DE102012013385B4 - Modifizierte poröse Membran, Verfahren und Vorrichtung dafür - Google Patents

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Abstract

Modifizierte poröse Membran, umfassend eine mit primären Amingruppen funktionalisierte poröse Membran, bifunktionelle Spacermoleküle, die mit jeweils einer Funktionalität mit den Amingruppen umgesetzt sind, und ein Enzym, das an die andere Funktionalität der bifunktionellen Spacermoleküle gebunden ist.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine modifizierte poröse Membran, umfassend eine mit primären Amingruppen funktionalisierte poröse Membran, bifunktionelle Spacermoleküle, die mit jeweils einer Funktionalität mit den Amingruppen umgesetzt sind, und ein Enzym, das an die andere Funktionalität der bifunktionellen Spacermoleküle gebunden ist, ein Verfahren zu deren Herstellung, ein Verfahren zur Spaltung von komplexen Molekülen, bei dem die Membran verwendet wird, sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahren zur Spaltung von komplexen Molekülen, welche die Membran umfasst.
  • Membranen, die gegebenenfalls modifiziert sind, sind für die Filtration, Aufreinigung oder Entfernung von Biomolekülen wie Proteinen, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Viren oder Endotoxinen aus flüssigen Medien von großem Interesse für die biopharmazeutische Industrie.
  • Ferner ist es bekannt, Membranen zur enzymatischen Spaltung komplexer Moleküle, wie z. B. Lactose oder Penicillinen, einzusetzen. Die Spaltung von Lactose, wie sie z. B. in Milch enthalten ist, findet eine wichtige Anwendung bei der Erzeugung von lactosefreien Nahrungsmitteln für die wachsende Anzahl von Menschen mit Lactoseintoleranz. Die Spaltung von Penicillinen wird beispielsweise zur Herstellung von Aminopenicillansäure (APA) verwendet, die wiederum als Ausgangssubstanz zur Herstellung neuer, modifizierter Penicillinderivate dient.
  • Im Stand der Technik sind beispielsweise folgende Membranen zur enzymatischen Spaltung von komplexen Molekülen, wie z. B. Lactose, bekannt.
  • DE 26 50 815 A1 beschreibt eine mit einem Enzym gekuppelte Cellulosemembran für eine Ultrafiltration, wobei die Oberflächen ihrer Poren mit Chymotrypsin oder β-Galactosidase als Enzym ausgekleidet sind und die Poren eine mittlere Größe haben, die etwa dem 3- bis 5-fachen Durchmesser des Enzyms entspricht und etwa 15 bis 200 Å beträgt. Die Fixierung des Enzyms an der Cellulosemembran erfolgt hierbei mittels Cyanbromid. Die Cellulosemembran kann z. B. zur Spaltung von Lactose in Milch verwendet werden.
  • EP 0 086 179 A2 beschreibt einen biokatalytischen Kapillarfilter, der eine halbdurchlässige enzymatische Membran umfasst, die aus einer Polymermatrix ausgebildet ist, die mit dem Phasenumkehrverfahren hergestellt wird, in der thermophile mikrobielle Zellen eingeschlossen sind, die gegen organische Lösungsmittel beständig sind und die zuerst dehydratisiert und mit Aceton permeabilisiert werden, ohne ihre Enzymwirkung zu schädigen. Ferner offenbart dieses Dokument ein Verfahren zur Hydrolyse von Lactose zu Glukose und Galactose, bei dem ein Substrat, das Lactose enthält, bei einer Temperatur zwischen 60 und 90°C durch einen vorstehend beschriebenen Kapillarfilter geleitet wird und das Permeat, das Glukose und Galactose enthält, gesammelt wird.
  • Die in dem vorstehend genannten Stand der Technik beschriebenen Membranen und Verfahren weisen jedoch die folgenden Nachteile auf.
  • Wenn die in DE 26 50 815 A1 beschriebene Cellulosemembran zur Entfernung von Lactose aus Milch verwendet werden soll, muss die verwendete Milch zuvor aufwändig entfettet und gefällt werden, um alle teilchenförmigen Inhaltsstoffe zu entfernen. Ferner sind die für die Membran angegebenen Flussraten sehr niedrig und der angelegte Filtrationsdruck sehr hoch. Der Nachteil einer Hemmung der verwendeten Galactosidase durch Galactose („Produkthemmung”), die durch eine mangelnde Abführung der Galactose entsteht, wird in diesem Dokument nicht erkannt. Zudem findet kein vollständiger Umsatz der eingesetzten Lactose statt.
  • Gemäß der EP 0 086 179 A2 ist die druckabhängige Konversionsrate bei der Umsetzung von Lactose durch β-Galactosidase mit 18% sehr gering. Ferner wird auch in diesem Dokument der Nachteil einer Produkthemmung nicht erkannt.
  • Das Auftreten einer Produkthemmung ist auch ein Problem bei Enzymreaktoren in Form von Rührkesseln, in denen eine für Substrat(e) und Produkt(e) durchlässige, für das Enzym aber undurchlässige Membran verwendet wird, bei Hohlfasersystemen, bei denen sich das Enzym im Lumen oder in der Hülle befindet, bei porösen Teilchen mit großer innerer Oberfläche, an der das Enzym immobilisiert wird, bei einem Enzymeinschluss in wasserunlösliche, aber diffusiv permeable Matrizen, z. B. Alginate, und bei säulenförmigen Schüttungen, durch die das Substrat geleitet wird. Insbesondere führt bei diesen Systemen die zwangsläufig vorhandene Diffusion zu einer mehr oder weniger ausgeprägten Produkthemmung.
  • DE 26 50 815 A1 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von mit Enzymen gekuppelten Ultrafiltrationsmembranen, bei dem eine Lösung von Chymotrypsin oder β-Galactosidase unter einem Druck von wenigstens etwa 0,7 atü durch eine poröse, aus Cellulose bestehende Ultrafiltrationsmembran gepresst wird, die an verschiedenen Stellen, die mit dem Enzym reaktionsfähig sind, mit Cyanbromid aktiviert worden ist, und hierdurch das Enzym an die Membran bindet.
  • WO 2009/127285 A1 beschreibt eine Cellulosehydrat-Membran mit einer porösen Doppelstruktur, welche besteht aus Mikroporen mit einem Durchmesser im Bereich von > 100 nm bis 20 μm, und Ultraporen mit einem Durchmesser von < 100 nm, die für Dextranblau mit einem mittleren Molekulargewicht Mw von 2.000.000 nicht zugänglich sind, wobei der Anteil des Volumens der Ultraporen an dem für Wasser zugänglichen Gesamtporenvolumen mehr als 15% beträgt
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung einer porösen Membran und entsprechender Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung, welche die vorgenannten Nachteile des Stands der Technik überwinden und die auf einfache Weise die enzymatische Spaltung komplexer Moleküle mit hohen Konversionsraten und Durchsätzen ohne Produkthemmung erlauben.
  • Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, dass durch die Verwendung einer modifizierten porösen Membran, wie im Anspruch 1 und nachstehend beschrieben, in einem Verfahren zur Spaltung von komplexen Molekülen, bei dem eine Lösung oder Suspension, welche zu spaltende komplexe Moleküle enthält, direkt konvektiv durch die Membran oder durch Leiten der Lösung oder Suspension an der Membran entlang, wobei ein Permeat quer zur Fließrichtung abgezogen wird, oder durch lediglich Entlangströmen an der äußeren Membranoberfläche transportiert wird, sowohl hohe Konversionsraten und Durchsätze bezüglich der zu erzeugenden Spaltprodukte erreicht werden können als auch eine Produkthemmung der verwendeten Enzyme vermieden werden kann.
  • Insbesondere wird erfindungsgemäß eine modifizierte poröse Membran bereitgestellt, umfassend
    eine mit primären Amingruppen funktionalisierte poröse Membran,
    bifunktionelle Spacermoleküle, die mit jeweils einer Funktionalität mit den Amingruppen umgesetzt sind bzw. an diese gekoppelt, d. h. kovalent gebunden sind, und
    ein Enzym, das an die andere Funktionalität der bifunktionellen Spacermoleküle gebunden ist.
  • Der Begriff „primäre Amingruppe” unterliegt erfindungsgemäß keiner besonderen Einschränkung und es können prinzipiell alle dem Fachmann bekannten Verbindungen mit einer primären Amingruppe verwendet werden, die zur Funktionalisierung poröser Membranen verwendet werden können.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die primären Amingruppen jedoch durch eine Verbindung bereitgestellt bzw. sind davon abgeleitet, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    Diaminen der Formel H2N-R1 x-NH2, wobei R1 = CH2 und x = 1 bis 4, wie z. B. Ethylendiamin und Propylendiamin; Diaminen der Formel H2N-C-NH2 oder der Formel H2N-C-R2 x-C-NH2, wobei C ein gesättigter, ungesättigter oder aromatischer 5- oder 6-gliedriger Ring aus Kohlenstoff ist, der gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatom(e), ausgewählt aus O, N und S, enthält, wobei der Ring gegebenenfalls mit einer oder mehreren Gruppe(n), ausgewählt aus -CH3, -C=O und -NH2, substituiert sein kann, und wobei R2-CH2- ist und x 0 bis 3 ist, wie z. B. 1,4-Cyclohexandiamin, 1,4-Phenylendiamin, p-Xylylendiamin und 3,5-Diamino-1,2,4-triazol; Diaminen der Formel H2N-R3-Y-R3-NH2, wobei R3 ein aromatischer 6-gliedriger Kohlenstoffring ist, der gegebenenfalls mit einer oder mehreren Gruppe(n), ausgewählt aus -NH2, -OCH3, -CH3, -COOH und -CONH2, substituiert sein kann, und Y eine Gruppe ist, ausgewählt aus -CO-NH-, -CH2CH2-, -NH-, -CH2-, -CH=CH- und -O-, oder Y nicht vorliegt, wie z. B. 4,4'-Diaminobenzanilid, 3,3'-Diaminobenzidin, 4,4'-Diaminobenzophenon, 4,4'-Ethylendianilin, 3,6-Diaminocarbazol, ortho-Dianisidin, ortho-Toluidin, 4,4'-Diamino-2,2'-dimethyldibenzyl, 4,4'-Diamino-3,3'-dimethyldiphenylmethan, 4,4'-Diamino-diphenylamin, 4,4'-Diaminodiphenylether und 4,4'-Diaminostilben; Polyethylenaminen der Formel H2N-[-CH2CH2-NH-]n-H, wobei n = 2 bis 4, d. h. Diethylentriamin, Triethylentetramin, Tetraethylenpentamin;
    Lysin, Polylysin, Arginin, Polyarginin; und Polyallylamin. Besonders bevorzugt wird Polyallylamin verwendet. Die Funktionalisierung poröser Membranen mit primären Amingruppen kann mit dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen, wie es z. B. in WO 2009/127285 (vgl. Beispiel 21) bezüglich der Funktionalisierung einer Celluloseacetat-Membran mit Polyallylamin beschrieben ist.
  • Der Begriff „poröse Membran” unterliegt erfindungsgemäß keiner besonderen Einschränkung und es können prinzipiell alle dem Fachmann bekannten porösen Membranen verwendet werden, die in dem vorliegenden Fachgebiet zur Ultrafiltration und Mikrofiltration geeignet sind.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird als poröse Membran jedoch eine Membran verwendet, die aus der Gruppe, bestehend aus einer Celluloseacetat-Membran, einer Cellulosehydrat-Membran und einer Membran aus regenerierter Cellulose, ausgewählt ist.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die poröse Membran einen Porendurchmesser im Bereich von 0,1 bis 10 μm, vorzugsweise von 0,5 bis 10 μm, vorzugsweise von 0,7 bis 10 μm, vorzugsweise von 1 bis 10 μm, mehr bevorzugt von 2 bis 8 μm, noch mehr bevorzugt von 3 bis 7 μm und insbesondere von 3 bis 5 μm auf. Poröse Membran mit einem Porendurchmesser im Bereich von 1 bis 10 μm werden hier als mikroporöse Membranen bezeichnet. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird als poröse Membran eine solche mikroporöse Membran mit einem Porendurchmesser von 1 bis 10 μm verwendet. Der Porendurchmesser wurde mit einem Coulter-Porometer Typ Capillary Flow Porometer 6.0, CAPWIN Software System, Fa. Porous Materials Inc., gemessen.
  • Der Begriff „bifunktionelles Spacermolekül” unterliegt erfindungsgemäß keiner besonderen Einschränkung und es können prinzipiell alle dem Fachmann bekannten bifunktionellen Spacermoleküle verwendet werden, die dazu geeignet sind, eine Verknüpfung zwischen einer primären Amingruppe an einer porösen Membran und einem Enzym herzustellen
  • Eine ausführliche und nicht-erschöpfende Auswahl an bifunktionellen Spacern und deren Einsatz ist in PIERCE/PERBIO 2003–2004, Applications Handbook + Catalog, Pierce Biotechnology, Inc. (2003), Rockford IL, U.S.A., Seiten 429–436 und 467–498 angegeben. Von besonderem Interesse sind hier die bifunktionellen Spacer, die mit primären Aminen reagieren.
  • Ferner sind Diepoxide verwendbar, welche die Struktur
    Figure DE102012013385B4_0002
    aufweisen, worin R = CH2 und x = 0, 2, 4, verwendbar, d. h. 1,3-Butadiendiepoxid, 1,5-Hexadiendiepoxid und 1,7-Octadiendiepoxid.
