DE2305320A1

DE2305320A1 - Durch einschluss in ein wasserloesliches, hydrophiles polymer stabilisierte enzymkoerper

Info

Publication number: DE2305320A1
Application number: DE19732305320
Authority: DE
Inventors: Francis E Gould; Samuel H Ronel
Original assignee: National Patent Development Corp
Current assignee: National Patent Development Corp
Priority date: 1972-02-11
Filing date: 1973-02-03
Publication date: 1973-08-30
Also published as: CA1007586A; IL41450A; ZA73696B; DE2305320B2; FR2171109B1; AU5203773A; BE795316A; IT987011B; AU469805B2; FR2171109A1; GB1415597A; ES411763A1; NL7301897A; FR2245668A1; JPS4892446A; IL41450A0

Description

PATENTANWALT . D-703

DiPL-ING. KNUD SCHULTE Gerokwege

Tetefon CO 70 3» 289 73 -66 7432

Patentanwalt K. Schute. D-703 Böblinrjen. Gorokweci 6

Fall 27

Anmelder:

National Patent Development Corporation 375 Park Avenue

New York, New York, USA

DurchEinschluss in ein wasserunlösliches, hydrophiles Polymer stabilisierte Enzymkörper

Eine immer grosser werdende Anzahl industrieller Verfahren hängt"von der durch natürliche Enzyme ausgehenden katalytischen Aktivität ab. Zusätzlich zu einer gewöhnlichen chemischen Katalyse bieten enzymatische Reaktionen den Vorteil hoher Spezifität, wobei sie gleichzeitig nicht die von einer grossen Anzahl Nebenprodukten herrührenden Probleme aufweisen. Enzymatische Reaktionen sind darüber hinaus milde Umsetzungen, welche bei niedrigen oder massigen Temperaturen durchgeführt werden, und es sind für sie keine Wärmeaustauschanlagen erforderlich, was einen wichtigen Kostenfaktor für die Industrie darstellt.

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Vo!kst>3! )k Bobiingen AG. Klo, 3 ASii (BL Z CO 390 220) · Postscheck: Stuttgart 9S6 55

Der industriellen Anwendung der enzymatischen Katalyse waren jedoch bisher Grenzen gesetzt durch die hohen Kosten der Enzyme selbst, die Schwierigkeit ihrer Abtrennung von den Endprodukten _r den durch die Regierungsstellen auferlegten Beschränkungen, falls das Endprodukt in die Klasse der Nahrungsmittel, Getränke oder Arzneimittel fiel, und die Instabilität der meisten freien, gereinigten Enzyme.

In. den letzten Jahren wurden bereits einige Versuche unternommen, um diese Nachteile zu überwinden, indem man die Enzyme an unlösliche Matrizes band, wie beispielsweise an natürliche Polymere (Stärke, Agar-Agar), modifizierte natürliche Polymere (Sephadex, Carboxymethylcellulose, Diäthylaminoäthylcellulose), synthetische Polymere (Bio-Gel CM-IOO), und ganz in letzter Zeit auch modifiziertes Sinterglas (CGW # 3100), welches silanisiert wurde, oder indem man Enzyme in ein wasserlösliches Polymer einschloss (US-Patentschrift Nr. 3 576 760).

Die angegebenen Verfahren eigneten sich zwar zum Immobilisieren von Enzymen in Laborversuchen, Hessen sich jedoch mit der Ausnahme desjenigen der US-Patent schrift Nr. 3 760 nicht anwenden in technischem Masstab. Will man Enzyme an ein stabiles Substrat binden, so erfordert dies eine komplexe Reihe chemischer Umsetzungen mit niedriger Ausbeute, welche für die proteinischen Bausteine nicht unschädlich sind. Andererseits ist der dabei erhaltene enzymatische Katalysator nicht so mechanisch stabil, wie man dies für einen längeren Einsatz haben möchte. So wurde davon

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berichtet, dass Säulen, die man mit Gelteilchen natürlicher oder synthetischer Polymerer füllte, an welche Enzyme gebunden sind, unter dem für einen wirtschaftlichen Durchsatz benötigten Druck verbacken, was eine Erniedrigung der Strömungsgeschwindigkeit und schliesslich ein völliges Verstopfen zur Folge hat. Aufgeschlämmte Gele von an natürliche oder synthetische Polymere gebundenen Enzymen halten ferner keinem gründlichen Rühren in einem gerührten Reaktionsgefäss stand, und sie werden daher mechanisch zerstört. Hierdurch lösen sich kleine Polymerteilchen ab, durch welche die Filter verstopft werden können, und gleichzeitig treten freie Enzyme in das Reaktionsgemisch über. Darüber hinaus weiss man, dass natürliche Polymere leicht von Mikroorganismen angegriffen werden, für welche sie ein willkommenes Substrat bilden.

Ziel der Erfindung ist daher die Schaffung verbesserter Formen bzw. Körper wiederverwendbarer katalytischer Systeme, welche dauerhaft enzymatisch aktiv und höher stabil sind.

Es wurde nun gefunden, dass man zu solchen Formen bzw. Körpern gelangen kann, indem man aktive Enzyme in einer hydrophilen Polymermatrix durch chemische Verfahren oder durch physikalischen Einschluss immobilisiert. Solche immobilisierten Enzymsysteme lassen sich nach einer Reihe' von Verfahren herstellen, und-man kann hierzu beispielsweise wie folgt vorgehen:

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1. Vor einer Polymerisation werden die Enzyme in einem ein Vernetzungsmittel enthaltenden Monomergemisch gelöst oder suspendiert, worauf man das ganze dann polymerisiert und so ein quervernetztes, unlösliches Polymergel-Gitter erhält. Die makromolekulare Struktur eines solchen Gitters lässt sich durch Steuerung der Art sowie der Konzentration der Monomerbauteile variieren, so dass die Enzymmoleküle in der gelartigen Matrix zurückgehalten werden, während Moleküle von Substrat und Reaktionsprodukt kleinerer Grosse sich frei in dem polymeren Netzwerk bewegen können.

2. Die Enzyme werden zuerst mit einer wässrigen oder organischen Lösung des Polymers vermischt, und dieses Polymergemisch vernetzt man dann, um hierdurch die einhüllende Matrix unlöslich zu machen.

3. Eine Lösung oder eine Suspension der Enzyme wird zuerst in einer porösen Struktur absorbiert, beispielsweise in natürlichen oder synthetischen Schäumen, porösen organischen oder anorganischen Materialien (wie einem geschäumten Polymethan [Toluoldiisocyanat-Polytetramethylenglykol], einem Harnstoff-Formaldehyd-Schaum, einem Phenol-Formaldehyd-Schaum,Polystyrol-Schaum, Polyäthylen-Schaum, Polypropylen-Schaum, Naturschaumgummi, einem geschäumten Butadien-Styrol-Copolymer, einem geschäumten Epoxyharz [Bisphenol A-Epichlorhydrin], Aktivkohle, porösem Glas bzw. Sinterglas, porösem Metall bzw. Sintermetall, aktiver Tonerde, Silicagel, geschäumten oder schwammartigen Hydroxy-

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äthylmethacrylat-Polymeren), worauf man dann das Lösungsmittel" unter vermindertem Druck entfernt.

Alle oben beschriebenen Körper bzw. Vorrichtungen können abschliessend mit einem zusätzlichen üeberzug aus einem hydrophilen Material versehen werden. Diese äussere Membran bietet einen zusätzlichen Schutz gegenüber einer möglichen Auslaugung der darin eingebetteten proteinischen Substanz, und dient ferner zur Verlängerung der Lagerbeständigkeit bzw. Lebensfähigkeit des Enzyms.

