchen in η-Hexan, das man mit Trockeneis auf -750C abgekühlt hat, um das Material schnell zu gefrieren.
In dieser Weise werden Eisstückchen gebildet, die Escherichia coli enthalten. Man dispergiert etwa
10 g der Eisstückchen in 100 ml bei - 100C gehaltenem
N,N'-Dimethylformamid,das 1,5 Gew.-% eines Acrylnitril/Vinylacetat-Copolymeren
(mit einem Acrylnitril/Vinylacetat-Gewichtsverhältnis
von 91 :9) in gelöstem Zustand enthält, worauf man die Dispersion auf eine
gekühlte Glasplatte gießt Die Glasplatte mit der aufgegossenen Dispersion wird weiter auf eine Temperatur
von etwa -500C abgekühlt und dann in ein bei einer Temperatur von -5O0C gehaltenes Methanolbad getaucht,
um in dieser Weise das Copolymere auszufällen. Die das ausgefällte Copolymere imprägnierenden organischen
Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck entfernt, worauf man den Rückstand während
eines ganzen Tages gefriertrocknet so daß man ein folienartiges Copolymeres erhält, das Escherichia coli in
eingeschlossenem Zustand enthält
Die Lebensfähigkeit des in dem folienartigen Copolymeren eingeschlossenen Mikroorganismus' Escherichia
coli wird nach der Verfahrensweise von Beispiel 11 untersucht wobei sich zeigt daß der in dem folienartigen
Copolymeren eingeschlossene Mikroorganismus Escherichia coli in lebensfähigem Zustand vorliegt
Beispiel 14
Man beimpft ein Kulturmedium (mit einem AnfangspH-Wert von 6,0), das 035 Gew.-°/o Pepton, 03 Gew.-%
Hefeextrakt 03 Gew.-°/o Malzextrakt 1,0 Gew.-% Glucose, 0,2 Gew.-o/o KH2PO4, 0,1 Gew.-% (NH4J2SO4 und
0,01 Gew.-% MgSO4 - 7 H2O enthält mit Saccharomyces
cerevisiae und züchtet den Mikroorganismus während 48 Stunden unter Schütteln bei 30° C. Dann bringt
man 5,0Gew.-% Glycerin, 3,0Gew.-% Pepton und
2,OGew.-°/o Dimethylsulfoxid in die Kulturbrühe Hn, worauf man Eisstückchen, die Saccharomyces cerevisiae
enthalten, nach der Verfahrensweise von Beispiel 11 bildet. Man schlämmt etwa 30 g der Eisstückchen in
50 ml einer auf -500C abgekühlten Lösungsmittelmischung
aus n-Hexan und Methylendichlorid (mit einem Mischungsverhältnis von η-Hexan zu Methylendichlorid
von 1 :1 (Volumen/Volumen)) auf. Die Aufschlämmung gibt man nach und nach unter heftigem Rühren zu
ίο 500 g auf -10°C abgekühltem Methylendichlorid, du
2,5 Gew.-% Cellulosetriacetat in gelöstem Zustand enthält, um die Eisstückchen zu dispergieren. Dann tropft
man die Dispersion in Form von Tröpfchen in ein auf — 500C gehaltenes Toluolbad ein, wobei man ausgefäll-
U- te Cellulosetriacetatteilchen erhält Die die ausgefällten
Teilchen imprägnierenden organischen Lösungsmittel entfernt man unter vermindertem Druck, worauf man
den Rückstand während eines ganzen Tages gefriertrocknet, um trockene Cellulosetriacetatteilchen zu er-
die ^*
o/ichorc!»vces
nem Zustand enthalten. Die Lebensfähigkeit des in die trockenen Teilchen eingeschlossenen Saccharomyces
cervisiae wird nach der Verfahrensweise von Beispiel 11
bestätigt.
Man beimpft ein Kulturmedium (mit einem AnfangspH-Wert von 5,5), das 2,0 Gew.-% Lactose, 1,0 Gew.-%
Glucose, 6,0 Gew.-% Maisquellwasser, 03 Gew.-% NaNO3, 0,05Gew.-% KH2PO4, 0,0125 Gew.-%
MgSO4 · 7 H2O und 0,5 Gew.-% CaCO3 enthält, mit Penicillum
chrysogenum und züchtet den Mikroorganismus während 3 Tagen bei 25° C Dann bringt man
5,0 Gew.-% Glycerin, 5,0 Gew.-% Natrium-L-glutamat und 3,0 Gew.-% Honig in die Kulturbrühe ein, worauf
man Penicillum chrysogenum enthaltende Eisstückchen nach der Verfahrensweise von Beispiel 11 bildet Man
dispergiert etwa 10 g der Eisstückchen in N,N'-Dimethylformamid, das ein Acrylnitril/Vinylacetat-Copolymeres
in gelöstem Zustand enthält, worauf man das Copolymere in Methanol ausfällt wie es in Beispiel 13
beschrieben ist Die in dem ausgefällten Copolymeren eingeschlossenen organischen Lösungsmittel1 werden
unter vermindertem Druck entfernt worauf man den Rückstand während eines ganzen Tages gefricrirocknet
wobei man eine Copolymerfolie erhält die eingeschlossenes Penicillium chrysogenum enthält.
