CH642105A5 - Enzym-immobilisierungsmembran, verfahren zur herstellung derselben und verwendung der membran in einer elektro-chemischen messvorrichtung. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Enzym-Immobilisierungsmembran, auf ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Membran und auf die Verwendung der Enzym-Immobilisierungsmembran in einer elektro-chemischen Messvorrichtung.

Es wurden bereits eine Anzahl von analytischen Methoden vorgeschlagen, die eine Enzym-Immobilisierungsmem-bran verwenden, um quantitativ wichtige medizinische Substanzen in lebenden Körpern zu messen, beispielsweise Sac-charide, Harnstoff, Cholesterol oder andere Substanzen, die in sehr geringen Mengen in Lebendkörper-Flüssigkeiten vorkommen. Diese Verfahren stellen wirkungsvolle Mittel zur Verfügung, um Komponenten in sehr geringen Mengen in einer Flüssigkeit mit einer Vielzahl von Komponenten zu entdecken, indem eine Substrateigenheit und eine hohe katalyti-sche Aktivität des Enzyms benutzt werden. Diese Verfahren haben jedoch Probleme mit dem Immobilisieren des Enzyms und sind daher bis jetzt nicht häufig benutzt worden.

Bis anhin wurde das Enzym in einem Membran-Zustand oder in einer Membran gemäss folgenden Verfahren festgehalten:

1. Ein Verfahren, wobei das Enzym mit einem Polyacyl-amid-Gel umhüllt wird (Nature 214986, 1967).

2. Ein Verfahren, bei welchem das Enzym mit einem inerten Protein, wie beispielsweise Albumin, gemischt wird, das als Verfestigungsmittel dient und Vernetzung des inerten Proteins durch ein Vernetzungsmittel (Biotechnology and Bioengineering, 15,359, 1973).

3. Ein Verfahren, bei welchem das Enzym in einem Filterpapier oder Cellophan absorbiert wird und durch Glutaral-dehyd vernetzt wird (Biotechnology and Bioengineering, 15,359, 1973).

4. Ein Verfahren, bei welchem das Enzym ionisch mit einer Ionenaustauschcellulose gebunden wird (Biotechnology and Bioengineering, 1971).

5. Ein Verfahren, bei welchem das Enzym einer Kollagen-faserlösung beigemischt, die Lösung in einer Elektrolysezelle gegeben und ein elektrischer Strom durch die Zelle geführt wird, um einen Kollagenniederschlag zu erzeugen, der das Enzym auf der Elektrode umhüllt (Biochemistry, Biophysics Research Communication 41,51,1972).

6. Ein Verfahren, wobei das Enzym physicochemisch auf einer porösen, organopolymerischen Schicht festgehalten wird (Japanische Offenlegungsschrift 17889/77).

7. Ein Verfahren, bei welchem ein Enzymgel zwischen zwei Schichten festgehalten wird (Japanische Offenlegungsschrift 55691/77).

Mit dem 1. Verfahren kann eine grosse Menge Enzym festgehalten werden, doch ist die Festigkeit der Membran nicht gross genug und die Diffusion von Substraten und Produkten ist klein. Beim 2. Verfahren kann die Menge des Enzyms vergrössert werden, doch auch hier ist die Festigkeit der Membran nicht gross genug und auch der Widerstand gegen Mikroorganismen ist nicht genügend, da ein Protein als Verfestigungsmittel genommen wird. Das 3. Verfahren kann leicht durchgeführt werden, doch ist die zurückgehaltene Menge Enzym nicht genügend und falls die Schichtdicke vergrössert wird, um deren Festigkeit zu erhöhen, wird die Diffusion des Substrates und der übrigen Anteile zu klein und falls die Schichtdicke kleiner gemacht wird, verringert sich deren Festigkeit. Das 4. und 5. Verfahren können leicht durchgeführt werden, doch ist die Bindung des Enzyms an einen Träger schwach, so dass das Enzym leicht wieder abgespalten werden kann. Das 6. Verfahren ist dazu gedacht, die Nachteile der zwei vorhergehenden Verfahren zu beseitigen, doch ist die Membran von der Vorderseite bis zur Rückseite der Membran durchlöchert unddaherkannnicht genügende Menge Enzym in diesen Löchern zurückgehalten werden. Ausserdem weist diese Membran keine genügende Porosität auf. Das 7. Verfahren ist bei der Herstellung kompliziert, da das Enzymgel zwischen zwei dünnen Schichten gehalten werden muss. Dadurch werden die Herstellungskosten stark vergrössert, obwohl die zurückgehaltene Enzymmenge gross ist.

