DE10118553A1 - Verfahren zur Anbindung von Biomolekülen an chemisch inerte Oberflächen - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Anbindung von Biomolekülen, insbesondere Enzymen oder enzymatischen Systemen, an plasmachemisch aktivierte bzw. funktionalisierte, chemisch inerte Trägeroberflächen beschrieben. Insbesondere wird ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen, vorzugsweise Enzymen oder enzymatischen Systemen, durch direkte oder mittelbare Anbindung, insbesondere chemische und/oder physikalische Anbindung, an plasmachemisch aktivierte bzw. funktionalisierte, chemisch inerte Trägeroberflächen beschrieben. Die auf diese Weise immobilisierten Biomoleküle eignen sich beispielsweise zur Anwendung in Bioreaktoren, Biosensoren und chromatographischen Systemen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anbindung von Biomole­ külen, insbesondere Enzymen oder enzymatischen Systemen, an chemisch in­ erte Trägeroberflächen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen, insbesondere Enzymen oder enzymatischen Systemen, durch Anbindung, insbesondere physikalische und/oder chemische Anbindung, an chemisch inerte Trägeroberflächen sowie die Verwendung der auf diese Weise hergestellten immobilisierten Systeme, vorzugsweise für die Anwendung in Bioreaktoren, Biosensoren und chromato­ graphischen Systemen.

In der angewandten Mikrobiologie, insbesondere in der Biotechnologie, ist es bekannt, Enzyme, enzymproduzierende Mikroorganismen oder Zellen auf be­ stimmten Trägern zu fixieren, insbesondere wenn sie als Biokatalysatoren ver­ wendet werden. Dieser Vorgang wird im allgemeinen als Immobilisierung be­ zeichnet.

Da native Enzyme bei der Lagerung oder beim einmaligen Batch-Ansatz durch biologische, chemische oder physikalische Einwirkungen in ihrer Akti­ vität reduziert werden, besteht wegen der hohen Herstellungskosten von Enzy­ men ein Bedarf, diese Enzyme zu stabilisieren. Durch die Immobilisierung werden sie wiederverwendbar. Nach der Verwendung körnen die Enzyme leicht abgetrennt werden. Auf diese Weise lassen sie sich in hoher lokaler Konzentration und in kontinuierlichem Durchfluß einsetzen. Die Substrat-Spe­ zifität und die Spezifität der Reaktion sowie die Reaktivität des Enzyms dür­ fen durch die Immobilisierung nicht verloren gehen.

Bei der Immobilisierung von Enzymen werden im allgemeinen drei grundsätz­ liche Methoden unterschieden, nämlich erstens die Immobilisierung durch Quervernetzung, zweitens die Immobilisierung durch Bindung an einen Träger und drittens die Immobilisierung durch Einschluß.

Bei der Immobilisierung durch Quervernetzung erhält man quervernetzte En­ zyme, die miteinander fixiert sind, ohne daß ihre Aktivität beeinflußt wird. Die Enzyme sind jedoch nicht mehr löslich. Die Quervernetzung erfolgt bei­ spielsweise mit Glutardialdehyd.

Wenn die Immobilisierung durch Anbindung an einen Träger erfolgt, kann die Bindung durch Adsorption, Ionenbindung oder kovalente Bindung erfolgen. Die Bindung an den Träger kann auch innerhalb der ursprünglichen mikrobi­ ellen Zelle stattfinden. Das Enzym wird durch die Fixierung nicht in seiner Aktivität beeinflußt, es kann trägergebunden mehrfach oder kontinuierlich ein­ gesetzt werden.

Bei der Immobilisierung durch Einschluß wird das Enzym meist zwischen se­ mipermeable Membranen und/oder Gelen, Mikrokapseln oder Fasern einge­ schlossen. Die gekapselten Enzyme sind z. B. durch eine semipermeable Membran von der umgebenden Substrat- und Produkt-Lösung getrennt. Es können auch Zellen gekapselt werden. Das Enzym ist durch die Fixierung im Raum nicht in seiner Aktivität beeinflußt.

Immobilisierte Enzyme, enzymproduzierende Mikroorganismen oder Zellen werden insbesondere in biotechnologischen Verfahren eingesetzt. Die ersten technischen Verfahren mit immobilisierten Zellen wurden empirisch optimiert und werden noch heute eingesetzt, so z. B. die Abwasserreinigung im Tropf­ körper. Ein ebenfalls älteres Verfahren ist die Essigproduktion mit dem Gene­ ratorverfahren. Im Nahrungsmittelbereich ist der Einsatz von Zellen mit Glu­ cose-Isomerase zur Produktion von fructosehaltigem Sirup das wichtigste Ver­ fahren. Glucose-Amylase zur Glucose-Herstellung im Stärkeprozeß wird ebenfalls immobilisiert eingesetzt. Die Spaltung von Laktose mit Hilfe der im­ mobilisierten β-Galactosidase aus Hefen zu Glucose und Galactose ist eben­ falls ein gängiges Verfahren. Weitere technische Verfahren mit immobilisier­ ten Systemen gibt es bei der Aminosäureherstellung, bei der Spaltung von Pe­ nicillin G zu 6-Aminopenicillinsäure und bei der Herstellung von Ethanol mit wachsenden, immobilisierten Zellen von Saccharomyces sp.

Immobilisierte Enzym- und Zellsysteme werden nicht nur in biotechnologisch ablaufenden Produktionsverfahren, sondern auch in der Analytik eingesetzt, so z. B. in sogenannten Biosensoren. Das Prinzip der Analytik mit Hilfe von im­ mobilisierten Systemen beruht darauf, daß ein zu bestimmendes Substrat durch ein immobilisiertes System umgesetzt wird, wobei die Veränderung der Produkt-, Substrat- oder Cosubstrat-Konzentration verfolgt werden kann, bei­ spielsweise mit mehreren gekoppelten Methoden (z. B. Enzym-Elektroden).

Nachteilig bei den aus dem Stand der Technik bekannten Methoden zur Im­ mobilisierung von Enzymen ist insbesondere die Tatsache, daß die Immobili­ sierung der Enzyme in relativ aufwendiger Weise durchgeführt werden muß und eine Kombination mit gegenüber den Enzymen an sich inerten Systemen nicht möglich ist.

Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Problem besteht nunmehr darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem sich Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatische Systeme, auch an chemisch inerte Trägeroberflä­ chen anbinden lassen. Insbesondere soll ein neues Verfahren bereitgestellt werden, mit dem sich Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatische Systeme, durch Anbindung an chemisch inerte Trägeroberflächen immobili­ sieren lassen.

Ein weiteres, der vorliegenden Erfindung zugrundeliegendes Problem besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem sich Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatische Systeme, in einfacher Weise immobilisieren las­ sen, wobei die Reaktivität der auf diese Weise immobilisierten Biomolekülen im wesentlichen erhalten bleiben soll, d. h. die auf diese Weise immobilisier­ ten Biomoleküle in ihrer Reaktivität im wesentlichen nicht beschränkt werden sollen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Immobili­ sierung von Biomolekülen, insbesondere Enzymen oder enzymatischen Syste­ men, durch deren Fixierung bzw. Bindung an eine chemisch inerte Träger­ oberfläche, wobei das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte umfaßt:

• a) Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche durch Modifizierung der Trägeroberfläche mit plasmachemischen Methoden; anschließend
• b) Anbindung des oder der zu immobilisierenden Biomoleküle, gegebenen­ falls nach deren Überführung in einen aktivierten bzw. anbindungsfähi­ gen Zustand, an die auf in Schritt (a) aktivierte Trägeroberfläche.

In Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt also eine Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche durch Modifizierung der Trägerober­ fläche mit plasmachemischen Methoden. Die plasmachemische Modifizierung von Oberflächen ist dem Fachmann an sich bekannt. Hier kann auf die ein­ schlägige Fachliteratur verwiesen werden. Bislang wurde aber diese Methode noch nicht genutzt, um Oberflächen für die Anbindung bzw. Immobilisierung von Biomolekülen vorzubereiten. Mit anderen Worten erfolgt in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Funktionalisierung der - zunächst - che­ misch inerten Trägeroberfläche.

Unter "chemisch inerter Trägeroberfläche" im Sinne der vorliegenden Erfin­ dung wird eine in bezug auf die jeweilige Anwendung nichtreaktive Oberflä­ che verstanden. Insbesondere ist vorliegend damit gemeint, daß die Träger­ oberfläche zunächst, d. h. ursprünglich bzw. an sich, nicht zur Anbindung von Biomolekülen geeignet ist, d. h. mit anderen Worten die Trägeroberfläche zu­ nächst keinerlei reaktive funktionelle Gruppen aufweist, die mit dem oder den anzubindenden bzw. anzukoppelnden Biomolekül(en) reagieren können. "Chemisch inert" im Sinne der vorliegenden Erfindung meint also insbeson­ dere nichtreaktiv gegenüber den jeweiligen Biomolekülen bzw. nicht zur An­ bindung von Biomolekülen geeignet. Erst durch die plasmachemische Be­ handlung in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Oberflä­ che des chemisch inerten Trägermaterials für die Fixierung, d. h. Ankopplung bzw. Anbindung des oder der Biomoleküle bzw. Enzyme in dem sich an­ schließenden Verfahrensschritt (b) vorbereitet.

Als erfindungsgemäß geeignete, chemisch inerte Oberflächen kommen alle Oberflächen in Betracht, welche die katalytische Aktivität des in Verfahrens­ schritt (b) anzubindenden bzw. anzukoppelnden Biomoleküls, insbesondere Enzyms, nicht oder im wesentlichen nicht beeinträchtigen und enzymatisch katalysierte Prozesse und Verfahren nicht oder im wesentlichen nicht stören. Hierbei kann es sich beispielsweise um chemisch inerte Metalloberflächen, insbesondere Oberflächen aus Edelmetall oder deren Legierungen (z. B. Platin oder Edelstahl), handeln. Erfindungsgemäß geeignet sind aber auch chemisch inerte Kunststoffoberflächen, insbesondere polyhalogenierte Polymere, vor­ zugsweise Polyalkyle oder Polyalkylene wie Polytetrafluorethylen (Teflon®) oder Polyvinylchlorid (PVC) umfassende Oberflächen. Des weiteren kommen als chemisch inerte Oberflächen zur Anbindung der Biomoleküle bzw. En­ zyme alle gängigen Polymere in Betracht, die für die Reaktorherstellung ein­ gesetzt werden, beispielsweise auch die bereits genannten polyhalogenierten Polymere wie Polytetrafluorethylen (Teflon®) oder PVC. Möglich ist es auch, verschiedene Materialien zu kombinieren, beispielsweise chemisch beständige Metalloberflächen (z. B. Edelstahl oder Platin) mit Polytetrafluorethylen (Te­ flon) oder PVC zu beschichten, z. B. durch Bedampfen. Ein weiteres, zur Anbindung von Biomolekülen geeignetes Material ist beispielsweise auch Celluloseacetat.

Die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche in Schritt (a) des er­ findungsgemäßen Verfahrens erfolgt insbesondere dadurch, daß unter plasma­ chemischen Bedingungen mindestens eine geeignete, gegenüber den anzubin­ denden Biomolekülen reaktive funktionelle Gruppe direkt an der chemisch inerten Trägeroberfläche angebracht bzw. fixiert wird. Diese Methode ist dem Fachmann an sich bekannt. Insbesondere kann die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens im reaktiven Plasma, insbesondere Hochfrequenzplasma, erfolgen. Dies geschieht beispielsweise in einem - reaktiven - Plasma, insbesondere Hochfrequenz­ plasma, aus Inertgas(en), wie z. B. Edelgase, und Reaktantgas(en), wie z. B. Ammoniak.

Die Formulierung "geeignete, gegenüber dem anzubindenden Biomolekül bzw. Enzym reaktive funktionelle Gruppe" bezeichnet ein funktionelle Grup­ pe, die zur direkten (unmittelbaren) Anbindung bzw. Ankopplung oder aber zur indirekten (mittelbaren) Anbindung bzw. Ankopplung des jeweiligen Biomoleküls, insbesondere Enzyms, geeignet ist, d. h. gegenüber dem jeweili­ gen Biomolekül bzw. Enzym reaktiv ist bzw. hiermit unter Anbindung bzw. Ankopplung reagiert.

Nach der plasmachemischen Aktivierung bzw. Modifizierung gemäß Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens weist die ursprünglich chemisch inerte Oberfläche funktionelle Gruppen auf, die gegenüber den anzubinden bzw. an­ zukoppelnden Biomolekülen reaktiv sind.

Nichtbeschränkende Beispiele für erfindungsgemäß geeignete, reaktive funk­ tionelle Gruppen sind insbesondere Gruppen oder Gruppierungen, die eine Carboxylgruppe, eine Aminogruppe, eine Hydroxygruppe und/oder eine Thio­ gruppe umfassen oder darstellen, gegebenenfalls in protonierter oder deproto­ nierter Form.

Besonders bevorzugt ist die plasmachemisch durchgeführte Amino-, Hydroxy- und/oder Carboxylmodifizierung chemisch inerter Oberflächen, insbesondere chemisch inerter Oberflächen aus Polytetrafluorethylen (z. B. Teflon®-Mem­ bran) oder PVC. Diese Methode ist dem Fachmann an sich geläufig.

Die Besonderheit der plasmachemischen Aktivierung in Schritt (a) des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens liegt insbesondere darin, daß die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche selektiv nur an der Oberfläche erfolgt. Mit anderen Worten bleiben bei der Aktivierung der chemisch inerten Trägerober­ fläche mittels plasmachemischer Methoden in Schritt (a) des erfindungsgemä­ ßen Verfahrens die Bulk-Eigenschaften der ursprünglich chemisch inerten Trägeroberfläche im übrigen erhalten, so z. B. Hydrophobie- oder Hydrophi­ lieeigenschaften, Permeabilitäten, Mikroporositäten, mechanische Eigenschaf­ ten wie Härte, Sprödigkeit etc.

Dem Verfahrensschritt (a) schließt sich dann in Verfahrensschritt (b) die An­ bindung oder Ankopplung des oder der zu immobilisierenden Biomoleküle an die plasmachemisch modifizierte Trägeroberfläche an, wobei dies durch An­ bindung oder Ankopplung der Biomoleküle über die in Schritt (a) reaktiven funktionellen Gruppen erfolgt. Dabei können die Biomoleküle unmittelbar an die auf die Trägeroberfläche aufgebrachten, reaktiven funktionellen Gruppen angebunden werden oder aber mittelbar, z. B. über geeignete Linker oder Lin­ kermoleküle. Methoden hierfür sind dem Fachmann an sich geläufig.