  • Des Weiteren können hier 1,4-Butandioldiglycidylether, 1,6-Hexandioldiglycidylether, Bis(4-glycidyloxyphenyl)propan, Ethylenglycoldiglycidylether bzw. Neopentylglycoldiglycidylether genannt werden.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird als bifunktionelles Spacermolekül jedoch ein Dialdehyd verwendet, wobei der Dialdehyd besonders bevorzugt aus der Gruppe, bestehend aus Succindialdehyd, Glutaraldehyd und 1,6-Hexandial, ausgewählt ist. Besonders bevorzugt wird als Dialdehyd Glutaraldehyd verwendet.
  • Der Begriff „Enzym” unterliegt erfindungsgemäß keiner besonderen Einschränkung und es können prinzipiell alle dem Fachmann bekannten Enzyme verwendet werden, die komplexe Moleküle in einer für technische Zwecke geeigneten Ausbeute spalten können.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird als Enzym jedoch ein Enzym verwendet, das aus der Gruppe, bestehend aus β-Galactosidase, Penicillin-Acylase, Alkoholdehydrogenase, Carbamoylreduktase und Formiatdehydrogenase, ausgewählt ist. Besonderes bevorzugt werden β-Galactosidase und Penicillin-Acylase verwendet, insofern damit wirtschaftlich besonders bedeutsame Produkte hergestellt werden können.
  • Ferner wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung einer modifizierten porösen Membran bereitgestellt, umfassend die Schritte:
    • – Umsetzen einer mit primären Amingruppen funktionalisierten porösen Membran mit bifunktionellen Spacermolekülen unter Reaktionsbedingungen, so dass im Wesentlichen jeweils nur eine Funktionalität des bifunktionellen Spacermoleküls an die primären Amingruppen gebunden wird, und
    • – Umsetzen der bifunktionelle Spacermoleküle aufweisenden Membran mit einem Enzym unter Reaktionsbedingungen, so dass das Enzym an die freien Funktionalitäten der bifunktionellen Spacermoleküle gebunden wird.
  • Die Reaktionsbedingungen zum Umsetzen mit bifunktionellen Spacermolekülen und zum Umsetzen mit einem Enzym des vorstehenden Verfahrens sind einem Fachmann auf dem vorliegenden Fachgebiet bekannt.
  • Insbesondere werden das Umsetzen mit bifunktionellen Spacermolekülen und das Umsetzen mit einem Enzym unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
    Temperatur: 4 bis 36°C, vorzugsweise 20 bis 22°C,
    Puffer: Borat-, Phosphat- oder Tris/HCl-Puffer, vorzugsweise Phosphatpuffer,
    pH-Bereich: 5 bis 9, vorzugsweise 7 bis 8, insbesondere 7,6.
    Ionenstärke: 0,01 bis 0,5 mol/Liter, vorzugsweise 0,02 bis 0,15 mol/Liter, insbesondere 0,05 mol/Liter.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Umsetzen mit Glutaraldehyd bei einer Konzentration von Glutaraldehyd von 0,01 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Reaktionsgemisch, mehr bevorzugt von 0,1 bis 2 Gew.-%, insbesondere von 1 bis 1,5 Gew.-% durchgeführt.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Umsetzen mit Glutaraldehyd in Natriumphosphatpuffer bei pH 7,6 durchgeführt.
  • Die vorstehend bezüglich der modifizierten porösen Membran gemachten Angaben hinsichtlich der Art und Eigenschaften der verwendbaren porösen Membran und der Art der verwendbaren Verbindungen und Enzyme, die zur Modifizierung der porösen Membran verwendet werden, gelten gleichermaßen für die modifizierte poröse Membran, die in dem vorstehenden Verfahren zur Herstellung einer modifizierten porösen Membran eingesetzt werden können, so dass hier nicht näher darauf eingegangen wird.
  • Ferner wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Spaltung von komplexen Molekülen bereitgestellt, umfassend die Schritte
    • – Bereitstellen einer modifizierten porösen Membran, wie sie vorstehend beschrieben worden ist, und
    • – Transportieren einer Lösung, Emulsion, insbesondere Milch, oder Suspension, welche zu spaltende komplexe Moleküle enthält, direkt konvektiv durch die Membran oder durch Leiten der Lösung oder Suspension an der Membran entlang, wobei ein Permeat quer zur Fließrichtung abgezogen wird, oder durch lediglich Entlangströmen an der äußeren Membranoberfläche,
    wobei die komplexen Moleküle durch die Wirkung des Enzyms gespalten werden und die Spaltungsprodukte von der Membran abgeführt werden.
  • Gemäß dem vorstehenden Verfahren erfolgt das Transportieren einer Lösung oder Suspension, welche zu spaltende komplexe Moleküle enthält, direkt konvektiv durch die Membran oder durch Leiten der Lösung oder Suspension an der Membran entlang, wobei ein Permeat quer zur Fließrichtung abgezogen wird, oder durch lediglich Entlangströmen an der äußeren Membranoberfläche.
  • Der direkte konvektive Transport durch die Membran entspricht einer sogenannten „Dead-End-Filtration”, worunter die klassische Form einer Filtration verstanden wird, bei der eine zu filtrierende Lösung oder Suspension entweder durch Schwerkraft oder unter Beaufschlagung mit Druck durch eine Membran (Filter) geleitet wird.
  • Der Transport durch Leiten der Lösung oder Suspension an der Membran entlang entspricht einer Querstromfiltration (auch als „Cross-Flow-Filtration” oder „Tangential-Flow-Filtration” bezeichnet), bei der eine zu filtrierende Lösung oder Suspension, vorzugsweise eine Suspension, parallel zu der Membran gepumpt wird und das Permeat quer zur Fließrichtung abgezogen wird. Die Querstromfiltration hat den Vorteil, dass sich ein Filterkuchen aus Feststoffpartikeln, die beispielsweise in einer Suspension vorliegen, nicht auf der Membran absetzen kann, wodurch der Filtrationswiderstand nicht erhöht wird und die Abführung der Reaktionsprodukte nicht verlangsamt wird.
  • Das Transportieren einer Lösung oder Suspension, welche zu spaltende komplexe Moleküle enthält, durch lediglich Entlangströmen an der äußeren Membranoberfläche bedeutet hier, dass die Lösung oder Suspension parallel zu der Membran gleichzeitig druckgetrieben auf beiden Seiten der Membrane in Kanälen transportiert wird. Dabei findet ein Überströmen der Membran bei Einhaltung gleicher Drücke des Überströmmediums an gegenüber liegenden Punkten der äußeren Membranflächen statt, wie es in der Patentanmeldung DE 102 36 664 A1 beschrieben ist. Diese Art des Transportierens hat ebenfalls den Vorteil, dass sich Feststoffpartikel, die beispielsweise in einer Suspension vorliegen, nicht auf der Membran absetzen können und damit das Transportieren der zu spaltenden komplexen Moleküle zu den an die Membran gebundenen Enzymmoleküle behindern oder verhindern.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt das Transportieren direkt konvektiv durch die Membran.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt das Transportieren durch Leiten der Lösung, Emulsion oder Suspension an der Membran entlang.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt das Transportieren durch lediglich Entlangströmen an der äußeren Membranoberfläche.