Es ist demgegenüber Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Enzym-Immobilisierungsmembran herzustellen, die eine grosse Menge des Enzyms zurückhalten kann, eine gute Diffusionsdurchlässigkeit für spezifische Materialien und eine stabilisierte Aktivität über einen längeren Zeitraum aufweist. Eine weitere Aufgabe ist es, eine elektro-chemische Messvorrichtung mit einer guten Ansprechbarkeit und einer guten analytischen Genauigkeit anzugeben.

Die Lösung dieser Aufgaben wird in den Ansprüchen

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

642 105

beschrieben.

Die Erfindung wird nun im einzelnen anhand von Ausführungsbeispielen und einer Zeichnung näher erläutert werden.

Fig. 1 zeigt im Schnitt eine erfindungsgemässe Enzym-Immobilisierungsmembran,

Fig. 2 zeigt in einem Längsschnitt einen Enzym-Elektrodenapparat eines elektro-chemischen Messinstrumentes und

Fig. 3 zeigt in einem Diagramm die Beziehung zwischen der Glukosekonzentration und dem Sauerstoffverbrauch in einer Messvorrichtung gemäss Fig. 2.

In Fig. 1 ist ein Schnitt durch eine Enzym-Immobilisie-rungsmembran schematisch wiedergegben, wobei man die dichte Oberflächenschicht 1 erkennt, die im wesentlichen undurchlässig für ein Enzym ist, aber durchlässig für ein Gas oder eine Flüssigkeit und darunter die poröse Schicht 2 mit genügender Porosität, um eine genügende Menge des Enzyms zurückzuhalten. Die Poren dieser Schicht stehen miteinander in Verbindung und die Oberflächenschicht und die poröse Schicht sind aus einem Stück geformt und vorzugsweise aus dem gleichen Material hergestellt, wodurch eine asymmetrische Enzym-Immobilisierungsmembran 3 entsteht. Daraus geht hervor, dass die Oberflächenschicht und die poröse Schicht nicht aus zwei verschiedenen, aneinander befestigte Schichten hergestellt sind.

Die asymmetrische Membran ist als Umkehr-Osmosemembran bekannt und das Herstellungsverfahren und die Struktur sind beispielsweise aus folgenden Literaturstellen bekannt:

a) S. Manjikian, S. Loeb und J.W. McCutchan: Proc. Ist Int. Symp. on Water Desalination, Washington, D.C.C. (1965), und b) G.T. Gittens, P.A. Hitchcock, D.C. Sammon und G.E. Wakley: Desalination 8, 369 (1970).

In der vorliegenden Erfindung hat die Oberflächenschicht die Eigenschaft, Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht (inklusive ionische Substanzen) durchzulassen, die durch eine Enzymreaktion erhöht oder erniedrigt wurden und die entdeckt werden sollen.

Irgendein Material, insofern es die sogenannte Umkehr-Osmosemembran bilden kann, kann als Material für die Herstellung einer asymmetrischen Membran verwendet werden. Beispiele solcher Materialien sind: Cellulose-Derivate, wie Acetylcellulose, Äthylcellulose, Propionylcellulose, Butyryl-cellulose usw., aliphatische und aromatische Polyamide, Polyamid-Imid, Polybenzoimidazol, Acrylonitril, Copoly-mere, Polycarbonate, Polyester, Polyaminosäure usw. Besonders erwünscht sind Cellulosederivate und Polyaminosäure, die eine Affinität gegenüber dem Enzym aufweisen.