Unter einem "Linker"-synonym auch als "Linkermolekül" bezeichnet - ver­ steht man erfindungsgemäß ein Molekül oder einen Molekülteil, welches oder welcher zum Verknüpfen von Fragmenten und/oder anderen Molekülen dient (hier: Verknüpfung bzw. Verbinden von plasmachemisch aktivierten bzw. modifizierten, chemisch inerten Trägeroberflächen mit Biomolekülen, insbe­ sondere Enzymen).

Vor der Anbindung bzw. Ankopplung des Biomoleküls, insbesondere Enzyms oder enzymatischen Enzyms, an die plasmachemisch aktivierte bzw. modifi­ zierte Trägeroberfläche kann gegebenenfalls eine Überführung des Biomole­ küls in einen aktivierten bzw. anbindungsfähigen Zustand empfehlenswert sein. Methoden hierzu sind dem Fachmann an sich ohne weiteres geläufig. Alternativ hierzu oder aber gleichzeitig hiermit kann gegebenenfalls auch eine Aktivierung der in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens an der Trägeroberfläche fixierten, reaktiven funktionellen Gruppe(n) empfehlenswert sein, beispielsweise durch Protonierung, Deprotonierung etc., abhängig von der chemischen Natur der funktionellen Gruppe(n). Derartige Methoden sind dem Fachmann an sich bekannt.

Nach dem erfindungemäßen Verfahren können also die Biomoleküle mittels kovalenter und/oder ionischer Bindung, vorzugsweise kovalenter Bindung, über die in Schritt (a) angebrachte(n), reaktive(n) funktionelle(n) Gruppe(n) unmittelbar oder mittelbar an eine plasmachemisch aktivierte, chemisch inerte Trägeroberfläche angebunden werden. Hierdurch wird eine Immobilisierung des Biomoleküls, insbesondere Enzyms, bewirkt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich grundsätzlich alle Arten von Biomolekülen, insbesondere alle Arten von Enzymen, immobilisieren. Wenn das zu immobilisierende Biomolekül ein Enzym ist, kann dieses bei­ spielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe von Oxidoreduktasen, Transfera­ sen, Hydrolasen (z. B. Esterasen wie Lipasen), Lyasen, Isomerasen und Liga­ sen (Synthetasen) sowie deren Mischungen und Kombinationen untereinander.

Dem Verfahrensschritt (b) kann sich gegebenenfalls ein Verfahrensschritt (c) anschließen, der eine Quervernetzung der in Verfahrensschritt (b) angekoppelten Enzyme umfaßt. Hierbei werden im allgemeinen quervernetzende, dem Fachmann an sich geläufige Reagenzien (z. B. Glutardialdehyd) eingesetzt, um die Enzyme zu binden.

Fig. 1 zeigt schematisch den Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens mit den Verfahrensschritten (a) und (b). Zunächst erfolgt die in Verfahrens­ schritt (a) durchgeführte Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche 1 durch Modifizierung der Trägeroberfläche 1 mit plasmachemischen Metho­ den, wobei Fig. 1 eine Ausführungsform zeigt, gemäß welcher - ausgehend von einem Ausgangsmolekül 2 - eine geeignete, gegenüber dem anzubinden­ den Biomolekül reaktive funktionelle Gruppe 2' (z. B eine Aminogruppe) di­ rekt an der chemisch inerten Trägeroberfläche 1 angebracht wird. Wie in der Ausführungsform gemäß Fig. 1 dargestellt, schließt sich dann im Verfahrens­ schritt (b) die unmittelbare Ankopplung bzw. Anbindung des zu immobilisie­ renden Biomoleküls 3 an die in Schritt (a) aktivierte Trägeroberfläche 1 an, wobei auf diese Weise eine Immobilisierung des Biomoleküls 3 bewirkt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, Biomoleküle, insbesondere Enzyme, an chemisch inerte Oberflächen anzubinden und auf diese Weise zu immobilisieren, wobei hierdurch das Biomolekül, insbesondere das Enzym, in seiner Reaktivität nicht bzw. im wesentlichen nicht beschränkt wird. Durch die Immobilisierung sind die Biomoleküle, insbesondere Enzyme, wiederver­ wendbar. Nach der Verwendung können die Enzyme leicht wieder abgetrennt werden. Auf diese Weise lassen sie sich insbesondere in hoher lokaler Kon­ zentration und beispielsweise in kontinuierlichem Durchfluß einsetzen. Die Substrat-Spezifität und die Spezifität der Reaktion sowie die Reaktivität der Biomoleküle, insbesondere Enzyme, bleiben bei der erfindungsgemäßen Im­ mobilisierung erhalten.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die nach dem erfindungsge­ mäßen Verfahren herstellbaren, immobilisierten und gegebenenfalls querver­ netzten Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatische Systeme. Hier­ bei sind die immobilisierten Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzy­ matischen Systeme, unmittelbar oder mittelbar an eine chemisch inerte Trä­ geroberfläche fixiert, insbesondere angebunden oder angekoppelt, wobei die Anbindung oder Ankopplung des Biomoleküls über an die chemisch inerte Trägeroberfläche angebrachte geeignete, reaktive funktionelle Gruppen erfolgt ist, beispielsweise unmittelbar über ionische und/oder kovalente Bindungen oder aber mittelbar über einen geeigneten Linker mit biomolekül- bzw. en­ zymreaktiven funktionellen Gruppen.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren, immobilisierten Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatischen Systeme, können bei­ spielsweise in Biosensoren oder Bioreaktoren Verwendung finden. Des weite­ ren ist auch ihre Verwendung in chromatographischen Systemen, insbesondere chromatographischen Säulen, möglich, entweder zu präparativen Zwecken bzw. Synthesezwecken oder aber auch zu analytischen Zwecken.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit auch Biosensoren, Biore­ aktoren und chromatographische Systeme, welche die erfindungsgemäß er­ hältlichen, immobilisierten Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzyma­ tischen Systeme, umfassen.

Wie zuvor beschrieben, können die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen immobilisierten Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzy­ matischen Systeme, auch in Biosensoren Verwendung finden.

Unter "Biosensoren" versteht man erfindungsgemäß Meßfühler mit einer bio­ aktiven Komponente, basierend auf der Kopplung von Biomolekülen, die als Rezeptoren im weitesten Sinne spezifisch Analyte erkennen, mit physikoche­ mischen Transduktoren, die ein biologisch erzeugtes Signal (z. B. Sauerstoff­ konzentration, pH-Wert, Farbstoff etc.) in elektrische Meßsignale umformen.

Fig. 2 zeigt den typischen Aufbau eines Biosensors zur spezifischen Erken­ nung eines Analyten 1, wobei der Biosensor einen Rezeptor 2 und einen Transduktor 3 umfaßt, der das vom Rezeptor 2 erzeugte biologische Signal in ein elektronisches Signal 4 umwandelt, welches an eine Elektronik 5 weiter­ geleitet wird.