Die Stärke der äusseren Membran kann so ausgelegt werden, dass sich hierdurch die Geschwindigkeit einstellen lässt, mit der das Substrat in die Nähe des Enzyms diffundiert, und natürlich auch die Diffusionsgeschwindigkeit der von den Reaktionsstellen nach aussen kommenden Produkte. Die Stärke der Membran kann beispielsweise 5 p. bis 1 mm betragen, sie liegt vorzugsweise nicht über 500 μ, und beträgt insbesondere 10 bis 50 ^u. Die chemische Zusammensetzung dieser äusseren Membran und ihre Molekularstruktur in gequollenem Zustand bei Berührung mit dem Substratmedium sorgen dafür, dass nur Moleküle unterhalb bestimmter Molekulargewichtsbereiche hindurch diffundieren können, d.h» Moleküle mit einem niedrigeren Molekulargewicht als die Enzyme, nämlich im allgemeinen bis zu einem Molekulargewicht von etwa 10.000. Bei Enzymmolekülen mit einem Molekulargewicht von 50.000 und darüber kann das hydrophile Polymer auch so ausgelegt werden, dass es auch für Moleküle bis hinauf zu einein Molekulargewicht von 40.000 passierbar ist.

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Da darüber hinaus all die Vorrichtungen und auch die äusseren, semipermeablen Membrane praktisch aus Polymeren bestehen, die für ihre hohe Gewebeverträglichkeit und ihre Nicht-Ihr ombogenität bekannt sind, lassen sich diese Vorrichtungen auch in Lebewesen einsetzen, um so eine fehlende enzymatische Wirkung zu ersetzen oder eine therapeutische Wirkung zu entfalten. Darüber hinaus können diese Vorrichtungen direkt in das Zirkulationssystem implantiert werden, wobei die äussere, hydrophile Membran einen Schutz gegen immunologische oder thrombogene Reaktionen bildet, welche bei direktem Kontakt mit fremden, proteinischen Substanzen hervorgerufen werden können.

Die Enzymsysteme können angewendet werden bei Menschen oder anderen Säugetieren, wie Hunden, Katzen, Schafen, Pferden, Rindern, Ziegen, Schweinen oder Kaninchen, im Zoo gehaltenen Tieren, wie Löwen, Elephanten usw.

Die Enzymsysteme lassen sich ferner verwenden für nichttherapeutische Zwecke, beispielsweise bei der enzymatischen Verdauung von Stärke, beispielsweise mit cc-Amylase, oder beim Gerben von Leder, beispielsweise mit Papain.

Die enzymatisch aktive Vorrichtung besteht vorzugsweise entweder aus einer Schicht mit einem darin eingeschlossenen Enzym, welche von einem hydrophilen Polymer überzogen ist, oder sie hat die Form eines hohlen Rohres, welches mit Fasern verstärkt ist.

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Die erfindungsgemässen, enzymatisch aktiven Vorrichtungen bzw. Körper können geformt sein als Perlen, grobe oder feine Pulver, Stäbchen, Rohre, vielschichtige Membrane, Filme, Fasern, Hohlfasern, Beutel oder Kapseln. Sie können ferner durch entsprechende Beschichtungsverfahren auf die Oberfläche fester Substrate irgendwelcher Form aufgebracht sein.

Bei allen erfindungsgemässen Vorrichtungen bleiben die Enzyme ständig eingeschlossen, und sie lassen sich weder herauslösen, noch löst sich 3ie Form bzw. der Körper auf, um sie freizusetzen.

Die erwähnten Systeme werden üblicherweise hergestellt in Gegenwart von Wasser, Pufferlösung oder Lösungsmxttelsystemen, welche die Enzyme nicht denaturieren, sie können jedoch abschliessend vollständig entwässert bzw. getrocknet werden, wodurch sie sich leichter lagern lassen und wodurch ihre Lebensdauer ziemlich erhöht wird. Nach ihrer Anwendung lassen sich die erfindungsgemässen Körper monatelang aufheben, um sie dann wieder zu verwenden, ohne dass hierdurch ihre Aktivität merklich abnimmt.

Polymermatrizes werden vorzugsweise hergestellt aus einem hydrophilen Monomer, welches entweder ein hydroxylgruppenhaltiges niederes Alkylacrylat- oder -methacrylat ist, oder welches ein hydroxyIgruppenhaltiges niederes Alkoxy-niederalkylacrylat oder -methacrylat darstellt. Als Beispiele hierfür seien erwähnt 2-Hydroxyäthylacrylat, 2-Hydroxy-

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äthylmethacrylat, Diäthylenglycolmonoacrylat, Diäthylenglycolmonomethacrylat, 2-Hydroxypropylacrylat, 2-Hydroxypropylmethacrylat, 3-Hydroxypropylacrylat, 3-Hydroxypropylmethacrylat oder Dipropylenglycolmonomethacrylat. Die bevorzugten Monomeren zur Herstellung der Matrizes sind Hydroxyalkylacrylate oder -methacrylate, und hier insbesondere die 2-Hydroxyäthy!.methacrylate. Die aus entsprechenden Monomeraufschlämmungen hergestellten Polymeren sind löslich in organischen Lösungsmitteln, beispielsweise in Alkohol, jedoch unlöslich in Wasser. Sie lassen sich beispielsweise, nach den in der US-Patentschrift Nr. 3 618 213, z.B. Beispiel 36a, oder der US-Patentschrift Nr. 3 575 946 beschriebenen Verfahren herstellen.

Die Hydroxyalkylacrylate oder -methacrylate können auch, obwohl dies weniger bevorzugt wird, teilweise ersetzt werden durch Vinylpyrrolidon, Acrylamid, Methacrylamid, N-Propylacrylamid, N-Isopropy!methacrylamid, N-Methacrylamid, N-Methy!methacrylamid, N-Methylolacrylamid, N-Methylolmethacrylamid, N-2-Hydroxyäthylacrylamid oder N-2-Hydroxyäthy!methacrylamid. Diese Monomeren sind jedoch normalerweise wasserlösliche Homopolymere, und man muss sie daher in Gegenwart eines Vernetzungsmittels polymerisieren oder in einer ausreichenden Menge an den Hydroxyalkylacrylaten oder -methacrylaten copolymerisieren, damit die Copolymerisate wasserunlöslich werden.

Zur Bildung von zum Einschluss von Enzymen geeigneter hydrophiler Polymermatrizes lassen sich auch andere, äthylenisch ungesättigte Monomere in Verbindung mit den oben genannten Monomeren oder Copolymeren verwenden. Hierunter gehören beispielsweise neutrale Monomere, wie Acrylnitril, Methacrylnitril, Vinylacetat, Alkylacrylate und -methacrylate, Alkoxyalkylacrylate und -methacrylate.

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Als Beispiele für Alkylacrylate oder -methacrylate lassen sich erwähnen Methylacrylat, Aethylacrylat, Butylacrylat, 2-Aethyihexylacrylat, Methylmethacrylat oder Buty!methacrylate. Beispiele geeigneter Alkoxyalkylacrylate oder -methacrylate sind Methoxyäthylacrylat, Methoxyäthylmethacrylat, Aethoxyäthylacrylat, AethoxyäthyImethacrylat, Propoxyäthylacrylat, Butoxyäthylmethacrylat, Methoxypropylacrylat oder AethoxypropyImethacrylat. Werden diese Comonomeren in Mengen von vorzugsweise nicht über 50 % (und normalerweise zwischen 0,5 und 20 %)/bezogen auf das Monomerengemisch, angewendet, dann ergeben sie eine Verbesserung der mechanischen Eigenschaften des Gels. Sie sollten nicht in solcher Menge zum Einsatz gelangen, dass hierdurch die hydrophile Natur des Polymers beeinträchtigt wird. Zur Bildung ionogener Matrizes können auch andere Vinylmonomere, welche ionisierbare funktionale Gruppen enthalten, mit den Hydroxyalkylacrylaten oder -methacrylaten copolymerisiert werden. Solche ionogene Matrizes können dann von Nutzen sein, wenn aus Stabilitätsgründen oder für eine optimale Enzymaktivität eine basische oder saure Umgebung erforderlich ist. Hierunter gehören beispielsweise von Säuren abgeleitete Monomere, wie Acrylsäure, Methacrylsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Itaconsäure, Aconitinsäure, Zimtsäure, Crotonsäure, Carboxylsäure, Propionsäure, Citraconsäure, Vinylsulfonsäure oder p-Vinylbenzolsulfonsäure, Teilester, wie Mono-2-hydroxyäthylitaconat, Mono-2-hydroxypropylcitraconat, Mono-2-hydroxyäthylmaleat, Mono-2-hydroxypropylfumarat, Monomethylitaconat, Monoäthylitaconat, Monomethylcellcsolvitaconat (Methylcellosolv stellt dabei den Monoäthylather von Diäthylenglycol dar), Monomethylcellosolvmaleat oder Mono-2-hydroxyäthylaconitat.

