DE2539657A1

DE2539657A1 - Biologisch aktives membranmaterial, enzymsaeule mit dem membranmaterial und verwendung des membranmaterials

Info

Publication number: DE2539657A1
Application number: DE19752539657
Authority: DE
Inventors: Stanley M Goldin; Chung Jung Lai
Original assignee: Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 1974-09-06
Filing date: 1975-09-05
Publication date: 1976-03-18
Also published as: US4066512A; JPS5857151B2; GB1521289A; JPS5154980A; FR2283903A1; CA1056746A; FR2283903B1

Description

Millipore Corporation, BEDFORD (Massachusetts), V.St.A.

Biologisch aktives Membranmaterial, Enzymsäule mit dem Membranmaterial und Verwendung des Membranmaterials.

Die Erfindung betrifft katalytische Filter. Insbesondere betrifft die Erfindung eine polymere, mikroporöse Matrix bzw. ein polymeres, mikroporöses Grundmaterial, auf das ein biologisch aktives Mittel, z.B. ein Enzym oder ein Antikörper, zur Durchführung der Katalyse aufgebracht wird, wenn reaktive Materialien mit da?Matrix entweder durch Massenstrom (bulk flow) oder durch Diffusion in Berührung kommen.

Die polymere, mikroporöse Matrix wird verschiedentlich im vorliegenden Zusammenhang als mikroporöses Membranfilter bezeichnet, da derartige Materialien eine Weiterverwendung für Filtrationen gefunden haben.

Es ist bekannt, daß Enzyme als Katalysatoren für bestimmte biochemische Reaktionen wirken können. Jedoch ist die Wiedergewinnung von Enzymen aus Lösungen, in die sie eingesetzt wurden, um als Katalysator zu wirken, oft so komplex und schwierig, daß die Verwendung von Enzymen als Katalysatoren bei biochemischen Reaktionen nicht über die Laborstufe hinaus gegangen ist. Ein weiteres Problem beider Verwendung von Enzymen

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als Katalysatoren besteht darin, daß Enzyme eine relativ kurze Lagerfähigkeit besitzen. Diese kurze Lagerfähigkeit ist wesentlich, da Enzyme äußerst teuer und schwer zu erhalten sind, insbesondere mit hoher Reinheit.

Es ist bekannt, daß das Wiedergewinnungsproblem als auch das Problem der Enzymlagerfähigkeit weitgehend vermieden wird, wenn das Enzym an die Oberfläche unlöslicher Substanzen gebunden wird. Wenn ein Enzym an eine derartige Oberfläche gebunden ist, wird die Lösung mit einem Gehalt an Reaktionsteilnehmern, für die das Enzym Katalysator ist, über die Oberfläche geführt, an die das Enzym gebunden ist, so daß das Enzym die Reaktion katalysieren kann. Da das Enzym in situ gebunden wurde, verbleibt es bei dieser Arbeitsweise an seinem Ort und ist eine Wiedergewinnung aus der Reaktionslösung nicht erforderlich. Zusätzlich wurde festgestellt, daß gebundene Enzyme eine längere Lagerfähigkeit als Enzyme in Lösung besitzen.

Eine bekannte Methode zum Binden eines Enzyms an eine Oberfläche besteht darin, daß man einen filmartigen, nicht-porösen Träger verwendet, der mit Enzymen einen Komplex bildet und sich mit ihnen verbindet, so daß enzymatische Reaktionen durchgeführt werden können, indem man die Reaktionsteilnehmer über die Membran bzw. den Film führt. Bei dieser bekannten Arbeitsweise werden Enzyme an eine dünne Proteinmembran gebunden bzw. auf ihr unbeweglich gemacht, die aus einem Protein gebildet ist, z.B. aus Kollagen oder Zein. Das jeweilige Enzym wird an die Membran gebunden, nachdem die Membran mit einer schwachen Säure gequollen wurde. Die vorstehende Arbeitsweise zum Katalysieren von Reaktionen mit gebundenen Enzymen weist eine Anzahl von Machteilen auf, von denen der bedeutendste darin besteht, daß bei derartigen nicht-porösen Filmen die Menge des Katalysators, die pro Einheitsvolumen gebunden werden kann, unbefriedigend klein ist. So muß man eine große Menge dieser bekannten nicht-porösen Struktur einsetzen, um eine bestimmte katalytische Kapazität zu erzielen.

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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein inertes Polymermaterial vorzusehen, an das ein biologisch aktives Mittel gebunden ist und das Reaktionsteilnehmer durchläßt.

Ferner ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine mikroporöse, polymere Membran vorzusehen, an die ein Enzym gebunden werden kann und die den Kontakt zwischen dem Enzym und Reaktionsteilnehmern fördert, wenn die Reaktionsteilnehmer durch die Membran strömen.

Weiter ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein mit Enzym überzogenes, polymeres Substrat vorzusehen, das reaktives Material durchläßt und katalysiert.

Schließlich ist es Aufgabe der Erfindung, eine neue Säule vorzusehen, die ein biologisch aktives Mittel enthält, das auf einer polymeren, mikroporösen Matrix unbeweglich gemacht wurde.

Die Größe der katalytischen Fläche für die Reaktionsteilnehmer wird mit dem biologisch aktiven, porösen Membranmaterial gemäß der Erfindung beträchtlich erhöht, an das das biologisch akti- ■ ve Mittel bzw. der Katalysator durch ein Protein zu einem hochmikroporösen, polymeren Material gebunden ist.

Die Erfindung betrifft also ein Material aus einer mit einem Protein überzogenen, mikroporösen, polymeren Membran und einem biologisch aktiven Mittel, das mit dem Proteinmaterial einen Komplex bildet. Die polymere, mikroporöse Membran ist biologisch inaktiv. Ein typisches Beispiel für ein biologisch aktives Mittel stellt ein Enzym dar.

Erfindungsgemäß werden Säulen vorgesehen, die sich aus Schichten des Materials zur Durchführung vorteilhafter biochemischer Reaktionen aufbauen, und spezifische Tests für Harnsäure und Glucose unter Verwendung des Materials als auch eine Vorrichtung beschrieben, die zur Durchführung der Tests vorteilhaft ist.

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Fig. 1 stellt eine perspektivische Ansicht in auseinandergezogener Anordnung einer Enzymsäule gemäß der Erfindung dar;

Fig. 2 stellt eine Vorderansicht einer Enzymsäule gemäß der Erfindung dar;

Fig. 3 stellt eine Fig. 2 entsprechende Ansicht zum Teil im Schnitt dar;

Fig. 4 stellt eine Schnittansicht längs der Linie H-H der Fig. dar; und

Fig. 5 stellt eine Schnittansicht längs der Linie 5~5 der Fig. dar.