Zur spezifischen Erkennung können verschiedene Biomoleküle verwendet werden, insbesondere Enzyme. Als Transduktoren können eingesetzt werden potentiometrische Sensoren, amperometrische Elektroden, piezoelektrische Sensoren, Thermistoren oder optoelektronische Sensoren. Aufgrund der Re­ aktion oder Wechselwirkung des Analyten mit dem Rezeptor unterscheidet man insbesondere zwei Grundtypen von Biosensoren, nämlich einerseits Bio­ affinitätssensoren, die bei der Komplex-Bildung eintretende Veränderung der Elektronendichte ausnutzen, und andererseits Metabolismussensoren, die auf der spezifischen Erkennung und Umsetzung von Substraten beruhen.

Biosensoren finden - insbesondere in Form von Enzym-Elektroden - im Ge­ sundheitswesen, zur Kontrolle biotechnologischer Prozesse, in der Lebens­ mittelindustrie oder im Umweltschutz Verwendung. Mit Biosensoren können unterschiedlichste Systeme analysiert werden z. B. Glucose, Galactose, Lacto­ se, Ethanol, Milchsäure oder Harnsäure.

Bei der Verwendung der immobilisierten Enzyme in herkömmlichen Biosen­ soren werden die Enzymmoleküle entweder in polymere Matrizes (wie z. B. PVC, Gele, Graphite oder Zeolithe) bzw. zwischen Folien (z. B. Celluloseace­ tat) eingebracht. Das erfindungsgemäße Konzept besteht dagegen darin, daß bei Sensoren, die beispielsweise auf der enzymatischen Erzeugung oder dem Verbrauch von Sauerstoff basieren und eine chemisch inerte Membran (z. B. eine Teflon®-Membran) besitzen, diese genutzt wird, um Enzyme nach dem erfindungsgemäßen Verfahren anzubinden; wie zuvor beschrieben müssen hierzu geeignete, biomolekül- bzw. enzymreaktive funktionelle Gruppen an die chemisch inerte Membranoberfläche gebunden werden, so z. B. Amino- oder Carboxylgruppen, wobei die Anbringung dieser Gruppen in einem Plas­ mabeschichtungsverfahren erfolgen kann. Gegebenenfalls können anschlie­ ßend quervernetzende Reagenzien eingesetzt werden, um die immobilisierten Enzyme zu binden. Beispiele für geeignete erfindungsgemäße Biosensor-Sy­ steme sind z. B. die Katalase und/oder Glucoseoxidase, bei denen nach An­ kopplung des jeweiligen Enzyms an eine geeignete funktionelle Gruppe, die an eine chemisch inerte Oberfläche gebunden ist, eine Quervernetzung mit Glutardialdehyd durchgeführt werden kann (z. B. 5% in Puffer, pH-Wert = 7 und 20 mg Katalase (Firma Merck) bzw. Glucoseoxidase (Firma Merck) auf 500 µl Lösung). Weitere Ausführungsbeispiele sehen die Bindung von 1.000 bis 100.000 U (Units) Katalase bzw. 10 bis 100 U Glucoseoxidase mit dem bi­ funktionellen Glutardialdehyd auf aminisierten PTFE-Membranen bei einem Membrandurchmesser von 1 bis 10 mm, vorzugsweise 8 mm, vor, jedoch stellen die angegebenen Bereiche keine Beschränkungen dar, sondern haben sich vielmehr nach den Applikationsarten unter Berücksichtigung des ge­ wünschten, zu messenden Konzentrationsbereichs des Analyten auszurichten. Die Standzeit solcher O₂-sensitiv-enzymatischer Sensoren beträgt circa 2 Mo­ nate.

Die erfindungsgemäßen Biosensoren ermöglichen beispielsweise die Herstel­ lung von Mikroelektroden(arrays) für kleine Volumina und hohen Proben­ durchsatz (z. B. für die kombinatorische Anwendung).

Es wurde bereits auf die kombinierte Immobilisierung der beiden Enzyme Ka­ talase und Glucoseoxidase hingewiesen. Dies ist dann von analytisch relevan­ ter Bedeutung, wenn es z. B. um die kontinuierliche Meßwertüberwachung von Glucose in sauerstoffarmen oder gar sauerstofffreien Medien geht. Dar­ über hinaus gestattet das im folgenden beschriebene Verfahren eine Meßbe­ reichserweiterung.

Da beim Substratumsatz der Glucoseoxidase (GOD) aber Sauerstoff ein wich­ tiger Reaktant ist,

liegt die Lösung des Problems in der gleichzeitigen Heranführung von che­ misch gebundenem Sauerstoff, der für den Substratumsatz der β-D-Glucose durch GOD dann innerhalb der Enzymmembran noch freigesetzt werden muß. Das kann in besonders eleganter Weise auf der Basis einer Bienzymmembran erfolgen, indem z. B. erfindungsgemäß auf einer aminisierten PTFE-Membran außer Glucoseoxidase zusätzlich Katalase mit Glutardialdehyd kovalent ge­ bunden und quervernetzt vorliegt. Die beiden Enzyme können in gemischter Form, aber auch schichtweise immobilisiert werden. Die schichtweise Immo­ bilisierung kann wiederum in zwei oder mehreren Schichten vorgenommen werden. Die Reihenfolge der Enzymschichten kann, muß aber nicht applikati­ onsorientiert von Bedeutung sein.

Wenn nun in einem O₂-sensitiv-enzymatischen Durchflußsensor mit der be­ schriebenen Bienzymmembran in ihrer erfindungsgemäßen Ausgestaltungsform neben β-D-Glucose, die bei eingestelltem Mutarotationsgleichgewicht mit der α-Form im Gleichgewicht steht, gleichzeitig chemisch gebundener Sauerstoff in Form von H₂O₂ anflutet, wird Katalase gemäß der Reaktionsglei­ chung

Sauerstoff aus Wasserstoffperoxid für den Substratumsatz der Glucoseoxidase zur Verfügung stellen. Da es sich einerseits um O₂-sensitiv-enzymatische Membranelektroden handelt und andererseits Sauerstoff einer der Reaktanden der Glucoseoxidase ist, sollte das Wasserstoffperoxidangebot in konstanter Konzentration erfolgen. Für den Fall eines sauerstoffhaltigen Meßmediums ist darüber hinaus vorzusehen, daß ebenfalls der Anteil des physikalisch gelösten Sauerstoffs in konstanter Konzentration den Sensor erreicht. Gegenstand der vorliegenden Erfindung gemäß einer besonderen Ausführungsform ist somit ein Biosensor, insbesondere zur Messung von Glucose, vorzugsweise β-D- Glucose, wobei der Biosensor mindestens ein auf einer aktivierten, plasma­ chemisch modifizierten und/oder funktionalisierten Trägeroberfläche eines chemisch inerten Trägermaterials, vorzugsweise Polytetrafluorethylen, fixier­ tes peroxidsensibles Biomolekül, insbesondere Enzym, vorzugsweise Gluco­ seoxidase, gegebenenfalls in Kombination mit Katalase, umfaßt.