  • Alle drei Transportverfahren haben erfindungsgemäß den Vorteil, dass das membrangebundene Enzym nicht gehemmt wird, da das Produkt rasch von der Membran abgeführt wird.
  • Ferner wird erfindungsgemäß eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur Spaltung von komplexen Molekülen bereitgestellt, die eine vorstehend beschriebene modifizierte poröse Membran umfasst.
  • Als derartige Vorrichtung können erfindungsgemäß beliebige Vorrichtungen verwendet werden, in die eine oder mehrere erfindungsgemäße Membran(en) eingebaut ist oder sind und die ein Transportieren einer Lösung oder Suspension, welche zu spaltende komplexe Moleküle enthält, direkt konvektiv durch die Membran oder durch Leiten der Lösung oder Suspension an der Membran entlang oder durch lediglich Entlangströmen an der äußeren Membranoberfläche erlauben.
  • 1 zeigt den Lactoseabbau durch die im Beispiel 2 hergestellte Membran bei verschiedenen Volumenströmen.
  • 2 zeigt die spezifische Aktivität von β-Galactosidase in Lösung in Abhängigkeit von der ONPG-Konzentration mit Galaktose als Inhibitor im Vergleichsbeispiel 1.
  • 3 zeigt die Michaelis-Menten-Konstante von β-Galactosidase in Lösung in Abhängigkeit von der Konzentration von Galaktose als Inhibitor im Vergleichsbeispiel 1.
  • 4 zeigt die Lineweaver-Burk-Transformation der Michaelis-Menten-Konstante in Abhängigkeit von der ONPG-Konzentration (Substrat) und der Konzentration von Galactose (Inhibitor) im Vergleichsbeispiel 1.
  • 5 zeigt Absorptionsmesswerte für Aminopenicillansäure (APA) bei der Hydrolyse von Penicillin G durch membrangebundene Penicillin-Acylase im konvektiven Betrieb gemäß Beispiel 6.
  • 6 zeigt Absorptionsmesswerte für APA bei der Hydrolyse von Penicillin G durch gelöste und membrangebundene Penicillin-Acylase im Schüttelbetrieb gemäß Vergleichsbeispiel 2.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert.
  • Beispiele
  • Bestimmung der Enzymaktivität
  • Die Bestimmung der Enzymaktivität in den Beispielen und Vergleichsbeispielen erfolgt mittels Standardverfahren der Enzymologie, die dem Fachmann bekannt sind und die im Folgenden kurz erläutert werden.
  • a) Aktivität von β-Galactosidase
  • Die Aktivität von β-Galactosidase wird durch die Spaltung von Lactose und nachfolgenden Umsatz der erzeugten Glukose durch das Enzym Glukoseoxidase zu Glukonolacton und Reduktionsäquivalenten und deren enzymatische Übertragung auf das synthetische Akzeptormolekül 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonsäure (ABTS) durch das Enzym Peroxidase mittels der entstehenden proportionalen Grünfärbung bestimmt. Dazu wird eine Kalibrierkurve mit bekannten Glukosekonzentrationen erstellt.
  • Alternativ kann die Aktivität von β-Galactosidase durch die Spaltung des Modellsubstrats o-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid (ONPG), das im alkalischen Milieu einen sehr hohen Absorptionskoeffizienten (3500 L/mol × cm) aufweist, mittels einer entsprechenden Kalibrierkurve bestimmt werden.
  • b) Aktivität von Penicillin-Acylase
  • Zur Bestimmung der Aktivität von Penicillin-Acylase wird die Spaltung des Penicillin G-Kaliumsalzes zu Aminopenicillansäure (APA) und Phenylessigsäure durch Umsetzen der APA mit Ehrlich's Reagenz (Dimethylaminobenzaldehyd) zu einem gelb gefärbten Produkt verfolgt. Die Quantifizierung erfolgt mittels einer entsprechenden Kalibrierkurve.
  • Alternativ kann die Aktivität von Penicillin-Acylase durch die Spaltung des Modellsubstrats 6-Nitro-3-phenylacetamidbenzoesäure zu Phenylessigsäure und 3-Amino-6-nitrobenzoesäure, die im alkalischen Milieu einen sehr hohen Absorptionskoeffizienten aufweist, mittels einer entsprechenden Kalibrierkurve bestimmt werden.
  • Bezüglich der vorstehend angegebenen Verfahren kann bei bekannter eingesetzter Enzymmenge, wie z. B. mg/cm2 Membran oder mg/ml Membranvolumen, die spezifische Aktivität des Enzyms in Units/mg, d. h. μMol Substrat/min × mg unter definierten, vom Enzymlieferanten angegebenen Bedingungen, wie Puffer, Ionenstärke, pH, Temperatur und gegebenenfalls Aktivatoren, bestimmt werden.
  • Beispiel 1: Herstellung einer modifizierten porösen Membran, die β-Galactosidase als Enzym enthält
  • Aus einer Polyallylamin-modifizierten Membran (von Sartorius Stedim Biotech GmbH, Göttingen, Deutschland, erhältlich, Typ 38942, Charge: T 831) wurde eine Membranronde mit einem Durchmesser von 30 mm ausgestanzt, was einer Membranfläche von 7,07 cm2 entsprach. Die Ronden bzw. Stanzlinge wurden zunächst mit Wasser gewaschen, um das in der Membran befindliche Glyzerin zu entfernen. Je eine Ronde wurde in 2 ml eines 0,05 mol/L Phosphatpuffers, pH 7,6, mit einer Konzentration von 2 Gew.-% Glutaraldehyd eingebracht und 40 min geschüttelt. Danach wurden die Membranen dreimal mit einem 0,05 mol/L Phosphatpuffer, pH 7,6, für jeweils 5 min gewaschen. Es wurde eine Enzymlösung von 4 mg/ml in 0,05 mol/L Phosphatpuffer, pH 7,6, hergestellt. Je eine mit Glutaraldehyd aktivierte Ronde wurde in 2 ml dieser Lösung eingebracht und 40 min geschüttelt. Anschließend wurden 100 μl NaBH4-Lösung (2 mg/ml NaBH4) zugesetzt und es wurde 15 min geschüttelt. Danach wurde die Membran entnommen und 3 × mit etwa 15 ml Puffer (0,05 M Phosphat, pH 7,6) gewaschen. Die Membran wurde bei +4°C gelagert.
  • Beispiel 2: Spaltung von Lactose in frischer Vollmilch durch membrangebundene β-Galactosidase
  • In dem vorliegenden Beispiel wird die in frischer Vollmilch enthaltene Lactose durch β-Galactosidase in Galactose und Glukose gespalten.