Die Erfindung betrifft ein katalytisches Material mit einem Substrat, bei dem es sich um eine mikroporöse, polymere Membranmatrix handelt, an die ein biologisch aktives Mittel gebunden ist. Das aktive Mittel ist an die poröse, polymere Matrix durch ein inertes Protein gebunden.

Filtermembranen, die als Substrate für die biologisch aktiven Mittel verwendet werden können, sind in großem Umfang bekannt und können entsprechend der Arbeitsweise der US-PS 1 421 3^1 (Zsigmondy et al.) und der US-PS 2 783 894 (Lovell et al.) hergestellt werden, wobei auf die Lehren dieser Patentschriften im vorliegenden Zusammenhang Bezug genommen wird. Diese Membranen werden verwendet, um Teilchen aus flüssigen Medien mit einem hohen Präzisionsgrad bei hohen Strömungsgraden durch die Membran wiederzugewinnen. Wenn überhaupt, dann bieten nur einige andere Abtrennmaterialien derart viele mögliche Anwendungen, da die genannten Filtermembranen hinsichtlich ihrer Anwendung lediglich durch die Anzahl makromolekularer, gelöster Stoffe begrenzt sind, die in speziellen Situationen von Interesse sind. Eine sterilisierende Filtration biologischer Materialien, eine Filtration hydraulischer flüssiger Medien zum Entfernen feinteiliger Materialien und das Sammeln von Bakterien für Wasseranalysen sind typische Anwendungen.

Bei den Membranfiltern, die als Substrat für biologisch aktive Mittel gemäß der Erfindung verwendet werden, handelt es sich

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um dünne, poröse Strukturen, die sich aus reinen und biologisch inerten Celluloseestern oder ähnlichen Polymermaterialien zusammensetzen. Sie werden in der Technik mit vielen verschiedenen Porengrößen von 14 Mikrometern bis 25 Nanometern (0,025 Mikrometer) und in Scheiben mit einem Durchmesser im Bereich von 13 bis 293 mm hergestellt. Sie können natürlich in irgendeine gewünschte Form gebracht werden.

Die Poren dieser Membranfilter besitzen eine außerordentlich gleichmäßige Größe. Z.B. beträgt der Gesamtbereich der Porengrößenverteilung bei einem im Handel erhältlichen Membranfilter mit einer mittleren Porengröße von 0,45 Mikrometern - 0,02 Mikrometer. Jeder Quadratzentimeter der Membranfilterfläche weist Millionen von kapillaren Poren auf, die etwa 80 % des gesamten Filtervolumens ausmachen.

Wie vorstehend ausgeführt wurde, ist das biologisch aktive Mittel an das poröse, polymere Filter durch ein Material gebunden, bei dem es sich beispielsweise um ein in Wasser unlösliches Protein handelt. Zwei brauchbare inaktive Proteine zum Binden von Enzymen und Antikörpern an die polymere Membran stellen Zein und Kollagen dar.

Bei Zein handelt es sich um das Prolamin (ein alkohollösliches Protein) von Korn. Es ist das einzige im Handel erhältliche Prolamin und eines der wenigen leicht erhältlichen Pflanzenproteine. Zein tritt hauptsächlich im Endosperm des Samenkorns auf. Die Menge des alkohollöslichen Proteins steht in unmittelbarem Zusammenhang mit dem Gesamtendospermproteingehalt, wobei der Zeingehalt im Bereich von 2,2 bis 10,4 % der Trockenmasse verschiedener Kornproben liegt.

Zein ist durch den relativen Mangel an hydrophilen Gruppen im Vergleich mit den meisten Proteinen gekennzeichnet. So trägt der hohe Anteil an nicht-polaren (Kohlenwasserstoff-) und Säureamidseitenketten zur Löslichkeit des Zeins in organischen Lösungsmitteln bei und rechtfertigt seine Klassifizierung als Prolamin.

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Ein technisches Zein ist Areo Zein G-200 der Corn Products Refining Company, Argo, Illinois.

Kollagen stellt ein Hydroxyprolin ein Protein vorn Glycintyp dar, das der hauptsächliche organische Bestandteil von tierischem Bindegewebe und Knochen ist. Es kann in guten Ausbeuten aus einer Vielzahl von Säugetier- und Pischteilen erhalten werden und es wird oft aus Schweine-, Schaf- und Rindersehnen, Schweinehäuten, Gerbereimaterialien, bei denen es sich um nicht für Leder brauchbare Kälberhäute handelt, und Knorpelleim erhalten ,bei dem es sich um Gewebe handelt, das durch Trocknen von Rinderknochen erhalten wird und nach der Säurebehandlung zum Entfernen von Calciumphosphat zurückbleibt.

Obgleich Kollagen und Zein bevorzugte Materialien zum Binden des Enzyms an die polymere Matrix darstellen, sind auch andere Proteine und Polypeptide brauchbar. Zu anderen Beispielen brauchbarer, in Wasser nicht-löslicher, natürlicher Proteine gehören Fibrinogen, Keratineund Gluteline. Zu Beispielen geeigneter synthetischer Polypeptide gehören Polyisoleucin, Polytryptophan, PoIyphenylalanin, Polytyrosin und Mischpolymere von Leucin mit p-Aminophenylalanin. Es können auch einige wasserlösliche Proteine, die wasserunlöslich gemacht werden können, zum Binden von Enzymen verwendet werden.

Die Wahl des jeweiligen synthetischen Polypeptids bzw. natürlichen Proteins (in modifizierter oder unmodifizierter Form) wird weitgehend durch die Natur des Enzyms (oder Antikörpers) und des Reaktionsmilieus bestimmt, die angetroffen werden. Wegen ihrer inerten Eigenschaften gegenüber einer großen Anzahl von Enzymen sind Kollagen und Zein bevorzugte natürliche Proteinmaterialien.

Es können viele verschiedene Enzyme unterschiedlichen Typs an polymere Filtermembranen mit natürlichen Proteinen, wie Kollagen und Zein, gebunden werden. Zu geeigneten Enzymen gehören beispielsweise Amylasen, Lysozym, Invertase, Urease, Uricase,

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Cellulasen, Catecholraethyltransferase, Sucrose-6-glucosyltransferase, Hexokinase, Carboxylesterase, D-Nase, Arylesterase, Lipase, Pectinesterase, Glucoamylase, Amylopectin-1, 6-Glucosidase, Oligo-1, 6-Glucosidase, Polygalacturonase, alpha-Glucosidase, ß-Glucosidase, ß-Galactosidase, Glucoseoxydase, Galactoseoxydase, Catecholoxydase, Catalase, Peroxydase, Lipoxydase, Glucosei.somerase, Pentosanasen, Cellobiase, Xyloseisomerase, Sulfitoxydase, Äthanolaminoxydase, Penicillinase, Kohlensäureanhydrase (carbonic anhydrase), Gluconolactonase, 3~Ketosteroid-ZA-dehydrogenase, 11-ß-Hydroxylase, Aminosäureacylasen und Glucose-6-phosphatdehydrogenase. Es können auch verträgliche Kombinationen von Enzymen und Mehrfachenzymsystemen mit dem Kollagen in dieser Weise Komplexe bilden. Zu Beispielen gehören Hexokinase mit Glucose-6-phosphatdehydrogenase und Hexokinase mit Glucoseoxydase.