Nach einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Biosensor ein Peroxidsensor bzw. ein biochemischer Peroxidsensor. Hierunter versteht man erfindungsgemäß einen Biosensor bzw. ein Meßele­ ment, welches qualitativ oder quantitativ auf die Anwesenheit oder Konzen­ tration von anorganischen oder organischen Peroxiden (z. B. Wasserstoffpero­ xid, gelöste Peroxide aus anorganischen oder organischen Salzen, organische Persäuren etc.) reagiert bzw. sensitiv ist. Ein solcher (biochemischer) Peroxid­ sensor enthält - quasi als Wirkkomponente - Moleküle, welche die Anwesen­ heit von Peroxiden indizieren bzw. mit Peroxiden reagieren. Hierbei kann es sich beispielsweise um Moleküle, insbesondere wasserstoffperoxidsensitive Enzyme, handeln, die durch das Anbinden an eine aktivierte, chemische inerte Trägeroberfläche angebunden sind, ohne daß sich hierdurch ihre Reaktivität grundlegend ändert.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung han­ delt es sich bei dem erfindungsgemäßen biochemischen Peroxidsensor um ei­ nen Biosensor zum qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von orga­ nischen oder anorganischen Peroxiden, insbesondere von Wasserstoffperoxid, von gelösten Peroxiden aus anorganischen oder organischen Salzen und/oder von organischen Persäuren, wobei der biochemische Peroxidsensor minde­ stens ein auf einer aktivierten, plasmachemisch modifizierten bzw. funktiona­ lisierten Trägeroberfläche eines chemisch inerten Trägermaterials, insbeson­ dere Polytetrafluorethylen (z. B. Teflon®-Membran), fixiertes bzw. angebun­ denes peroxidsensitives Biomolekül, insbesondere Enzym, vorzugsweise Ka­ talase, umfaßt. Mit anderen Worten können auf dem Träger ein oder mehrere Biomoleküle bzw. Enzyme - unmittelbar oder aber mittelbar über Linker - fi­ xiert bzw. angebracht sein, die sich in ihrer Wirkung gegenseitig ergänzen: Das eigentlich mit Wasserstoffperoxid reagierende Enzym kann beispiels­ weise eine Katalase sein. Derartige Enzyme sind kommerziell erhältlich, bei­ spielsweise von der Merck KGaA in Deutschland. Die an die chemisch inerte Trägeroberfläche angebundenen Biomoleküle bzw. Enzyme können anschlie­ ßend noch quervernetzt werden, beispielsweise mit Glutardialdehyd. Die Fi­ xierung oder Anbindung der Biomoleküle bzw. Enzyme an die Oberfläche er­ folgt mittels geeigneter, reaktiver funktioneller Gruppen, die zuvor durch an sich bekannte plasmachemische Methoden auf die Trägeroberfläche aufge­ bracht worden sind.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform hiervon besteht die Trä­ geroberfläche aus plasmachemisch oberflächlich modifiziertem Polytetrafluor­ ethylen (Teflon®) oder weist eine Beschichtung hiervon auf (z. B. ein mit Po­ lytetrafluorethylen bedampftes Metall wie beispielsweise Platin), wobei die Oberfläche der Teflon®-Schicht wie vorstehend beschrieben modifiziert und hieran das oder die Enzyme fixiert sind. Die oberflächliche Modifizierung des Teflons besteht vorzugsweise darin, daß man plasmachemisch chemisch reak­ tive Gruppen, wie beispielsweise Amino- oder Carboxylgruppen, auf der Trägeroberfläche erzeugt bzw. anbringt und hieran anschließend das oder die Enzyme anbindet und dann gegebenenfalls quervernetzt.

Im erfindungsgemäßen biochemischen Peroxidsensor liefert die Einheit aus Biomolekül(en), insbesondere Enzym(en), und Trägeroberfläche ein vorzugs­ weise elektrisches Signal, aufgrund dessen auf die Anwesenheit und/oder Konzentration von Peroxiden geschlossen werden kann (z. B. anhand einer zuvor erstellten Kalibrierkurve).

Der erfindungsgemäße biochemische Peroxidsensor ermöglicht also die quali­ tative und/oder quantitative Bestimmung von Peroxiden in freier oder in ge­ bundener Form, beispielsweise in Form von freiem Wasserstoffperoxid, in Form von Persäuren, in Form von Perboraten oder in Form von löslichen Per­ oxiden. In allen diesen Fällen steht eine bestimmte Konzentration der Perver­ bindung mit einer bestimmten Konzentration von Wasserstoffperoxid im Gleichgewicht, die durch den erfindungsgemäßen Peroxidsensor bestimmt werden kann. Beispielsweise kann durch entsprechende Kalibrierkurven die Höhe des elektrischen Signals des erfindungsgemäßen Peroxidsensors mit der Konzentration der jeweils vorliegenden Perverbindung korreliert werden. Möchte man die Konzentration von Wasserstoffperoxid in freier oder gebun­ dener Form bestimmen, puffert man die Meßlösung vorzugsweise auf einen pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 8 ab.

Mit dem erfindungsgemäßen Peroxidsensor lassen sich indirekt auch die An­ wesenheit oder Konzentrationen von Molekülen bestimmen, die mit den Pero­ xiden reagieren bzw. einen Peroxidverbrauch bewirken (z. B. Nitrit oder Hy­ droxylamin). Hierfür nutzt man die Reaktion der peroxidverbrauchenden Mo­ leküle mit den Peroxiden (z. B. Wasserstoffperoxid) oder die Konkurrenzre­ aktion des Peroxidsensors hiermit aus. Demnach kann man beispielsweise eine bekannte Menge Wasserstoffperoxid zu der Lösung der peroxidverbrauchen­ den Moleküle geben, die Höhe des elektrischen Signals des biochemischen Peroxidsensors messen, mit der theoretisch zu erwartenden Höhe (z. B. auf­ grund von Kalibrierung) vergleichen und aus der Differenz die Konzentration der peroxidverbrauchenden Moleküle ableiten.

Der erfindungsgemäße Peroxidsensor eignet sich beispielsweise zur Prozeß­ überwachung, -kontrolle oder -steuerung (z. B. bei der Phosphatierung).

Bei der Verwendung der erfindungsgemäß immobilisierten Biomoleküle, ins­ besondere Enzyme oder enzymatischen Systeme, in Biosensoren besteht also die Möglichkeit, mindestens zwei verschiedene Arten von Biomoleküle, ins­ besondere Enzyme oder enzymatischen Systeme, miteinander zu kombinieren, d. h. insbesondere sogenannte Enzymketten oder Enzymabbauketten einzuset­ zen. Dabei können die verschiedenen Enzyme entweder in einem Reaktions­ system (z. B. in einer Meßzelle) vorliegen oder aber sequentiell hintereinander geschaltet sein (z. B. in aufeinanderfolgenden Meßzellen). Gegebenenfalls kann jedoch auch ein parallel angeordneter Multimeßkettenaufbau vorteilhaft sein (z. B. für Differenzmessungen). Auf diese Weise gelingt beispielsweise die parallele Bestimmung mehrerer Stoffe durch mehrere Enzyme (oder En­ zymketten) in einer Meßzelle oder in Meßsystemen. Diesbezüglich kann Be­ zug genommen werden auf die Patentanmeldung der Henkel KGaA vom sel­ ben Anmeldetag wie die vorliegende Anmeldung mit der Bezeichnung "En­ zymabbauketten" und dem Amtsaktenzeichen DE 101 . . . (kanzlei-internes Aktenzeichen: 00.746.6.do), deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist.

Wie zuvor beschrieben, können die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen, immobilisierten Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzy­ matischen Systeme, auch in Bioreaktoren Verwendung finden.