  • β-Galactosidase wurde an eine Membran analog Beispiel 1 (Verwendung der identischen Substanzen) gekoppelt, wobei die Membran jedoch eine Fläche von 491,4 cm2 aufwies (70-fache Fläche der Membran von Beispiel 1). Zur Enzymkopplung wurde ein von Sartorius Stedim Biotech GmbH, Göttingen, Deutschland, gefertigtes Modul mit der Chargenbezeichnung 0806563 verwendet, in das die unbeladene Membran (von Sartorius Stedim Biotech GmbH, Göttingen, Deutschland, erhältlich, Typ 38942, Charge: T 831) in einem aufgewickelten Zustand eingebracht war. Zunächst wurde das Totvolumen des Moduls mit Puffer festgestellt, dann wurde das Modul mit Puffer gespült. 35 ml β-Galactosidase und 35 ml Puffer wurden mit etwa 30 mL/min in dem Modul im Kreis gepumpt. Dann wurden 70 ml Puffer und 1,4 mL Glutaraldehyd zugesetzt und etwa 60 bis 80 min inkubiert. Schließlich wurden 7 mL NaBH4-Lösung (2 mg/mL) zugesetzt und 15 min im Kreis gepumpt, dann wurde mit jeweils 1 L Puffer 3 × 15 min gewaschen.
  • Dann wurden 300 mL frische Vollmilch (Lactosekonzentration: 4,8% bzw. 140,23 mMol/L) bei verschiedenen Volumenströmen (1 mL/min, 2,5 mL/min, 4,2 mL/min) einmal linear durch das Modul (Adsorbereinheit) gefördert, wobei die Membran mit der Milch überströmt wurde. Nach zweimaligem Durchlaufen des Totvolumens wurde jeweils eine Probe der Milch zur Messung der Glukosekonzentration entnommen.
  • Zur Probenvorbereitung für die Messung der Glukosekonzentration wurden die Milchproteine durch Fällung entfernt. Der Überstand wurde zur Messung verwendet.
  • Dazu wurden 500 μL der entnommenen Milch mit 100 μL 20%iger Trichloressigsäure versetzt, gemischt und 5 min stehen gelassen. Anschließend wurde bei 13400 U/min zentrifugiert. 200 μL des Überstands wurden entnommen und mit 35 μL 1 M NaOH neutralisiert (pH etwa 6,6). Die erhaltene Lösung wurde 1:20 mit Wasser verdünnt und 5 μL davon wurden mit dem nachstehend beschriebenen Verfahren bezüglich der Glukosekonzentration gemessen.
  • Die Messung der Glukosekonzentration erfolgte mittels Glukoseoxidase/Peroxidase (GOD/POD). Das Prinzip dieser Messung beruht darauf, dass GOD Glukose zu D-Glukono-1,5-lacton und H2O2 oxidiert und POD die Übertragung von Wasserstoff von dem Donor 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonsäure (ABTSH2) auf das entstandene H2O2 katalysiert, wobei ABTS+ + 2H2O erhalten werden. Die Entstehung von ABTS+ wird durch eine photometrische Endpunkt-Messung bei 436 nm gemessen.
  • Zur Durchführung der Messungen wurde ein Standard (10 mM Glukose, Verdünnungen 1:50, 1:20, 1:10, 1:5, jeweils 5 und 10 μl) oder 5 μl Probe, die in der vorstehend beschriebenen Weise aufbereitet worden ist, mit 100 μl POD (1 mg/mL), 100 μl GOD (1 mg/mL), 100 μl ABTS (6 mg/mL) und 700 μl Puffer (0,05 M Natriumphosphat, pH 6,5) versetzt und 45 bis 55 min inkubiert, worauf die photometrische Messung bei 436 nm durchgeführt wurde.
  • Ergebnis:
  • Tabelle 1: Lactoseabbau durch die Membran bei verschiedenen Volumenströmen
    Volumenstrom [mL/min] Glukosekonzentration [mMol/L) Lactoseabbau [%]
    1 68,46 48,82
    2,5 84,89 60,54
    4,2 50,49 36,01
  • Wie es sich aus der Tabelle 1 und der 1 ergibt, welche die Werte in der Tabelle 1 graphisch wiedergibt, zeigt sich ein Optimum der Lactosespaltung bei einer Flussrate von 2,5 ml/min. Bei langsamerem Fluss hemmt die entstandene Galactose, die nicht rasch genug abgeführt wird, die β-Galactosidase. Bei schnellerem Fluss ist die Kontaktzeit für die Lactose zu gering. Eine Optimierung wurde in diesem Beispiel nicht angestrebt.
  • Vergleichsbeispiel 1: Nachweis der Produktinhibierung von gelöster β-Galactosidase durch Galactose mit o-Nitrophenol-β-D-galaktopyranosid (ONPG) als Substrat
  • Vom Enzympräparat Maxilact LX 5000 (von Sigma-Aldrich erhältlich, β-Galactosidasekonzentration etwa 50 mg/ml) wurden eine 1:200 (0,25 mg/mL)- und eine 1:500 (0,1 mg/mL)-Verdünnung hergestellt.
  • Ferner wurde eine Konzentrationsreihe von verschiedenen ONPG-Konzentrationen (0,2 mM bis 10 mM) in K/NaPi-Puffer (0,1 Mol/L Kalium-Natrium-Phosphat, pH 7,0 mit 1 mMol/L Magnesiumchlorid) hergestellt. 980 μL der jeweiligen ONPG-Lösung wurden in eine Küvette pipettiert. Anschließend wurden 20 μL der 1.200- bzw. 1:500-Enzymlösungen zugesetzt. Das Signal für o-Nitrophenol, das aus ONPG entsteht, wurde bei 405 nm im Photometer gemessen. Daraus wurden die Aktivitäten entsprechend dem für die Enzymaktivität veränderten Lambert-Beer'schen Gesetz wie folgt berechnet:
    Figure DE102012013385B4_0003
    wobei
    • v
    spezifische Aktivität von β-Galactosidase [μMol/min mg]
    ΔA
    Änderung der Absorption in der Küvette bei definierter Wellenlänge [1/min]
    VTest
    Gesamtvolumen in der Küvette [mL]
    VEnzym
    Enzymvolumen [mL]
    EProdukt
    Extinktionskoeffizient für das zu detektierende Produkt [mL/[μMol·cm]]
    d
    Küvettendicke (Länge des Lichtwegs durch die Küvette) [cm]
    c
    Konzentration des Enzyms im Enzymvolumen [mg/mL]
  • Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten.
  • 2 zeigt die Abhängigkeit der spezifischen Aktivität von der ONPG-Konzentration (Substrat) und der Galactosekonzentration (Inhibitor). Die Aktivität des Enzyms sinkt mit zunehmender Galactosekonzentration. Die spezifische Aktivität nähert sich mit steigender Galactosekonzentration immer langsamer ihrem Maximum.