Besonders geeignet sind jedoch Lysozym, Invertase, Urease und Amylasen. Lysozym wird weitgehend zum Hydrolysieren von Mikroorganismen in der pharmazeutischen Forschung und bei der Abwasserbehandlung entweder allein oder in Kombination mit anderen Enzymen und/oder Bakterien verwendet. Eine besonders wichtige Anwendung für den Lysozym-Protein-Membrankomplex besteht in der Auflösung (lysis) von Zellen.

Invertase oder ß-D-Fructofuranosidase wird weitgehend in der Nahrungsmittel- und Getränkeindustrie als auch für analytische Zwecke verwendet. Invertase kann zum Katalysieren der Hydrolyse von Rohrzucker zu Glucose und·Fructose oder Invertzucker verwendet werden. Invertase ist bei der Hydrolyse von ß-D-Fructofuranosylbindungen von Rohrzucker, Raffinose, Gentianose und Methyl- und ß-Fructofructose wirksam. Eine besonders wichtige Anwendung für einen Invertase-Protein-Membrankomplex besteht in der kontinuierlichen Hydrolyse von Rohrzucker.

Bei Urease handelt es sich um ein hochspezifisches Enzym, das die Umwandlung von Harnstoff in Ammoniumcarbonat katalysieren kann und das oft zum Bestimmen des Harnstoffgehalts in Urinproben

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verwendet wird. Wegen seiner hohen spezifischen Aktivität besteht ein Vorteil der Urease-Protein-Komplexmembran in der Verwendung für künstliche Nieren (kidney machine). Insbesondere können Urease-Protein-Komplexmembranen für die wiederholte Hydrolyse von Harnstoff verwendet werden, z.B. zur Behandlung von von Menschen herrührenden Abfällen.

Alpha-Amylase wird als "verflüssigendes Enzym" bezeichnet, und es ist bekannt, daß sie Stärke, Glycogen und Dextrane unregelmäßig (randomly) hydrolysiert. ß-Amylase kann Maltose aus Zucker, Glycogen und Dextran bilden. Zu anderen geeigneten Amylasen gehören alpha-Glucosidase, Amyloglucosidase, Amylo-1, 6-alpha-glucosidase (Verzweigungen trennendes Enzym), Oligo-1, 6-glucosidase (limit dextrinase), Isomaltase und Isotriase. Im vorliegenden Zusammenhang bezeichnet der Ausdruck "Amylase" allgemein eine oder mehrere dieser und anderer Amylasen. Eine besonders wichtige Anwendung des Amylase-Protein-Komplexes gemäß der Erfindung besteht darin, daß man kontinuierlich ein Stärkesubstrat über die enzymatisch aktive Membran führt, um eine kontinuierliche Hydrolyse von Stärke zu erzielen.

Es können verschiedene Enzyme gleichzeitig mit der Proteinmembran komplex gebunden werden. Z.B. ist es sehr erwünscht, alpha-Amylase mit andersartigen Enzymen komplex zu binden, da alpha-Amylase unregelmäßig Stärkemoleküle auftrennen kann, so daß reaktive Stellen für andere spezifischere Enzyme vorgesehen v/erden.

Arbeitsweisen zum Auftragen eines inerten Proteins auf eine mikroporöse, polymere Membran gemäß der Erfindung sind in den folgenden Beispielen 1 und 2 beschrieben.

Beispiel 1

Es wurde eine Zeinlösung durch Vermischen von 18 ml A'thanol, 3¹J ml n-Butanol, 8 ml Wasser, 3 ml Cellosolve als Lösungsmittel und 7,9 g Zein hergestellt. Zein löst sich leicht in den vorstehend angeführten Lösungsmitteln und die Lösung kann bei Raum-

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temperatur (20 ⁰C) hergestellt werden. Die Lösung wurde eine ausreichende Zeit lang gemischt, damit alles Zein gelöst war.

Danach wurde ein mikroporöses, polymeres Filter mit der Zeinlösung getränkt. Es wurde ein Filter vom'SS"-Typ mit einer Durchschnittsporengröße von 3,0 ium (Mikrometer) verwendet (Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts). Das Filter verblieb in der Lösung etwa 24 h lang bei Raumtemperatur. Das überzogene Filter wurde danach an der Luft getrocknet.

Beispiel 2

Es wurde ein mit Kollagen überzogenes Filter mit einer Kollagenlösung aus 0,7 g säurelöslichem Kollagen in 80 ml 0,1 η Essigsäure hergestellt. Ein mikroporöses, polymeres Membranfilter wurde mit der Kollagenlösung etwa 24 h lang getränkt. Vor der Komplexbildung mit einem Enzym oder einem Antikörper wurde das mit Kollagen überzogene Filter danach an der Luft getrocknet,

Die Arbeitsweise, um ein biologisch aktives Mittel, wie ein Enzym, auf einem mit einem Protein überzogenen polymeren Filter komplex zu binden, ist recht einfach. Nachdem das mit Protein überzogene Filter zur Komplexbildung gemäß der vorstehenden Arbeitsweise zubereitet wurde, wurde das mit Protein überzogene Filter mit einer Lösung eines Enzyms etwa 48 h lang in Eerührung gebracht. Es wird angenommen, daß sich während dieser Zeit sekundäre Bindungen, die sich zuvor zwischen Proteinmolekülen ausbildeten (Kollagen-Kollagen-Bindungen oder Zein-Zein-Bindungen),zwischen dem Enzym und dem inaktiven Proteinüberzug bilden (Kollagen-Enzym-Bindungen oder Zein-Enzym-Bindungen). Jedoch ist der genaue Mechanismus, durch den das Enzym an den Filter gebunden wird, nicht genau bekannt.

Die Bindung zwischen dem Enzym und dem inaktiven Proteinüberzug ist jedoch fest. Es treten keine chemischen Reaktionen, die für die Enzymaktivität nachteilig sind, während der Komplexbildung auf. So wird da3 Enzym fest an den Filter mit einem minimalen Aktivitätsverlust gebunden .