Als basische Monomere lassen sich beispielsweise erwähnen AminoäthyImethacrylat, Dimethylaminoäthylmethacrylat,

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Monomethylaminoäthylmethacrylat , t-Butylaminoäthylmethacrylat, p-Aminostyrol, o-Aminostyrol, 2~Amino-4-vinyl~ toluol, Diäthylaminoäthylacrylat, Dimethylaminoäthylacrylat, t-Butylaminoäthylacrylat, Piperidinoäthylacrylat, Piperidinoäthy!methacrylate, Morpholinoäthylacrylat, Morpholinoäthylmethacrylat, 2-Vinylpyridin, 3-Vinylpyridin, 4-Vinylpyridin, 2-Aethyl-5-vinylpyridin, Dimethylaminopropylacrylat, Dimethylaminopropylmethacrylat, D!propylamine äthylacrylat, Dimethylaminoäthylvinyläther, Dimethylaminoäthylvinylsulfid, Diäthylaminoäthylvinyläther, Äminoäthylvinylather, 2-Pyrrolidinoäthylmethacrylat, 3-(Dimethylaminoäthyl)-hydroxypropylacrylat, 3-(Dimethylaminoäthyl)-2-hydroxypropylmethacrylat, 2-Arainoäthylacrylat oder 2-Aminoäthylmethacrylat. Aus dieser Gruppe werden die Alkylaminoäthylacrylate sowie -methacrylate bevorzugt. Diese ionogenen Monomeren sollten nicht in so grossen Mengen eingesetzt werden, dass hierdurch die Hydroxyalkylacrylate oder -methacrylate wasserlöslich werden. In besonderen Fällen kann sich zum Einschluss der Enzyme am besten eine Matrix eignen, die aus einem Mischpolymer besteht, welches man erhält aus einem Gemisch aus 3,4 oder mehreren der oben erwähnten Monomeren. Diese Monomeren werden normalerweise verwendet in Mengen zwischen 0,1 und 20 %, vorzugsweise 1 und 15 %, bezogen auf die Gesamtmenge an Monomeren.

Um eine zum Einschluss von Enzymen geeignete Matrix herzustellen, muss man diese Matrix oft in Wasser oder einem organischen Lösungsmittel unlöslich machen. Dies wird erreicht, indem man das,zum Einschluss verwendete Polymer

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leicht vernetzt. Das Vernetzungsmittel wird dabei vorzugsweise in Mengen zwischen 1 und 10 %, insbesondere nicht in Mengen von über 2 %, eingesetzt/ obgleich auch Mengen zwischen 0,05 und 15 % oder sogar bis 20 % an Vernetzungsmittel verwendet werden können. Ein Vernetzungsmittel macht die ansonsten in einem organischen Lösungsmittel löslichen oder in Wasser löslichen Polymeren unlöslich/ beeinträchtigt jedoch nicht die hydrophilen Eigenschaften. Selbstverständlich kann man ein nichtvernetztes, in einem organischen Lösungsmittel lösliches Polymersystem verwenden, wenn das verwendete Substrat oder die zum Verdünnen des Substrats verwendete nichtwässrige Flüssigkeit kein Lösungsmittel ist für die zum Einschliessen verwendete Matrix.

Als typische Beispiele von Vernetzungsmitteln lassen sich erwähnen Aethylenglycoldiacrylat, Aethylglycoldimethacrylat, 1,4-Butylendimethacrylat, Diathylenglycoldimethacrylat, Propylenglycoldimethacrylat, Diathylenglycoldimethacrylat, Dipropylenglyeoldimethacrylat, Diäthylenglycoldiacrylat,. Dipropylenglycoldiacrylat, Divinylbenzol, Divinyltoluol, Diallyltartrat, Allylpyruvat, Allylmalat, Divinyltartrat, Triallylmelamin, Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid, Diallylmaleat, Divinylather, Diallylmonoäthylenglycolcitrat, Aethylenglycolvinylallyleitrat, Allylvinylmaleat, Diallylitaconat, Aethylenglycoldiester von Itaconsäure, Divinylsulfon, Hexahydro-l,3,5-triacryltriazin, Triallylphosphit, Diallyläther von Benzolphosphonsäure, Polyester von Maleinsäureanhydrid mit Triäthylenglycol, Diallylaconitat, Divinylcitraconat, Diallylfumarat oder Ammoniumdichromat. Werden die erfindungsgemässen Körper bzw. Zubereitungen zu therapeutischen Zwecken verwendet, dann sollten natürlich keine toxischen Vernetzungsmittel verwendet werden.

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Lösliche Polymere, welche sich zur Herstellung immobilisierter Enzymsysteme eignen, können nach einer Reihe von Polymerisationsverfahren hergestellt werden. Zu erwähnen ist hier beispielsweise die Lösungspolymerisation oder die Suspensionspolymerisation. Werden die Polymeren durch Lösungspolymerisation hergestellt, dann löst man die Monomeren sowie den Katalysator nur in dem geeigneten Lösungsmittel, und polymerisiert das ganze dann. Das so erhaltene Polymer wird dann durch wiederholtes Ausfällen und Waschen in einem Nichtlösungsmittel gereinigt. Für die Umsetzung geeignete Lösungsmittel sind Isopropylalkohol, Aethylenglycol, Propylenglycol, Diäthylenglycol, Dipropylenglycol, Monomethyläther von Aethylenglycol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder Tetrahydrofuran. Ein Polymerisationsverfahren, welches sich zur Bildung von in einem Lösungsmittel löslichen Polymeren eignet, kann beispielsweise nach dem in den US-Patentschriften Nr. 3 618 213 oder 3 575 beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.

Eine Suspensionspolymerisation wird in einem nicht-polaren Medium durchgeführt, beispielsweise in Silikonöl, Mineralöl, Xylol oder Toluol, wie dies in den Beispielen 36a, 36b und 36c der US-Patentschrift Nr. 3 618 213 beschrieben ist.

Das durch Lösungs- oder Suspensionsverfahren entstandene lösliche Polymer wird dann, wie oben gezeigt, in dem entsprechenden Lösungsmittel gelöst, und kann so mit dem Enzym vermischt werden. Das Lösungsmittel wird hierauf entfernt,

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und man unterwirft das ganze, falls notwendig, einem Verfahren zur Bildung einer vernetzten Struktur, und zwar vorzugsweise bei Temperaturen von unter 5⁰C, wodurch man dünne, unlösliche Filme erhält, in die das aktive Enzym eingeschlossen ist. Normalerweise arbeitet man hierzu bei Temperaturen zwischen -5⁰C oder O⁰C bis zu 1O°C, um so sicherzugehen, dass das Enzym keinen Schaden erleidet.