Unter "Bioreaktoren" versteht man erfindungsgemäß das physikalische Be­ hältnis, in dem biologische Stoffumwandlungen insbesondere mit Biomolekü­ len wie Enzymen durchgeführt werden.

Dabei kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu angewandt werden, um beispielsweise eine Modifizierung der Wandungsoberflächen von Bioreakto­ ren zu erreichen. Dabei kann es sich um beliebige Arten von Bioreaktoren handeln, so z. B. um Reaktoren mit planaren Oberflächen wie auch um röhren­ förmige Reaktoren. Beispiele hierfür sind mit Polytetrafluorethylen beschich­ tete Enzymreaktoren, an deren Wandungen das Enzym nach der zuvor be­ schriebenen erfindungsgemäßen Vorbehandlung angebunden ist, so daß eine effizientere Generation von Reaktoren verwirklicht werden kann, bei denen keine Abtrennung der Enzyme von der Reaktionslösung erforderlich ist. Erfin­ dungsgemäß geeignete Reaktoroberflächen können beispielsweise aus Metall bestehen oder mit allen gängigen Polymeren, die für die Reaktorherstellung eingesetzt werden, beschichtet sein (z. B. Teflon® oder PVC) oder eine Kom­ bination dieser Materialien aufweisen.

Bei der Verwendung der erfindungsgemäß immobilisierten Biomoleküle, ins­ besondere Enzyme oder enzymatischen Systeme, in Bioreaktoren besteht nach einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auch die Mög­ lichkeit, insbesondere im Fall von Festbettreaktoren, das immobilisierte Bio­ molekül, insbesondere Enzym oder enzymatische System, an das stationäre Trägermaterial oder Schüttgut anzubinden.

Bei der Verwendung der erfindungsgemäß immobilisierten Biomoleküle, ins­ besondere Enzyme oder enzymatischen Systeme, in Bioreaktoren, insbeson­ dere zur Modifizierung der Wandungsoberfläche oder bei der Anbindung des Enzyms an das Trägermaterial bzw. Schüttgut, besteht die Möglichkeit, min­ destens zwei verschiedene Arten von Biomolekülen, insbesondere Enzymen oder enzymatischen Systemen, miteinander zu kombinieren, d. h. sogenannte Biomolekül- bzw. Enzymketten oder Biomolekül- bzw. Enzymabbauketten einzusetzen. Dabei können die verschiedenen Biomoleküle, insbesondere En­ zyme oder enzymatischen Systeme, entweder in einer einzigen Reaktionszone oder aber sequentiell hintereinander geschaltet sein (z. B. in aufeinanderfol­ genden Reaktionszonen). Auf diese Weise werden beispielsweise mehrstufige, enzymatisch katalysierte Synthesen und Prozesse ermöglicht.

Fig. 3 zeigt beispielhaft und schematisch verschiedene Arten von Bioreaktoren des Standes der Technik:

Fig. 3A zeigt einen Rührkessel-Reaktor, bei denen der Energieeintrag durch mechanisch bewegte Einheiten erfolgt. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom und M die mechanische Antriebsvorrichtung (z. B. Motor). Wegen ihrer Viel­ seitigkeit werden Rührkessel-Reaktoren am häufigsten eingesetzt.

Fig. 3B zeigt einen Blasensäulen-Reaktor, bei dem die Durchmischung durch Zufuhr von Luft oder eines anderen Gases erfolgt. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom.

Fig. 3C zeigt einen sogenannten Airlift-Fermenter mit innerem Durchlauf, wo­ bei im allgemeinen durch Eintrag von Luft oder einem anderen Gas ein Flüs­ sigkeitsumlauf und eine Durchmischung erzeugt wird. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom.

Fig. 3D zeigt einen sogenannten Airlift-Fermenter mit äußerem Durchlauf, wobei im allgemeinen durch Eintrag von Luft oder einem anderen Gas ein Flüssigkeitsumlauf und eine Durchmischung erzeugt wird. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom.

Die zuvor beschriebenen Bioreaktor-Typen des Standes der Technik können erfindungsgemäß modifiziert werden, beispielsweise durch zur Modifizierung der Wandungsoberfläche (z. B. durch erfindungsgemäße Ankopplung von Biomolekülen, insbesondere Enzymen oder enzymatischen Systemen, an die chemisch inerte Reaktorwandungen) oder im Fall von Festbett-Bioreaktoren durch Anbindung der Biomoleküle, insbesondere Enzyme oder enzymatischen Systeme, an das Trägermaterial bzw. Schüttgut.

Die Fig. 4 zeigt exemplarisch und schematisch einige Ausführungsformen von Bioreaktoren nach der vorliegenden Erfindung:

Fig. 4A zeigt einen Bioreaktor, dessen chemisch inerte Wandungen durch An­ kopplung eines immobilisierten Biomoleküls, insbesondere Enzyms, vom Typ A modifiziert sind. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom.

Fig. 4B zeigt einen Bioreaktor, dessen chemisch inerte Wandungen durch An­ kopplung eines immobilisierten Biomoleküls, insbesondere Enzyms, vom Typ A und eines immobilisierten Biomoleküls, insbesondere Enzyms, vom Typ B modifiziert sind, welche in unterschiedlichen, aufeinanderfolgenden Reaktionszonen angeordnet sind. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom.

Fig. 4C zeigt einen Bioreaktor, dessen chemisch inerte Wandungen durch An­ kopplung eines immobilisierten Biomoleküls, insbesondere Enzyms, vom Typ A und eines immobilisierten Biomoleküls, insbesondere Enzyms, vom Typ B modifiziert sind, welche innerhalb einer einzigen Reaktionszone ange­ ordnet sind.

Fig. 4D zeigt einen Bioreaktor in Form eines Festbettreaktors, an dessen Trä­ germaterial oder Schüttgut immobilisierte Biomoleküle, insbesondere Enzy­ me, vom Typ A und vom Typ B angekoppelt sind, welche innerhalb einer Re­ aktionszone angeordnet sind.

Es sind noch zahlreiche andere Varianten zur erfindungsgemäßen Modifizie­ rung von Bioreaktoren, insbesondere Bioreaktorwandungsoberflächen und/­ oder Bioreaktorschüttgut und dergleichen, möglich, die der Fachmann beim Lesen der vorliegenden Beschreibung ohne weiteres in Betracht ziehen wird, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Des weiteren besteht die Möglichkeit, die erfindungsgemäß immobilisierten Biomoleküle, insbesondere Enzyme bzw. enzymatischen Systeme, in chroma­ tographischen Systemen, insbesondere in chromatographischen Säulen, einzu­ setzen. Dies kann zu präparativen bzw. synthetischen Zwecken geschehen (z. B. Durchführung enzymatisch katalysierter Reaktionen auf einer chroma­ tographischen Säule) oder aber auch zu analytischen Zwecken (z. B. bei der analytischen Säulenchromatographie).