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Die Arbeitsweise, um ein Enzym an einen mit Protein überzogenen Filter komplex zu binden, kann variieren. In jedem Fall wird die Membran jedoch in einer wässerigen, enzymhalt igen Lösung gehalten, bis die Komplexbildung eintritt. Im allgemeinen ist die Komplexbildung nach einer Zeitspanne von 10 h bis 2 Tagen vollständig. Die Temperatur soll während dieser Zeit im Bereich von *1 bis 20 C in Abhängigkeit von dem jeweils verwendeten Enzym gehalten werden. Die maximale Komplexbildung mit dem Enzym wird durch die Aktivität des Materials gemessen, an das es nach dem Waschen gebunden ist. So kann die Knzymaktivität verwendet werden, um anzuzeigen, wann die Komplexbildung vollständig ist. Das mit Enzym überzogene Material wird vorzugsweise bei Raumtemperatur oder darunter getrocknet, um das gebundene Enzym nicht zu beeinträchtigen.

Die Fähigkeit eines mit Zein überzogenen Filters, Enzyme beständig unbeweglich zu machen, und die Fähigkeit dieses Materials, eine Reaktion von Reaktionsteilnehmern zu katalysieren, die durch die Poren des Filters durchtreten, wurde mit Invertase, D-Nase und Urlcase in den folgenden Beispielen 3, ^ und 5 veranschaulicht.

Beispiel 3 Invertase

Es wurden vier Zein-Invertase-Komplexfilter aus einer Invertaselösung (12,5 mg/ml Invertaserohpräparat) genommen und nacheinander angeordnet. Es wurden 25 ml einer 6 >o-igen Kohrzuckerlösunr durch das Filter geleitet, indem man die durch die Schwerkraft bedingte Ströirungsrate drosselte, wobei man eine durchschnittliche Verweilzeit von 9 bis 24 Sekunden für jede Portion des Materials wählte, die durch den Stapel der Filter durchtrat. Der Filterstapel wurde sorgfältig mit 50 ml V/asser zwischen jedem Versuch gewaschen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

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ο ίο co

Versuch 1 2 3 4

ungefähre

Verweilzeit

(sec) 9 18 24 9 18 24 9 18 24 9 18 24 9 18

U) Umsetzung 92 92 77 46 80 30,7 50 85 30,7 50 72 34,5 46

Zwischen den Versuchen 4 und 5 wurde der gesamte Reaktor auseinandergenommen, wobei jedes Filter sorgfältig gewaschen und in willkürlicher Reihenfolge wieder eingesetzt wurde.

Beispiel 4 D-Nase

Es wurden 6 Zein-D-Nase-Komplexfilter mit einer D-Naselösung (5 mg/ml) hergestellt und zu einem Stapel angeordnet. Die Menge der D-Nase, die nach Spülungen mit destilliertem Wasser ausgelaugt wurde, nahm rasch ab, wie nachstehend gezeigt wird.

durchgeleitetes destilliertes ausgewaschene D-Nase Wasser (aliquote 10 ml-Portionen)

(ml) (mg)

10 4,20

20 0,90

30 . 0,40

40 0,12

50 0,01 60

Es wurde eine DNA-Lösung (0,82 mg/ml) danach durch den Filterstapel geschickt. Das Ergebnis ist nachstehend zusammengestellt (es wurde kein DNA vom Filter zurückgehalten).

Rate der Strömung der Lösung Umsetzung (%; gespaltene durch das Filter Phosphodiesterbindungen

in *)

(ml/min)

0,250 54

0,167 . 7B⁺

0,250 52

0,250 . 54

infolge längerer Verweilzeit

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Die Filter gemäß der Erfindung, die gebundene Enzyme enthalten, lassen sich vielfältig anwenden. Einige Anwendungen für die Filter gemäß der Erfindung sind in den folgenden Beispielen angeführt.

Beispiel ^ Alkoholische Getränke

A. Durch die Anwendung von matrixgebundenen Enzymen kann die Fermentation von Glucose zu Alkohol erreicht werden, ohne daß Hefe zum System zugegeben werden muß.

B. Durch die Anwendung von matrixgebundenem Lysozym und matrixgebundener alpha-Amylase kann Hefe bis zu dem Punkt zersetzt werden, bei dem das Getränk kaum zum Verstopfen von Filtern neigt, so daß die Getränkefiltration in vorteilhafter Weise wirtschaftlicher wird.

Beispiel 6 Erdöl/Kraftstoffe

Es wurden umfangreiche Untersuchungen hinsichtlich der Fähigkeit bestimmter Bakterien durchgeführt, Erdöldestillate zu metabolisieren und sie in Proteine überzuführen. Durch Binden metabolischer Enzyme können diese Umsetzungen wirtschaftlicher und effektiver ohne Einsatz von Bakterien durchgeführt werden, wodurch eine neue und billige. Nahrungsquelle geschaffen wird.

Beispiel 7 Pharmazeutika/Toilettenartikel (Toiletries)

A. Indem man ein Antigen (eher als ein Enzym) an eine Oberfläche bindet, kann der jeweilige menschliche Antikörper, der für das Antigen spezifisch ist, isoliert werden; das bedeutet, daß das Antigen selektiv den Antikörper bindet. Der Antikörper kann da-

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nach durch Waschen der Säule mit 0,1 η Kaliumiodid oder einem anderen den Komplex trennenden Mittelfreigesetzt werden, wodurch der reine Antikörper zur Verwendung als Arzneimittel oder für weitere Untersuchungen gewonnen wird.

B. Ein matrixgebundener Antikörper kann wiederholt zum Isolieren des jeweiligen Antigens verwendet werden.

C. Indem man Enzyme, wie D-Nase und R-Nase, in eine Matrix einverleibt und einen viralen Impfstoff (auf Basis von DNA oder RNA) durch eine Säule leitet, kann das genetische Material im Impfstoff inaktiviert werden, während die Antigenaktivität beibehalten wird, da die viralen Proteine nicht beeinträchtigt werden.

D. Indem man Lysozym in eine unlösliche Matrix einverleibt, können Suspensionen routinemäßig und billig geklärt werden, indem man die Zellwandungen auflöst (lysing). Eine folgende Ultrafiltration oder Membranfiltration kann die Reste entfernen.

Beispiel 8 Andere Nahrungsmittel und Getränke

A. Indem man Invertase unlöslich macht, kann die Hydrolyse von Rohrzucker zu Glucose und Fructose (invertierter Zucker) für Getränke und Sirup katalysiert werden.

B. Indem man mit Papain hydrolysiert und auf diese Weise bestimmte Fischproteine löslich macht,die bisher verworfen werden, können wertvolle, hoch-proteinhaltige Getränke hergestellt werden.

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Beispiel 9 Medizinische und klinische Anwendungen

A. Viele enzymatische Reagenzien werden jetzt für routinemäßige klinische Diagnosen und analytische Bestimmungen verwendet. Indem man diese Enzyme unlöslich macht, kann ein rasch arbeitendes, wiederverwendbares System zur Durchführung der folgenden klinischen Tests hergestellt v/erden.

