WO2002083932A2 - Enzymabbauketten - Google Patents

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WO2002083932A2
WO2002083932A2 PCT/EP2002/004043 EP0204043W WO02083932A2 WO 2002083932 A2 WO2002083932 A2 WO 2002083932A2 EP 0204043 W EP0204043 W EP 0204043W WO 02083932 A2 WO02083932 A2 WO 02083932A2
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enzymes
enzyme
enzymatic system
degradation
chain
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PCT/EP2002/004043
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Inventor
Johannes Georg Schindler
Hans-Willi Kling
Jens Seemann
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Cognis Deutschland Gmbh & Co. Kg
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Publication of WO2002083932A3 publication Critical patent/WO2002083932A3/de

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes

Definitions

  • the present invention relates to enzymatic systems with enzyme degradation chains from enzymes of various types, preferably in the immobilized state, and their use, in particular for use in bioreactors, biosensors and chromatographic systems.
  • immobilizing enzymes When immobilizing enzymes, three basic methods are generally distinguished, namely firstly the immobilization by crosslinking, secondly the immobilization by binding to a support and thirdly the immobilization by inclusion.
  • crosslinked enzymes When immobilized by crosslinking, crosslinked enzymes are obtained which are fixed to one another without their activity being influenced. However, the enzymes are no longer soluble.
  • the crosslinking takes place, for example, with glutardialdehyde.
  • the immobilization is carried out by binding to a carrier, the binding can be carried out by adsorption, ion binding or covalent binding.
  • the binding to the carrier can also take place within the original microbial cell.
  • the activity of the enzyme is not affected by the fixation; it can be used multiple or continuously in a carrier-bound manner.
  • the enzyme When immobilized by inclusion, the enzyme is usually enclosed between semipermeable membranes and / or gels, microcapsules or fibers.
  • the encapsulated enzymes are e.g. B. separated by a semipermeable membrane from the surrounding substrate and product solution. Cells can also be encapsulated. The activity of the enzyme is not affected by the fixation in space.
  • Immobilized enzymes, enzyme-producing microorganisms or cells are used in particular in biotechnological processes.
  • the first technical processes with immobilized cells were empirically optimized and are still used today.
  • Another older process is vinegar production using the generator process.
  • the most important process is the use of cells with glucose isomerase to produce syrup containing fructose.
  • Glucose amylase for the production of glucose in the starch process is also used immobilized.
  • the cleavage of lactose with the help of the immobilized ß-galactosidase from yeast to glucose and galactose is also a common method.
  • There are further technical processes with immobilized systems in the production of amino acids in the cleavage of penicillin G to 6-aminopenicillinic acid and in the production of ethanol with growing, immobilized cells from Saccharomyces sp.
  • Immobilized enzyme and cell systems are used not only in biotechnological production processes, but also in analytics. B. in so-called biosensors.
  • the principle of analysis with the aid of immobilized systems is based on the fact that a substrate to be determined is implemented by an immobilized system, the change in the Product, substrate or cosubstrate concentration can be tracked, for example with several coupled methods (e.g. enzyme electrodes).
  • the degradation or conversion of molecules does not take place through a single enzyme, but along a so-called enzyme degradation chain from several enzymes, i.e. H. the reaction is enzyme-catalyzed in several stages with different enzymes.
  • the parallel determination of several substances by several different enzymes or by enzyme (degradation) chains is necessary.
  • such a multi-enzymatically catalyzed reaction sequence can often only be carried out rarely, because the bioreactors and biosensors known from the prior art preferably comprise a type of enzyme.
  • the problem on which the present invention is based is to provide a system with which it is also possible to catalyze enzymatically those processes which are enzymatic in several stages, i. H. in which the molecules, in particular biomolecules or technical molecules, are broken down enzymatically catalyzed in several stages or converted into end products, the conversion being carried out within only one single enzymatic system, but with different enzymes.
  • the present invention is based on the problem of providing a system with which the parallel reaction of several substances by several different enzymes or by enzyme (degradation) chains is also possible.
  • such a system should be suitable for use in bioreactors, biosensors and chromatographic systems.
  • the present invention thus relates to an enzymatic system which comprises an enzyme degradation chain which in turn comprises at least two different or different enzymes, i.e. .H. Enzymes of different types.
  • the at least two enzymes in the enzyme (degradation) chain are matched to one another in such a way that, in particular selectively or essentially selectively, they break down at least one specific molecule - also referred to as a "target molecule”.
  • the enzymes of the enzyme (degradation) chain can be coordinated with one another in such a way that, in particular selectively or essentially selectively, they break down at least one non-naturally occurring molecule, in particular a technical molecule.
  • the enzymes of the enzyme (degradation) chain can, for example, be coordinated with one another in such a way that they break down the non-naturally occurring molecule, in particular technical molecule, in accordance with a non-naturally occurring metabolism, ie. H. form a non-naturally occurring metabolism chain.
  • the enzymes of the enzyme (degradation) chain can also be coordinated with one another in such a way that they break down the non-naturally occurring molecule, in particular technical molecule, according to a naturally occurring metabolism, ie. H. form a naturally occurring metabolism chain, which however naturally occurs regulates the breakdown of other, namely naturally occurring molecules.
  • the enzymes of the enzyme (degradation) chain can be coordinated with one another in such a way that, in particular selectively or essentially selectively, they break down at least one naturally occurring molecule in accordance with a non-naturally occurring metabolism.
  • the naturally occurring molecule can be a natural product, for example.
  • the enzymatic system according to the invention is particularly suitable for the consecutive and / or multi-stage degradation of molecules.
  • the runs Degradation is preferably selective or substantially selective with respect to the molecule or molecules to be degraded.
  • the enzymatic system according to the invention can be used in particular for the catalysis of multistage enzymatically catalyzed reactions.
  • the enzymatic system according to the invention is suitable for the parallel implementation of different molecules with different enzymes.
  • At least one of the enzymes of the enzyme (degradation) chain is present in immobilized form in the enzymatic system according to the invention.
  • all enzymes of the enzyme (degradation) chain can preferably be present in immobilized form.
  • the enzymes can be immobilized according to the invention by the customary methods of the prior art described above, the reactivity of the enzymes immobilized in this way being at least substantially retained.
  • the immobilization of at least one of the enzymes of the enzymatic system according to the invention can take place, for example, by crosslinking.
  • At least one of the enzymes of the enzymatic system according to the invention can also be immobilized by binding to a suitable carrier.
  • the binding can occur due to adsorption, ion binding and / or covalent binding.
  • the immobilization can have been carried out by binding to a suitable, preferably chemically inert carrier, the carrier having previously been activated by plasma-chemical surface modification.
  • This process comprises the following process steps:
  • step (b) binding the enzyme or enzymes to be immobilized, if necessary after converting them into an activated, bindable state, to the carrier surface activated in step (a); and finally
  • process step (c) optionally crosslinking the enzyme bound in process step (b), in particular where process steps (b) and (c) may be combined, in particular may be carried out simultaneously and / or the immobilization may be carried out in layers, in particular with glutardialdehyde.
  • the present invention thus relates to an enzymatic system in which at least one of the enzymes, preferably all of the enzymes in the enzyme (degradation) chain, are fixed and / or bound to a chemically inert, plasma-chemically activated and / or functionalized support surface after The methods described above are immobilized.
  • the activation of the chemically inert carrier surface by means of plasma-chemical methods in step (a) of the previously described method is preferably carried out selectively only on the surface, so that the bulk properties of the chemically inert carrier surface are retained, the activation of the chemically inert carrier surface in Step (a) of the previously described method in reactive plasma, in particular high-frequency plasma, has taken place.
  • the chemically inert support surface can include, in particular, noble metals such as platinum in particular and their alloys, stainless steel or polyhalogenated polymers, in particular polyhalogenated polymeric hydrocarbons such as in particular polytetrafluoroethylene or polyvinyl chloride, or else cellulose acetate or combinations of these materials.
  • PTFE (Teflon ® ) and cellulose acetate membranes, for example, are particularly suitable.
  • connection or coupling of the enzyme (s) to be immobilized to the plasma-chemically modified carrier surface in accordance with step (b) of the previously described method can in particular be carried out by connecting or coupling the enzyme (s) via the reactive functional groups attached in step (a), where the enzyme or enzymes can be attached directly to the reactive functional groups applied to the carrier surface or indirectly via a suitable linker.
  • the present invention relates to an enzymatic system in which at least one of the enzymes, preferably all of the enzymes in the enzyme (degradation) chain, are immobilized by fixing and / or binding to a chemically inert, plasma-chemically activated and / or functionalized carrier surface.
  • the enzyme or enzymes can be fixed directly or indirectly to a chemically inert carrier surface, in particular linked or coupled.
  • the attachment or coupling of the enzyme or enzymes can be carried out via suitable, reactive functional groups attached to the chemically inert support surface.
  • the enzymes of the enzymatic system according to the invention can in particular be selected from the group of oxidoreductases, transferases, hydrolases (e.g. esterases such as lipases), lyases, isomerases and ligases (synthetases) and their mixtures or combinations with one another.
  • the at least two enzymes are located either within a single reaction zone or in separate, successively, sequentially connected reaction zones which then together form the enzymatic system.
  • the enzymes of the enzyme (degradation) chain can be arranged within a unit, preferably within a reaction zone, a compartment or a cell, in particular a measuring cell, or else in separate, in particular successive units, preferably be arranged in separate, successive reaction zones, compartments or cells, in particular measuring cells, which together form the enzymatic system. In order to measure the difference, however, measuring cells can also be connected in parallel.
  • the enzymatic system according to the invention contains amyloglucosidase and glucose oxidase, optionally in combination with mutarotase and / or ⁇ - Glucosidase (maltase).
  • amyloglucosidase and glucose oxidase optionally in combination with mutarotase and / or ⁇ - Glucosidase (maltase).
  • mutarotase / or ⁇ - Glucosidase (maltase).
  • ⁇ - Glucosidase maltase
  • the enzymatic system according to the invention can be used in many ways, in particular in biosensors, bioreactors or chromatographic systems (for example chromatographic columns).
  • the present invention thus also relates to biosensors, bioreactors and chromatographic systems which comprise the enzymatic system according to the invention.
  • the enzymatic systems according to the invention can be used in biosensors. At least two different types of immobilized enzymes are combined with one another, which are used in an enzyme chain or enzyme degradation chain.
  • the various enzymes can either be present in a single reaction system (for example in a measuring cell) or can be sequentially connected (for example in successive measuring cells) which then together form the enzymatic system according to the invention. In this way, for example, the parallel determination of several substances by several enzymes (or enzyme chains) in one measuring cell or the sequential degradation of a starting material (analyte) in several measuring cells connected in series with simultaneous electrical analysis in one and / or several measuring cells.
  • biosensors are sensors with a bioactive component, based on the coupling of biomolecules that specifically recognize analytes as receptors in the broadest sense, with physicochemical transducers that generate a biologically generated signal (e.g. oxygen concentration, pH value, Convert dye etc.) into electrical measurement signals.
  • a biologically generated signal e.g. oxygen concentration, pH value, Convert dye etc.
  • FIG. 1 schematically shows the typical structure of a biosensor for the specific detection of an analyte 1, the biosensor comprising a receptor 2 and a transducer 3, which converts the biological signal generated by the receptor 2 into an electronic signal 4, which is passed on to electronics 5 becomes.
  • Various biomolecules can be used for specific recognition, in particular enzymes. Potentiometric sensors, amperometric electrodes, piezoelectric sensors, thermistors or optoelectronic sensors can be used as transducers.