Wird die enzymatisch aktive Vorrichtung durch direkten Einschluss in eine vernetzte Matrix gebildet, dann geht man zur Herstellung der Polymer-Enzym-Matrix zweckmässigerweise so vor, dass man eine giessfähige Lösung aus einem oder mehreren Monomeren, erforderlichenfalls einem Vernetzungsmittel, sowie einem Katalysator, in welchem Enzyme in Gegenv?art schwankender Mengen destilliertem Wasser, einer wässrigen Pufferlösung oder organischer Lösungsmittel suspendiert sind, polymerisiert. Die Wahl eines geeigneten pH-Wertes, d.h. des für die Wirksamkeit des spezifischen Enzyms bevorzugten pH-Wertes, begünstigt die Auflösung des Enzyms. Die Menge an Wasser, wässrigem Puffer oder organischem Lösungsmittel kann schwanken zwischen O und 100 Gew.-%, bezogen auf die Monomeren, und sie kann sogar noch darüberliegen, beispielsweise 1000 oder 1500 % dieses Gewichtes betragen. Die hierdurch erhaltene Giesslösung lässt man dann in Giessformen vorgegebener Gestalt polymerisieren, so dass man zu einer Matrix mit immobilisiertem Enzym gelangt, welche entweder ein Film, ein Stäbchen oder ein Rohr ist. Wie bereits oben erwähnt, werden Polymerisationen dieser Art im allgemeinen durchgeführt bei

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Temperaturen von unter 5⁰C.

Typische organische Lösungsmittel sind Alkohole, wie
Methylalkohol, Aethylalkohol, Propylalkohol, Isopropylalkohol, Monomethylather von Diäthylenglycol, Monoäthyläther von Diäthylenglycol, Monomethylather von Aethylenglycol, Monoäthyläther von Aethylenglycol, Dioxan, Dioxan-Wasser-Gemische, Alkohol-Wasser-Gemische, beispielsweise 95%-iger Alkohol, Pyridin, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofurfurylalkohol, Aethylenglycol,
Propylenglycol, Formamid, Cyclohexanol, Glycerin, Toluol, Xylol, Benzol, Triäthylenglycol oder t-Butanol.

Stäbchen oder Filme können ferner zu groben oder feinen Pulvern vermählen werden, mit denen sich dann Kolonnen, Hülsen bzw. Patronen oder permeable Säcke füllen lassen. Die entsprechenden Körper können abschliessend mit einem Ueberzug aus einer Polymer-Lösung oder einem polymerisierbaren Monomer versehen werden, falls man dafür sorgen möchte, dass das darin befindliche Enzym nicht direkt dem Substrat ausgesetzt ist. Das Lösungsmittel wird entweder entfernt durch Verdampfen oder auf eine andere Weise, bis ein fester Üeberzug, beispielsweise ein Gel, gebildet ist, oder bis das Monomere unter Bildung eines festen Ueberzugs polymerisiert ist.

In die Giessform können vor dem Polymerisieren ferner
Verstärkungsmittel eingebracht werden, wie Glasfasergewebe, Dacron (Polyathylenterephthalat), Nylon (beispielsweise Nylon 6, Nylon 6,6, Nylon 6,10), Polyacrylnitrxlfasern,

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Polyvinylchloridfasern oder ähnliches, Goldgewebe, Geflechte aus Platin, rostfreiem Stahl und ähnlichem, und zwar in verschiedenen Materialstärken und Maschenweiten, so dass das Verstärkungsmaterial vollständig in die Giesslösung eingeschlossen wird. Die auf diese Weise erhaltenen, enzymhaltigen Membrane, Stäbchen oder Röhrchen sind dann weit zugfester, und halten zudem gröbere Behandlungen aus.

Ein anderes typisches System zum Einschluss von Enzymen lässt sich herstellen in Form harter, mikroporöser Perlen verschiedener Grossen, welche sich zum Füllen von Säulen verwenden lassen, durch die das Substrat fliesst, oder mit denen Reaktionsgefässe gefüllt und dort mit dem Substrat vermischt werden können, und man kann diese Perlen dann nach erfolgter Umsetzung leicht wieder gewinnen.

Solche, aus einer Mikroorganismen (einen einzelnen Mikroorganismus sowie auch ein Gemisch verschiedener Mikroorganismen) einschliessenden, vernetzten, hydrophilen Matrix zusammengesetzte perlenförmige Körper lassen sich herstellen durch Suspensions-Polymerisation in einem nichtpolaren Medium, beispielsweise in Siliconöl, Mineralöl, Paraffinöl, Xylol, Benzol, Toluol oder in Gegenwart eines hochmolekularen Polyisobutylene. Die Enzyme (normalerweise 1 bis 10 % , bezogen auf das Monomergewicht) werden entweder in einer geringen Menge Wasser ( mit oder ohne Puffer) oder einem organischen Lösungsmittel, dem Katalysatorsystem und dem Vernetzungsmittel (0,05 bis 20 %, üblicherweise 1 bis 10 %, bezogen auf das Monomergewicht) suspendiert. Die Polymerisation wird durchgeführt bei kon-

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stanter Rührgeschwindigkeit sowie einer bestimmten Temperatur (-5 bis +2O⁰C, normalerweise O bis 1O°C). Nach Beendigung der Polymerisation werden die porösen, harten, kugelförmigen Perlen, in denen das aktive Enzym eingeschlossen ist, gesammelt, rasch in einem entsprechenden Lösungsmittel gewaschen und dann in Wasser ausgelaugt, um so restliches Monomer, restlichen Katalysator sowie nicht gebundene Enzyme zu entfernen. Zu enzymatisch aktiven Perlen verschiedener Grossen kann man gelangen, indem man das Verhältnis der monomeren Phase zu der zum Suspendieren dienenden Phase variiert, und zwar ebenfalls wieder unter entsprechendem Rühren. Die Perlen können abschliessend in jeder geeigneten Weise mit einem Ueberzug'des hydrophilen Polymers versehen werden.

Zur Durchführung der Polymerisation werden normalerweise freie Radikale liefernde Katalysatoren verwendet, und zwar in Mengen von 0,05 bis 1 %, bezogen auf das polymerisierbare Monomer. Die Katalysatormenge beträgt vorzugsweise 0,1 bis 0,5 %, bezogen auf das Monomer.

Die Polymerisation kann durchgeführt werden bei Temperaturen zwischen 20 und 150°C, üblicherweise bei 40 bis 90°C, und zwar zur Herstellung der Matrix , die man verwendet zum Einhüllen von Enzymen mittels einer Lösung, oder man arbeitet vorzugsv/eise bei Temperaturen zwischen -5 und +5⁰C, üblicherweise 0 und +2⁰C, falls das Enzym in dem polymerisiert baren Gemisch vorhanden ist. Bei niedrigeren Temperaturen arbeitet man insbesondere in Gegenwart eines Enzyms, um so eine Zersetzung dieses Enzyms zu vermeiden.

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Für die Polymerisation kommen als typische Katalysatoren infrage t-Butylperoctoat, Benzoylperoxid, Isopropylpercarbonat, Methyläthylketonperoxid, Cumolhydroperoxid, 1,3-Bis-(t-butylperoxyisopropyl)-benzol sowie Dicumylperoxid. Eine weitere, vorwiegend für Niedertemperatur-Polymerisation geeignete Gruppe von Katalysatoren umfasst Redox-Systeme, wie Kaliumpersulphat-Riboflavin, Kaliumpersulfat-Natriumbisulfit, Wasserstoffperoxid-zweiwertiges Eisen. Zur Beschleunigung der Wirkung der Katalysatoren können verschiedene Verbindungen verwendet werden, beispielsweise Ν,Ν,Ν¹ ,K'-Tetramethyläthylendiamin. Die Polymerisation kann ferner mittels Bestrahlung katalysiert werden, beispielsweise durch ültraviolettlicht von Gammstrahlen. Der jeweils verwendete Katalysator ist nicht kritisch, und man kann irgendeinen Katalysator bekannter Art verwenden.

Im allgemeinen werden 0,1 bis 10 % eingeschlossener Enzyme eingesetzt, bezogen auf das Gewicht des Polymers der Matrix, man kann jedoch auch bis zu 50 % Enzym verwenden, bezogen auf das Polymergewicht. Die verwendete Enzymmenge kann sogar nur 0,01 % betragen.