1. Glucose-6-phosphatdehydrogenase kann in Kombination mit Hexokinase zur Ermittlung von Glucose durch die NAD-NADII-Verschiebung ermittelt werden. Diese kann spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 3^0 Nanometern beobachtet werden.

2. LDH kann polarographisch durch Verwendung einer Enzymelektrode ermittelt werden. Bei dem gebundenen Enzym handelt es sich um Lactatoxydase.

3. Messungen der Konzentration von Harnsäure im Blutserum in der in Beispiel 5 beschriebenen Weise mit Uricase.

Ij. DPN-Diaphorase für LDH-Messungen. 5. Urease für Harnstoffbestimmungen.

B. Gebundene Enzyme, die in den Blutstrom eingeführt oder eingeschlossen werden, können zur Behandlung von Enzymmangelerscheinungen verwendet werden, z.B. Phenylketomzrie.

C. Urease kann verwendet'werden, um Harnstoff in UU₁^ +HCO, umzuwandeln, wodurch das Blut durch Abbau von Harnstoff chemisch entgiftet wird.

Zusätzlich zu den vorstehend angeführten Anwendungen gibt es viele andere Anwendungen für gebundene Enzyme. Z.B. wird natürlich jeder beim Studium der Natur enzymatischer Reaktionen vom

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Unlöslichmachen der angesprochenen Enzyme profitieren. Ferner wird derjenige, der routinemäßig biochemische Prozesse mit einer Proteolyse oder einer Zellmembranzerlegung durchführt, von einem System profitieren, das gebundene Proteinase bzw. Lysozym enthält. Zusätzlich könnte derjenige, der eine rasche Durchführung einer komplexen Reihe biochemischer Reaktionen wünscht, verschiedene gebundene Enzyme nacheinander anordnen (connect in series), um dieses Reaktionsschema viel leichter durchzuführen und seine Ausbeute zu erhöhen.

Natürlich finden membrangebundene Enzyme gemäß der Erfindung eine weite Anwendung bei klinischen Diagnosen. Z.B. scheint die Anwendung von Enzymprüfarbeitsweisen zum Ermitteln verschiedener Metabolite in Körperflüssigkeiten in den letzten Jahren recht populär geworden zu sein. Zu derartigen Enzymprüfarbeitsweisen, die vorteilhaft mit dem Filter der vorliegen den Erfindung verbessert werden können, gehören:

1. Die Bestimmung von Blutalkohol nach dem folgenden Schema: Äthylalkohol ♦ NAD Alkoholdehydrogenase _{Acetaldehyd + NADH}

Die NAD-NADH-Verschiebung kann spektrophotometrisch bei Manometern ermittelt werden, wie vorstehend beschrieben wurde.

2. Bestimmung von Serumlactat für die Diagnose von Angstneurosen:

LDK
Lactat + NAD ■■* Pyruvat(benztraubensaures Salz) + NADH

Wiederum kann die NAD-NADH-Verschiebung in der beschriebenen Weise bestimmt werden.

Es wurde gezeigt, daß die Aktivität verschiedener Enzyme (wie D-Nase, Invertase) über Wochen in einem Bereich von - einigen Prozent des Ausgangswerts stabil ist; es wurde gezeigt, daß Uricase, die erfindungsgemäß gebunden ist, über eine Zeitspanne von 5 Monaten stabil ist, wenn sie in der Kälte (U ⁰C) aufbe-

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wahrt und bei Raumtemperatur verwendet wird. Es wurde kein oberer Zeit g renzwert für die Stabilität ermittelt. Die Aktivität wird bestimmt, indem man lediglich das Substrat bei einer konstanten Strömungsrate durch die Poren eines Membranfilter-Enzym-Komplexes führt und für die Aktivität (wie angegeben) die Umwandlung des Substrats in das Produkt ermittelt.

Eine wesentliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt eine Enzymsäule mit aktivem Membranmaterial dar. Eine derartige Säule ist in den Fig. 1 bis 5 dargestellt und weist eine Küvette 60, ein unteres Säulensegment 62 und ein oberes Säulensegment 64 auf. Die Säule 66 ist derart dimensioniert, daß sie in eine Zentrifuge eingesetzt werden kann. Die Küvette 60 und die Segmente 62 und 6¹J werden aus einem transparenten Kunststoffmaterial geformt, z.B. aus Polystyrol. Die unteren Enden der Segmente 62 und 64 werden mit Stützringen 68 bzw. 70 versehen. Die Stützringe 68 und 70 haben zwei Funktionen. Sie stellen ein Kupplungselement für die Küvette 60 mit dem unteren Segment 62 und für das untere Segment 62 mit dem oberen Segment 64 dar. Sie tragen ferner Filtermembranen 72 und 74. Wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird, handelt es sich bei dem Vorfilter 72 um ein Membranfilter mit einer Durchschnittsporengröße von 0,45 lim und bei d_;em Filter 74 um eine Membran, die mit einem Enzym gemäß der -Erfindung imprägniert wurde. Der Zweck des Vorfilters 72 besteht darin, eine Verstopfung des Filters 74 zu verhindern.

Wie man Fig. 1 entnehmen kann, sind der obere Abschnitt der Küvette und das untere Säulensegment mit Schlitzen 80 bzw. 82 versehen. Der Einsatz eines Schlitzes unterhalb eines Filters wird als vorteilhaft angesehen, um einen geeigneten Durchfluß des Filtrats durch das Filter vorzusehen. Das obere Säulensegment 64 ist gleichfalls mit einem Schlitz 84 dargestellt. Der Grund für diesen Schlitz des oberen Säulensegments besteht darin, daß es an die Stelle eines unteren Süulersegments eingesetzt werden kann. Da kein Filter oberhalb des Schlitzes 84 angeordnet ist, dient dieser Schlitz keinem anderen Zweck als

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dem, das obere Säulensegment anstelle eines unteren Säulensegments einsetzen zu können. Die Säulensegmente sind auch mit Schultern versehen, in die Teflondichtrinpe 36 und 88 passen. An dieser Stelle soll festgehalten werden, daß in der Zeichnung ein einziges Filter 7¹I unter dem unteren Säulensegment dargestellt ist. Aus der folgenden Beschreibung geht klarer hervor, daß es vorteilhaft ist, einen Stapel biologisch aktiver Filter vorzusehen, um die Verweilzeit der Probe zu erhöhen, die durch das Filter 7*J strömt. Der Einfachheit halber ist jedoch nur ein aktives Filter 7^ in der Zeichnung dargestellt.