  • biosensors Due to the reaction or interaction of the analyte with the receptor, a distinction is made between two basic types of biosensors, namely, on the one hand, bioaffinity sensors, which take advantage of changes in the electron density that occur during complex formation, and, on the other hand, metabolism sensors, which are based on the specific detection and conversion of substrates.
  • Biosensors are used - especially in the form of enzyme electrodes - in healthcare, for the control of biotechnological processes, in the food industry or in environmental protection. A wide variety of systems can be analyzed with biosensors.
  • the various enzyme molecules can be introduced for immobilization either in polymer matrices (such as PVC, gels, graphites or zeolites) or between foils (e.g. cellulose acetate).
  • polymer matrices such as PVC, gels, graphites or zeolites
  • foils e.g. cellulose acetate
  • the various enzymes to bind with sensors for example based on the enzymatic production or consumption of oxygen and a chemically inert membrane (eg. As a Teflon ® membrane) have, they will be used.
  • the biosensors according to the invention can be produced, for example, as described in the already cited German patent application DE 101 18 553.7, the entire content of which is included by reference.
  • biosensors according to the invention enable, for example, the production of microelectrodes (arrays) for small volumes and high sample throughput (e.g. for combinatorial use).
  • Application examples for the biosensors according to the invention are the analytical determination of surfactants, in particular ionic surfactants such as nonionic surfactants (e.g. alkyl polyglucosides), of polyaspartic acid and of fatty alcohol derivatives.
  • the present invention relates to a biosensor, in particular for the qualitative and / or quantitative determination of nonionic surfactants, preferably alkyl polyglucosides, the biosensor comprising as an enzyme (degradation) chain an enzymatic system which, as enzymes, amyloglucosidase and glucose oxidase, optionally in Combination with mutarotase and / or ⁇ -glucosidase (maltase).
  • the aforementioned enzymes are present in particular in immobilized form, preferably by binding to a chemically inert surface and / or membrane, preferably to a polytetrafluoroethylene or cellulose acetate membrane.
  • the enzymatic system according to the invention can also be used in bioreactors.
  • biomass are understood to mean the physical container in which biological substance conversions are carried out, in particular with enzymes.
  • the immobilized enzymes of the enzymatic system according to the invention can, for example, be attached to the wall surfaces of the bioreactor or - particularly in the case of fixed bed reactors - can be attached to the stationary support material or bulk material.
  • Reactor surfaces suitable according to the invention can consist of metal (eg noble metal such as platinum) or can be coated with all common polymers used for reactor manufacture (eg Teflon® ). 2 shows, by way of example and schematically, different types of prior art bioreactors:
  • FIG. 2A shows a stirred tank reactor, in which the energy is introduced by mechanically moving units.
  • G denotes the gas flow and M the mechanical drive device (e.g. motor). Because of their versatility, stirred tank reactors are used most frequently.
  • 2B shows a bubble column reactor in which the mixing is carried out by supplying air or another gas.
  • G denotes the gas flow.
  • 2C shows a so-called airlift fermenter with an internal passage, a liquid circulation and mixing being generally generated by the introduction of air or another gas.
  • G denotes the gas flow.
  • 2D shows a so-called airlift fermenter with an external passage, a liquid circulation and mixing being generally generated by the introduction of air or another gas.
  • G denotes the gas flow.
  • the enzymatic system according to the invention can be used in the previously described bioreactor types of the prior art, for example by modifying the wall surface (for example by coupling the enzymes to the chemically inert reactor walls) or in the case of fixed bed bioreactors by connecting the Enzymes on the stationary carrier material or bulk material.
  • FIG. 3 shows an example and schematically some embodiments of bioreactors according to the present invention:
  • 3A shows a bioreactor, the chemically inert walls of which are modified by coupling an immobilized enzyme of type A and an immobilized enzyme of type B, which are arranged in different, successive reaction zones.
  • G denotes the gas flow.
  • 3B shows a bioreactor, the chemically inert walls of which are modified by coupling an immobilized enzyme of type A and an immobilized enzyme of type B, which are arranged within a single reaction zone.
  • 3C shows a bioreactor in the form of a fixed bed reactor, to the carrier material or bulk material of which immobilized enzymes of type A and type B are coupled, which are arranged within a reaction zone.
  • the enzymatic system according to the invention in chromatographic systems, in particular in chromatographic columns. This can be done for synthetic purposes (e.g. carrying out enzymatically catalyzed reactions on a chromatographic column) or also for analytical purposes (e.g. in analytical column chromatography).
  • the immobilized enzymes of the enzymatic system can, for example, be bound to the stationary support material or bulk material, in particular the stationary column material, of the chromatographic system.
  • the use of the enzymatic system according to the invention has the advantage that, with the system according to the invention, it is also possible to catalyze enzymatically those processes which take place in a multistage enzymatic manner, ie. H. in which the molecules, in particular biomolecules or technical molecules, are broken down enzymatically catalyzed in several stages and with different enzymes or converted into end products.
  • the use of the enzymatic system according to the invention also enables the parallel conversion of several substances by different enzymes or by enzyme (degradation) chains and thereby, for example, the parallel analytical determination of several substances side by side with a single measuring cell which contains an enzyme degradation chain from different enzymes or the sequential decomposition of a starting material (analyte) in several measuring cells connected in series with simultaneous electrical analysis in one and / or several measuring cells.
  • the use of the enzymatic system according to the invention also has the advantage that, on the one hand, the enzymes can be reused due to the immobilization and, on the other hand, easy separation is possible after their use (e.g. after synthesis in the bioreactor, for example by draining off the reaction mixture).
  • the enzymes can be used efficiently and inexpensively in a high local concentration and in a continuous flow.
  • the substrate specificity and the specificity of the reaction and the reactivity of the enzymes are not lost.
  • the concept of the present invention is therefore to combine different enzymes with one another in such a way that molecules (eg technical molecules or biomolecules) can be broken down in this way.
  • certain parameters as described above e.g. change in pH value, generation of oxygen, etc.
  • bioreactors this means that there is also the possibility of the simultaneous or sequential reaction of one or more substances.
  • the production of a substance and the reaction tracking with sensors that measure oxygen or H 2 O 2 , for example, are identical and thus also enable efficient reaction control.
  • APG alkyl polyglucoside, a group of nonionic surfactants, sold by Henkel
  • APG alkyl polyglucoside, a group of nonionic surfactants, sold by Henkel
  • an enzymatic degradation chain has been developed, consisting of amyloglucosidase and glucose oxidase and optionally also mutarotase and / or ⁇ -glucosidase (maltase).
  • the aforementioned enzymes were first immobilized.
  • the immobilization was carried out by the aforementioned enzymes on a
  • the membrane was modified or activated according to known plasma chemical methods, i. H. functionalized in reactive high-frequency plasma under conditions known per se, as a result of which suitable, enzyme-reactive functional groups are bound to the chemically inert membrane surface, in particular amino and / or carboxyl groups.
  • suitable, enzyme-reactive functional groups are bound to the chemically inert membrane surface, in particular amino and / or carboxyl groups.
  • the enzymes were then bound to them using methods known per se.
  • the immobilization can also be carried out using methods known per se from the prior art, for example by inserting them between foils (for example made of cellulose acetate) or in polymer matrices (for example PVC, gels, graphites, zeolites, etc .).
  • foils for example made of cellulose acetate
  • polymer matrices for example PVC, gels, graphites, zeolites, etc .
  • APG could then be detected or determined electroanalytically.
  • Alkyl polyglycosides are added phosphate-free as surface-active neutraltenside cosmetics or detergents.
  • One to seven glucose units drastically decreasing in the frequency of mono- to heptaglycosides, are glycosidically linked to a mostly long-chain alcohol such as dodecanol or tetradecanol.
  • bioelectrochemical membrane electrodes are a particularly attractive measuring principle for the alkyl polyglycosides.
  • Measuring solutions were phosphate buffered to a pH of 5.0.
  • the sensors according to the invention are integrated in a flow measuring system
  • the measuring anode and reference cathode are designed in a "spark plug-shaped" construction and are screwed tightly against the edges of the flow chambers. Only the end faces of the precious metal electrodes are freely accessible and are electro-analytically active.
  • the membrane systems with a diameter of 5 mm are protected against cavities and are in direct contact with the Pt measuring anode.
  • Electrode surface design in connection with thin enzyme membranes promotes the speed of the adjustment behavior.
  • these measuring system components were integrated into the side walls of an acrylic glass tube which was provided with inlet and outlet taps at the upper and lower ends.
  • the Pt measuring anode also with a cavity-protected enzyme membrane of 5 mm, has direct access to the measuring solution through an anodic window, while the rod-shaped Ag reference cathode (diameter 1 mm) is located in a side space of the measuring cell and an internal electrolyte with the Pt measuring anode communicates.
  • APG sensors consist of a Pt cathode with a
  • the Ag / AgCI reference anode is again analogous to 2.1.1.2. in a side area of the measuring cell and is connected via a buffered internal electrolyte to the Pt measuring electrode in the cathodic window, which is sealed by the PTFE membrane, but is gas-permeable, so that O 2 acts as a transducer between the immobilized enzymes and the Pt cathode can act.
  • the membrane system On the electrode side, the membrane system has a chemically unmodified PTFE membrane on which two dialysis membranes made of cellulose acetate lie, between which - protected against bacterial degradation - the enzymes are immobilized and / or covalently cross-linked on a strip of cellulose fibers by adsorption and / or ionic binding ,
  • the bifunctional reagent glutardialdehyde couples covalently to the PTFE membranes aminated in high-frequency plasma
  • glucose oxidase ⁇ -D-glucose + O 2 + H 2 O GQD H 2 O 2 + gluconic acid.
  • the amperometric measurement at the end of the enzyme degradation chain can be carried out by consuming O 2 by means of oxygen electrodes or by forming H 2 O 2 with water peroxide detectors.
  • Fig. 1 graphically illustrates the relationship between the enzyme concentration ge together in U / membrane
  • the bienzyme membranes contain the two enzymes amyloglucosidase and glucose oxidase in the same concentration based on units, the total concentration of which is shown in the graph in Fig. 1.
  • the enzymes are present in the membrane systems in cross-linked form due to glutardialdehyde.
  • ® SBC-1419-APG is one of the three measuring systems listed in Fig. 1
  • the SBC-1419-APG bienzyme membrane is also suitable for use on the H 2 O 2 -sensitive-enzymatic measuring system with an anodic window
  • GOD reacts very selectively with ß-D-glucose, while the ⁇ form is not converted by this enzyme.
  • Substrate supply for the glucose oxidase can be forced if one
  • Trienzym membrane system (see Tab. 1).
  • Amyloglucosidase glucose oxidase, mutarotase additionally ⁇ -glucosidase, the latter with the idea of possibly releasing the fatty alcohol from its glycosidic bond (Table 2).
  • ⁇ -1,6-glucosidic bonds by the enzyme also known as maltase is slow. There is no attack on ⁇ -glucosidic bonds. In contrast, ⁇ -1,4-glucosidic bonds are the preferred target.
  • the four enzymes were immobilized by adsorption and / or ionic binding on a strip of cellulose fibers between two dialysis membranes made of cellulose acetate.
  • the enzyme membrane was covered with a chemically unmodified PTFE membrane and stretched on an acrylic glass ring using an O-ring and finally positioned with the help of an inner electrolyte film in front of the Pt cathode of the O 2 sensor, which was connected to the common one by an Ag / AgCI reference cathode internal electrolyte
  • Amyloglucosidase and glucose oxidase were covalently bound to chemically modified PTFE membranes in aminized form (2.1.2.2.) For oxygen electrodes (2.1.2.) By the bifunctional reagent glutardialdehyde. In further layers, these enzymes were cross-linked and coupled to the previous layer.