Der Einsatz der erfindungsgemäß immobilisierten Biomoleküle, insbesondere Enzyme bzw. enzymatischen Systeme, in Biosensoren, Bioreaktoren und chro­ matographischen Systemen hat den Vorteil, daß einerseits die Biomoleküle, insbesondere Enzyme bzw. enzymatischen Systeme, durch die Immobilisie­ rung wiederverwendet werden können und andererseits nach ihrer Verwen­ dung eine leichte Abtrennung möglich ist (z. B. nach erfolgter Synthese im Bioreaktor, beispielsweise durch Ablassen der Reaktionsmischung). Auf diese Weise lassen sich die Biomoleküle, insbesondere Enzyme bzw. enzymatischen Systeme, effizient und kostengünstig in hoher lokaler Konzentration und in kontinuierlichem Durchfluß einsetzen. Die Substrat-Spezifität und die Spezi­ fität der Reaktion sowie die Reaktivität der Enzyme gehen durch die erfin­ dungsgemäße Immobilisierung jedoch nicht verloren.

Ziel des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es unter anderem, das chemisch inerte Oberflächenmaterial (z. B. Teflon®) als Diffusionsbarriere - im Plasma - aufzusputtern und danach die funktionellen Gruppen bzw. für allei­ nige Reaktoranwendungen direkt z. B. die Amino- oder Carboxylgruppen auf­ zubringen, an welche dann die Biomoleküle, insbesondere Enzyme bzw. enzy­ matischen Systeme, angekoppelt werden können.

Weitere Ausgestaltungen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann beim Lesen der Patentschrift ohne weiteres erkennbar und rea­ lisierbar, ohne daß er dabei den Rahmen der vorliegenden Erfindung verläßt.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Ausführungsbeispiele veranschaulicht, welche die Erfindung jedoch keinesfalls beschränken sollen.

Ausführungsbeispiele Herstellung erfindungsgemäßer bioelektrochemischer Peroxid- und Glu­ cosesensoren

Eine chemisch inerte Trägeroberfläche, im vorliegenden Fall eine PTFE- Membran (Teflon®-Membran), wird zunächst im reaktiven Hochfrequenz­ plasma unter an sich bekannten Bedingungen funktionalisiert. Hierbei werden geeignete, enzymreaktive funktionelle Gruppen an die chemisch inerte Mem­ branoberfläche gebunden, insbesondere Amino- und/oder Carboxylgruppen.

Nach Ausstanzen von im Durchmesser 13 mm großen aminisierten PTFE- Membranen werden diese auf einen Acrylglasring mittels O-Ring so aufge­ spannt, daß eine plane Fläche von 8 mm im Durchmesser vorliegt, so daß an deren Meßlösungsseite die kovalente Bindung und Quervernetzung der Enzy­ me erfolgen kann, z. B. applikationsorientiert (Meßbereich):
für verschiedene H₂O₂-Sensoren: 1.000 bis 100.000 U Katalase/­ Membran
für verschiedene Glucose-Sensoren: 10 bis 100 U Glucoseoxidase/­ Membran.

Detektorseitig wird die Kavität des Acrylglasringes mit einem Innenelektrolyt beschickt zwecks Verbindung Meßkathode aus Pt und Ag/AgCl-Referenzano­ de.

Nach Aufschieben des Acrylglasringes mit Membransystem auf eine O₂-Elek­ trode und Arretierung in einer Durchflußkammer resultieren erfindungsgemä­ ße bioelektrochemische Sensoren, wie sie zuvor in der allgemeinen Beschrei­ bung definiert worden sind. Die Standzeit derartiger Sensoren beträgt circa zwei Monate.

Die erfindungsgemäßen Glucose-Sensoren messen strenggenommen β-D-Glu­ cose. Da aber β- und α-Form der Glucose nach Einstellung des Mutarotationsgleichgewichtes in einem konstanten Verhältnis vorliegen, kann im vorliegen­ den Fall von Glucose-Sensoren gesprochen werden, da der Kalibriervorgang ebenfalls diese Gegebenheiten berücksichtigt.

Beispielsweise wurden die folgenden erfindungsgemäßen Biosensoren herge­ stellt:

• 1. Glucose-Sensor mit Labor-Code 2.) SBC-1320-β-D-Glucose-HDKS-Nr. 1:
  40 U Glucoseoxidase kovalent gebunden mit Glutardialdehyd an carboxy­ lierte PTFE-Membran eines O₂-Detektors.
• 2. Glucose-Sensor mit Labor-Code 3.) SBC-1321-β-D-Glucose-HDKS-Nr. 1:
  40 U Glucoseoxidase kovalent gebunden mit Glutardialdehyd an amini­ sierte PTFE Membran eines O₂-Detektors.
• 3. Wasserstoffperoxid-Sensor mit Labor-Code 5.) SBC-1323-H₂O₂-HDKS1- Nr. 1:
  26.000 U Katalase kovalent gebunden mit Glutardialdehyd an aminisierte PTFE-Membran eines O₂-Detektors.

Bei dem Glucose-Sensor mit Labor-Code 3.) SBC-1321-β-D-Glucose-HDKS- Nr. 1 handelt es sich um ein auf einer aminisierten PTFE-Membran basieren­ des Membransystem mit kovalent durch Glutardialdehyd gebundener GOD, wobei die Aminisierung der PTFE-Membran und die anschließende Immobili­ sierung der GOD nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt wurde. Dieses Membransystem wurde in eine amperometrische Durchfluß­ zelle mit Pt-Meßkathode und Ag/AgCl-Referenzanode integriert: Es entstand ein O₂-sensitiv-enzymatischer β-D-Glucose-Sensor für Durchflußmessungen. Das erfindungsgemäße Sensorsystem wurde in einem Dauerversuch getestet. Hierzu wurde eine Dauerperfusion des erfindungsgemäßen Sensors mit einem Phosphatpuffer (pH-Wert von 7,04 bei 25°C) durchgeführt. Innerhalb dieses Zeitraums wurden etwa 100 l dieses Puffers durch das Meßsystem gepumpt. Abschließend wurden nochmals Glucosemessungen mit dem Phosphatpuffer als Lösungsmittel für den Analyten zum Nachweis der Funktionsfähigkeit des Membransystems durchgeführt (Pumpe: Permax 12/6 bei 20 Digits mit Sili­ konschlauch 1,9 × 4,5 mm). Trotz einjähriger Dauerperfusion des erfindungsgemäßen Sensors mit Phosphatpuffer (HPL) bei einer Temperatur von 20 bis 25°C kann die enzymatische Aktivität des Membransystems selbst nach ei­ nem Jahr noch als hinreichend bezeichnet werden.

Des weiteren wurden Biosensoren hergestellt, die Glucoseoxidase und Katala­ se enthalten. Solche Biosensoren können beispielsweise verwendet werden für die kontinuierliche Meßwertüberwachung von Glucose in sauerstoffarmen oder gar sauerstofffreien Medien. Darüber hinaus gestattet dies eine Meßbe­ reichserweiterung. Im folgenden sind die Konzentrationen an zu immobilisie­ renden Units (U) von Katalase bzw. Glucoseoxidase für solche Biosensoren angegebenen. Die beiden zuvor genannten Enzyme können uneingeschränkt auch gleichzeitig im Membransystem in immobilisierter Weise vorliegen. Dies wird anhand von drei Beispielen unter Angabe der Membranzusammenset­ zung konkretisiert, wobei wiederum die kovalente Bindung und Vernetzung der beiden Enzyme auf einer aminisierten PTFE-Membran durch Glutardial­ dehyd erfolgt:

Bei den erfindungsgemäßen bioelektrochemischen Durchflußsensoren kann das Meßmedium mit nachgeschalteter Rollenpumpe angesaugt werden.