Analysen, für die eine Enzymsäule gemäß der Erfindung verwendet wird, sind solche, die die Gesamtveränderung zwischen Endpunkten messen. Wenn z.B. die Substanz alpha bestimmt werden soll und in ß bei der enzymatischen Reaktion alpha --> ß übergeführt v/erden kann und alpha und ß unterschiedliche, charakteristische Absorptionsspektren besitzen, dann stellt der Unterschied der optischen Absorption bei einer bestimmten Wellenlänge zwischen einer Probe, die mit einem Enzym umgesetzt wurde, und einer unumgesetzten Probe ein Maß für die alpha-Konzentration dar, die ursprünglich vorlag. Bei dieser Art der Messung ist die Verweilzeit ausreichend, damit die Umsetzung vollständig sein kann.

Eine wichtige Anwendung für eine Enzymsäule gemäß der Erfindung besteht in der Analyse von Harnsäure im Blutserum, indem man Harnsäure mit dem Sixzjm Uricase umsetzt. Die Umsetzung, von der die Analyse abhängt, ist folgende:

Harnsäure ^Uricase> Allantoin

Bei dieser Umsetzung ist Harnsäure ein UV-absorbierendes Material bzw. Chromogen und trägt zu einem optisch sehr dichten System bei Beginn der Umsetzung bei. Die optische Dichte fällt ab, wenn die Reaktion nach rechts abläuft. Die Harnsäure absorbiert Licht mit Wellenbereichen, die einen optischen Schwerpunkt bei 292 nm be-

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sitzen. So wird die Menge der Harnsäure bestimmt, indem man die optische Absorption dieses Lichts einer unumgesetzten Probe mit der Absorption einer identischen, aliquoten Menge vergleicht, die mit einer bekannten Menge Uricase umgesetzt wurde. Aus der Differenz der Absorption zwischen den beiden alinuoten Mengen kann die Menge der Harnsäure berechnet werden. Diese Analyse wird weiter durch das folgende Beispiel erläutert.

Beispiel 10

Harnsäurebestimmung mit einer Enzymsäule A. Herstellung eines Zeinfilters

1. Behandlung des imprägnierten Filters und des oüulenvorfilters,

Bei den verwendeten Filtern handelt es sich um 13 mm-"S£"-Millipore-Filter. Um alle auswaschbaren Materialien auszuwaschen, die bei 292 nm absorbieren, kann man destilliertes Wasser durch das Substratfilter lassen, bis das Inkrement des Peaks der optischen Dichte der abfließenden Flüssigkeit (increment of effluent peak optical density) nahe bei dem des eingesetzten destillierten Wassers liegt. Die gespülten Filter werden danach an Luft getrocknet.

2. Herstellung von Zeinfaltern.

Das Filter, das mit Uricase imprägniert werden soll, wird zuerst mit Zein nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 überzogen.

3. Behandlung von Zeinfiltern vor der Komplexbildung mit Enzymen.

Die vorstehende Stufe 1 wird wiederholt. Das Zeinfilter wird mit destilliertem Wasser gewaschen, bis der Unterschied der optischen Dichte (^k0.D) bei 280 mn im Bereich von 0,01 im Vergleich zu destilliertem Wasser liegt. Das Filter wird danach wieder an Luft bei Raumtemperatur getrocknet.

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B. Arbeitsweise zur Herstellung von Enzymsäulen. Vorrichtung

1. Ein 10 ml-Becher (sorgfältig gewaschen, ^mit destilliertem Wasser gespült und getrocknet) für jeden Satz von drei vorzubereitenden 13 mm-Säulen.

2. Parafilmquadrate (squares).

3. Saubere, trockene Teströhrchen (gespült wie vorstehend angegeben) zur Herstellung der Enzymlösung (Durchmesser^10 mm).

4. Sigma-Uricase von Candida Utilis, Sigma-Katalog-Nr. U-85OO, spezifische Aktivität 2,5 bis 6,5 Einheiten 1 mg.

5. Zerkleinertes Eis (mit einem Mischer fein zerkleinert) und eine Schale für ein Eis-Wasser-Bad für die Enzymlösung und Bechergläser für die Komplexbildung.

Arbeitsweise

1. Man wiegt auf einem Glassinepapier (etwa 6,4 cm bzw. 2,5" im Quadrat) 0,5 mg Enzym je vorzubereitende Säule aus (d.h. man wiegt 5 mg Enzym aus, wenn man 10 Säulen vorbereitet).

2. Man gibt in ein einzelnes Teströhrchen auf Eis 200Λdestilliertes Wasser je vorzubereitende Säule. Man bringt den Teströhrcheninhalt auf O⁰C, bevor man die nächste Stufe durchführt.

3. Man überträgt das Enzym quantitativ in destilliertes VJasser und erhält eine 2,5 mg ml Lösung. Man rührt sorgfältig bis zum Lösen.

4. Man gibt jeweils 600 £1 der Enzymlösung in einen 10 ml-Becher auf Eis. Der Becher soll mindestens 10 Minuten in zerkleinertem Eis stehen, bevor man das Enzym mit den sorgfältig abgekühlten Becherwandungen in Berührung bringt.

5. In jeden Becher gibt man der Reihe nach zweiunddreißig 15 mm-Zein-Filter. Man läßt die Enzymlösung sorgfältig durch jedes Filter laufen (wick up). Jeder Becher wird mit einem Parafilm verschlossen, wenn er nicht benutzt

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wird. Die Becher sollen stets im Eis stehen.

6. Wenn das Durchlaufen vervollständigt ist, achtet man darauf, daß sich die Filter im Stapel in inniger Berührung miteinander befinden. Man bedeckt den Becher dicht mit dem Parafilm und umwickelt mit einem Band. Man läßt bei 2 bis 4 ⁰G mindestens 24 Stunden lang stehen.

7- Nach einem Minimum von 24 h (vorzugsweise 48 h) entfernt man den Verschluß des Bechers, breitet die Filter auf sauberen Geweben, die frei von absorbierender Rohbaumwolle bzw. absorbierenden Fusseln sind (lint), in einer Petrischale aus und trocknet unter milder Entwässerung (d.h. man läßt die Petrischale in Gegenwart eines Trocknungsmittels locker verschlossen) in einem Kühlschrank.

Die folgenden Stufen können bei Raumtemperatur durchgeführt werden.

8. A. Man stellt einen 0,01 η Boratpuffer mit einem pH-Wert von 8,2 her, wie er auf Seite J-195 der Sober-Ausgabe von 1968 des Handbook of Biochemistry beschrieben ist, das von der Chemical Rubber Company veröffentlicht wurde. Man befeuchtet die Filter mit dem Puffer. B. Man beschickt jeden Abschnitt der Röhrchen der Fig. 1 bis 5 folgendermaßen:

1. Das obere Segment 64;

a. 1 - Teflon-Dichtring 86:

b. 1 - vorgespültes Vorfilter 72 des zuvor beschriebenen Typs, das zuvor mit Puffer befeuchtet wurde.