  • the APG ® sensor is marked with 10.
  • SBC-1322-APG ® -HDKS5-No. 1 In addition to high measurement stability, response times of only 3 to 6 minutes. This is the result of a particularly aerodynamic geometry with tangential Inflow to the entire membrane system and the lack of enzyme-encapsulating dialysis membranes.
  • FIG. 1 shows the relationship of mass (mg) to substrate turnover (U) in the
  • ® Fig. 3 shows the enzyme concentrations in the U / APG selective biosensor membrane.
  • ® Fig. 4 shows the enzyme concentrations in mg / APG selective biosensor membrane.
  • ® 1425-APG was developed on H 2 O 2 detectors according to 2.1.1.1. constructed modular flow measuring system with a temperature increase of 10 ° C the
  • hydrogen peroxide detectors In their capacity as measuring anodes, hydrogen peroxide detectors also convert other anodically oxidizable substances.
  • the nanoamperemeter transducer supplies the amperometric sensor with a plateau-adapted polarization voltage and has a transducer constant of 1mV / nA.
  • the polarization voltage for O 2 is sensitive enzymatic measuring systems -750 mV measuring- against reference electrode and for H 2 0 2 -sensitive-enzymatic measuring systems with anodic oxidation +950 mV measuring- against reference electrode.
  • the 21-bit A / D converter converts the electrical direct voltages supplied by the nano-amperemeter according to current / voltage conversion into corresponding digital signals, which are transmitted via a serial interface (RS 232) to an IBM-compatible computer in order to use the measured currents with computer support carry out a measurement data evaluation.
  • a serial interface RS 232
  • the course of the measurement curve with a measured value within approx. 2 seconds can be followed on the screen in a continuous display.
  • Substances in the area of the reactors can e.g. B. be substances that are used on site at the customer, such. B. peroxides or surfactants, lubricants or high-quality special chemicals.

Abstract

Es werden enzymatische Systeme beschrieben, die Enzymabbauketten für Moleküle, insbesondere technische Moleküle oder Biomoleküle, enthalten, wobei diese Abbauketten mindestens zwei verschiedene Enzyme umfassen, welche vorzugsweise in immobilisierter Form vorliegen können. Die enzymatischen Systeme können für Bioreaktoren, Biosensoren und chromatographische Systeme verwendet werden.

Description

Enzymabbauketten
Die vorliegende Erfindung betrifft enzymatische Systeme mit Enzymabbauketten aus Enzymen verschiedenen Typs, vorzugsweise im immobilisierten Zustand, und ihre Verwendung, insbesondere für die Anwendung in Bioreaktoren, Biosensoren und chromatographischen Systemen.
In der angewandten Mikrobiologie, insbesondere in der Biotechnologie, ist es bekannt, Enzyme, enzymproduzierende Mikroorganismen oder Zellen auf bestimmten Trägern zu fixieren, beispielsweise wenn sie als Biokatalysatoren verwendet werden. Dieser Vorgang wird im allgemeinen als Immobilisierung bezeichnet.
Da native Enzyme bei der Lagerung oder beim einmaligen Batch-Ansatz durch biologische, chemische oder physikalische Einwirkungen in ihrer Aktivität reduziert werden, besteht wegen der hohen Herstellungskosten von Enzymen ein Bedarf, diese Enzyme zu stabilisieren. Durch die Immobilisierung werden sie wiederverwendbar. Nach der Verwendung können die Enzyme leicht wieder abgetrennt werden. Auf diese Weise lassen sie sich in hoher lokaler Konzentration und in kontinuierlichem Durchfluß einsetzen. Die Substrat-Spezifität und die Spezifität der Reaktion sowie die Reaktivität des Enzyms dürfen durch die Immobilisierung nicht verloren gehen.
Bei der Immobilisierung von Enzymen werden im allgemeinen drei grundsätzliche Methoden unterschieden, nämlich erstens die Immobilisierung durch Quervernetzung, zweitens die Immobilisierung durch Bindung an einen Träger und drittens die Immobilisierung durch Einschluß.
Bei der Immobilisierung durch Quervernetzung erhält man quervernetzte Enzyme, die miteinander fixiert sind, ohne daß ihre Aktivität beeinflußt wird. Die Enzyme sind jedoch nicht mehr löslich. Die Quervernetzung erfolgt beispielsweise mit Glutardialdehyd. Wenn die Immobilisierung durch Anbindung an einen Träger erfolgt, kann die Bindung durch Adsorption, lonenbindung oder kovalente Bindung erfolgen. Die Bindung an den Träger kann auch innerhalb der ursprünglichen mikrobiellen Zelle stattfinden. Das Enzym wird durch die Fixierung nicht in seiner Aktivität beeinflußt, es kann trägergebunden mehrfach oder kontinuierlich eingesetzt werden.
Bei der Immobilisierung durch Einschluß wird das Enzym meist zwischen semipermeablen Membranen und/oder Gelen, Mikrokapseln oder Fasern eingeschlossen. Die gekapselten Enzyme sind z. B. durch eine semipermeable Membran von der umgebenden Substrat- und Produkt-Lösung getrennt. Es können auch Zellen gekapselt werden. Das Enzym ist durch die Fixierung im Raum nicht in seiner Aktivität beeinflußt.
Immobilisierte Enzyme, enzymproduzierende Mikroorganismen oder Zellen werden insbesondere in biotechnologischen Verfahren eingesetzt. Die ersten technischen Verfahren mit immobilisierten Zellen wurden empirisch optimiert und werden noch heute eingesetzt, so z. B. die Abwasserreinigung im Tropfkörper. Ein ebenfalls älteres Verfahren ist die Essigproduktion mit dem Generatorverfahren. Im Nahrungsmittelbereich ist der Einsatz von Zellen mit Glucose-Isomerase zur Produktion von fructosehaltigem Sirup das wichtigste Verfahren. Glucose-Amylase zur Glucose-Herstellung im Stärkeprozeß wird ebenfalls immobilisiert eingesetzt. Die Spaltung von Lactose mit Hilfe der immobilisierten ß-Galaktosidase aus Hefen zu Glucose und Galactose ist ebenfalls ein gängiges Verfahren. Weitere technische Verfahren mit immobilisierten Systemen gibt es bei der Aminosäureherstellung, bei der Spaltung von Penicillin G zu 6-Aminopenicillinsäure und bei der Herstellung von Ethanol mit wachsenden, immobilisierten Zellen von Saccharomyces sp.
Immobilisierte Enzym- und Zellsysteme werden nicht nur in biotechnologisch ablaufenden Produktionsverfahren, sondern auch in der Analytik eingesetzt, so z. B. in sogenannten Biosensoren. Das Prinzip der Analytik mit Hilfe von immobilisierten Systemen beruht darauf, daß ein zu bestimmendes Substrat durch ein immobilisiertes System umgesetzt wird, wobei die Veränderung der Produkt-, Substrat- oder Cosubstrat-Konzentration verfolgt werden kann, beispielsweise mit mehreren gekoppelten Methoden (z. B. Enzym-Elektroden).
Oftmals erfolgt der Abbau oder die Umsetzung von Molekülen aber nicht durch ein einziges Enzym, sondern entlang einer sogenannten Enzymabbaukette aus mehreren Enzymen, d. h. die Reaktion wird mehrstufig enzymkatalysiert mit unterschiedlichen Enzymen. Bisweilen ist auch die parallele Bestimmung mehrerer Stoffe durch mehrere unterschiedliche Enzyme oder durch Enzym(abbau-)ketten erforderlich. In herkömmlichen Biosensoren und Bioreaktoren des Standes der Technik kann eine solche mehrfach enzymatisch katalysierte Reaktionsfolge aber oftmals nur selten durchgeführt werden, weil die aus dem Stand der Technik bekannten Bioreaktoren und Biosensoren vorzugsweise einen Typ von Enzym umfassen.
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Problem besteht darin, ein System bereitzustellen, mit dem sich auch solche Prozesse enzymatisch katalysieren lassen, die mehrstufig enzymatisch ablaufen, d. h. bei denen die Moleküle, insbesondere Biomoleküle oder technische Moleküle, in mehreren Stufen enzymatisch katalysiert abgebaut oder zu Endprodukten umgesetzt werden, wobei die Umsetzung innerhalb nur eines einzigen enzymatischen Systems, aber mit verschiedenen Enzymen erfolgen soll.
Des weiteren liegt der vorliegenden Erfindung das Problem zugrunde, ein System bereitzustellen, mit dem auch die parallele Umsetzung mehrerer Stoffe durch mehrere unterschiedliche Enzyme oder durch Enzym(abbau-)ketten möglich ist.
Insbesondere soll ein solches System zur Anwendung in Bioreaktoren, Biosensoren und chromatographischen Systemen geeignet sein.
Es wurde nun hier überraschenderweise herausgefunden, daß das zuvor genannte Problem gelöst werden kann durch Kombination von mindestens zwei verschiedenen Enzymen, d. h. mindestens zwei verschiedenen Typen von Enzymen, die vorzugsweise jeweils in immobilisierter Form vorliegen können. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein enzymatisches System, welches eine Enzymabbaukette umfaßt, die ihrerseits mindestens zwei verschiedene bzw. unterschiedliche Enzyme, d. .h. Enzyme unterschiedlichen Typs, umfaßt.
Die mindestens zwei Enzyme der Enzym(abbau-)kette sind dabei derart aufeinander abgestimmt, daß sie, insbesondere selektiv oder im wesentlichen selektiv, mindestens ein bestimmtes Molekül - auch als "Target-Molekül" bezeichnet - abbauen.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Enzyme der Enzym(abbau-)kette derart aufeinander abgestimmt sein, daß sie, insbesondere selektiv oder im wesentlichen selektiv, mindestens ein nicht natürlich vorkommendes Molekül, insbesondere ein technisches Molekül, abbauen. Dabei können die Enzyme der Enzym(abbau-)kette beispielsweise derart aufeinander abgestimmt sein, daß sie das nicht natürlich vorkommende Molekül, insbesondere technische Molekül, gemäß einem nicht natürlich vorkommenden Metabolismus abbauen, d. h. eine nicht natürlich vorkommende Metabolismuskette bilden. Alternativ können aber die Enzyme der Enzym(abbau-)kette auch derart aufeinander abgestimmt sein, daß sie das nicht natürlich vorkommende Molekül, insbesondere technische Molekül, gemäß einem natürlich vorkommenden Metabolismus abbauen, d. h. eine natürlich vorkommende Metabolismuskette bilden, welche aber natürlich vorkommend den Abbau anderer, nämlich natürlich vorkommender Moleküle reguliert.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Enzyme der Enzym(abbau-)kette derart aufeinander abgestimmt sein, daß sie, insbesondere selektiv oder im wesentlichen selektiv, mindestens ein natürlich vorkommendes Molekül gemäß einem nicht natürlich vorkommenden Metabolismus abbauen. Das natürlich vorkommende Molekül kann beispielsweise ein Naturstoff sein.
Das erfindungsgemäße enzymatische System eignet sich insbesondere zum konsekutiven und/oder mehrstufigen Abbau von Molekülen. Dabei verläuft der Abbau vorzugsweise selektiv oder im wesentlichen selektiv in bezug auf das oder die abzubauenden Moleküle.
Des weiteren kann das erfindungsgemäße enzymatische System insbesondere zur Katalyse mehrstufig enzymatisch katalysierter Reaktionen eingesetzt werden.