  • In der 3 ist die Michaelis-Menten-Konstante km in Abhängigkeit zur Galactosekonzentration dargestellt. Sie zeigt, dass km mit steigender Galactosekonzentration ansteigt und ein Maximum bei etwa 18 mM erreicht. Ohne Inhibitor wird eine Konstante von 1,2 mM erreicht. Die verwendete β-Galactosidase verliert ihre Affinität zu ONPG mit steigender Galactosekonzentration.
  • Schließlich ist aus der 4 ersichtlich, dass es sich eindeutig um eine kompetitive Hemmung handelt, da die Geraden der Lineweaver-Burk-Transformation um einen Punkt auf der y-Achse rotieren.
  • Beispiel 3: Vergleich der spezifischen Aktivität für gelöste und immobilisierte β-Galactosidase
  • Die spezifischen Aktivitäten (U/mg) von gelöster und immobilisierter β-Galactosidase wurden für ONPG und Lactose als Substrate gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
    Vmax [U/mg] km [mM]
    Gelöstes Enzym Immobilisiertes Enzym Gelöstes Enzym Immobilisiertes Enzym
    ONPG 127,3 190,2 1,2 1,5 (20 mL/min; flussabhängig)
    Lactose 10,9 58,8 11,8 10,7 (10 mL/min; flussabhängig)
  • Aus der Tabelle 2 ist ersichtlich, dass die spezifische Aktivität (U/mg) durch die Immobilisierung bei beiden Substraten wesentlich, im Fall der Lactose signifikant, egenüber dem löslichen Enzym erhöht wird. Der km-Wert gibt an, wie die Affinität des Enzyms zu seinem Substrat ist. Er ist nicht signifikant verändert, was bedeutet, dass die Hemmung in diesem Fall kompetitiv ist, d. h. je mehr Produkt vorliegt, desto geringer ist die Enzymaktivität.
  • Beispiel 4: Herstellung einer modifizierten porösen Membran, die Penicillin-Acylase als Enzym enthält
  • Aus einer Polyallylamin-modifizierten Membran (von Sartorius Stedim Biotech GmbH, Göttingen, Deutschland, erhältlich, Typ 38942, Charge: T 831) wurden sechs Membranronden mit einem Durchmesser von 30 mm ausgestanzt. Die Membranronden wurden mit 50 mM Puffer (Natriumdihydrogenphosphat/Dinatriumhydrogenphosphat, pH 7,6, Leitfähigkeit: 6 mS/cm) benetzt und in eine Petrischale mit 6 cm Durchmesser überführt, die 4 ml des vorstehend genannten 50 mM Puffers sowie 200 μL Glutaraldehyd (GluDA) (25%ig, von SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland, erhältlich) enthielt. Die Membranen wurden in dieser Lösung 30 min geschüttelt und dann zweimal in einer großen Petrischale (9,4 cm Durchmesser) in dem vorstehend genannten 50 mM Puffer gewaschen.
  • Zur Bindung des Enzyms wurden in einer Petrischale (6 cm Durchmesser) 4 ml des vorstehend genannten Puffers und 50 μl Penicillin-Acylase (entspricht 8,55 mg) (erhältlich von Fluka, 972 U/ml bei 37°C, 171 mg/ml) auf einem Schüttler gemischt. Die in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen 6 Membranen wurden in die Petrischale eingebracht und 2 Stunden geschüttelt und dann zweimal in einer großen Petrischale (9,4 cm Durchmesser) in je 15 ml des vorstehend genannten 50 mM Puffers gewaschen.
  • Die Immobilisierung der Penicillin-Acylase an der Membran wurde mittels der Enzymaktivität in den Überständen vor/nach der Immobilisierung bestimmt. Dazu wurden Proben der Überstände (150 μl) einer konzentrierten Penicillin G-Lösung (3 ml, 10 mg/ml) zugesetzt, in Abständen von einer Minute wurden Proben entnommen und die entstandene 6-Aminopenicillansäure (APA) wurde mittels einer APA-Standardreihe bestimmt.
  • Die Bestimmung von APA wurde mit einem Testansatz durchgeführt, der 500 μl Probe (z. B. APA-Standard in dem vorstehend genannten 50 mM Puffer), 500 μl 200 mM Natriumacetatlösung, pH 3,5 (hergestellt aus Essigsäure und Natriumhydroxid) sowie 500 μl Ehrlich's Reagenz (4-Dimethylaminobenzaldehyd, erhältlich von Merck) enthielt. Das Ehrlich's Reagenz reagiert mit der Aminogruppe von APA und führt zu einer gelben Färbung, die bei 413 nm photometrisch gemessen werden kann. Da diese Reaktion nur im sauren stattfindet, ist die Zugabe der Natriumacetatlösung erforderlich. Die Messung wurde bei 413 nm in einer Halbmikroküvette aus optischem Glas durchgeführt. Tabelle 3: Bestimmung der Aktivität von Penicillin-Acylase mit einem APA-Standard
    E 413 nm
    Probe (22°C) 1 min 2 min 3 min ΔE/min U/mg
    3151 1,088 1,366 1,688 0,3 2,86
    1581 0,601 0,73 0,903 0,15 2,84
    631 0,202 0,243 0,292 0,05 2,38
    102 0,116
    202 0,189
    502 0,458 (= 0,23 μmol)
    1002 0,843
    1 Acylase [μg] in 3 mL Penicillin G
    2 APA-Standard [μg] im Testansatz Tabelle 4: Bestimmung der Immobilisierung von Penicillin-Acylase an der Membran
    E 413 nm
    Probe 1 min 2 min 3 min ΔE/min U/mg (22°C)
    Lösung vor Immobilisierung1 1,004 1,269 1,521 0,26 2,47
    Lösung nach Immobilisierung1 0,496 0,622 0,768 0,13 1,33
    1 150 μL aus dem Immobilisierungsansatz (50 μL Acylase +4 mL des vorstehend genannten 50 mM Puffers) +3 mL Penicillin G, davon minütlich je 0,5 ml für die APA-Bestimmung
  • Aus der Tabelle 4 ergibt sich, dass die Acylaselösung vor der Immobilisierung eine Aktivität von 2,47 U/mg und nach der Immobilisierung eine Aktivität von 1,33 U/mg aufweist und dass somit 1,14 U/mg auf der Membran immobilisiert worden sind. Die Enzymaktivität des Überstands nach der Immobilisierung liegt somit um etwa 50% unterhalb der Enzymaktivität der Startlösung. Bei einem Angebot von 8,55 mg Acylase entspricht dies einer immobilisierten Menge von etwa 4,28 mg Acylase an 6 Membranen, d. h. etwa 0,71 mg/Membran oder 0,10 mg/cm2.