2. Das untere Segment 62;

c. Teflon-Dichtring 88;

d. 12 - Uricase-Zein-Filter 74, wie vorstehend beschrieben.

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Konditionieren der Enzymsäule

Man spült beide Säulen mit 40 ml Boratpuffer unter Vakuum.

Dadurch wird die Säule "konditioniert". Die Säule soll nach

dem Konditionieren bei 2 bis 4- ⁰C bis zur Verwendung gelagert werden.

Analysen

das enzymatische Harnsäure-Prüfröhrchen werden zwei Säulen verwendet, die Enzymsäule und die Vergleichssäule. Die Vergleichs säule ist mit der Enzymsäule mit der Ausnahme identisch, daß die Vergleichssäule kein Enzym enthält. Es werden gleiche Mengen verdünnter Serumproben in die Vorfiltersegmente jeder Säule gegeben. Die Zentrifugalkraft zieht die Proben durch die Vorfilter, durch das Enzym- bzw. Vergleichssegment und in die Küvetten.

Das Enzymsegment enthält einen Stapel von Filtern, an die Uricase gebunden ist. Wegen des hohen Verhältnisses von Oberfläche zu Volumen der aufgestapelten porösen Matrices :ist eine ausreichende Menge an an die Oberfläche gebundener Uricase vorgesehen, um eine Vervollständigung der Umwandlung von Harnsäure in Allantoin vorzusehen, bevor die Probe in das Küvettensegment eintritt. Ferner verbleibt die Uricase vollständig im Enzymsegment, so daß das Segment immer wieder benutzt werden kann. Da keine Uricase im Vergleichssegment vorliegt, wird die Harnsäure der Probe der Vergleichssäule nicht umgewandelt. Das Vorfiltersegment entfernt alle Teilchen der Proben, die das Enzym- oder Vergleichssegment verstopfen können. Es muß in Abständen ersetzt werden. Sowohl bei dem Vorfiltersegment als auch bei der Küvette handelt es sich um verfügbare bzw. austauschbare Einheiten.

Es ist eine minimale Kontaktzeit (Verweilzeit) für die Probe an der Enzymmatrix erforderlich, damit die Umwandlung

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der Harnsäure vollständig ist. Dies kann dadurch erzielt werden, daß man die Zentrifugenrotationsgeschwindigkeit in der Größenordnung von 1000 Upm einstellt, um eine relative Zentrifugalkraft von 200 g zu erzielen.

Für die meisten klinischen Tischzentrifugen wird empfohlen, von der niedrigsten Rotationsgeschwindigkeit auszugehen; wenn am Ende der 6 Minuten (nominelle Dauer des Vorgangs) die gesamte Pufferlösung nicht vom oberen Abschnitt in die Küvette gelaufen ist, soll die Rotationsgeschwindigkeitseinstellung zur nächsthöheren Rotationsgeschwindigkeit geändert werden, so daß die erforderliche Zeit des Vorgangs weniger als 6 Minuten, Jedoch nicht weniger als 3 Minuten beträgt.

Arbeit Gv/e is en

1. Man setzt die Säulen zusammen, indem man das Vorfiltersegment auf das Enzym- bzw. Vergleichssegment setzt und das Eüvettensegment unter dem Enzym- bzw. Vergleichssegment anordnet, so daß sich das Enzym- bzw. Vergleichssegment in der Mitte befindet. Die Gesamtlänge jeder Säule entspricht einem konischen 15 ml-Zentrifugenröhrchen.

2. Man schaltet ein Spektrophotometer an. Man stellt die Wellenlänge auf 292 nm ein.

3· Man verdünnt 0,2 ml einer Serumprobe mit 5>8 ml Puffer.

4. Man gibt 2,8 ml der verdünnten Serumprobe in das Vorfiltersegment jeder der beiden Säulen. Man setzt die beiden Röhrchen in einen Zentrifugenkopf in gegenüberliegenden Stellungen ein.

5. Man zentrifugiert die Röhrchen mit einer Rotationsgeschwindigkeit oberhalb des gewählten Wertes 6 Minuten lang.

6. Man überträgt die Proben in einen Behälter und mißt die optische Dichte (OD) der Proben bei 292 nm.

Für eine Einstrahlmessung:

a. Man stellt die OD der Probe des Vergleichsröhrchens (thimble) auf 0,4 ein.

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b. Man mißt die OD der Probe der Enzymlösung (D.). Für eine Doppelstrahlmessung:

a. Man gewährleistet, daß die Probenbehälter ein aufeinander abgestimmtes Paar darstellen.

b. Man gibt den Behälter mit der Probe aus der Enzymküvette in die Vergleichsstellung, und den Behälter mit der Probe der Vergleichsküvette in die Stellung der Probe.

c. Man notiert die Ablesung für die optische Dichte (ΔθΏ).

7. Man berechnet die Konzentration der Harnsäure nach den folgenden Beziehungen:

Für eine Einstrahlmessung:
Harnsäure (mg %) = (0,4 - D₁) χ 42,5 Für eine Doppelstrahlmessung: Harnsäure (mg %) =Δθΰ χ 42,5

8. Bevor man die Säulen wieder in den Kühlschrank bei 4 G gibt, müssen sie mit Puffer gespült werden, indem man 3 ml Puffer in den oberen Abschnitt jedes Röhrchens gibt. Man zentrifugiert die Röhrchen 5 Minuten lang.

Es ergeben sich mehrere bemerkenswerte Vorteile, die aus der Verwendung einer Enzymsäule gemäß der vorliegenden Erfindung resultieren. Ein Vorteil besteht darin, daß Spezialtests, die schwierig mit anderen Systemen durchzuführen sind, möglich werden. In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, daß die Verwendung der Enzymsäule nicht auf Harnsäureanalysen begrenzt ist. Tatsächlich können viele enzymatische Analysen vorteilhaft mit Enzymsäulen gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden. Ein Beispiel einer Analyse, die mit einer Enzymsäule gemäß der Erfindung zweckmäßiger durchgeführt werden kann, stellt die Analyse von Glukose dar, bei der die Umsetzungen angewendet werden, die zuvor beschrieben wurden.

Die Enzymsäule bietet insbesondere bei der Durchführung von "Stat"-Tests Vorteile. Eine Analyse von Harnsäure

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kann mit der Enzymsäule in 6 bis 7 Minuten gegenüber 30 Minuten bei bekannten Systemen durchgeführt werden. Der grundlegende Vorteil der Methode mit gebundenem Enzym und die Wiederverwertbarkeit der gebundenen Enzyme sind kennzeichnend.