eingeschlossenen Penicillium chrysogenum nach der Verfahrensweise von Beispiel 11, wobei sich zeigt, daß
der Mikroorganismus in lebensfähigem Zustand in dem trockenen Produkt eingeschlossen ist
Man beimpft ein Kulturmedium (mit einem AnfangspH-Wert von 7,0), das 0,5 Gew.-% Glucose, 0,5 Gew.-%
lösliche Stärke, 0,05 Gew.-% L-Asparagin, 0,05 Gew.-% K2HPO4, 0,05 Gew.-% MgSO4 · 7 H2O, 0,05 Gew.-%
KCl, 0,001 Gew.-% FeSO4 · 7 H2O und 0,05 Gew.-%
Hefeextrakt enthält mit Streptomyces griseus und züchtet den Pilz während 48 Stunden unter Schütteln
bei 27°C. Dann bringt man 5,0Gew.-°/o Glycerin, 5,0Gew.-% Serumalbumin und 1,0Gew.-% Polyäthylenglykol
in die Kulturbrühe ein und bildet Streptomyces griseus enthaltende Eisstückchen nach der Verfahrensweise
von Beispiel 11. Dann dispergiert man etwa
15
30 g der Eisstückchen nach der Verfahrensweise von Beispiel 14 in Methylendichlorid, in dem Cellulosetriacetat
gelöst ist. worauf man das Cellulosetriacetat nach der Verfahrensweise von Beispiel 14 koaguliert. Die in
der koagulierten Substanz eingeschlossenen organi- 5 sehen Lösungsmittel werden unter vermindertem
Druck entfernt worauf man den Stückstand während eines ganzen Tages gefriertrocknet, so daß man trockene
Cellulosetriacetatteilchen erhält, die eingeschlossenen
Streptomyces grioseus enthalten. 10
Die Lebensfähigkeit des in den trockenen Teilchen eingeschlossenen Streptomyces griseus wird nach der
Verfahrensweise von Beispiel 11 untersucht, wobei sich
zeigt daß der Mikroorganismus in lebensfähigem Zustnnd
in den trockenen Teilchen eingeschlossen ist 15
20
25
30
35
40 j
45
50
55
60
65
Claims (1)
1 2
Bekannte Beispiele für das Einschlußverfahren umPatentanspruch:
fassen ein Verfahren, das darin besteht, ein wasserlösliches
Monomers (wie Acrylamid. Vinylpyrrolidon, Hy-
Verfahren zur Herstellung von immobilisierten droxyäthylacrylat oder ein Salz der Acrylsäure), eine
Enzymen oder Mikroorganismen, dadurch ge- 5 wasserlösliche hochmolekulare Substanz (wie Polyvikennzeiehnet.
daß man Eisstückchen mit ei- nylalkohol odet Polyacrylamid) oder ein wasserlösliches
nem Durchmesser von höchstens 1 mm, die ein En- Vernetzungsmittel (wie N,N'-Methylenbis(acrylamid))
zym oder einen lebenden Mikroorganismus enthal- zusammen mit Enzymen oder Mikroorganismen in
ten, in einem organischen Lösungsmittel, in dem Wasser zu lösen und die Polymerisation durch die Anmindestens
0,1 Gew.-% einer hochmolekularen Sub- 10 wendung von Polymerisationskatalysatoren, wie Kalistanz
aus der Celluloseacetat, Athylcellulose, Poly- umpersulfat, oder unter Einwirkung einer Strahlung,
acrylnitril Polyacrylsäureester, Polymethacrylsäu- wie ^-Strahlung, ablaufen zu lassen. Dieses Verfahren
reester. Polystyrol, Polyvinylacetat Polyvinylchlorid, führt gleichzeitig zu einer vernetzten Struktur, wodurch
Polycarbonat und Copolymere aus den diese Homo- die Enzyme oder Mikroorganismen in dem gebildeten
polymere bildenden Monomeren umfassenden 15 wasserunlöslichen Gel mit hohem Molekulargewicht
Gruppe bei 0° C oder darunter gelöst ist, dispergiert eingeschlossen werden. Ein anderes Einschlußverfahren
und dann das organische Lösungsmittel entfernt besteht darin, eine die Enzyme oder Mikroorganismen
enthaltende wäßrige Lösung in Form von fern χι Tröpf-
chen in einem organischen Lösungsmittel, in dem ein
20 wasserunlösliches Monomeres gelöst ist zu dispergie-
Gegenstand der Erfindung ist das Verfahren zur Her- ren und dann die Polymerisation in Gang zu bringen,
stellung von immobilisierten Enzymen oder Mikroorga- Hierdurch werden feine Wassertröpfchen in dem gebil-
nismen gemäß dem Patentanspruch. deten wasserunlöslichen Polymeren eingeschlossen. Ein
Enzyme und Mikroorganismen werden in jüngster weiteres herkömmliches Verfahren bfsteht darin, eine
Zeit vielfältig in der Nahrungsmittelindustrie und in der 25 wäßrige Lösung, die ein Enzym oder einen Mikroorga-
pharmazeutischen Industrie angewandt und haben da- nismus enthält in Form von feinen Wassertröpfchen in
her erneut an Bedeutung und Interesse gewonnen. Bei einem organischen Lösungsmittel, in dem eine wasser-
den herkömmlichen Verfahren werden für die Durch- unlösliche hochmolekulare Substanz gelöst ist zu di-
führung der Reaktion die Enzyme in Wasser gelöst und spergieren und dann das organische Lösungsmittel zu
die Mikroorganismen in Wasser suspendiert Bei der 30 entfernen, um die feinen Wassertröpfchsn in der was-
Anwendung dieser Verfahrensweisen ist es jedoch serunlöslichen hochmolekularen Substanz einzuschlie-
schwierig, diese Materialien nach Beendigung der Reak- Ben.