Die Dicke der asymmetrischen Membran ist etwa zwischen 1 bis 1000 jim gelegen, vorzugsweise zwischen 30 bis 300 jim. Die Dicke der Oberflächenschicht in der asymmetrischen Membran kann zwischen 0,01 und 10 um sein, vorzugsweise zwischen 0,1 bis 3 um. Die Oberflächenschicht weist keine Poren auf, die weit genug sind, um Enzymmoleküle durchzulassen, während die Poren in der porösen Schicht verschiedene Porenweiten aufweisen. Poren, die weiter entfernt von der Oberflächenschicht sind, sind weiter und die Poren an der Oberfläche der porösen Schicht haben Porenweiten von 100 bis 500 nm, derart, dass eine Enzymlösung frei in die poröse Schicht eindringen kann. Die Porosität der porösen Schicht der asymmetrischen Membran kann zu einem gewissen Grade geändert werden, wobei dies von den Membranherstellungsbedingungen abhängt, doch normalerweise wird eine Membran mit einer Porosität von 50 bis 90% verwendet.

Das Enzym kann in die Poren der porösen Schicht gemäss dem gewöhnlichen Immersionsverfahren eingebracht und zurückgehalten werden. Vorteilhafter und wirkungsvoll jedoch ist die Anwendung des Druckfiltrierverfahrens. Damit wird eine Enzymlösung unter Druck in die poröse Schichtseite der Membran getrieben, wobei die Eigenschaften der Umkehr-Osmosemembran benutzt wird, und wobei die Enzymlösung in den Poren der porösen Schicht zurückgehalten wird. Während dieser Zeit tritt das Enzym nicht wesentlich durch die Oberflächenschicht und ist stabil in den Poren zurückgehalten. Die Druckfiltration wird durchgeführt,

indem eine wässrige Enzymlösung oder eine wässrige Enzymlösung mit einem Stabilisator von der porösen Schichtseite her durchgetrieben wird, wobei dieses Verfahrn nur mit der erfindungsgemässen asymmetrischen Membran durchgeführt' werden kann. Im Falle einer gewöhnlichen porösen Membran, beispielsweise aus Fasermaterialien wie Papier, werden die Poren von einem Ende der Membran zum anderen Ende durchdrungen, und es kann nicht zwischen der Vorder- und Rückseite der Membran unterschieden werden, so dass die Enzymlösung nicht durch Druck durchgetrieben und zurückgehalten werden kann. Die wässrige Enzymlösung kann jede gewünschte Enzymkonzentration aufweisen, doch wird im allgemeinen eine Konzentration von 0,1 bis 50 mg/ml bevorzugt. Der Druck für das Druckfiltrieren ist überatmosphärisch und kann frei gewählt werden, solange die asymmetrische Membran nicht zusammengedrückt oder sonstwie beschädigt wird, wobei der bevorzugte Bereich zwischen 0,2 und 1 MPa liegt. Die Filtrationszeit hängt von der Enzymkonzentration ab und liegt in einem Bereich von 5 Min. und 10 Std. Die Temperatur bei der Druckfiltration muss in einem Bereich liegen, innerhalb welchem das Enzym nicht denaturiert wird, wobei dieser Bereich zwischen 0 und 40 °C liegt.

Das Enzym wird in der porösen Schicht durch Berührung mit einem Vernetzungsmittel vernetzt und dadurch in den Poren immobilisiert. Diese Vernetzung kann durch irgendeines der nachgenannten Verfahren oder in Kombination davon erfolgen: a) durch Eintauchen der asymmetrischen Membran in eine Lösung mit einem Vernetzungsmittel, b) durch Aufsprühen oder Beschichten der Vernetzungsmittellösung auf die asymmetrische Membran und c) durch Hindurchtreiben unter Druck der Vernetzungsmittellösung durch die asymmetrische Membran von der porösen Schichtseite her. Als Vernetzungsmittel können beispielsweise Dialde-hyde, wie Glutaraldehyde, Dialdehydstärke usw., Isocyanat-verbindungen wie Hexamethylen-Diisocyanat, Tolylen-Diisocyanat usw., Bisdiazobenzidin,

N,N'-Polymethylen-Bisiodoacetamid, N,N-Äthylenbismalli-mid usw. verwendet werden. Besonders bevorzugt sind Dial-dehyde, wie Glutaraldehyd. Es werden 10 bis 1000 Gewichtsanteile Vernetzungsmittel pro Gewichtsanteil Enzym, das festgehalten werden soll, verwendet, während die Konzentration des Vernetzungsmittels in der Lösung zwischen 1 und 20 Gew.-% liegt. Die Zeit für die Vernetzung hängt von der Konzentration des Vernetzungsmittels in der Lösung ab und liegt gewöhnlicherweise zwischen 15 Min. und 25 Std., während die dabei zu herrschende Temperatur in einem Bereich von - 10°C bis Zimmertemperatur, vorzugsweise von 0 bis 5°C liegen sollte.