Eine weitere Verwendung einer Urease-Membran gemäß der Erfindung bietet sich beim Messen von Harnstoff. I¹Ur Einzelheiten dieses Verfahrens wird auf Enzymes Bound to Artificial Matrixes, Klaus Mosbach, Scientific American, März 1971, S. 26 bis 33> verwiesen, wobei auf diese Arbeit im vorliegenden Zusammenhang voll Bezug genommen wird. Auf Seite 32 dieser Druckschrift wird die Messung von Harnstoff unter Verwendung eines Urease-haltigen Gels beschrieben. Erfindungsgemäß wird Urease an eine poröse, polymere Membran gebunden und an Stelle des Urease-haltigen Gels der Druckschrift verwendet.

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Claims

Patentansprüche

1. Biologisch aktives Membranmaterial, gekennzeichnet durch ein mikroporöses Membransubstrat aus einem polymeren, biologisch inaktiven Material, einen Überzug eines inerten Mittels auf dem Membransubstrat, wobei der Ü"berzug von einer Verbindung aus der Gruppe der Proteine und Polypeptide gebildet wird, und ein biologisch aktives Mittel aus der durch Antikörper, Antigene und Enzyme gebildeten Gruppe, wobei das Mittel mit dem Proteinmaterial einen Komplex bildet, das den Überzug auf dem Substrat bildet.

2. Membranmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei· dem inerten Mittel, das den Überzug auf dem Substrat bildet, um ein Protein aus der durch Zein und Collagen gebildeten Gruppe und bei dem biologisch aktiven Mittel um ein Enzym handelt.

3. Membranmaterial nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Membransubstrat um einen polymeren, mikroporösen Filter handelt.

4. Membranmaterial nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sich der poLymere !Filter aus inerten Zelluloseestern aufbaut.

5· Membranmaterial nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Protein, das den Überzug auf dem Substrat bildet, um Zein handelt.

6. Membranmaterial nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem, Protein, das den Überzug auf dem Substrat bildet, um GpIlagen handelt.

7. Membraniaaterial nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem biologisch aktiven Mittel um ein Enzym

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aus der durch Amylasen, Lysozym, Invertase, Urease, Uricase, Cellulasen, Catecholmethyltransf erase, Rohrzucker-6-glukosyltransferase, Hexokinase, D-Nase, Carbosylesterase, Arylesterase, Lipase, Pektinesterase, Glucoamylase, Amylopektin-1,6-glucosidase, Oligo-1,6-glucosidase, Polygalacturonase, alpha-Glucosidase, ß-Glucosidase, ß-Galactosidase, Glucoseoxydase, Galactoseoxydase, Katecholoxydase, Katalase, Peroxydase, Lipoxydase, Glucoseisomerase, Pentosanasen, Cellobiase, Xyloseisomerase, SuIfitoxydase, Äthanolaminoxydase, Penicillinase, Kohlensäureanhydrase, Gluconolactonase, 3-Ketosteroid-delta '-dehydrogenase, H-ß-Hydroxylase, Aminosäureacylasen und Glucose-6-phosphatdehydrogenase gebildeten Gruppe handelt.

8. Membranmaterial nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß es sich "bei dem biologisch aktiven Mittel um ein Enzym aus der durch Lysozym, Invertase, Urease und Amylasen gebildeten Gruppe handelt.

9- Enzymsäule, gekennzeichnet durch

- eine Küvette (60),

- ein Säulensegment (62 ), das mit dem oberen Abschnitt der Küvette (60) verbunden ist, wobei das Säulensegment (62 ) und die Küvette (60) so ausgebildet sind, daß sie in eine Zentrifuge gegeben werden können,

- ein biologisch aktives Filtermembranmaterial (7¹O , das im Strömungsweg zwischen der Küvette (60) und dem Säulensegment (62 ) angeordnet ist, wobei das biologisch aktive Membranmaterial (7²O ein mikroporöses Membransubstrat aus einem polymeren, biologisch inaktiven Material, ein inertes Mittel, das das Membransubstrat überzieht, wobei der Überzug durch eine Verbindung aus der Gruppe der Proteine und Polypeptide gebildet wird, und ein biologisch aktives Mittel aus der durch Antikörper, Antigene und Enzyme gebildeten Gruppe umfaßt, wobei dieses Mittel mit dem Proteinmaterial einen Komplex bildet, das den Überzug auf dem Substrat bildet.

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10. Enzymsäule nach Anspruch 9? gekennzeichnet durch einen Stützring (68), der die Küvette (60) und das Säulensegment (62 ) verbindet, wobei der Stützring (68) mit Mitteln zum Tragen des biologisch aktiven Membranmaterials (74-) ver sehen ist.

11. Enzymsäule nach Anspruch 10, gekennzeichnet ferner durch einen Dichtring (.88) zwischen dem biologisch aktiven Membranmaterial (74-) und dem Säulensegment (62„,

12. Enzymsäule nach Anspruch 10, gekennzeichnet ferner durch ein oberes Säulensegment (64-) über dem Säulensegment (62) und einen mikroporösen Filter (72) im Strömungsweg zwischen dem oberen Säulensegment (64-) und dem Säulensegment (62), wobei der mikroporöse Filter (72) dem Verstopfen des biologisch aktiven Membranmaterials (74-) entgegenwirkt.

13· Enzymsäule nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Küvette (60) einen Schlitz (80) zur Erhöhung der Strömung des flüssigen Mediums durch die biologisch aktive Membran (74-) aufweist.

14·. Enzymsäule nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem inerten Mittel für den Überzug um Zein und bei dem biologisch aktiven Mittel um Uricase handelt.

15· Verwendung des Membranmaterials gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Durchführung von Analysen, wobei man

- eine zu analysierende Probe durch ein biologisch aktives Membranmaterial führt, das sich aus einem mikroporösen Membransubstrat eines polymeren, biologisch inaktiven Materials, einem Überzug eines inerten Mittels auf dem Membransubstrat,

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wobei der Überzug durch eine Verbindung aus der Gruppe der Proteine und Polypeptide gebildet wird, und einem biologisch aktiven Mittel aus der durch Antikörper, Antigene und Enzyme gebildeten Gruppe aufbaut, wobei dieses Mittel mit dem Proteinmaterial einen Komplex bildet, das den Überzug auf dem Substrat bildet,

- die Probe sammelt und

- die optische Absorption der gesammelten Probe mißt.

16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als biologisch aktives Mittel Uricase verwendet und die Probe analysiert und ihren Harnsäuregehalt bestimmt, indem man die optische Absorption der gesammelten Probe für Licht mit Wellenbandzentren bei 292 nm mißt, nachdem man die gesammelte Probe durch das biologisch aktive Membranmaterial geführt hat.

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