Claims (26)

1. Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen, insbesondere Enzy­ men oder enzymatischen Systemen, durch deren Fixierung und/oder Bin­ dung an eine chemisch inerte Trägeroberfläche, wobei das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte umfaßt:

• a) Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche durch Modifi­ zierung der Trägeroberfläche mit plasmachemischen Methoden; an­ schließend
• b) Anbindung mindestens eines zu immobilisierenden Biomoleküls, gegebenenfalls nach seiner Überführung in einen aktivierten, anbin­ dungsfähigen Zustand, an die auf in Schritt (a) aktivierte Träger­ oberfläche.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivie­ rung der chemisch inerten Trägeroberfläche in Schritt (a) eine Funktiona­ lisierung der chemisch inerten Trägeroberfläche umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ak­ tivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche in Schritt (a) dadurch erfolgt, daß unter plasmachemischen Bedingungen mindestens eine ge­ eignete, gegenüber den anzubindenden Biomolekülen reaktive funktio­ nelle Gruppe direkt an der chemisch inerten Trägeroberfläche angebracht wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die reaktive funktionelle Gruppe eine Carboxyl-, Amino-, Hydroxy- und/oder Thiogruppe, gegebenenfalls in aktivierter, insbeson­ dere protonierter oder deprotonierter Form, umfaßt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche mittels plasmachemischer Methoden in Schritt (a) selektiv nur an der Oberfläche erfolgt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß bei der Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche mittels plasmachemischer Methoden in Schritt (a) die Bulk-Eigenschaf­ ten der chemisch inerten Trägeroberfläche im übrigen erhalten bleiben.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche in Schritt (a) im reaktiven Plasma, insbesondere Hochfrequenzplasma, er­ folgt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die chemisch inerte Trägeroberfläche Edelmetalle wie ins­ besondere Platin sowie deren Legierungen, Edelstahl oder polyhaloge­ nierte Polymere, insbesondere polyhalogenierte polymere Kohlenwasser­ stoffe wie insbesondere Polytetrafluorethylen oder Polyvinylchlorid, oder aber Celluloseacetat oder Kombinationen dieser Materialien um­ faßt.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß in Schritt (b) die Anbindung oder Ankopplung des oder der zu immobilisierenden Biomoleküle an die plasmachemisch modifizierte Trägeroberfläche durch Anbindung oder Ankopplung der Biomoleküle über die in Schritt (a) reaktiven funktionellen Gruppen erfolgt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (b) die Biomoleküle unmittelbar an die auf die Trägeroberfläche aufgebrach­ ten, reaktiven funktionellen Gruppen angebunden werden oder aber mit­ telbar über einen geeigneten Linker.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Biomoleküle mittels kovalenter und/oder ionischer Bindung, vorzugsweise kovalenter Bindung, über die reaktive(n) funk­ tionelle(n) Gruppe(n) unmittelbar oder mittelbar an die Trägeroberfläche angebunden werden.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das zu immobilisierende Biomolekül ein Enzym ist und insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe von Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen wie insbesondere Esterasen wie Lipasen, Lya­ sen, Isomerasen und Ligasen (Synthetasen) sowie deren Mischungen oder Kombinationen untereinander.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sich dem Verfahrensschritt (b) ein Verfahrensschritt (c) an­ schließen kann, der eine Quervernetzung der in Verfahrensschritt (b) an­ gebundenen oder angekoppelten Biomoleküle umfaßt, wobei die Verfah­ rensschritte (b) und (c) gegebenenfalls auch zusammengefaßt, insbeson­ dere gleichzeitig durchgeführt werden können.

14. Immobilisiertes Biomolekül, insbesondere Enzym oder enzymatisches System, erhältlich nach dem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 13.

15. Immobilisiertes Biomolekül, insbesondere Enzym oder enzymatisches System, dadurch gekennzeichnet, daß das Biomolekül unmittelbar oder mittelbar an eine chemisch inerte Trägeroberfläche fixiert, insbesondere angebunden oder angekoppelt ist, wobei die Anbindung oder Ankopp­ lung des Biomoleküls über an die chemisch inerte Trägeroberfläche an­ gebrachte, geeignete, reaktive funktionelle Gruppen erfolgt ist.

16. Verwendung eines immobilisierten Biomoleküls, insbesondere Enzyms oder enzymatischen Systems, nach Anspruch 14 oder 15 in Bioreaktoren oder Biosensoren.

17. Verwendung nach Anspruch 16 zur Modifizierung der Wandungsober­ flächen von Bioreaktoren.

18. Verwendung nach Anspruch 16, wobei das immobilisierte Biomolekül, insbesondere Enzym oder enzymatische System, an das Trägermaterial oder Schüttgut eines Bioreaktors angebunden ist.

19. Verwendung eines immobilisierten Biomoleküls, insbesondere Enzyms oder enzymatischen Systems, nach Anspruch 14 oder 15 in chromatogra­ phischen Systemen, insbesondere chromatographischen Säulen.

20. Verwendung nach Anspruch 19 zu analytischen oder präparativ-syntheti­ schen Zwecken.

21. Biosensoren, Bioreaktoren oder chromatographische Systeme, enthaltend ein immobilisiertes Biomolekül, insbesondere Enzym oder enzymati­ sches System, nach Anspruch 14 oder 15.

22. Biosensor, insbesondere zur qualitativen und/oder quantitativen Bestim­ mung von Peroxiden, insbesondere anorganischen und/oder organischen Peroxiden wie Wasserstoffperoxid, gelösten Peroxiden aus anorgani­ schen oder organischen Salzen und/oder organischen Persäuren, wobei der Biosensor mindestens ein auf einer aktivierten, plasmachemisch mo­ difizierten und/oder funktionalisierten Trägeroberfläche eines chemisch inerten Trägermaterials, vorzugsweise Polytetrafluorethylen, fixiertes peroxidsensitives Biomolekül, insbesondere Enzym, vorzugsweise Ka­ talase, umfaßt.

23. Biosensor, insbesondere zur qualitativen und/oder quantitativen Bestim­ mung von Glucose, insbesondere β-D-Glucose, wobei der Biosensor mindestens ein auf einer aktivierten, plasmachemisch modifizierten und/oder funktionalisierten Trägeroberfläche eines chemisch inerten Trä­ germaterials, vorzugsweise Polytetrafluorethylen, fixiertes peroxidsensi­ tives Biomolekül, insbesondere Enzym, vorzugsweise Glucoseoxidase, gegebenenfalls in Kombination mit Katalase, umfaßt.

24. Biosensor nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die an die chemisch inerte Trägeroberfläche angebundenen Biomo­ leküle, insbesondere Enzyme, zusätzlich quervernetzt sind, insbesondere mit Glutardialdehyd.

25. Biosensor nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeich­ net, daß in dem Biosensor die Einheit aus Biomolekül(en), insbesondere Enzym(en), und Trägeroberfläche ein vorzugsweise elektrisches Signal liefert, insbesondere wobei aufgrund des Signals auf die Anwesenheit und/oder Konzentration von Peroxiden bzw. Glucose, insbesondere β-D- Glucose, geschlossen werden kann.

26. Biosensoren, insbesondere nach einem der Ansprüche 21 bis 25, enthal­ tend Glucoseoxidase und/oder Katalase jeweils in immobilisierter Form.