Die in vorliegender Erfindung benutzten Enzyme sind Glucoseoxidase, Aminosäureoxidase, Cholesteroloxidase, Uricase usw., Urease, Creatininase, Glutaminase, Penicilli-nase, Catalase, Peroxidase, Invertase, Mutarotase, Amylase; Proteasen wie Papain, Trypsin usw. und Glucoseisomerase usw. Diese Enzyme können entweder einzeln oder in Kombination von zwei oder mehreren festgehalten werden, d.h. eine Kombination von Cholesterolesterase und Cholesteroloxidase, einer Kombination von Glucoseoxidase und Catalase, und einer Kombination von Invertase und Glucoseoxidase oder Mutarotase oder dergleichen kann zusammen immobilisiert werden.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

642105

4

Die vorliegende Enzym-Immobilisierungsmembran kann leicht hergestellt werden und weist die folgenden Eigenschaften auf: 1. Eine grosse festgehaltene Enzymmenge, 2. eine gute Stabilität gegenüber physikalischen, chemischen und biologischen Stimulanzien von der Aussenseite, da das Enzym in der porösen Schicht der asymmetrischen Membran immobilisiert ist, 3. eine grosse Festigkeit, obwohl die Membran dünn ist, und 4. eine grosse Lebensdauer und eine grosse Aktivität.

Es folgen nun Beispiele und Vergleichsbeispiele.

Beispiel 1

25 g Acetyl-Cellulose mit 39,8 Gew.-% Acetylgruppen (hergestellt durch Eastman Kodak, USA), 45 g Aceton und 30 g Formamid wurden zusammengemischt, um eine Giesslö-sung vorzubereiten. Ungefähr 10 g dieser Giesslösung wurden auf eine saubere und glatte Glasplatte mittels eines Baker-Typ Applikators zu einer Membran mit einer Dicke von ungefähr 50 um gegossen und, nachdem das Lösungsmittel nach etwa 30 Sek. verdampft war, wurde die Membran mit der Glasplatte in 4°C kaltes Wasser eingetaucht, um eine Gelbildung zu bewirken, wodurch eine asymmetrische Membran erhalten wurde. Diese Membran war eine Umkehr-Osmosemembran, mit einer Oberflächenschicht von 1 um und einer porösen Schicht mit einer Porosität von 80%. Eine Scheibe mit einem Durchmesser von 47 mm wurde aus dieser Membran geschnitten und den nachfolgenden Tests unterworfen.

Andererseits wurde Glucoseoxidase (spezifische Aktivität 70 IÜ/mg (hergestellt von Boehringer, Mannheim) in einer 0,1 M Phosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 6,8 gelöst, um eine Enzymlösung (pH 6,8) mit einer Enzymkonzentration von 10 mg/ml herzustellen. Die so erhaltene Lösung wurde unter Druck von der porösen Schichtseite her in die asymmetrische Membran getrieben (0,5 MPa), um die Glucoseoxidase in den Poren der Membran zurückzuhalten. Durch die asymmetrische Membran wurden 5 ml einer 0,1-M-Phosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 6,8, enthaltend 2 Gew.-% Glutaraldehyd und einem Druck von 0,5 MPa durchgelassen, und dann wurde die asymmetrische Membran in 10 ml der vorhergehenden Lösung getaucht. Die Membran wurde darin bei 4°C während 3 Std. gehalten, um die Vernetzungsreaktion durchzuführen und die Glukoseoxidase festzuhalten.

10

15

Die so erhaltene Oxid-Immobilisierungsmembran wies eine Aktivität von 0,5 IÜ/cm2 auf, und nachdem sie bei Raumtemperatur während 30 Tagen in einer Phosphatpufferlösung (0,1 M, pH 6,8) gehalten wurde, war die verbleibende Aktivität ungefähr 80%.