tion wieder aus der Reaktionsmischung zurückzugewin- Im allgemeinen sind Enzyme oder Mikroorganismen
non. Daher wurden die einmal verwendeten Enzyme in Wasser relativ stabil, sind jedoch in organischen Lö-
oder Mikroorganismen verworfen. Aufgrund dieser 35 sungsmitteln instabil, so daß die üblicherweise bei den
Tatsache wurden bei Reaktionen, bei denen Enzyme herkömmlichen Einschlußverfahren verwendeten Ma-
oder Mikroorganismen verwendet werden, üblicherwei- terialien in Wasser löslich sind. Die Verwendung von
se absatzweise geführte Reaktionsschritte angewandt wasserlöslichen Materialien macht die Anwendung ei-Diese
absatzweise geführten Reaktionen verringern nes Verfahrens erforderlich, mit dem diese wasserunlösden
Wirkungsgrad der Ausnützung der Enzyme oder 40 lieh gemacht werden, beispielsweise eine Polymerisader
Mikroorganismen sehr stark. In jüngster Zeit wur- tion oder eine Vernetzung, was jedoch unvermeidbar zu
den daher vielfältig Anstrengungen unternommen, im- einer Beeinträchtigung der Enzyme oder der Mikroormobilisierte
Enzyme oder immobilisierte Mikroorganis- ganismen Anlaß gibt Die Verwendung von wasserunmen
zu schaffen, die wiederholt oder ständig bei der löslichen hochmolekularen Substanzen als Einschluß-Reaktion
verwendet werden können, indem man die 45 materialien macht es auf der anderen Seite erforderlich.
Enzyme unter Aufrechterhaltung ihrer Aktivität was- organische Lösungsmittel zu verwenden, um sie zu löserunlöslich
macht oder indem man die Mikroorganis- sen. was zur Folge hat daß die Enzyme oder Mikroorga·
men unter Beibehaltung ihrer Lebensfähigkeit in eine nismen durch die organischen Lösungsmittel geschädigt
leicht wiederzugewinnende Form bringt werden.
Bislang wurde bereits über eine Reihe von Verfahren 50 Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht so-
zur Herstellung von immobilisierten Enzymen oder im- mit darin, ein Verfahren anzugeben, mit dem es gelingt,
mobilisierten Mikroorganismen berichtet Diese Ver- die tnzyme oder Mikroorganismen, ohne sie in merkli-
fahran können grob eingeteilt werden in ehern Ausmaß zu deaktivieren, zu immobilisieren und
das es ermöglicht die Enzyme oder Mikroorganismen in
a) Immobilisierungsverfahren, die darin bestehen, die 55 die Form von Kügelchen, eines Pulvers, von Fasern,
Enzyme oder Mikroorganismen durch kovalente Stäben oder Folien zu bringen.
Bindung, lonenbindung oder Adsorption mit orga- Diese Aufgabe wird gelöst durch die kennzeichnen-
nischen oder anorganischen wasserunlöslichen den Merkmale des Verfahrens gemäß Patentanspruch.
Substanzen zu verbinden; Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung
b) Immobilisierungsverfahren, die darin bestehen. En- 60 von immobilisierten Enzymen oder Mikroorganismen
zyme oder Mikroorganismen unter Verwendung besteht darin, Eisstückchen mit einem Durchmesser von
von bifunktionellen Reagenzien und dergleichen höchstens 1 mm, die ein Enzym oder einen lebenden
kovalent miteinander zu verbinden; und Mikroorganismus enthalten, in einem organischen Lo-
c) Immobilisierungsvsrfahren. die darin bestehen, die sungsmittel, indem mindestens 0,1 Gew.-% einer hoch-Enzyme
oder Mikroorganismen in wasserunlösli- 65 molekularen Substanz aus der Celluloseacetat, Äthylcclche
hochmolekulare Substanzen einzuschließen, lulose, Polyacrylnitril, Polyacrylsäureester, Polymethadie
nachfolgend als »Einschlußverfahren« bezeich- crylsäureester. Polystyrol, Polyvinylacetat, Polyvinylnet
werden. chlorid, Polycarbonat und Copolymere aus den diese
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