In die hydrophile Matrix kann irgendein Enzym oder Enzym-Gemisch eingeschlossen werden. Als Beispiele werden erwähnt:

Chimotrypsin (Rinderpankreas)

Glucose-Oxidase (A. Niger, Fungi) Galactose-Oxidase (D. Dendroides) Asparaginase (E. Coli}

Alpha-amylase (Bakterien, Fungi, Malz, Schweinepankreas) Beta-amylase (Gerste, süsse Kartoffel)

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Acetyl-Cholinesterase (Rindererythrocyten) urease

Peroxidase

Protease

Papain (Papayalatex) Lipase (Weizenkeim/ Schweinepankreas) Pepsin (Schweinemagen) Apyrase (Kartoffel) Arginase (Rindsleber) Catalase (Pilze, Rindsleber) Pepsinogen (Schweinemagen) Creatin-Phosphokinase (Hasenmuskel) Deoxyribonuclease (Rinderplasma oder MiIz) Trypsinogen (Pankreas) Protease (Bakterien, Fungi, Rinderpankreas) Xanthin-Oxidase (Milch) Pyruvat-Kinase (Hasenmuskel) Pyruvat-Decarboxylase (Hefe) Ribonuclease A, B, D (Pankreas) Glutamin-Pyruvat-Transaminase (Schweineherz) Acetat-Kinase (E. coli) Acylase (Schweineniere) Alkohol-Dehydrogenase (Pferdeleber, Hefe) Aldolase (Hasenmuskel) Aminopeptidase (B. Sublilis) Uricase (Rinderniere, Schwein) Enolase (Hefe, Hasenmaskel) Ficin (Feigenlatex) B-Glucosidase (Mandeln) Proxidase (Meerettich) Hexokinase (Hefe) Histidase (Ps. Fluorescens)

Peptidase (Schweineintestinum) Carboxy-Peptidase Invertase (Hefe) Leucylpeptidase Milchsämre-Dehydrogenase (Hefe, Rinderherz) d-Aminosäure-Oxidase Luciferase (Photobacterium Fischeri) Ascorbinsäure-Oxidase Penicillinase Säure-Phosphatase (Kartoffel, Weizenkeim) Malz-Diastase Pronase

Rennin

Tyrosinase (Ständerpilz) Pancreatin Tyrosin-Decarboxylase (Apo-Enzym) Lipase

Streptokinase Phosphatase RNA Polymerase (E. coli) Pectase

Amyloglucosidase Arginase Penicillin-Amidase Glyoxalase Lactat-Dehydrogenase ( Rinderherz) Glucoamylase (A. Awamori, R. Nivens)

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Werden besondere chemische, physikalische oder mechanische Eigenschaften benötigt, dann kann es von Vorteil sein, verschiedene Arten stabilisierter Enζym-Polymer-Systeme, wie Filmstreifen, Pulver, Granulate, Perlen, Scheiben oder Rohre bzw. Hülsen,in die Struktur geeigneter polymerer Materialien, wie Silicon-Kautschuk oder Epoxyharze, beispielsweise aus Bisphenolepichlorhydrin, Vinylpolymer, Polyolefinen, Polyurethanen oder natürlichen •Polymeren, einzuschliessen. Solche Polymere sind beispielsweise Polyvinylchlorid, Polyvinylacetat, Polyvinylidenchlorid, Polyvinylidenfluorid, Polystyrol, Polyäthylen, Polypropylen, Aethylen-Propylen-Copolymer, Aethylen-Propylen-Terpolymer, Polybutadien, Butadien-Styrol-Copolymer oder Naturkautschuk. Eine solche Verfahrensweise kann ferner gewählt werden, um ein geeignetes Gleichgewicht zwischen hydrophilen und hydrophoben Eigenschafen für ein bestimmtes Substratmedium zu erreichen. Dies kann erfolgen, indem man Teile der stabilisierten Enzym-Polymer-Matrix mit dem Grundbzw. Wirtspolymer vermischt, oder indem man ein Gemisch der entsprechenden, geeigneten Monomeren in Gegenwart von Teilen der Enzym-Polymer-Matrix. polymerisiert.

Die erfindungsgemäss hergestellten Systeme aus in den Polymer-Matrizes eingeschlossenen und immobilisierten Enzymen zeichnen sich durch eine besonders hohe Stabilität aus. Aus diesem Grunde können sie besonders günstig für industrielle Verfahren eingesetzt werden, beispielsweise in der Nahrungsmittelindustrie, der pharmazeutischen Industrie, der Herstellung hochwertiger Chemikalien sowie der Behandlung von Fabrikationsabfällen. Auf analytischem

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Gebiet lassen sich die erfindungsgemässen Produkte bei Sensoren oder Monitoren im Zusammenhang mit manometrischen, optischen, potentiometrisehen, konduktometrischen oder polarographischen Verfahren verwenden. Sie können ferner Teil analytischer Systeme sein, und zwar auf dem Gebiete der Fluoeszenzmessung, der Spektroskopie und der pH- bzw. ionenselektiven Elektroden. In der Medizin lassen sich die erfindungsgemässen Systeme aus eingeschlossenen Enzymen und hydrophilen Gelen unter anderem in vivo als Sensoren sowie zu therapeutischen Zwecken in Fällen von Enzymmangelerscheinungen einsetzen. Man kann sie beispielsweise ver~ wenden,um Stärke in Glukose umzuwandeln, beispielsweise ausgehend von cc-Amylase, oder in irgendeinem anderen Verfahren, bei welchen man ein Enzym einsetzt, um ein Material in ein anderes umzuwandeln.

Die Erfindung wird anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 einen Schnitt durch eine erfindungsgemässe Vorrichtung,

Fig. 2 einen Schnitt durch eine als Elektrode dienende erfindungsgemässe Vorrichtung,

Fig. 3 einen Schnitt durch ein erfindungsgemässes Rohr.

Falls nichts anderes angegeben, beziehen sich alle Angaben in Teilen sowie Prozenten in den folgenden Beispielen auf Gewichtsangaben.

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Beispiel 1:

150 g destilliertes Hydroxyäthylmethacrylat, 600 g Methanol und 0,3 g t-Butylperoctoat (Katalysator) werden in einem mit Rührer sowie Rückflusskühler ausgerüsteten und unter Stickstoff gehaltenen Dreihalskolben bei 67⁰C polymerisiert. Das erhaltene Hydroxyäthylmethacrylat-Polymer reinigt man dann durch langsames Ausfällen in einem zehnfachen Ueberschuss an destilliertem Wasser. Das ausgefallene Polymer wird gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen und über Nacht bei Raumtemperatur und vermindertem Druck getrocknet. Die Ausbeute beträgt 85 %.

Beispiel 2:

Aus 10 g des gemäss Beispiel 1 erhaltenen trockenen Polymers und 85 g Aethylenglycolmonomethyläther wird eine Lösung hergestellt, welche man auf 5⁰C kühlt. Die so erhaltene Lösung versetzt man dann mit einer Lösung von 0,2 g Ammoniumdichromat in 5 ml destilliertem Wasser, und rührt das ganze 5 Minuten mit einem Magnetrührer, wodurch man zu einer vernetzbaren Lösung von Hydroxyäthylmethacrylat-Polymer gelangt.

Beispiel 3;

Aus 0,1 g Urease (Jack Bean, 50 Einheiten/mg Minimum, Worthinton Biochemical Cor.) und 0,5 g destilliertem Wasser wird eine Lösung hergestellt, welche man darm mit 4,5 g der gemäss Beispiel 2 erhaltenen Polymer-Lösung vermischt.