Vergleichsbeispiel 1

Glukoseoxidase wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 festgehalten, ausgenommen, dass eine poröse Nylonmembranschicht mit einer Dicke von 130 |i.m, Porenweite 1 Lim, Porosität 80%, verwendet wurde, wobei die sich ergebende Membran eine Aktivität von 0,1 IÜ/cm2 aufwies.

Beispiel 2

Eine Enzym-Immobilisierungsmembran wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, dass die asymmetrische Membran in der Enzymlösung während 24 Std. eingetaucht wurde, um das Enzym hereinzubringen. Diese Membran hatte eine Aktivität von 0,2 IÜ/cm2.

Beispiel 3

Eine Membran wie gemäss Beispiel 1 wurde hergestellt, mit der Ausnahme, dass 5 ml Glutaraldehyd durch die Membran unter Druck hindurchgetrieben wurde. Die Membran 25 wies eine Aktivität von 0,2 IÜ/cm2 auf.

Aus den vorhergehenden Beispielen und dem Vergleichsbeispiel geht hervor, dass diese Enzym-Immobilisierungs-membrane eine höhere Aktivität und damit auch eine grössere Menge festgehaltenes Enzym aufwiesen. Aus den Bei-30 spielen geht ferner hervor, dass dies im besonderen zutrifft, falls das Enzym unter Druck gemäss Druckfiltration in die Membrane getrieben wird und eine Lösung eines Vernetzungsmittels ebenfalls unter Druck durch die Membrane hindurchgetrieben wird.

Beispiele 4 bis 11

Eine Enzym-Immobilisierungsmembrane wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, wobei die Membran, das Enzym, das Vernetzungsmittel und die Festhaltebedingungen verändert wurden und die Eigenschaften der so erhaltenen Membrane wurden untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle zusammengestellt, wobei alle Enzyme von der Firma Boehringer, Mannheim, hergestellt wurden.

40

Tabelle

Asymmetrische Membran

Enzymlösung

Vernetzungsmittellösung

Enzym-Immobilisierungs-membran-Eigenschaften

Ex-

Material

Dicke Benutztes

Enzym •

Spezifische

Kon

Vernetzungs

Kon-

Vernet-

Urspüng-

Verbleibende

Nr.

(um)

Puffer

Aktivität zen mittel zentra-zungszeit liehe

Aktivität in

konzentrat

(IÜ/mg)

tration tion

(h)

Aktivität

Prozenten nach

pH

(mg/

(Gew.-

(IÜ/cm2) 30 Tagen

ml)

%)

4

Aromatisches Polyamid

60

Phosphatpuffer (0,1 M ; 6,8)

Glucoseoxidase

70

20

Glutaraldehyd

5

5

0,45

85

5

Acetylcellu-lose

200

Phosphatpuffer (0,1 M ; 6,8)

Glucoseoxidase

70

10

Glutaraldehyd

2

10

0,6

82

6

Acetylcellu-lose

75

Phosphatpuffer (0,1 M; 6,8)

Glucoseoxidase

70

5

Dialdehyd-stärke

5

10

0,2

75

7

Acetylcellu-lose

50

Phosphatpuffer (0,1 M ; 6,5)

Urease

100

10

Glutaraldehyd

2

5

0,5

70

8

Acetylcellu-

50

Phosphat

Urease

100

10

Hexameth-

5

3

0,3

76

lose

puffer (0,1 M ; 6,5)

ylen-Di-isocyanat

5

Tabelle

642105

Ex-Nr.

Asymmetrische

Membran

Material

Enzymlösung Vernetzungsmittellösung

Dicke Benutztes Enzym Spezifische Kon- Vernetzungs- Kon- Vernet-(i-im) Puffer- Aktivität zen- mittel zentra-zungszeil konzentrat (IÜ/mg) tration tion (h)

pH (mg/ (Gew.-

ml) %)

Enzym-Immobilisierungs-membran-Eigenschaften Urspüng- Verbleibende liehe Aktivität in Aktivität Prozenten nach (IÜ/cm:) 30 Tagen

9

Acetylcellu-lose

50

Essigsäurepuffer (0,IM; 3,5)