Gleichermaßen eignet sich das erfindungsgemäße enzymatische System zur parallelen Umsetzung von verschiedenen Molekülen mit jeweils unterschiedlichen Enzymen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt in dem erfindungsgemäßen enzymatischen System mindestens eines der Enzyme der Enzym(abbau-)kette in immobilisierter Form vor. Vorzugsweise können bei dieser Ausführungsform alle Enzyme der Enzym(abbau-)kette in immobilisierter Form vorliegen.
Die Immobilisierung der Enzyme kann erfindungsgemäß nach den üblichen, zuvor beschriebenen Verfahren des Standes der Technik erfolgen, wobei die Reaktivität der auf diese Weise immobilisierten Enzyme zumindest im wesentlichen erhalten bleiben soll.
So kann die Immobilisierung mindestens eines der Enzyme des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems beispielsweise durch Quervernetzung erfolgen.
Des weiteren besteht die Möglichkeit, mindestens eines der Enzyme des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems durch Einschluß oder Verkapselung zu immobilisieren, insbesondere durch Einschluß oder Verkapselung in eine semipermeable Membran oder zwischen mehrere semipermeable Membranen, aber auch zwischen eine und/oder mehrere semipermeable Membranen und abschließend eine ionendurchlässige, aber gaspermeable Membran, z. B. aus PTFE oder Silikonkautschuk. Die Immobilisierung mindestens eines der Enzyme des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems kann auch durch Bindung an einen geeigneten Träger erfolgen. Hierbei kann die Bindung aufgrund von Adsorption, lonenbindung oder/und kovalenter Bindung Zustandekommen. Beispielsweise kann die Immobilisierung durch Anbindung an einen geeigneten, vorzugsweise chemisch inerten Träger erfolgt sein, wobei der Träger zuvor durch plasmachemische Oberflächenmodifizierung aktiviert worden sein kann.
Schließlich besteht auch die Möglichkeit, das oder die Enzyme des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems durch ein Verfahren zu immobilisieren, wie es beschrieben ist in der deutschen Patentanmeldung mit dem Amtsaktenzeichen DE 101 18 553.7, wobei deren gesamter Inhalt hiermit ausdrücklich durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Dieses Verfahren umfaßt die folgenden Verfahrensschritte:
(a) Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche durch Modifizierung der Trägeroberfläche mit plasmachemischen Methoden, insbesondere wobei die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche eine Funktionalisierung der Trägeroberfläche umfaßt und vorzugsweise dadurch erfolgt, daß unter plasmachemischen Bedingungen mindestens eine geeignete, gegenüber dem oder den anzubindenden Enzymen reaktive funktionelle Gruppe direkt an der chemisch inerten Trägeroberfläche angebracht wird, insbesondere wobei die funktionelle Gruppe vorzugsweise eine Carboxyl-, Amino-, Hydroxy- und/oder Thiogruppe, gegebenenfalls in aktivierter, insbesondere protonierter oder deprotonierter Form, umfaßt; anschließend
(b) Anbindung des oder der zu immobilisierenden Enzyms, gegebenenfalls nach ihrer Überführung in einen aktivierten, anbindungsfähigen Zustand, an die auf in Schritt (a) aktivierte Trägeroberfläche; und schließlich
(c) gegebenenfalls Quervernetzung des in Verfahrensschritt (b) angebundenen Enzyms, insbesondere wobei die Verfahrensschritte (b) und (c) gegebenenfalls zusammengefaßt, insbesondere gleichzeitig durchgeführt werden können und/oder die Immobilisierung gegebenenfalls schichtweise, insbesondere mit Glutardialdehyd, durchgeführt werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft also gemäß einer besonderen Ausführungsform ein enzymatisches System, bei dem mindestens eines der Enzyme, vorzugsweise sämtliche Enzyme der Enzym(abbau-)kette durch Fixierung und/oder Bindung an eine chemisch inerte, plasmachemisch aktivierte und/oder funktionalisierte Trägeroberfläche nach dem zuvor beschriebenen Verfahren immobilisiert sind.
Die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche mittels plasmachemischer Methoden in Schritt (a) des zuvor beschriebenen Verfahrens ist vorzugsweise selektiv nur an der Oberfläche erfolgt, so daß die Bulk-Eigenschaften der chemisch inerten Trägeroberfläche im übrigen erhalten bleiben, wobei die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche in Schritt (a) des zuvor beschriebenen Verfahrens im reaktiven Plasma, insbesondere Hochfrequenzplasma, erfolgt ist. Die chemisch inerte Trägeroberfläche kann insbesondere Edelmetalle wie insbesondere Platin sowie deren Legierungen, Edelstahl oder polyhalogenierte Polymere, insbesondere polyhalogenierte polymere Kohlenwasserstoffe wie insbesondere Polytetrafluorethylen oder Polyvinylchlorid, oder aber Celluloseacetat oder Kombinationen dieser Materialien umfassen. Besonders geeignet sind beispielsweise PTFE- (Teflon®) und Celluloseacetatmembranen.
Die Anbindung oder Ankopplung des oder der zu immobilisierenden Enzyme an die plasmachemisch modifizierte Trägeroberfläche gemäß Schritt (b) des zuvor beschriebenen Verfahrens kann insbesondere durch Anbindung oder Ankopplung des oder der Enzyme über die in Schritt (a) angebrachten, reaktiven funktionellen Gruppen erfolgt sein, wobei das oder die Enzyme unmittelbar an die auf die Trägeroberfläche aufgebrachten, reaktiven funktionellen Gruppen angebunden sein können oder aber mittelbar über einen geeigneten Linker. Gemäß einer besonderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein enzymatisches System bei dem mindestens eines der Enzyme, vorzugsweise sämtliche Enzyme der Enzym(abbau-)kette durch Fixierung und/oder Bindung an eine chemisch inerte, plasmachemisch aktivierte und/oder funktionalisierte Trägeroberfläche immobilisiert sind. Dabei können das oder die Enzyme unmittelbar oder mittelbar an eine chemisch inerte Trägeroberfläche fixiert, insbesondere angebunden oder angekoppelt sein. Insbesondere kann die Anbindung oder Ankopplung des oder der Enzyme über an die chemisch inerte Trägeroberfläche angebrachte, geeignete, reaktive funktionelle Gruppen erfolgt sein.
Die Enzyme des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems können insbesondere ausgewählt sein aus der Gruppe von Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen (z. B. Esterasen wie Lipasen), Lyasen, Isomerasen und Ligasen (Synthetasen) sowie deren Mischungen oder Kombinationen untereinander.
Bei dem erfindungsgemäßen enzymatischen System befinden sich die mindestens zwei Enzyme entweder innerhalb einer einzigen Reaktionszone oder aber in getrennten, hintereinander folgenden, sequentiell geschalteten Reaktionszonen, die dann gemeinsam das enzymatische System bilden. Mit anderen Worten können in dem er indungsgemäßen enzymatischen System die Enzyme der Enzym(abbau-)kette innerhalb einer Einheit, vorzugsweise innerhalb einer Reaktionszone, eines Kompartimentes oder einer Zelle, insbesondere Meßzelle, angeordnet sein oder aber auch in getrennten, insbesondere hintereinanderfolgenden Einheiten, vorzugsweise in getrennten, hintereinanderfolgenden Reaktionszonen, Kompartimenten oder Zellen, insbesondere Meßzellen, die zusammen das enzymatische System bilden, angeordnet sein. Zwecks Differenzmessung kann jedoch auch eine Parallelschaltung von Meßzellen erfolgen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das erfindungsgemäße enzymatische System Amyloglucosidase und Glucoseoxidase, gegebenenfalls in Kombination mit Mutarotase und/oder α- Glucosidase (Maltase). Ein solches System ist insbesondere zum Abbau von nichtionischen Tensiden, insbesondere von Alkylpolyglucosiden, geeignet.
Das erfindungsgemäße enzymatische System ist vielseitig verwendbar, insbesondere in Biosensoren, Bioreaktoren oder chromatographischen Systemen (z. B. chromatographischen Säulen). Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit auch Biosensoren, Bioreaktoren und chromatographische Systeme, welche das erfindungsgemäße enzymatische System umfassen.
Wie zuvor beschrieben, können die erfindungsgemäßen enzymatischen Systeme in Biosensoren Verwendung finden. Es werden mindestens zwei verschiedene Arten von immobilisierten Enzymen miteinander kombiniert, die in einer Enzymkette oder Enzymabbaukette eingesetzt werden. Dabei können die verschiedenen Enzyme entweder in einem einzigen Reaktionssystem (z. B. in einer Meßzelle) vorliegen oder aber sequentiell hintereinander geschaltet sein (z. B. in aufeinanderfolgenden Meßzellen), die dann zusammen das erfindungsgemäße enzymatische System bilden. Auf diese Weise gelingt beispielsweise die parallele Bestimmung mehrerer Stoffe durch mehrere Enzyme (oder Enzymketten) in einer Meßzelle oder der sequentielle Abbau eines Ausgangsstoffes (Analyt) in mehreren hintereinander geschalteten Meßzellen bei gleichzeitiger Elektroanalyse in einer und/oder mehreren Meßzellen.
Unter "Biosensoren" versteht man erfindungsgemäß Meßfühler mit einer bioaktiven Komponente, basierend auf der Kopplung von Biomolekülen, die als Rezeptoren im weitesten Sinne spezifisch Analyte erkennen, mit physikochemischen Transduktoren, die ein biologisch erzeugtes Signal (z. B. Sauerstoffkonzentration, pH-Wert, Farbstoff etc.) in elektrische Meßsignale umformen.
Fig. 1 zeigt schematisch den typischen Aufbau eines Biosensors zur spezifischen Erkennung eines Analyten 1 , wobei der Biosensor einen Rezeptor 2 und einen Transduktor 3 umfaßt, der das vom Rezeptor 2 erzeugte biologische Signal in ein elektronisches Signal 4 umwandelt, welches an eine Elektronik 5 weitergeleitet wird. Zur spezifischen Erkennung können verschiedene Biomoleküle verwendet werden, insbesondere Enzyme. Als Transduktoren können eingesetzt werden potentiometrische Sensoren, amperometrische Elektroden, piezoelektrische Sensoren, Thermistoren oder optoelektronische Sensoren. Aufgrund der Reaktion oder Wechselwirkung des Analyten mit dem Rezeptor unterscheidet man insbesondere zwei Grundtypen von Biosensoren, nämlich einerseits Bioaffinitätssensoren, die bei der Komplex-Bildung eintretende Veränderung der Elektronendichte ausnutzen, und andererseits Metabolismussensoren, die auf der spezifischen Erkennung und Umsetzung von Substraten beruhen.
Biosensoren finden - insbesondere in Form von Enzym-Elektroden - im Gesundheitswesen, zur Kontrolle biotechnologischer Prozesse, in der Lebensmittelindustrie oder im Umweltschutz Verwendung. Mit Biosensoren können unterschiedlichste Systeme analysiert werden z. B. Glucose, Galactose, Lactose, Ethanol, Milchsäure oder Harnsäure.
Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems in Biosensoren können beispielsweise die verschiedenen Enzymmoleküle zur Immobilisierung entweder in polymere Matrizes (wie z. B. PVC, Gele, Graphite oder Zeolithe) oder zwischen Folien (z. B. Celluloseacetat) eingebracht werden. Des weiteren kann bei Sensoren, die beispielsweise auf der enzymatischen Erzeugung oder dem Verbrauch von Sauerstoff basieren und eine chemisch inerte Membran (z. B. eine Teflon®-Membran) besitzen, diese genutzt werden, um die verschiedenen Enzyme anzubinden. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Biosensoren kann beispielsweise erfolgen, wie es beschrieben ist in der bereits zitierten deutschen Patentanmeldung DE 101 18 553.7, deren gesamter Inhalt durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Die erfindungsgemäßen Biosensoren ermöglichen beispielsweise die Herstellung von Mikroelektroden(arrays) für kleine Volumina und hohen Probendurchsatz (z. B. für die kombinatorische Anwendung). Anwendungsbeispiele für die erfindungsgemäßen Biosensoren sind die analytische Bestimmung von Tensiden, insbesondere ionischen Tensiden wie nichtionischen Tensiden (z. B. Alkylpolyglucosiden), von Polyasparaginsäure und von Fettalkoholderivaten.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Biosensor, insbesondere zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung nichtionischer Tenside, vorzugsweise von Alkylpolyglucosiden, wobei der Biosensor als Enzym(abbau-)kette ein enzymatisches System umfaßt, welches als Enzyme Amyloglucosidase und Glucoseoxidase, gegebenenfalls in Kombination mit Mutarotase und/oder α-Glucosidase (Maltase), enthält. Dabei liegen die zuvor genannten Enzyme insbesondere in immobilisierter Form vor, vorzugsweise durch Bindung an eine chemisch inerte Oberfläche und/oder Membran, bevorzugt an eine Polytetrafluorethylen- oder Celluloseacetatmembran.
Wie zuvor beschrieben kann das erfindungsgemäße enzymatische System auch in Bioreaktoren Verwendung finden.
Unter "Bioreaktoren" versteht man erfindungsgemäß das physikalische Behältnis, in dem biologische Stoffumwandlungen insbesondere mit Enzymen durchgeführt werden.
Dabei können die immobilisierten Enzyme des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems beispielsweise an die Wandungsoberflächen des Bioreaktors angebracht sein oder aber - insbesondere im Fall von Festbettreaktoren - an das stationäre Trägermaterial oder Schüttgut angebunden sein. Zu Einzelheiten kann verwiesen werden auf die bereits zitierte deutsche Patentanmeldung DE 101 18 553.7, deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Auf diese Weise kann eine effizientere Generation von Reaktoren verwirklicht werden, bei denen keine Abtrennung der Enzyme von der Reaktionslösung erforderlich ist. Erfindungsgemäß geeignete Reaktoroberflächen können aus Metall (z. B. Edelmetall wie Platin) bestehen oder mit allen gängigen Polymeren, die für die Reaktorherstellung eingesetzt werden, beschichtet sein (z. B. Teflon®). Fig. 2 zeigt beispielhaft und schematisch verschiedene Arten von Bioreaktoren des Standes der Technik:
Fig. 2A zeigt einen Rührkessel-Reaktor, bei dem der Energieeintrag durch mechanisch bewegte Einheiten erfolgt. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom und M die mechanische Antriebsvorrichtung (z. B. Motor). Wegen ihrer Vielseitigkeit werden Rührkessel-Reaktoren am häufigsten eingesetzt.
Fig. 2B zeigt einen Blasensäulen-Reaktor, bei dem die Durchmischung durch Zufuhr von Luft oder eines anderen Gases erfolgt. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom.
Fig. 2C zeigt einen sogenannten Airlift-Fermenter mit innerem Durchlauf, wobei im allgemeinen durch Eintrag von Luft oder einem anderen Gas ein Flüssigkeitsumlauf und eine Durchmischung erzeugt wird. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom.
Fig. 2D zeigt einen sogenannten Airlift-Fermenter mit äußerem Durchlauf, wobei im allgemeinen durch Eintrag von Luft oder einem anderen Gas ein Flüssigkeitsumlauf und eine Durchmischung erzeugt wird. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom.
In den zuvor beschriebenen Bioreaktor-Typen des Standes der Technik kann das erfindungsgemäße enzymatische System zum Einsatz kommen, beispielsweise durch Modifizierung der Wandungsoberfläche (z. B. durch Ankopplung der Enzyme an die chemisch inerte Reaktorwandungen) oder im Fall von Festbett- Bioreaktoren durch Anbindung der Enzyme an das stationäre Trägermaterial bzw. Schüttgut.
Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen enzymatischen Systems in Bioreaktoren, insbesondere zur Modifizierung der Wandungsoberfläche oder bei der Bindung der Enzyme an das stationäre Trägermaterial bzw. Schüttgut, besteht die Möglichkeit, die mindestens zwei verschiedenen Arten von Enzymen derart miteinander zu kombinieren, d. h. die Enzymketten oder Enzymabbauketten derart einzusetzen, daß entweder die verschiedenen Enzyme in einer einzigen Reaktionszone vorliegen oder aber sequentiell hintereinander geschaltet sind (z. B. in aufeinanderfolgenden Reaktionszonen). Auf diese Weise werden insbesondere mehrstufige, enzymatisch katalysierte Synthesen und Prozesse ermöglicht oder auch die zeitgleiche, parallele Umsetzung verschiedener Ausgangsstoffe durch verschiedene Enzyme.
Die Fig. 3 zeigt exemplarisch und schematisch einige Ausführungsformen von Bioreaktoren nach der vorliegenden Erfindung:
Fig. 3A zeigt einen Bioreaktor, dessen chemisch inerte Wandungen durch Ankopplung eines immobilisierten Enzyms vom Typ A und eines immobilisierten Enzyms vom Typ B modifiziert sind, welche in unterschiedlichen, aufeinanderfolgenden Reaktionszonen angeordnet sind. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom.
Fig. 3B zeigt einen Bioreaktor, dessen chemisch inerte Wandungen durch Ankopplung eines immobilisierten Enzyms vom Typ A und eines immobilisierten Enzyms vom Typ B modifiziert sind, welche innerhalb einer einzigen Reaktionszone angeordnet sind.
Fig. 3C zeigt einen Bioreaktor in Form eines Festbettreaktors, an dessen Trägermaterial oder Schüttgut immobilisierte Enzyme vom Typ A und vom Typ B angekoppelt sind, welche innerhalb einer Reaktionszone angeordnet sind.
Es sind noch zahlreiche andere Varianten möglich, die der Fachmann beim Lesen der vorliegenden Beschreibung ohne weiteres in Betracht ziehen wird, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Des weiteren besteht die Möglichkeit, das erfindungsgemäße enzymatische System in chromatographischen Systemen, insbesondere in chromatographischen Säulen, einzusetzen. Dies kann zu synthetischen Zwecken geschehen (z. B. Durchführung enzymatisch katalysierter Reaktionen auf einer chromatographischen Säule) oder aber auch zu analytischen Zwecken (z. B. bei der analytischen Säulenchromatographie). Hierbei können die immobilisierten Enzyme des enzymatischen Systems beispielsweise an das stationäre Trägermaterial oder Schüttgut, insbesondere das stationäre Säulenmaterial, des chromatographischen Systems gebunden sind. Für weitere Einzelheiten kann verwiesen werden auf die bereits zitierte deutsche Patentanmeldung DE 101 18 553.7, deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Der Einsatz des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems hat den Vorteil, daß sich mit dem erfindungsgemäßen System auch solche Prozesse enzymatisch katalysieren lassen, die mehrstufig enzymatisch ablaufen, d. h. bei denen die Moleküle, insbesondere Biomoleküle oder technische Moleküle, in mehreren Stufen und mit verschiedenen Enzymen enzymatisch katalysiert abgebaut oder zu Endprodukten umgesetzt werden.
Des weiteren ermöglicht der Einsatz des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems auch die parallele Umsetzung mehrerer Stoffe durch unterschiedliche Enzyme oder durch Enzym(abbau-)ketten und hierdurch beispielsweise die parallele analytische Bestimmung mehrerer Stoffe nebeneinander mit einer einzigen Meßzelle, welche eine Enzymabbaukette aus verschiedenen Enzymen enthält oder der sequentielle Abbau eines Ausgangsstoffes (Analyt) in mehreren hintereinander geschalteten Meßzellen bei gleichzeitiger Elektroanalyse in einer und/oder mehreren Meßzellen.
Schließlich hat der Einsatz des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems auch den Vorteil, daß einerseits die Enzyme aufgrund der Immobilisierung wiederverwendet werden können und andererseits nach ihrer Verwendung eine leichte Abtrennung möglich ist (z. B. nach erfolgter Synthese im Bioreaktor, beispielsweise durch Abiassen der Reaktionsmischung). Auf diese Weise lassen sich die Enzyme effizient und kostengünstig in hoher lokaler Konzentration und in kontinuierlichem Durchfluß einsetzen. Die Substrat-Spezifität und die Spezifität der Reaktion sowie die Reaktivität der Enzyme gehen dabei jedoch nicht verloren. Das Konzept der vorliegenden Erfindung besteht also darin, verschiedene Enzyme so miteinander zu kombinieren, daß auf diese Weise Moleküle (z. B. technische Moleküle oder Biomoleküle) abgebaut werden können. Dies kann beispielsweise zu analytischen Zwecken dazu genutzt werden, um die abgebauten Moleküle über bestimmte, wie zuvor beschriebene Parameter (z. B. pH-Wertveränderung, SauerstoffzehrungAerzeugung etc.) nachzuweisen. In bezug auf Bioreaktoren bedeutet dies, daß auch die Möglichkeit der gleichzeitigen oder sequentiellen Umsetzung eines oder mehrerer Stoffe besteht.
Nach dem erfindungsgemäßen Konzept sind die Herstellung eines Stoffes und die Reaktionsverfolgung mit Sensoren, die beispielsweise Sauerstoff oder H2O2 messen, identisch und ermöglichen somit auch eine effiziente Reaktionskontrolle.
Weitere Ausgestaltungen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann beim Lesen der Patentschrift ohne weiteres erkennbar und realisierbar, ohne daß er dabei den Rahmen der vorliegenden Erfindung verläßt.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Ausführungsbeispiele veranschaulicht, welche die vorliegende Erfindung jedoch keinesfalls beschränken sollen.
Ausführungsbeispiele
Enzymatische Abbauketten für Alkylpolyglucoside (APG®) in erfindungsgemäßen Biosensoren
® Für APG (Alkylpolyglucoside, eine Gruppe von nichtionischen Tensiden, vertrieben von der Firma Henkel) wurde eine enzymatische Abbaukette entwickelt, bestehend aus Amyloglucosidase und Glucoseoxidase sowie gegebenenfalls auch Mutarotase und/oder α-Glucosidase (Maltase).
Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Biosensors wurden die zuvor genannten Enzyme zunächst immobilisiert.
Die Immobilisierung erfolgte, indem die zuvor genannten Enzyme auf eine
Celluloseacetat-Membran oder auf eine Teflon -Membran aufgebracht wurden, wie dies beschrieben ist in der deutschen Patentanmeldung DE 101 18 553.7. Hierzu wurde die Membran nach an sich bekannten plasmachemischen Methoden modifiziert bzw. aktiviert, d. h. im reaktiven Hochfrequenzplasma unter an sich bekannten Bedingungen funktionalisiert, wobei hierdurch geeignete, enzymreaktive funktionelle Gruppen an die chemisch inerte Membranoberfläche gebunden werden, insbesondere Amino- und/oder Carboxylgruppen. Hieran wurden dann die Enzyme mit an sich bekannten Methoden gebunden.
Alternativ kann die Immobilisierung auch mit an sich aus dem Stand der Technik bekannten Methoden durchgeführt werden, z B. durch Einbringen zwischen Folien (z. B. aus Celluloseacetat) oder in polymere Matrizes (z. B. PVC, Gele, Graphite, Zeolithe etc.).