  • Beispiel 5: Vergleich der spezifischen Aktivität für gelöste und immobilisierte Penicillin-Acylase
  • Die spezifischen Aktivitäten (U/mg) von gelöster und immobilisierter Penicillin-Acylase wurden analog zu Beispiel 4 bei verschiedenen Betriebsbedingungen gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5: Spezifische Aktivität (%) von gelöster und membrangebundener Penicillin-Acylase unter verschiedenen Betriebsbedingungen
    Zeit [min] Acylase1 Acylase2
    diffusiv3 konvektiv4
    10 1005 100 100 100
    20 67 57 94 103
    30 51 43 101 104
    1 Lösliches Enzym, gleiche Menge wie membrangebundenes Enzym
    2 Membrangebundenes Enzym
    3 Membrangebundenes Enzym in 5 ml Penicillin G-Lösung geschüttelt
    4 Membrangebundenes Enzym mit Penicillin G-Lösung durchströmt, Flussrate 1 ml/min, 2 × durchgeführt
    5 Die spezifischen Aktivitäten der Präparate (U/mg) in den ersten 10 min wurden auf 100% gesetzt
  • Aus der Tabelle 5 ergibt sich, dass bei konvektivem Betrieb keine Inhibierung des membrangebundenen Enzyms durch die erzeugte APA stattfindet, was den Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Spaltung von komplexen Molekülen bestätigt.
  • Beispiel 6: Hydrolyse von Penicillin G durch an einer Membran immobilisierte Penicillin-Acylase zu 6-Aminopenicillansäure (APA) und Phenvlessigsäure im konvektiven Betrieb
  • Eine Membran, die analog Beispiel 4 hergestellt worden ist, wurde in einen Filtrationsvorsatz eingebaut. Die Membran befand sich dabei ohne Filterunterstützungen im Filtrationsvorsatz und wurde lediglich durch Silikonringe zwischen Ober- und Unterteil des Filtrationsvorsatzes fixiert und gehalten. Dadurch wurde eine frontale Anströmfläche von 2,5 cm2 und ein optimaler konvektiver Transport ohne physikalische Widerstände erhalten. Eine Penicillin G-Lösung (10 mg/ml in 50 mM Puffer (Natriumdihydrogenphosphat/Dinatriumhydrogenphosphat, pH 7,6) wurde mit einem Fluss von 1 ml/min über die Membran filtriert.
  • Die Adsorptionsmesswerte für APA wurden bei 413 nm photometrisch in einer Halbmikro-Kunststoffküvette gemessen, wobei 0,1 ml Probe, 1 ml des vorstehend genannten 50 mM-Puffers und 1 ml 200 mM Natriumacetatlösung, pH 3,5 (hergestellt aus Essigsäure und Natriumhydroxid) verwendet wurden.
  • Wie es aus der 5 ersichtlich ist, wird das Produkt APA von der Membran abgeführt. Eine Inhibierung des auf der Membran gebundenen Enzyms durch das Produkt wird so verhindert.
  • Vergleichsbeispiel 2: Hydrolyse von Penicillin G durch an einer Membran immobilisierte Penicillin-Acylase zu 6-Aminopenicillansäure (APA) und Phenvlessigsäure im Schüttelbetrieb
  • Zwei Ansätze einer Penicillin G-Lösung (je 5 ml mit 10 mg/ml) wurden in Petrischalen (6 cm Durchmesser) pipettiert. In eine der Petrischalen wurde eine Membran, die analog Beispiel 4 hergestellt worden ist, eingebracht. Der zweiten Petrischale wurden 4 μL Penicillin-Acvlase zugesetzt (dies entspricht etwa 0,7 mg Enzym und damit der im Beispiel 4 bestimmten immobilisierten Enzymmenge pro Membran). In zehnminütigen Abständen wurde jeder Petrischale eine Probe von 10 μL entnommen. Anschließend wurde die entstandene APA bestimmt. Nach 150 Minuten wurden jeder Petrischale 100 mg/ml Penicillin G zugesetzt und nach weiteren 120 Minuten wurden jeder Petrischale 4 μL Penicillin-Acvlase zugesetzt. Nach 100 Minuten wurde die Membran nach Spülen mit dem vorstehend genannten 50 mM Puffer in frische Penicillin G-Lösung eingebracht.
  • Die Adsorptionsmesswerte für APA wurden bei 413 nm photometrisch in einer Halbmikro-Kunststoffküvette gemessen, wobei 0,01 ml Probe, 1 ml des vorstehend genannten 50 mM-Puffers, 1 ml 200 mM Natriumacetatlösung, pH 3,5 (hergestellt aus Essigsäure und Natriumhydroxid) und 1 ml Ehrlich's Reagenz verwendet wurden.
  • Wie es aus der 6 ersichtlich ist, wird Penicillin G in Anwesenheit von Penicillin-Acylase hydrolysiert. Die Absorptionswerte bei 413 nm zeigen das entstehende APA und den Anstieg der APA-Konzentration in der Petrischale. Nach 150 Minuten findet keine weitere Hydrolyse von Penicillin G statt. Dies kann entweder eine Inhibierung der Hydrolyse durch entstandenes Produkt bedeuten oder einen Verbrauch des Penicillin G oder des Enzyms. Weder eine Zugabe von frischem Penicillin G noch von frischem Enzym bewirkt eine weitere Hydrolyse. Dies lässt auf eine Inhibierung durch das entstandene Produkt APA schließen.
  • Nach der Überführung der mit Puffer gespülten Membran in eine Petrischale mit frischer Penicillin G-Lösung zeigt diese wieder eine Aktivität der membrangebundenen Penicillin-Acylase. Die Annahme einer Inhibierung durch das entstandene Produkt APA wurde damit bestätigt. Da die Konzentration des entstehenden Produkts APA in der Petrischale im Schüttelbetrieb ansteigt, führt dies zu einer Hemmung des Enzyms.

Claims (21)

  1. Modifizierte poröse Membran, umfassend eine mit primären Amingruppen funktionalisierte poröse Membran, bifunktionelle Spacermoleküle, die mit jeweils einer Funktionalität mit den Amingruppen umgesetzt sind, und ein Enzym, das an die andere Funktionalität der bifunktionellen Spacermoleküle gebunden ist.