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Das auf diese Weise erhaltene Polymer-Enzym-Gemisch vergiesst man dann mittels eines Gardner-Giessmessers auf einem mit Polyäthylen überzogenen waagerechten Giesstisch zu einer 20,3 μ starken Schicht. Ueber den so gebildeten Film lässt man 5 Minuten lang kalten, trockenen Stickstoff strömen. Der Film wird hierauf 10 Minuten mit einer General Electric U.V.-Lampe (275 Watt) bestrahlt, welche 12,7 cm oberhalb der Filmoberfläche angeordnet ist, um das Polymer zu vernetzen. Auf diese Weise erhält man einen 1,3 yu starken Film. Auf die Oberseite dieses noch auf dem Giesstisch befindlichen Films giesst man dann mit dem Giessmesser eine 5,1 /a. starke Schicht der gemäss Beispiel 2 hergestellten Polyhydroxyäthylmethacrylat-Lösung, welche gleich darauf 5 Minuten lang mit der U.V.-Lampe bestrahlt wird. Auf diese Weise erhält man eine 1,5 /a starke, unlösliche, aus zwei Schichten bestehende Membran, in die immobilisierte Urease eingeschlossen ist (Fig. 1). Wie in Fig. 1 gezeigt, besteht die Membran 2 aus dem verhältnismässig starken Film 4 an vernetztem Hydroxyäthylmethacrylat, in den Urease eingeschlossen ist, und aus einer verhältnismässig dünnen, 0,25 yu starken Schicht 6 von vernetztem Hydroxyäthylmethacrylat, welches frei von Enzym ist. Die enzymhaltige Schicht ist im allgemeinen zumindest zweimal so stark wie die enzymfreie Ueberzugsschicht. Die enzymhaltige Schicht kann beispielsweise O,64 bis 25,4/u stark sein, oder sogar noch .stärker, beispielsweise 635yu oder darüber.

Eine Probe des Urease-haltigen Films wird in ein verschlossenes, mit Stickstoff gespültes Reaktionsgefäss

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gegeben, welches gefüllt ist mit einer Standardlösung aus 1,5 g Harnstoff in 50 ml 0,75 M Phosphatpuffer vom pH 7,0, und zwar bei einer Temperatur von 23⁰C und unter konstantem Rühren mit einem Magnetrührer. Unter Verwendung von Brom-Kresol Grün - Methyl Rot als Mischindikator bis zum purpurnen Endpunkt wird hierauf die Ureaseaktivität ermittelt, und zwar durch Titrieren des in 30 Minuten pro mg Polymer-Enzym-Matrix durch Titrieren mit 0,1 M Salzsäure freigesetzten Ammoniaks. Wöchentliche Proben der Ureaseaktivität unter den gleichen Bedingungen ergeben, dass nach 8 Tagen noch 92 % der Enzymaktivität vorhanden sind und nach einem Monat noch 85 %, und zwar bei Proben mit eingeschlossener Urease, welche bei Raumtemperatur (23⁰C) gehalten werden.

Derartige enzymatisch aktive, zweischichtige Membranen lassen sich mit Erfolg als nicht-thrombogene Dialysiermembrane verwenden, und zwar anstelle der bisher verwendeten, handelsüblichen Dialysiermembrane, falls die hydrophile Schicht von reinem Hydroxyäthylmethacrylat-Polymer die dem Blut ausgesetzte Seite bildet.'

Beispiel 4:

Man arbeitet wie in Beispiel 1 und 2, stellt die Polymer-Matrix jedoch her, indem man das Polymerisationsgefäss mit einem Gemisch aus 120 g 2-Hydroxyäthylmethacrylat, 30 g Vinylpyrrolidon, 0,3 g t-Butylperoctoat und 600 g Methanol beschickt. Aus diesem Ansatz werden in der in Beispiel 3 angegebenen Weise Membrane mit darin eingeschlossener Urease hergestellt, die gegenüber Harnstoff ähnlich aktiv sind.

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Beispiel 5:

Die Oberfläche des Glaszylinders einer kationischen Glaselektrode (Beckman Modell 76) wird überzogen, indem man sie in ein gemäss Beispiel 3 hergestelltes Gemisch aus Urease-Polymer taucht und das ganze dann 10 Minuten mit einer U.V.-Lampe bestrahlt. Man bringt sodann einen weiteren üeberzug aus Polyhydroxyäthylmethacrylat durch Tauchen auf, den man wiederum 10 Minuten mit einer U.V.-Lampe bestrahlt. Die auf diese Weise erhaltene, mit Urease modifizierte Elektrode ist empfindlich gegenüber Ammonium-Ionen, und mit ihr lassen sich Aenderungen in der Konzentration von Harnstoff in wässrigen Lösungen messen. Sie kann ferner auch zur Harnstoff analyse im Blut verwendet werden.

Beispiel 6:

Die in Beispiel 3 beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt, das darin verwendete Enzym ersetzt man jedoch durch Glukose-Oxidase (113 U.I.B. - Worthington Biochemical Corp.), und die Membranen werden auf einen mit einem Dacron-Netz ausgelegten Giesstisch gegossen. Die dabei erhaltene, verstärkte, zweischichtige Membran wird bezüglich ihrer Glukose-Oxidase-Aktivität bei einem pH-Wert von 6,0 untersucht, und zwar unter Verwendung des hochspezifischen Enzyms Meerrettich -Peroxidase, welches das bei der Reaktion von Glukose-Oxidase mit Glukose gebildete Wasserstoffperoxid reduziert, und zwar in Gegenwart eines Farbspenders (o-Dianisidin) , wobei man die Zunahme der Absorption bei 460 m /u. während der ersten 10 Minuten ermittelt . Für diese Unter-

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suchungen werden 1 cm grosse Proben der Glukose-Oxidase-Membran verwendet. Nach 28 Tagen wird die Aktivität der . . eingeschlossenen Glukose-Oxidase gemessen, und zwar ausgedrückt in zu Molen an pro Minute und pro mg Membran, bei 23⁰C verbrauchtem Sauerstoff. Hierbei ergibt sich, dass bei einer Lagerung der Proben bei 5⁰C im angegebenen Zeitraum über 82 % der ursprünglichen Aktivität noch vorhanden sind.

Derartige Membranen, in welche Glukose-Oxidase eingeschlossen ist, eignen sich zur Herstellung automatischer Wahrnehmungsvorrichtungen, welche für Glukose spezifisch sind.

Beispiel 7;

Ein I.V.-Glukosesensor wird hergestellt durch Beschichten der Kathode eines I.V.-Sauerstoff-Sensors (International Biophysics Corp.), indem man diesen in eine gemäss Beispiel 6 hergestellte, Glukose-Oxidase-haltige hydrophile Polymer-Lösung taucht, und das ganze durch 10-minütiges Bestrahlen mit einer U.V.-Lampe in einem Stickstoffstrom trocknet und vernetzt. Im Anschluss daran versieht man das ganze mit einem Aussenüberzug einer gemäss Beispiel ,5 hergestellten Lösung von Hydroxyäthylmethacrylat, worauf man, wie oben beschrieben, trocknet und vernetzt. Diese Vorrichtung ist in Fig. 2 beschrieben. Der Sensor wird dort allgemein mit der Bezugszahl 8 bezeichnet, und er besteht aus einer Kupferkathode 10, die einen ersten üeberzug 12 von etwa 1,27 /u Stärke aus dem Hydroxyäthylmethacrylat-Polymer mit der darin eingeschlossenen Glukose-Oxidase enthält, und ferner einen äusseren, dünneren (0,254/u) starken üeberzug 14 aus dem

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reinen Hydroxyäthylmethacrylat-Polymer. Die Kathode wird in einem Behälter und Isolator 16 aus Plastik, beispielsweise aus Polyäthylen, aufbewahrt. Der mit Blut kompatible Glukose-Sensor wird in die Halsschlagader eines Hundes eingeführt, und die Aenderungen des Blutzuckergehaltes werden während eines Zeitraums von 12 Stunden registriert. Durch Koppeln des mit Glukose-Oxidase modifizierten Sensors mit einem nicht-modifizierten I.V.-Sauerstoff-Sensor kann der Blutglukose-Gehalt reproduzierbar gemessen werden.