® Mit dieser enzymatischen Abbaukette konnten dann APG nachgewiesen oder elektroanalytisch bestimmt werden.
1. Alkylpolyglycoside
Seit circa 10 Jahren konnte ein erheblicher Anstieg in der Produktion von Alkylpolyglycosiden beobachtet werden. Phosphatfrei werden sie als oberflächenaktive Neutraltenside Kosmetikpräparaten oder Waschmitteln zugesetzt. Ein bis sieben Glucoseeinheiten, in der Häufigkeit von Mono- zu Heptaglycosiden drastisch abnehmend, sind glycosidisch mit einem meist langkettigen Alkohol wie Dodecanol oder Tetradecanol verknüpft.
Da auf der Basis von Enzymen die gesamte biochemische Information zur Erkennung des Analyten in ein Membransystem inkorporiert werden kann, bieten sich bioelektrochemische Membranelektroden als ein besonders attraktives Meßprinzip für die Alkylpolyglycoside an.
® Von den bisher konzipierten verschiedenen molekularselektiven APG -
Membranen mit immobilisierten Enzymen wird hier anhand von elf
Membransystemen über die erfindungsgemäßen Prinzipien berichtet.
® Zur Analytik stand das wasserlösliche Alkylpolyglycosid APG 220 (Cβ-io-
Alkylpolyglycosid) der Firma Henkel KGaA in Düsseldorf zur Verfügung. Alle
Meßlösungen wurden phophatgepuffert auf einen pH-Wert von 5,0.
2. Konstruktion molekularselektiver APG -Sensoren
® 2.1. APG -Sensoren
Die erfindungsgemäßen Sensoren sind in ein Durchflußmeßsystem integriert,
® wobei die Enzymmembranen für den APG -Substratumsatz das Dach einer wannenförmig abgeflachten Durchflußkammer bilden, die über radiale Zu- und
Abflußkanäle verfügt. Die tangentiale Anströmung der Enzymmembran erfolgt
® durch Ansaugung der APG -haltigen Lösungen mit einer der Meßzelle nachgeordneten Rollenpumpe, wobei Meß- und Kalibrierlösungen luftblasengetrennt eingespeist werden.
® 2.1.1. H2O2-sensitiv-enzymatische APG -Sensoren 2.1.1.1. Modular aufgebautes Meßsystem
® Es handelt sich um amperometrische APG -Biosensoren mit H2O2-Detektoren in Disk-Elektrodenbauweise ohne Innenelektrolyt aus Pt-Meßanode und Ag- Referenzkathode mit jeweils 2 mm Durchmesser in zwei getrennten, seriell angeordneten und über einen Schlauch verbundenen Durchflußkammern. Meßanode und Referenzkathode sind in "zündkerzenförmiger" Bauweise ausgeführt und werden dichtend gegen die Berandung der Durchflußkammern geschraubt. Nur die Stirnflächen der Edelmetall-Elektroden liegen in frei zugänglicher Form vor und sind elektroanalytisch aktiv. Die Membransysteme mit einem Durchmesser von 5 mm stehen jeweils kavitätengeschützt in direktem Kontakt zur Pt-Meßanode.
Besondere Ausgestaltungsformen der Enzym-Membranen sehen zwecks
Oberflächenvergrößerung die zylindrische Auskleidung der Kavität
® gegebenenfalls mit Überzug der Pt-Oberfläche vor (SBC-1412-APG ). Konvexe
Elektrodenoberflächengestaltung in Verbindung mit dünnen Enzymmembranen fördert die Schnelligkeit des Einstellverhaltens.
Für eine spezielle Applikationsform erfolgte der Einbau der hier beschriebenen
Meßanoden und Referenzkathoden in den Deckel und Boden von
® Kunststoffgefäßen (SBC-1420-APG ) zur stationären Messung z. B. für einen
Meßkoffer des Kundendienstes. In einer anderen Ausführungsform wurden diese Meßsystembauteile in die Seitenwände eines Acrylglasrohres integriert, das am oberen und unteren Ende mit Zu- und Abflußhähnen versehen war.
2.1.1.2. Meßsystem mit anodischem Fenster
Die Pt-Meßanode mit ebenfalls kavitätengeschützter Enzymmembran von 5 mm verfügt durch ein anodisches Fenster über einen direkten Zugang zur Meßlösung, während sich die stabförmige Ag-Referenzkathode (Durchmesser 1 mm) in einem Seitenraum der Meßzelle befindet und über einen Innenelektrolyten mit der Pt-Meßanode in Verbindung steht.
® 2.1.2. O2-sensitiv-enzymatische APG -Sensoren ® Diese APG -Sensoren bestehen aus einer Pt-Kathode mit einem
Membransystem (vgl. 2.1.2.1. und 2.1.2.2.) auf der Basis von PTFE und immobilisierten Enzymen. Die Ag/AgCI-Referenzanode befindet sich wiederum analog zu 2.1.1.2. in einem Seitenraum der Meßzelle und steht über einen gepufferten Innenelektrolyten mit der Pt-Meßelektrode im kathodischen Fenster in Verbindung, das durch die PTFE-Membran ionenundurchlässig, aber gaspermeabel verschlossen ist, so daß O2 als Transducer zwischen den immobilisierten Enzymen und der Pt-Kathode fungieren kann.
2.1.2.1. Membransystem mit chemisch nicht modifizierter PTFE-Membran
Elektrodenseitig verfügt das Membransystem über eine chemisch nicht modifizierte PTFE-Membran, der meßlösungswärts zwei Dialysemembranen aus Celluloseacetat aufliegen, zwischen denen - vor bakteriellem Abbau geschützt - die Enzyme an einem Streifen aus Cellulosefasern durch Adsorption und/oder ionischer Bindung immobilisiert und/oder kovalent vernetzt liegen.
2.1.2.2. Membransystem mit chemisch modifizierter PTFE-Membran
An die im Hochfrequenzplasma aminisierten PTFE-Membranen koppelt kovalent das bifunktionelle Reagenz Glutardialdehyd unter gleichzeitiger
® Queπ/ernetzung APG umsetzende Enzyme.
® APG -selektive Enzymmembranen
3.1. Bienzym-Membranen
Der enzymatische Angriff auf die α-1 ,6-glucosidischen Bindungen von
® APG 220 durch die Amyloglucosidase liefert Glucose,
Alkylpolyglycoside Amyloglucosidase ^ p . G|ucose
deren ß-Form durch Glucoseoxidase (GOD) weiter umgesetzt wird: ß-D-Glucose + O2 + H2O GQD H2O2 + Gluconsäure.
Reaktionsbedingt kann die amperometrische Messung am Ende der Enzymabbaukette über den Verbrauch von O2 durch Sauerstoff-Elektroden oder die Bildung von H2O2 mit Wasserperoxid-Detektoren erfolgen.
Abb. 1 zeigt ein U/I-Diagramm für Bienzym-Membranen für Alkylpolyglycosid- Biosensoren mit Wasserstoffperoxid-Detektoren (t = 20,0 °C).
SBC-Nr. Amyloglucosidase Glucoseoxidase
1417 6,7 U 6,7 U
1419 26,7 U 26,7 U
1408 40,0 U 40,0 U
Für die APG -Sensoren mit Wasserstoffperoxid-Detektoren des Typs 2.1.1.1. mit den Membranen SBC-1408, SBC-1417 und SBC-1419 gibt Abb. 1 graphisch den Zusammenhang zwischen der Enzymkonzentrationgesamt in U/Membran, der
® bei 7500 ppm APG 220 (Markierungspunkte) gemessenen Stromstärke und der
Einstellzeit wieder.
Die Bienzym-Membranen enthalten die beiden Enzyme Amyloglucosidase und Glucoseoxidase in gleicher Konzentration bezogen auf Units, deren Gesamtkonzentration in der graphischen Darstellung in Abb. 1 angegeben ist. Die Enzyme liegen in den Membransystemen durch Glutardialdehyd in vernetzter Form vor.
® SBC-1419-APG verfügt unter den drei in Abb. 1 aufgeführten Meßsystemen mit
Bienzym-Membranen über das höchste analytische Auflösungsvermögen.
® Eine Erhöhung der Enzymkonzentration (SBC-1408-APG ) verlängert die intramembranösen Diffusionswege. Durch die Membranverdickung kommt es zu einem Anstieg in der Einstellzeit. Parallel geht damit zugleich ein Absinken des
Auflösungsvermögens einher. Es erscheint diskussionswürdig, daß hierfür ursächlich u. a. ein größerer Zerfall an H2O2 auf dem längeren Diffusionsweg zur Pt-Meßanode mit zusätzlichem Verlust durch Abdiffusion über die Membranoberfläche verantwortlich sein könnte.
® Als Ausdruck niedrigerer Enzymkonzentration (SBC-1417-APG ) sinkt der
Substratumsatz und entsprechend der Meßstrom. Die schnelleren
Einstellzeiten sind eine Folge der kürzeren intramembranösen Diffusionswege
(Membranverdünnung).
® Die Bienzym-Membran SBC-1419-APG ist prinzipiell auch für einen Einsatz am H2O2-sensitiv-enzymatischen Meßsystem mit anodischem Fenster
(2.1.1.2.) geeignet ebenso wie die im nachfolgenden beschriebene Trienzym-
Membran.
3.2. Trienzym-Membranen
® Um die Empfindlichkeit des APG -Sensors nochmals zu steigern, wurde durch zusätzliche kovalente Bindung beziehungsweise Quervernetzung von
® Mutarotase mit Glutaraldehyd die Trienzym-Membran SBC-1425-APG konzipiert (Tab. 1).
Tab. 1: Bi- und Trienzym-Membranen für Alkylpolyglycosid-Biosensoren mit Wasserstoffperoxid-Detektoren
SBC-Nr. Amyloglucosidase Glucoseoxidase Mutarotase
1419 26,7 U 26,7 U —
1425 22,9 U 22,9 U 142,9 U
Bekanntlich reagiert GOD hochselektiv mit ß-D-Glucose, während die α-Form durch dieses Enzym nicht umgesetzt wird.
Von Rybinski, W. und Hill, K. beschreiben aber in ihrer Arbeit über "Alkylpolyglycoside - Eigenschaften und Anwendungen einer neuen Tensidklasse" in Angew. Chem. 110 (1998), Seiten 1395 bis 1412, daß im technischen Prozeß die α-Anomere und ß-Anomere in einem Verhältnis von ungefähr 2 : 1 stehen. Da aber nahezu umgekehrt nach Einstellung des Mutarotationsgleichgewichtes α-D-Glucose mit 36 % und ß-D-Glucose mit 64 % nach ca. 2 Stunden aus frisch angesetzter α-D-Glucose vorliegen, wurde erwartet, daß mit Hilfe der zusätzlich inkorporierten Mutarotase
α-D-Glucose Mutarotase ^ ß-D-Glucose langsame spontane Reaktion
in beschleunigter Reaktionsweise ein höheres intramembranöses
Substratangebot für die Glucoseoxidase erzwungen werden kann, wenn man
® davon ausgeht, daß im Produkt APG 220 ein ähnliches Verhältnis der α- und ß-Anomere wie im technischen Prozeß gegeben ist.