  2. Modifizierte poröse Membran nach Anspruch 1, wobei die primären Amingruppen durch eine Verbindung bereitgestellt werden, die aus der Gruppe, bestehend aus Diaminen der Formel H2N-R1 xNH2, wobei R1 = CH2 und x = 1 bis 4, Diaminen der Formel H2N-C-NH2 oder der Formel H2N-C-R2 x-C-NH2, wobei C ein gesättigter, ungesättigter oder aromatischer 5- oder 6-gliedriger Ring aus Kohlenstoff ist, der gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatom(e), ausgewählt aus O, N und S, enthält, wobei der Ring gegebenenfalls mit einer oder mehreren Gruppe(n), ausgewählt aus -CH3, -C=O und -NH2, substituiert sein kann, und wobei R2-CH2- ist und x 0 bis 3 ist, Diaminen der Formel H2N-R3-Y-R3-NH2, wobei R3 ein aromatischer 6-gliedriger Kohlenstoffring ist, der gegebenenfalls mit einer oder mehreren Gruppe(n), ausgewählt aus -NH2, -OCH3, -CH3, -COOH und -CONH2, substituiert sein kann, und Y eine Gruppe ist, ausgewählt aus -CO-NH-, -CH2CH2-, -NH-, -CH2-, -CH=CH- und -O-, oder Y nicht vorliegt, Polyethylenaminen der Formel H2N-[-CH2CH2-NH-]n-H, wobei n = 2 bis 4, Lysin, Polylysin, Arginin, Polyarginin und Polyallylamin, vorzugsweise aus Diethylentriamin, Triethylentetramin, Tetraethylenpentamin; Lysin, Polylysin, Arginin, Polyarginin und Polyallylamin, besonders bevorzugt aus Polyallylamin, ausgewählt ist.
  3. Modifizierte poröse Membran nach Anspruch 1 oder 2, wobei die poröse Membran eine mikroporöse Membran mit einem Porendurchmesser im Bereich von 1 bis 10 μm ist.
  4. Modifizierte poröse Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die poröse Membran eine Celluloseacetat-Membran, eine Cellulosehydratmembran oder eine Membran aus regenerierter Cellulose ist.
  5. Modifizierte poröse Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die bifunktionellen Spacermoleküle ein Dialdehyd oder ein Diepoxid sind.
  6. Modifizierte poröse Membran nach Anspruch 5, wobei der Dialdehyd aus der Gruppe, bestehend aus Succindialdehyd, Glutaraldehyd und 1,6-Hexandial, ausgewählt ist, und das Diepoxid aus der Gruppe, bestehend aus 1,3-Butadiendiepoxid, 1,5-Hexadiendiepoxid und 1,7-Octadiendiepoxid, ausgewählt ist.
  7. Modifizierte poröse Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Enzym aus der Gruppe, bestehend aus β-Galactosidase, Penicillin-Acylase, Alkoholdehydrogenase, Carbamoylreduktase, Formiatdehydrogenase, ausgewählt ist.
  8. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten porösen Membran, umfassend die Schritte: das Umsetzen einer mit primären Amingruppen funktionalisierten porösen Membran mit bifunktionellen Spacermolekülen unter Reaktionsbedingungen, so dass im Wesentlichen jeweils nur eine Funktionalität des bifunktionellen Spacermoleküls an die primären Amingruppen gebunden wird, und das Umsetzen der bifunktionelle Spacermoleküle aufweisenden Membran mit einem Enzym unter Reaktionsbedingungen, so dass das Enzym an die freien Funktionalitäten der bifunktionellen Spacermoleküle gebunden wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die primären Amingruppen durch eine Verbindung bereitgestellt werden, die aus der Gruppe, bestehend aus Diaminen der Formel H2N-R1 xNH2, wobei R1 = CH2 und x = 1 bis 4, Diaminen der Formel H2N-C-NH2 oder der Formel H2N-C-R2 xC-NH2, wobei C ein gesättigter, ungesättigter oder aromatischer 5- oder 6-gliedriger Ring aus Kohlenstoff ist, der gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatom(e), ausgewählt aus O, N und S, enthält, wobei der Ring gegebenenfalls mit einer oder mehreren Gruppe(n), ausgewählt aus -CH3, -C=O und -NH2, substituiert sein kann, und wobei R2-CH2- ist und x 0 bis 3 ist, Diaminen der Formel H2N-R3-Y-R3-NH2, wobei R3 ein aromatischer 6-gliedriger Kohlenstoffring ist, der gegebenenfalls mit einer oder mehreren Gruppe(n), ausgewählt aus -NH2, -OCH3, -CH3, -COOH und -CONH2, substituiert sein kann, und Y eine Gruppe ist, ausgewählt aus -CO-NH-, -CH2CH2-, -NH-, -CH2-, -CH=CH- und -O-, oder Y nicht vorliegt, Polyethylenaminen der Formel H2N-[-CH2CH2-NH-]n-H, wobei n = 2 bis 4, Lysin, Polylysin, Arginin, Polyarginin und Polyallylamin, vorzugsweise aus Diethylentriamin, Triethylentetramin, Tetraethylenpentamin; Lysin, Polylysin, Arginin, Polyarginin und Polyallylamin, besonders bevorzugt aus Polyallylamin, ausgewählt ist.
  10. Verfahren nach Anspruche 8 oder 9, wobei die poröse Membran eine mikroporöse Membran mit einem Porendurchmesser im Bereich von 1 bis 10 μm ist.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die poröse Membran eine Celluloseacetat-Membran, eine Cellulosehydrat-Membran oder eine Membran aus regenerierter Cellulose ist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die bifunktionellen Spacermoleküle ein Dialdehyd oder ein Diepoxid sind.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Dialdehyd aus der Gruppe, bestehend aus Succindialdehyd, Glutaraldehyd und 1,6-Hexandial, ausgewählt ist, und das Diepoxid aus der Gruppe, bestehend aus 1,3-Butadiendiepoxid, 1,5-Hexadiendiepoxid und 1,7-Octadiendiepoxid, ausgewählt ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Umsetzen mit Glutaraldehyd in Natriumphosphatpuffer bei pH 7,6 durchgeführt wird.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, wobei das Enzym aus der Gruppe, bestehend aus β-Galactosidase, Penicillin-Acylase, Alkoholdehydrogenase, Carbamoylreduktase, Formiatdehydrogenase, ausgewählt ist.
  16. Verfahren zur Spaltung von komplexen Molekülen, umfassend die Schritte: das Bereitstellen einer modifizierten porösen Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und das Transportieren einer Lösung, Emulsion oder Suspension, welche zu spaltende komplexe Moleküle enthält, direkt konvektiv durch die Membran oder durch Leiten der Lösung oder Suspension an der Membran entlang, wobei ein Permeat quer zur Fließrichtung abgezogen wird, oder durch lediglich Entlangströmen an der äußeren Membranoberfläche, wobei die komplexen Moleküle durch die Wirkung des Enzyms gespalten werden und die Spaltungsprodukte von der Membran abgeführt werden.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Transportieren direkt konvektiv durch die Membran erfolgt.
  18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Transportieren durch Leiten der Lösung, Emulsion oder Suspension an der Membran entlang erfolgt, wobei ein Permeat quer zur Fließrichtung abgezogen wird.
  19. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Transportieren durch lediglich Entlangströmen der Lösung, Emulsion oder Suspension an der Membran erfolgt.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei an der Membran β-Galactosidase gebunden ist und als Emulsion Milch eingesetzt wird, wodurch in der Milch enthaltene Lactose gespalten wird.
  21. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 8 bis 20, die eine modifizierte poröse Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfasst.
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