Beispiel 8;

Ein Beckman Polarograph-Sauerstoff-Sensor wird modifiziert durch Beschichten der dünnen, sauerstoffdurchlässigen Teflon-Membran (Polytetrafluoräthylen) mit einem 2,54/a starken Film, der zusammengesetzt ist aus einer Matrix unlöslichem, hydrophilem Hydroxyäthylmethacrylat-Polymer, in welches Glukose-Oxidase eingeschlossen ist, und zwar gemäss der in Beispiel 6 beschriebenen Art, wobei man diese zusammengesetzte Membran mit einem Q-Ring als Membranhalter verankert. Der neue Sensor wird an einen Beckman-Labor-Sauerstoffanalysator angeschlossen, und man kann· hierdurch in reproduzierbarer Weise Aenderungen in der Glukose-Konzentration messen, und zwar in wässrigen Lösungen im Bereich von O bis 5 g pro Liter, bei "konstant gelöster Sauerstoff-Konzentration (unterhalb von 500 mm Hg).

Ein verbesserter Glukose-Sensor, der unabhängig ist vom Sauerstoffpartialdruck, wird hergestellt, indem man zwei identische polarographische Sauerstoff-Sensoren miteinander koppelt, von denen der eine durch einen die eingeschlossene Glukose-Amidase enthaltenden Film modifiziert ist. Die

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Differenz aus der Bestimmung des gelösten Sauerstoffs durch die zwei Sensoren steht in linearer Beziehung mit der Glukose-Konzentration in der Lösung. Der Glukose-Sensor zeigt nach einmonatiger Lagerung bei einer Temperatur von unter 5⁰C keinerlei Aktivitätabnahme.

Beispiel 9:

In einem mit einem Magnetrührer versehenen Kolben von 250 ml Fassungsvermögen wird eine Lösung hergestellt aus 50 g Hydroxyäthylmethacrylat, 2 g Ν,Ν-Methylenbisacrylamid und 15 g einer 0,02 M Phosphatpuffer-Lösung. Die so erhal- "-tene Lösung wird mit einer Lösung von 5 g Urease (Crude-Matheson, Coleman und Bell) in 22 g 0,02 M Phosphatpuffer· versetzt, und der Kolbeninhalt wird gründlich durchmischt und durch Einleiten von Stickstoff während 15 Minuten entlüftet. Das Gemisch versetzt man sodann mit 0,25 g Ammoniumpersulfat in 5 ml Wasser, und nach 1 Minute gibt man eine Lösung von 0,25 g Natriumbisulfit in 5 ml Wasser zu. Der Kolbeninhalt wird dann sofort in eine durch zwei, über eine 5 mm starke Gummidichtung voneinander getrennte Glasplatten gebildete. Form gegossen, die sich in einem Wasserbad von 10⁰C befindet. Es kommt sofort zur Polymerisation. Nach 4. Stunden wird die Form geöffnet, und man erhält hierbei ein festes, schaumartiges Polymergel, in welches Urease eingeschlossen ist. Die dicke Gelplatte wird in unregelmässige, 2 bis 3 mm grosse Teilchen zerschnitten. Die Teilchen werden gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen und bei 23⁰C unter vermindertem Druck getrocknet. Die Anwendung der so modifizierten Probe besteht darin, dass man 2 g Polymerteilchen

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mit darin eingeschlossener Urease hydriert und eine Kolonne mit 1 cm Durchmesser mit dem Gel füllt. Die Enzymaktivität wird bestimmt, indem man in die Kolonne 50 ml einer Standardlösung von Harnstoff, wie sie in Beispiel 3 näher beschrieben ist, bei konstanter Geschwindigkeit von 1 ml pro Minute eingiesst, das Eluat unter Stickstoff als Schutzgas auffängt und mit 0,1 N HCl titriert. Die eingeschlossene Urease hat nach 14 Tagen noch 92 % der ursprünglichen Enzymaktivität. Die Gelteilchen kann man ferner mit einer 1,27 λι starken Schicht aus Hydroxyäthylmethacrylat-Polymer überziehen, um so die Lebensdauer bzw. Lagerbeständigkext der ureasehaltigen Teilchen zu erhöhen.

Beispiel 10:

Man verfährt wie bei Beispiel 9, verwendet jedoch ansteile der Urease eine Lipase (Worthington Biochemical Corp.), und giesst das enzymhaltige polymerisierbare Gemisch in Glasröhrchen von 0,8 cm Innendurchmesser. Auf diese Weise erhält man Stäbchen eines Gels mit darin eingeschlossener Lipase. Die Stäbchen werden in dünne Scheiben (1 mm stark) geschnitten und bezüglich ihrer Lipaseaktivität untersucht, und zwar unter Verwendung einer Standardsäule von 1 cm Durchmesser, die mit 2 g (trockenem) lipasehaltigen Gel gefüllt ist. Die Lipaseaktivität .wird ermittelt, indem man durch die Säule bei konstanter Fliessgeschwindigkeit von 1 ml pro Minute eine Lösung von 2 ml Triacetin (5,43 m Mol), 8 ml 3 M Natriumchlorid, 4 ml 0,075 M Calciumchlorid und 36 ml Wasser, eingestellt auf pH 7,0, leitet und die dabei erhaltene Essigsäure mit 0,001 N NaOH titriert.

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Nach 14tägigem Gebrauch beträgt die Enzymaktivität bei Raumtemperatur (23°C) noch 88 % der ursprünglichen Aktivität. Die Haltbarkeit der Scheiben kann verbessert werden, indem man diese mit einem Polymer aus Hydroxyäthylmethacrylat-Aethylendimethacrylat (99,8:0,2) überzieht.

Beispiel 11;

10 g Hydroxyäthylmethacrylat, 8 g Acrylamid,5g Methacrylsäure und 2 g Aethylenglycoldimethacrylat werden mit 20 g destilliertem Wasser bei einem pH-Wert von 7,0 vermischt. Das erhaltene Gemisch versetzt man mit einer Lösung von 1,0 g Urease (50 Einheiten pro mg - Worthington) in 35 g destilliertem Wasser, und der Ansatz wird 15 Minuten lang entlüftet. Sodann werden unter Rühren 0,12 g Ammoniumpersulfat in.5 ml Wasser zugegeben, und nach 1 Minute versetzt man das •ganze mit einer Lösung von 0,12 g Natriumbisulfit in 5 ml Wasser. Das so erhaltene Gemisch giesst man sofort in den Zwischenraum einer aus zwei konzentrischen Glasrohren gebildeten Form, deren grösseres Glasrohr einen Innendurchmesser von 4 mm hat, und deren kleineres Glasrohr einen Aussendurchmesser von 3 mm aufweist, und zwar in Gegenwart eines als Schutzmantel dienenden Dacron-Netzes (12,7 ai). Das durch Polymerisation gebildete Rohr ist in Fig. 3 gezeigt, in welcher das Rohr allgemein mit 18 bezeichnet ist, der Innenhohlraum die Bezeichnung 20 trägt, das enzymhaltige Polymer mit der Zahl 22 angegeben wird und der Schutzmantel aus Dacron (Polyäthylenterephthalat) mit 24 bezeichnet ist. (Um die Lebensdauer des Enzyms zu verbessern, kann das Rohr 18 innen und aussen mit einem hydrophilen, wasserlöslichen Hydroxyäthylmethacrylat-Polymer überzogen sein, welches

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kein Enzym enthält. Zur Steuerung der Geschwindigkeit, mit welcher ein im Inneren des Rohres befindliches Material an das Enzym herangelangen kann, lässt sich ein innerer üeberzug aus einem hydrophilen, wasserlöslichen Hydroxyäthylmethacrylat-Polymer aufbringen).

In einem besonderen Beispiel, und zwar unter Verwendung einer Vorrichtung gemäss Fig. 3, wird eine Lösung von 1OO g Harnstoff pro Liter Wasser durch das Innere des Rohres gedrückt. Die Lösung diffundiert in das im Rohr eingeschlossene Enzym,und an der Aussenseite 26 des Rohres tritt Ammoniak aus. Das Verfahren lässt sich einsetzen, um hierdurch Körperflüssigkeiten von Harnstoff zu reinigen.