Es konnte an modular aufgebauten Meßsystemen (vgl. 2.1.1.1.) mit H2O2-
Detektoren der Nachweis erbracht werden, daß sich gegenüber der
® Bienzymmembran SBC-1419-APG durch die zusätzliche Anwesenheit der
® Mutarotase in der Trienzym-Membran SBC-1425-APG die
Sensorempfindlichkeit um ca. 30 % steigern ließ, obwohl die beiden anderen
Enzyme sogar in geringfügig niedrigeren enzymatischen Konzentrationen im
Trienzym-Membransystem vorlagen (vgl. Tab. 1).
3.3. Tetraenzym-Membranen
® Die ersten molekularselektiven Membranelektroden zur Bestimmung von APG wurden auf der Basis von vier Enzymen realisiert und enthielten neben
Amyloglucosidase, Glucoseoxidase, Mutarotase zusätzlich α-Glucosidase, letztere unter der Vorstellung, möglicherweise den Fettalkohol aus seiner glycosidischen Bindung freizusetzen (Tab. 2). ®
Tab. 2: Tetraenzym-Membranen für O∑-sensitive APG -Multienzymelektroden
SBC-Nr. Amyloglucosidase Glucoseoxidase Mutarotase α-Glucosidase 1400 52,0 U 40,0 U 1056,0 U 20,8 U
1402 150,0 U 120,0 U 1000,0 U 20,8 U
Ein Umsatz von α-1 ,6-glucosidischen Bindungen durch das auch als Maltase bekannte Enzym erfolgt leider nur langsam. Kein Angriff findet auf ß- glucosidische Bindungen statt. Hingegen sind α-1 ,4-glucosidische Bindungen der bevorzugte Angriffsort.
Die Immobilisierung der vier Enzyme erfolgte durch Adsorption und/oder ionischer Bindung an einem Streifen aus Cellulosefasern zwischen zwei Dialysemembranen aus Celluloseacetat. Die Enzymmembran wurde mit einer chemisch nicht modifizierten PTFE-Membran abgedeckt und auf einem Acrylglasring mittels eines O-Ringes gespannt und schließlich unter Vermittlung eines Innenelektrolytfilmes vor der Pt-Kathode des O2-Sensors positioniert, die durch eine Ag/AgCI Referenzkathode mit dem gemeinsamen Innenelektrolyten
® zur Meßzelle komplettiert wurde: O2-sensitive APG -Multienzym-
Membranelektroden.
® 3.4. APG -Biosensoren mit Enzymen an aminisierten PTFE- Membranen
An chemisch modifizierte PTFE-Membranen in aminisierter Form (2.1.2.2.) für Sauerstoff-Elektroden (2.1.2.) wurden durch das bifunktionelle Reagenz Glutardialdehyd Amyloglucosidase und Glucoseoxidase kovalent gebunden. In weiteren Schichten wurden diese Enzyme quervernetzt und an die vorherige Schicht angekoppelt. Unter den in Tab. 3 aufgeführten Enzymmembranen zeichnet den APG®-Sensor mit 10.) SBC-1322-APG®-HDKS5-Nr. 1 neben einer hohen Meßwertstabilität Einstellzeiten von nur 3 bis 6 Minuten aus. Dies ist Folge einer besonders strömungsgünstigen Geometrie bei tangentialer Anströmung des gesamten Membransystems und dem Fehlen von Enzyme kapselnden Dialysemembranen.
Tab. 3 . -Aminisierte PTFE-Membranen mit kovalent gebundenen Enzymen für
® O∑-Detektoren molekularselektiver APG -Sensoren
Labor-Code Amyloglucosidase GOD
7.) SBC-1322-APG®-HDKS3-Nr. 1 60,0 U 120,0 U
8.) SBC-1322-APG®-HDKS4-Nr. 1 140,0 U 120,0 U
10.) SBC-1322-APG®-HDKS5-Nr. 1 40,0 U 40,0 U
4. Ergebnisse
4.1. Einstellzeit
Neben der Wechselzahl der einzelnen Enzyme und strömungsgünstigen Positionierung der Membransysteme üben die Konzentrationen immobilisierter
Enzyme über die damit in Zusammenhang stehende Länge der Diffusionswege
® Einfluß auf die Einstellzeit der APG -Sensor-Membranen aus. Das Verhältnis
® von Masse (mg) zum Substratumsatz (Unit) der in den APG -Sensor- Membranen immobilisierten Enzyme läßt nach Abb. 2 erwarten, daß der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im intramembranösen
Diffusionsgeschehen von der Amyloglucosidase ausgeht. Ein Vergleich von Abb. 3 mit Abb. 4 bestätigt diesen Zusammenhang (vgl. hierzu auch Abb. 1).
Daraus erklärt sich aber auch das schleichende Einstellverhalten von SBC-
® 1402. Im Gegensatz hierzu zeigen andere APG -selektive Membranelektroden mit O2-Detektoren und immobilisierten Enzymen an aminisierten PTFE- Membranen bei ebenfalls tangentialer Anströmung unter Verzicht auf Dialysemembranen kurze Einstellzeiten von wenigen Minuten: vgl. hierzu 10.)
SBC-1322-APG -HDKS5-Nr. 1 unter 3.4 und Tab. 3, während APG®-Sensoren mit Wasserstoffperoxid-Detektoren mit einer überlegenem Empfindlichkeit bzw. größerem Auflösungsvermögen aufwarten (vgl. hierzu Abb. 1). Abb. 2 zeigt die Beziehung von Masse (mg) zum Substratumsatz (U) der in den
® APG -Sensor-Membranen eingesetzten Enzyme (1 Unit = 1 μmol
Substratumsatz/min)
® Abb. 3 zeigt die Enzymkonzentrationen in U/APG -selektiver Biosensor- Membran.
In den Abb. 3 und 4 sind die Säulen für Mutarotase und Maltase (α-Glucosidase) der mit "Bi." (Abkürzung für Bienzymmembran) gekennzeichneten Membranen auf Null gesetzt, für SBC-1425-Tri. (Tri. = Trienzymmembran) betrifft dies entsprechend nur die α-Glucosidase (Maltase).
® Abb. 4 zeigt die Enzymkonzentrationen in mg/APG -selektiver Biosensor- Membran.
Durch Anhebung der Temperatur des Meßmediums darf eine Verkürzung der
® Einstellzeiten von APG -Sensoren erwartet werden. Um eine thermisch bedingte Denaturierung der Enzyme sicher auszuschließen, wurde ein
Temperaturanstieg über 40 °C vermieden. Für die Trienzym-Membran SBC-
® 1425-APG wurde an H2O2-Detektoren des nach 2.1.1.1. aufgebauten modularen Durchflußmeßsystems bei einer Temperaturerhöhung um 10 °C der
Faktor 1 ,3 bestimmt, der ebenfalls darauf hinweist, daß der physikalische
Vorgang der Diffusion als geschwindigkeitsbestimmender Schritt für die
® Einstellzeiten dieses APG -Sensors maßgeblich ist; denn bekanntlich steigt nach der RGT-Regel die Geschwindigkeit einer chemischen Reaktion um das
Zwei- bis Vierfache an, wenn sich die Temperatur um 10 °C erhöht.
Offensichtlich wird also dieser chemische Vorgang durch die intramembranösen Diffusionsvorgänge überlagert, wobei dann ein Faktor von nur etwa 1 ,2 zu erwarten ist.
4.2. Funktionsdauer
Da der bisherige Schwerpunkt in der Erarbeitung membranchemischer
® Prinzipien lag, wurden die kontinuierlichen Dauerperfusionen der APG - Sensoren mit Phosphatpuffer des pH-Wertes 5,0 bei zwischenzeitlichen
® Messungen in APG -haltigen Lösungen nach einigen Wochen abgebrochen.
4.3. Molekularselektivität
Neben der Substratselektivität der Enzyme sind prinzipiell detektorbezogene
® Querempfindlichkeiten bei APG -Sensoren zu berücksichtigen. Diese verursachen bei O2-Detektoren grenzflächenaktive oder gasförmige, die PTFE- Membran permeierende und kathodisch umsetzbare Substanzen wie beispielsweise die Halogenkohlenwasserstoffe Chloroform (Trichlormethan) oder das Inhalationsnarkotikum Halothan (1 ,1 ,1-Trifluor-2-brom-2-chlorethan).
Wasserstoffperoxid-Detektoren setzen in ihrer Eigenschaft als Meßanoden auch andere anodisch oxidierbare Substanzen um. Der bei einer Polarisationsspannung von +950 mV Meß- gegen Referenzelektrode an frisch polierten Platin-Anoden zu beobachtende Glucose-Interferenzstrom in 5,55 mmol/l glucosehaltigen Phosphatpufferlösungen mit einem pH-Wert von 7,04 zeigte innerhalb von zwei Wochen einen e-funktionellen drastischen Abfall, der nach diesem Zeitraum nahezu vernachlässigbar klein wurde.
® Bei einer Konzentration von 7500 mg/l APG 220 in auf einen pH-Wert von 5,0 phophatgepufferten Lösungen lieferten nicht frisch polierte Pt-Meßanoden in einem modular aufgebauten Meßsystem nach 2.1.1.1. lediglich 1 ,33 % des
Meßstromes gegenüber einer mit der Bienzym-Membran SBC-1419
® beschichteten. Diese geringfügige durch die APG -Moleküle konzentrationsabhängig direkt am Detektor auslösbare zusätzliche Stromstärke kann nicht als Interferenzsignal gewertet werden, da sie synergistisch zu dem durch die Enzym-Membran ausgelösten Meßstrom wirkt und einkalibrierbar ist.
5. Elektronische Komponenten und rechnergestützte
Meßdatenauswertung
Der Nanoamperemeßwandler liefert dem amperometrischen Sensor plateauanpaßt eine Polarisationsspannung und verfügt über eine Wandlerkonstante von 1mV/nA. Die Polarisationsspannung beträgt für O2-sensitiv- enzymatische Meßsysteme -750 mV Meß- gegen Referenzelektrode und für H202-sensitiv-enzymatische Meßsysteme mit anodischer Oxidation +950 mV Meß- gegen Referenzelektrode.
Der 21-Bit-AD-Wandler setzt die von dem Nanoamperemeßwandler nach Stromstärke/Spannungswandlung gelieferten elektrischen Gleichspannungen in entsprechende digitale Signale um, die über eine serielle Schnittstelle (RS 232) an einen IBM-kompatiblen Rechner übermittelt werden, um rechnergestützt aus den gemessenen Stromstärken eine Meßdatenauswertung vorzunehmen. Der Meßkurvenverlauf mit einem Meßwert innerhalb von ca. 2 Sekunden läßt sich dadurch am Bildschirm in fortlaufender Darstellung verfolgen.
Weitere Anwendungsmöglichkeiten im Bereich der Biosensoren sind neben Alkylpolyglucosiden und anderen Tensiden beispielsweise auch die Bestimmung von Polyasparaginsäure und Fettalkoholderivaten.
Stoffe im Bereich der Reaktoren können z. B. Stoffe sein, die vor Ort beim Kunden gebraucht werden, so z. B. Peroxide oder Tenside, Schmiermittel oder hochwertige SpezialChemikalien.

Claims

Patentansprüche:
1. Enzymatisches System, umfassend eine Enzym(abbau-)kette, die ihrerseits mindestens zwei verschiedene Enzyme umfaßt.
2. Enzymatisches System nach Anspruch 1 , wobei die Enzyme der Enzym(abbau-)kette derart aufeinander abgestimmt sind, daß sie, insbesondere selektiv oder im wesentlichen selektiv, mindestens ein bestimmtes Molekül (Target-Molekül) abbauen.