Pepsin

2500

10

Glutaraldehyd

2

10

8

78

10

Acetylcellu-lose

50

Phosphatpuffer (0,1 M; 6,0)

a-Amylase

1800

10

Glutaraldehyd

2

3

5

85

11

Acetylcellu-lose

50

Phosphatpuffer (0,1M;7,4)

Choleste-

roloxidase

Choleste-

25 20

3 3

Glutaraldehyd

2

5

0,1*

85

rolesterase

* Total Aktivität von 2 Enzymen

In Fig. 2 ist im Längsschnitt ein Enzym-Elektrodenappa-rat für ein elektro-chemisches Messinstrument dargestellt und man erkennt eine Säule aus isolierendem Material in der Mitte des aus einem isolierenden Material hergestellten Behälters 8, in welchem sich eine elektrolytische Lösung 9 befindet. Am unteren Ende der Säule ist eine Anode 4 angebracht, während die Kathode 5 um die Säule gewunden ist. Die Anode 4 und die Kathode 5 sind über Leitungsdrähte an eine Gleichstromquelle angeschlossen. Das obere Ende des Behälters ist mittels einer nicht korrodierenden Platte verschlossen, während das untere Ende mit einer Enzym-Immobilisierungsmembran 6 abgeschlossen ist, die mittels eines O-Rings 7 fest mit dem Behälter 8 verbunden ist. Wenn nun diese Enzym-Immobilisierungsmembran mit einer Probelösung in Verbindung gebracht wird, reagiert ein Substrat in dieser Probelösung selektiv mit dem Enzym der Membran und verbraucht den Sauerstoff in der Probelösung. Dadurch wird der Gleichgewichtszustand zwischen der Elektrolytlösung 9 und der Probelösung geändert, was einer Änderung des elektrischen Stromes, der zwischen der Anode und der Kathode fliesst, bewirkt. Dadurch kann die Menge des Substrats in der Probelösung durch Messung der Änderung im elektrischen Strom festgestellt werden. Im vorliegenden Beispiel beruht der Enzymelektrodenapparat auf einer Kombination der Sauerstoffelektrode und der Enzym-Immobilisierungsmembran 6, doch selbst im Falle einer Kombination mit anderen Arten von Elektroden arbeitet die Membran 6 in gleicher Weise, wobei nur die Messvorrichtungen für das Messen der Änderungen im Elektrolyten 9 verschieden sind. Insbesondere können eine grosse Vielzahl von Elektroden verwendet werden, wie beispielsweise eine Sauerstoffelektrode, Wasserstoffperoxydelektrode, Amoniakelektrode, Amoniumelektrode, Carbonationelektrode, Cyanionelek-trode, Kohlendioxidgaselektrode, Iodinionelektrode, monovalente Kationelektrode, Gaselektrode usw. Es kann ein weiter Bereich von Substanzen gemessen werden, wie beispielsweise Glucose, Harnstoff, Cholesterol, Aminosäure, Penicillin, Amygdalin, Creatinin, Harnsäure, Sucrose, Lactose usw., und eine Analyse von anderen Substanzen ist durch Kombination der verschiedenen Elektroden mit der vorliegenden Enzym-Immobilisierungsmembran möglich.

Beispiel 12

25 Ein Enzym-Elektrodenapparat wurde durch Befestigen einer gemäss Beispiel 1 hergestellten Enzym-Immobilisierungsmembran an die Arbeitsseite einer Clark-Typ Sauerstoffelektrode von Fig. 2 mittels eines O-Rings. Dieser Apparat wurde in eine Glucoselösung von 100 mg/dl Phosphat-30 pufferlösung bei einem pH-Wert von 6,8 getaucht und der Sauerstoffverbrauch wurde gemessen. Nach ungefähr 15 Sek. wurde der Dauerzustand erreicht. Dann wurde der Apparat in eine andere Glucoselösung mit anderen Glucosekonzentra-tionen getaucht und der jeweilige Sauerstoffverbrauch 5 Sek. 35 nach dem Eintauchen gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt, d.h. die Beziehung zwischen der Glucosekonzen-tration und dem Sauerstoffverbrauch mit dem Enzym-Elek-trodenapparat gemäss Fig. 2. Falls die Glucosekonzentration einer Probelösung auf 3 Werte festgelegt wurde, d.h. auf 100 io mg/dl, 200 mg/dl und 300 mg/dl, war der Sauerstoffverbrauch proportional der Konzentration. Falls nun dieser Enzym-Elektrodeapparat mit einer Glucoselösung mit unbekannter Konzentration in Berührung gebracht wird, kann diese Konzentration schnell und mit grosser Genauigkeit « ermittelt werden.

