JPS61111687A - 酵素固定膜及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は酵素固定膜及びその製造方法に関するものであ
る。

〈従来の技術〉 配素反応を利用した工業的な実施は医薬品、食品などの
製造において一部行われているが、そのほとんどは水溶
液中で酵素と基質を反応させて生成物を得るものであり
、反応条件の厳格な管理や、活性酵素の補給、反応後に
おける生成物と酵素の分離、反応後の活性な酵素の回収
など非常に困難な問題が多く存在している。

このような問題を解決するために、担持体に酵素を固定
した、所謂固定化酵素の開発や利用が近年試みられてい
る。例えば水不溶性の担持体の表面を活性化し、反応性
を高（したのちに酵素を結合、固定化する担体結合法や
、担持体へ物理的に酵素を吸着させる物理吸着法、水溶
性重合体に酵素を添加せしめたのち架橋手段によって該
重合体をゲル化して酵素を封入する包括法などが行われ
ているが、担体結合法では特殊な担持体を必要とし、且
つ固定化操作が煩雑なために一般に高活性の固定化酵素
が得られていない。また、物理吸着法による固定化では
担持体と酵素との結合が充分ではな（、使用中に酵素が
脱離、流出しやすいので酵素反応を安定に行えないとい
う欠点を有している。上記二つの方法と比べて包括法は
比較的固定化操作が簡単であり、工業的には有用な方法
であるが、水溶性重合体の架橋、ゲル化に際して含有す
る酵素の活性が低下し、また反応基質の重合体中での透
過拡散移動性が悪いので、固定化された酵素の反応に対
する有効性に乏しいなどの欠点を有している。

一方、膜材料の分離機能を利用して膜材料に酵素を固定
化し、酵素反応と生成物分離を同時に処理出来る複合機
能膜の研究も行われており、食品工業界においては多Ｐ
ｉ類の加水分解による単糖化や、蛋白質の加水分解によ
る低ペプチド化、及びこれらの分離操作などに大きく貢
献するものとして期待される。

しかし、単に膜表面に酵素を固定化したり、膜内に酵素
を封入するだけでは、前記担体結合法や包括法と差異は
なく、生成物の分離操作を同時に行えるという機能を付
与するにすぎず、酵素活性の高いものが得られていなか
った。

〈発明が解決しようとする問題点〉 従って、本発明の第１の目的は、酵素の固定化量が多（
、且つ高活性に維持出来て基質との反応生成物、特に高
分子基質との反応生成物である低分子生成物の分離機能
に優れた酵素固定膜を提供することにある。

本発明の第２の目的は、上記酵素固定膜を効率よく製造
するための方法を提供することにある。

さらに本発明の第３の目的は、得られた酵素固定膜を利
用して、基質溶液が迅速に且つ効果的に分配されて酵素
反応を受け、性能良く反応生成物が分離されるための酵
素反応装置を提供することにある。

〈問題点を解決するための手段〉 本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を行
った結果、緻密層と多孔質層とからなる非対称性膜の多
孔質層に、加圧条件下にて特定の水溶性高分子及び酵素
の溶液を順次強制透過、含浸させることによって、固定
化された酵素が自由度に優れ、酵素活性が非常に高い酵
素固定膜が得られることを見出し、本発明に至ったもの
である。

即ち、本発明の酵素固定膜は、微細孔を有する緻密層と
、これを担持する比較的粗な空隙を有する多孔質層から
なる非対称性膜の多孔質層に、少なくとも２個の官能基
を有する水溶性高分子を介して酵素が共有結合されてお
り、且つ該水溶性高分子が実質的に三次元化せずに結合
されていることを特徴とするものである。

さらに、かかる酵素固定膜を得る好適な製造態様は、微
細孔を有する緻密層と、これを担持する比較的粗な空隙
を有する多孔質層とからなる非対称性膜の多孔質層に、
少なくとも２個の官能基を有する水溶性高分子水溶液を
加圧条件下にて強制透過させ、多孔質層に該水溶性高分
子を共有結合させる第１工程と、前記工程より低い加圧
条件下にて酵素溶液を強制透過させ、水溶性高分子末端
に酵素を共有結合させる第２工程とを含むものである。