Bei einer anderen Ausgestaltung der Erfindung schickt man Stärkelösung durch das Innere des Rohres. Als Enzym ist dabei ct-Amylase eingeschlossen. Die Stärke wird zu Glukose umgewandelt, welche man von der äusseren Oberfläche 26 des Rohres entfernt.

Die Polymerisation wird durchgeführt in einem Wasserbad bei 10°C über einen Zeitraum von 4 Stunden. Das in der Mitte befindliche Glasrohr entfernt man hierauf vorsichtig, und das Polymerrohr wird langsam aus dem äusseren Glasrohr herausgeholt. Das so entstandene Polymerrohr hat einen Innendurchmesser von 3 mm, und verfügt über eine verstärkte Wand von 1 mm Stärke, und in ihm ist aktive Urease eingeschlossen. Wegen der Kompatibilität der hydrophilen Polymer-Matrix gegenüber Blut, und aufgrund der Tatsache, dass eine enzymatische Zersetzung von Harnstoff in der Membranwand zu niedrig

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molekularen Körpern die Dialysiergeschwindigkeit insgesamt beschleunigt, lassen sich diese Rohre für Geräte mit verbesserter Blutharnstoff-Dialyse verwenden, bei welche Blut in in Form einer langen Spule angeordnete Rohre zirkuliert, welche in einem Dialysierbad eingetaucht ist. Die Verwendung nicht—thrombogener,hydrophiler Oberflächen (wie sie beispielsweise gemäss. diesem Beispiel hergestellt werden) im Kontakt mit Blut vermindert oder eliminiert vollständig die Notwendigkeit zum Heparinisieren des Patienten während der Dialyse.

Beispiel 12;

Das Verfahren gemäss Beispiel 9 wird wiederholt, wobei man anstelle von Urease jedoch Trypsin (Worthington Biochemical Corp.) verwendet, und die hydrolytische Wirkung bei 23⁰C sowie einem pH-Wert von 8,0 unter Verwendung von N-co-Benzoyl-L-argeninäthylester als Substrat untersucht. Während einer einmonatigen Lagerung bei 5⁰C gehen maximal 10 % Aktivität verloren. Mit fein zerkleinertem (2 bis 5 mm grossem),das Trypsin einschliessenden Gel-wird eine Säule gefüllt, welche sich verwenden lässt zur Hydrolyse von peptidbrückenhaltigen Verbindungen oder zur Analyse der Aminosäurensequenz. In der Nahrungsmittelindustrie kann man eine solche Vorrichtung verwenden zur Behandlung von Milch, um deren Haltbarkeit zu verbessern.

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Claims

Patentansprüche:

1. Produkt aus einem festen, wasserunlöslichen, hydrophilen Hydroxy-nieder-alkylacrylat-Polymer, Hydroxy-niederalkylmethacrylat-Polyitier, Hydroxy-nieder-alkoxy-nieder- . alkylacrylat-Polymer, Hydroxy-nieder-alkoxy-nieder-alkylmethacrylat-Polymer, Vinylpyrrolidon-Polymer, Acrylamid-Polymer, Methacrylamid-Polymer, N-Nieder-alkylacrylamid-Polymer, N-Nieder-alkylmethacrylamid-Polymer, N-Hydroxy-niederalkylacrylamid-Polymer oder N-Hydroxy-nieder-alkylmethacrylamid-Polymer und einem darin eingeschlossenen En:zym.

2. Produkt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer schwach guervernetzt ist.

3. Produkt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein Hydroxyäthylacrylat-Polymer, Hydroxy- äthylmethacrylat-Polymer, Hydroxypropylacrylat-Polymer oder Hydroxypropylmethacrylat-Polymer darstellt.

4. Produkt nach Anspruch I₁. dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer in einem organischen Lösungsmittel löslich ist.

5. Vorrichtung,gekennzeichnet durch eine verhältnismässig dicke Schicht des Produktes gemäss Anspruch 1, welche zumindest an einer Seite mit einer verhältnismässig dünnen Membranschicht eines enzymfreien, wasserunlöslichen, hydrophilen Hydroxy-nieder-alkylacrylat-Polymers, Hydroxynieder-alkylmethacrylat-Polymers, Hydroxy-nieder-alkoxynieder-alkylacrylat-Polymers, Hydroxy-nieder-alkoxy-

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nieder-alkylmethacrylat-Polymers, Vinylpyrrolidon-Polymers, Acrylamid-Polymers, Methacrylamid-Polyraers, N-Niederalkylacrylamid-Polymers, N-Nieder-alkylmethacrylamid-Polymers, N-Hydroxy-nieder-alkylacrylamid-Polymers oder N-Hydroxy-nieder-alkylmethacrylamid-Polymers überzogen Ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die dünne Membranschicht aus einem mit Gewebe ver- · träglichen, nicht thrombogenen Polymer besteht.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl die dicke Schicht als auch die dünne Schicht aus·Hydroxyäthylacrylat-Polymer, Hydroxyäthylmethacrylat-Polymer, Hydroxypropylacrylat-Polymer oder Hydroxypropylmethacrylat-Polymer bestehen.

8.- Vorrichtunq nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran 5 bis 500^u stark ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die dünne Membran 10 bis 50 /a. stark ist, und die dicke Schicht zumindest zweimal so stark ist wie die dünne Membran.

10. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die verhältnismässig dünne Membranschicht nur an einer Seite der verhältnismässig starken Schicht aufgezogen ist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die verhältnismässig starke Schicht vollkommen von der verhältnismässig dünnen Schicht eingeschlossen wird.

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12. Produkt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die Form eines hohlen Rohres hat.

13. Produkt nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es durch darin eingebettete Fasern verstärkt ist.

14. Vorrichtung nach Anspruch 12, gekennzeichnet durch einen verhältnismässig dünnen inneren Membranüberzug aus einem enzymfreien, wasserunlöslichen, hydrophilen Hydroxynieder-alkylacrylat-Polymer, Hydroxy-nieder-alkylmethacrylat-Polymer, Hydroxy-nieder-alkoxy-nieder-alkylacrylat-Polymer, Hydroxy-nieder-alkoxy-nieder-alkylmethacrylat-Polymer, Vinylpyrrolidon-Polymer, Acrylamid-Polyitier, Methacrylamid-Polymer, N-Nieder-alkylacrylamid-Polymer, N-Nieder-alkylmethacrylamid-Polymer, N-Hydroxy-nieder-alkylacrylamid-Polymer oder N-Hydroxy-nieder-alkylmethacrylaraid-Polymer.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der dünne Ueberzug aus einem mit Gewebe verträglichen, nicht thrombogenen Polymer besteht.

16. Elektrode, gekennzeichnet durch einen auf ihr befindlichen ersten Ueberzug eines Produktes gemäss Anspruch 1 und einen darüber angeordneten zweiten Ueberzug aus einer verhältnismässig dünnen Membran eines enzymfreien, wasserunlöslichen, hydrophilen Hydroxy-nieder-alkylacrylat-Polymers, Hydroxy-nieder-alkylmethacrylat-Polymers, Hydroxy-niederalkqxy-nieder-alkylacrylat-Polymers, Hydroxy-nieder-alkoxynieder-alkylmethacrylat-Polymers, Vinylpyrrolidon-Polymers, Acrylamid-Polymers, Methacrylamid-Polymers, N-Nieder-

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alkylacrylamid-Polymers, N-Nieder-alky!methacrylamid-Polymers, N-Hydroxy-nieder-alkylacrylamid-Polymers oder N-Hydroxy-nieder-alkylmethacrylamid-Polymers.

17. Verfahren zur Herstellung des Produktes nach Anspruch l_r dadurch gekennzeichnet, dass man ein entsprechendes Monomer mit dem darin dispergierten Enzym bei Temperaturen von nicht über 1O°C polymerisiert.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass man bei Temperaturen zwischen -5⁰C und +5⁰C arbeitet.

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