Vergleichsbeispiel 2

Um den vorliegenden Enzym-Elektrodenapparat von Beispiel 12 mit einem vorbekannten Enzym-Elektrodenapparat so zu vergleichen, wurde der folgende Test durchgeführt. Eine Enzym-Immobilisierungsmembran, die wie in Beispiel 1 eine durch ein Polyacrylamidgel eingeschlossene Glucoseoxidase enthielt, wurde gemäss einem vorbekannten Verfahren hergestellt, wobei diese Membran eine Dicke von 75 jim und die 55 gleiche Aktivität wie diejenige in Beispiel 1 aufwies. Dann wurde die Membran durch eine als Grenzmembran agierende Polyfluorocarbonmembran mit einer Dicke von 10 ja.ni an die Arbeitsseite des Enzym-Elektrodenapparats befestigt. Bei der Analyse der Probelösung von Beispiel 12 durch den derart 60 vorbereiteten, vorbekannten Enzym-Elektrodenapparat, benötigte man 60 Sek., um einen Dauerzustand zu erreichen. Das bedeutet, dass die Ansprechbarkeit viel kleiner war. Es stellt sich heraus, dass diese verzögerte Ansprechbarkeit durch eine niedrige Diffundierbarkeit dieser vorbekannten 65 Membran und durch die Benutzung der Grenzmembran hervorgerufen wird.

G

1 Blatt Zeichnungen

Claims (9)

1. 642105

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Enzym-Immobilisierungsmembran, gekennzeichnet durch eine asymmetrische Membran (3), die aus einem Stück aus einer Oberflächenschicht (1) geformt ist, die undurchlässig für ein Enzym, aber durchlässig für ein Gas oder eine Flüssigkeit ist und eine poröse Schicht (2) mit genügender Porosität und Porenweite, um eine hinreichende Menge Enzym zurückzuhalten, aufweist, wobei die Poren miteinander in Verbindung stehen und das Enzym darin durch Vernetzung festgehalten ist.
2. 2. Membran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die asymmetrische Membran eine Umkehrosmose-Membran ist.
3. 3. Membran nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekènn-zeichnet, dass die asymmetrische Membran aus Cellulose-Derivate, Polyamide und Polyaminosäure gefertigt ist und die Oberflächenschicht und die poröse Schicht aus dem gleichen Material gebildet sind.
4. 4. Membran nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die asymmetrische Membran eine Oberflächenschicht mit einer Dicke von 0,1-3 (im und eine poröse Schicht mit einer Dicke von 30-300 {xm und einer Porosität von 50-90% aufweist.
5. 5. Verfahren zur Herstellung einer Membran mit festgehaltenem Enzym nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Enzymlösung mit der asymmetrischen Umkehrosmose-Membran und dann mit einer Lösung eines Vernetzungsmittels in Berührung gebracht wird, um das Enzym in der porösen Schicht zu immobilisieren.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzymlösung im voraus in den Poren der porösen Schicht zurückgehalten wird und die Lösung des Vernetzungsmittels mit dem Enzym in Berührung gebracht wird.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzymlösung in den Poren der porösen Schicht durch Druckfiltration von der porösen Schichtseite der asymmetrischen Membran aus zurückgehalten wird und das Vernetzungsmittel durch die asymmetrische Membran mit Druck von der porösen Schicht her beigegeben wird.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die ganze asymmetrische Membran in die Lösung des Vernetzungsmittels getaucht wird.
9. 9. Verwendung der Enzym-Immobilisierungsmembran nach einem der Ansprüche 1-4, in einer elektro-chemischen Messvorrichtung, in welcher eine Substanz einer Probelösung elektro-chemisch analysiert wird, mit einem Behälter, einer Anode, einer Kathode, einer Grenzschichtmembran an einer Arbeitsseite der Anode und/oder der Kathode, einer Enzym-Immobilisierungsmembran an der Grenzschichtmembran und eine elektrolytische Lösung.