3. Enzymatisches System nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Enzyme der Enzym(abbau-)kette derart aufeinander abgestimmt sind, daß sie, insbesondere selektiv oder im wesentlichen selektiv, mindestens ein nicht natürlich vorkommendes Molekül, insbesondere ein technisches Molekül, abbauen.
4. Enzymatisches System nach Anspruch 3, wobei die Enzyme der Enzym(abbau-)kette derart aufeinander abgestimmt sind, daß sie das nicht natürlich vorkommende Molekül, insbesondere technische Molekül, gemäß einem nicht natürlich vorkommenden Metabolismus abbauen.
5. Enzymatisches System nach Anspruch 3, wobei die Enzyme der Enzym(abbau-)kette derart aufeinander abgestimmt sind, daß sie das nicht natürlich vorkommende Molekül, insbesondere technische Molekül, gemäß einem natürlich vorkommenden Metabolismus abbauen.
6. Enzymatisches System nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Enzyme der Enzym(abbau-)kette derart aufeinander abgestimmt sind, daß sie, insbesondere selektiv oder im wesentlichen selektiv, mindestens ein natürlich vorkommendes Molekül gemäß einem nicht natürlich vorkommenden Metabolismus abbauen.
7. Enzymatisches System nach Anspruch 6, wobei das natürlich vorkommende Molekül ein Naturstoff ist.
8. Enzymatisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche zum konsekutiven und/oder mehrstufigen Abbau von Molekülen, insbesondere wobei der Abbau selektiv oder im wesentlichen selektiv in bezug auf das oder die abzubauenden Moleküle verläuft.
9. Enzymatisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Katalyse mehrstufig enzymatisch katalysierter Reaktionen.
10. Enzymatisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur parallelen Umsetzung von verschiedenen Molekülen mit unterschiedlichen Enzymen.
11. Enzymatisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens eines der Enzyme der Enzym(abbau-)kette in immobilisierter Form vorliegt.
12. Enzymatisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß alle Enzyme der Enzym(abbau-)kette in immobilisierter Form vorliegen.
13. Enzymatisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens eines der Enzyme der Enzym(abbau-)kette durch Quervernetzung, vorzugsweise mit Glutardialdehyd, immobilisiert ist.
14. Enzymatisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens eines der Enzyme der Enzym(abbau-)kette immobilisiert ist durch Einschluß oder Verkapselung, insbesondere in eine semipermeable Membran oder zwischen mehrere semipermeable Membranen oder aber auch zwischen eine und/oder mehrere semipermeable Membranen und abschließend einer ionenundurchlässigen, aber gaspermeablen Membran, insbesondere aus PTFE und/oder Silikonkautschuk.
15. Enzymatisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens eines der Enzyme der Enzym(abbau-)kette durch Anbindung an einen geeigneten, vorzugsweise chemisch inerten Träger immobilisiert ist, insbesondere wobei der Träger zuvor durch plasmachemische Oberflächenmodifizierung aktiviert worden ist.
16. Enzymatisches System nach Anspruch 15, wobei die Bindung aufgrund physikalischer und/oder chemischer Bindung, insbesondere aufgrund von Adsorption, lonenbindung und/oder kovalenter Bindung, erfolgt.
17. Enzymatisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens eines der Enzyme, vorzugsweise sämtliche Enzyme der Enzym(abbau-)kette durch Fixierung und/oder Bindung an eine chemisch inerte, plasmachemisch aktivierte und/oder funktionalisierte Trägeroberfläche nach einem Verfahren immobilisiert sind, welches die folgenden Verfahrensschritte umfaßt:
(a) Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche durch Modifizierung der Trägeroberfläche mit plasmachemischen Methoden, insbesondere wobei die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche eine Funktionalisierung der Trägeroberfläche umfaßt und vorzugsweise dadurch erfolgt, daß unter plasmachemischen Bedingungen mindestens eine geeignete, gegenüber dem oder den anzubindenden Enzymen reaktive funktionelle Gruppe direkt an der chemisch inerten Trägeroberfläche angebracht wird, insbesondere wobei die funktionelle Gruppe vorzugsweise eine Carboxyl-, Amino-, Hydroxy- und/oder Thiogruppe, gegebenenfalls in aktivierter, insbesondere protonierter oder deprotonierter Form, umfaßt; anschließend
(b) Anbindung des oder der zu immobilisierenden Enzyms, gegebenenfalls nach ihrer Überführung in einen aktivierten, anbindungsfähigen Zustand, an die auf in Schritt (a) aktivierte Trägeroberfläche; und schließlich (c) gegebenenfalls Quervernetzung des in Verfahrensschritt (b) angebundenen Enzyms,
insbesondere wobei die Verfahrensschritte (b) und (c) gegebenenfalls zusammengefaßt, insbesondere gleichzeitig durchgeführt werden können und/oder die Immobilisierung gegebenenfalls schichtweise, insbesondere mit Glutardialdehyd, durchgeführt werden kann.
18. Enzymatisches System nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche mittels plasmachemischer Methoden in Schritt (a) selektiv nur an der Oberfläche erfolgt ist und die Bulk- Eigenschaften der chemisch inerten Trägeroberfläche im übrigen erhalten bleiben, insbesondere wobei die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche in Schritt (a) im reaktiven Plasma, insbesondere Hochfrequenzplasma, erfolgt ist.
19. Enzymatisches System nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die chemisch inerte Trägeroberfläche Edelmetalle wie insbesondere Platin sowie deren Legierungen, Edelstahl oder polyhalogenierte Polymere, insbesondere polyhalogenierte polymere Kohlenwasserstoffe wie insbesondere Polytetrafluorethylen oder Polyvinylchlorid, oder aber Celluloseacetat oder Kombinationen dieser Materialien umfaßt.
20. Enzymatisches System nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (b) die Anbindung oder Ankopplung des oder der zu immobilisierenden Enzyme an die plasmachemisch modifizierte Trägeroberfläche durch Anbindung oder Ankopplung des oder der Enzyme über die in Schritt (a) angebrachten, reaktiven funktionellen Gruppen erfolgt ist, insbesondere wobei in Schritt (b) das oder die Enzyme unmittelbar an die auf die Trägeroberfläche aufgebrachten, reaktiven funktionellen Gruppen angebunden sind oder aber mittelbar über einen geeigneten Linker.
21. Enzymatisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Enzyme, vorzugsweise sämtliche Enzyme der Enzym(abbau-)kette durch Fixierung und/oder Bindung an eine chemisch inerte, plasmachemisch aktivierte und/oder funktionalisierte Trägeroberfläche immobilisiert sind, wobei das oder die Enzyme unmittelbar oder mittelbar an eine chemisch inerte Trägeroberfläche fixiert, insbesondere angebunden oder angekoppelt sind, insbesondere wobei die Anbindung oder Ankopplung des oder der Enzyme über an die chemisch inerte Trägeroberfläche angebrachte, geeignete, reaktive funktionelle Gruppen erfolgt ist.
22. Enzymatisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme der Enzym(abbau-)kette ausgewählt sind aus der Gruppe von Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen wie insbesondere Esterasen wie Lipasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen (Synthetasen) sowie deren Mischungen oder Kombinationen untereinander.
23. Enzymatisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Enzyme der Enzym(abbau-)kette innerhalb einer Einheit, vorzugsweise innerhalb einer Reaktionszone, eines Kompartimentes oder einer Zelle, insbesondere Meßzelle, angeordnet sind.
24. Enzymatisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Enzyme der Enzym(abbau-)kette in getrennten, insbesondere hintereinanderfolgenden Einheiten, vorzugsweise in getrennten, hintereinanderfolgenden Reaktionszonen, Kompartimenten oder Zellen, insbesondere Meßzellen, die zusammen das enzymatische System bilden, angeordnet sind und/oder wobei, insbesondere zwecks Differenzmessung, auch eine Parallelschaltung von Reaktionszonen, Kompartimenten oder Zellen, insbesondere Meßzellen, erfolgen kann.
25. Enzymatisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, enthaltend Amyloglucosidase und Glucoseoxidase, gegebenenfalls in Kombination mit Mutarotase und/oder α-Glucosidase (Maltase).
26. Enzymatisches System nach Anspruch 25 zum Abbau von nichtionischen Tensiden, insbesondere von Alkylpolyglucosiden.
27. Verwendung eines enzymatischen Systems nach einem der Ansprüche 1 bis 26 in Bioreaktoren.
28. Verwendung nach Anspruch 27, wobei das oder die Enzyme des enzymatischen Systems immobilisiert und insbesondere an den Wandungsoberflächen der Bioreaktoren fixiert oder gebunden sind.
29. Verwendung nach Anspruch 27, wobei das oder die Enzyme des enzymatischen Systems immobilisiert und insbesondere an das stationäre Trägermaterial oder Schüttgut der Bioreaktoren fixiert oder gebunden sind, insbesondere im Fall von Festbettreaktoren.
30. Verwendung eines enzymatischen Systems nach einem der Ansprüche 1 bis 26 in chromatographischen Systemen, insbesondere chromatographischen Säulen.
31. Verwendung nach Anspruch 30 zu analytischen oder präparativ- synthetischen Zwecken.
32. Verwendung nach Anspruch 30 oder 31 , wobei das oder die Enzyme des enzymatischen Systems immobilisiert und insbesondere an das stationäre Trägermateria! oder Schüttgut des chromatographischen Systems, insbesondere das stationäre Säulenmaterial, fixiert oder gebunden sind.
33. Verwendung eines enzymatischen Systems nach einem der Ansprüche 1 bis 26 in Biosensoren.
34. Verwendung nach Anspruch 33, wobei das oder die Enzyme des enzymatischen Systems immobilisiert und insbesondere an eine Membran des Biosensors fixiert oder gebunden sind.
35. Biosensoren, Bioreaktoren oder chromatographische Systeme, enthaltend ein enzymatisches System nach einem der Ansprüche 1 bis 26.
36. Biosensor, insbesondere zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung nichtionischer Tenside, vorzugsweise von Alkylpolyglucosiden, wobei der Biosensor als Enzym(abbau-)kette ein enzymatisches System umfaßt, welches als Enzyme Amyloglucosidase und Glucoseoxidase, gegebenenfalls in Kombination mit Mutarotase und/oder α-Glucosidase (Maltase), enthält, insbesondere wobei die Enzyme in immobilisierter Form vorliegen, vorzugsweise durch Bindung an eine chemisch inerte Oberfläche und/oder Membran, bevorzugt eine Polytetrafluorethylen- oder Celluloseacetatmembran.
37. Biosensor nach Anspruch 35 oder 36, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen H2O2-sensitiv-enzymatischen oder O2-sensitiv-enzymatischen Sensor für Alkylpolyglucoside handelt.
38. Biosensor nach einem der Ansprüche 35 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die Membransysteme des Biosensors mindestens eine chemisch modifizierte Polytetrafluorethylenmembran umfassen.
39. Biosensor nach einem der Ansprüche 35 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die Membransysteme des Biosensors kavitätengeschützt sind und/oder in direktem Kontakt zur Meßelektrode, insbesondere einer Platinanode, stehen.
40. Biosensor nach einem der Ansprüche 35 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß der Biosensor mindest eine Multienzym-Membran, insbesondere eine Bi-, Tri- und/oder Tetraenzym-Membran, umfaßt.
41. Biosensor nach einem der Ansprüche 35 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen amperometrischen Biosensor handelt.
2. Biosensor nach einem der Ansprüche 35 bis 41 zur Spaltung von 1 ,4- und/oder 1 ,6-glycosidisch verknüpften Bindungen, insbesondere von α-1 ,4- und/oder α-1 ,6-glucosidisch verknüpften Bindungen.
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