本発明において用いられる非対称性膜は、逆浸透膜また
は限外濾過膜として分画分子量が５００〜１０００００
の性能を有する緻密層と、該層を担持する孔径数μｍ〜
１００μｍの多孔質層とからなるものであり、平板状、
管状、中空糸状など酵素反応装置に応じて形状は任意に
選択することが出来る。好ましくは、有効膜面積を大き
くし、固定化された酵素と基質との接触を多くするため
に中空糸状膜とすることが望ましい。

非対称性膜に用いる材料としては、後述する水溶性高分
子の官能基と反応しうる官能基を有するものであればよ
く、これら官能基は製膜前または後に専大しても良い。

また、膜材料中に存在せしめる官能基の量は鹸化処理や
、加水分解処理の程度に応じて任意に変化させることが
出来るので、固定化させる酵素量によって適宜設定出来
る。このような膜材料としてはフィルム形成能を有する
ものが選ばれ、例えば水酸基を有するものとしてアセチ
ルセルロース、プロピオン酸セルロースの如きセルロー
スＰｃ、１体及びその鹸化物、エチレン−酢酸ビニル共
重合体の鹸化物、ポリビニルアルコールなどが挙げられ
、アミノ基やカルボキシル基を有するものとしてポリア
ミドやポリイミドの加水分解物などが挙げられる。その
他エチレンー酢酸ビニルーアクリル酸三元共重合体、及
びその鹸化物、ポリアクリロニトリルの加水分解物など
が使用できる。特に、本発明において膜製造の安定性の
点からエチレン−酢酸ビニル共重合体の鹸化物、ポリア
ミドの加水分解物が好ましく、さらに前者の場合は酢酸
ビニル単位が２０〜９７重量％で、酢酸ビニル単位の８
０モル％以上が鹸化されているもの、後者ではアミド結
合の１０％以下を加水分解したものが酵素固定膜の製造
における加圧下での各種溶液の強制透過に際する膜強度
や親水性の点から望ましいものである。

上記非対称性膜は既知の方法で製造することが出来る。

その−例としては、上記膜材料を水と混和しうる極性有
機溶剤、例えばジメチルスルホキシド、ジメチルホルム
アミド、ジメチルアセトアミド、フェノール、クレゾー
ル、エチレンクロルヒドリン、エチレングリコール、プ
ロピレングリコール、セルソルブ、グリセリン、メタノ
ール、エタノール、プロパツール、ブタノール、アセト
ン、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのうち一種以
上に溶解せしめたのち、主として水からなる凝固液と接
触させて各種形状の非対称性膜とすることが出来るが、
緻密層と多孔質層を有する非対称性膜であれば如何なる
方法、形状のものであっても本発明の技術を適用するこ
とが出来る。

本発明の酵素固定膜を製造する一例を示すと、第１工程
として上記で得られた非対称性膜の多孔質層に、少なく
とも２個の官能基を有する水溶性高分子水溶液を加圧条
件下にて強制透過せしめ、多孔質層に該水溶性高分子を
共有結合させるが、このような水溶性高分子としては、
例えばポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポ
リエチレンイミンノの如きポリアルキレンイミン、ポリ
エチレングリコール、ポリプロピレングリコールの如き
ポリアルキレングリコール、ポリリジン、ポリアルギニ
ンの如きポリアミノ酸、ポリアリルアミンなどが挙げら
れ、通常、重量平均分子量が約１０００〜２０００００
、官能基数が数十〜数百のものが好ましく、使用する酵
素の種類や膜材料の種類、膜の形状に応じて適宜選択す
ることが出来る。

上記水溶性高分子の水溶液を多孔質層に強制透過させる
にあたり、該水溶液の溶質濃度は０．１〜１０重景％、
好ましくは０．５〜５重量％の範囲に調製することが望
ましく、１０重量％を越えた場合は溶液粘度が高くなる
ので強制透過中に水溶性高分子同士が反応を起こし、三
次元化してゲル化状態となり、第２工程で酵素溶液を強
制透過させる際に透過障害となるだけでなく、多孔質層
に結合した水溶性高分子末端への確実な酵素固定が出来
ない場合がある。また、０．１重量％に満たない希薄溶
液の場合は多孔質層への水溶性高分子の結合量が少なく
なり、第２工程での酵素の結合が少なくなるので単位面
積当たりの酵素活性が低（なる傾向を生じる。

また、水溶性高分子水溶液を強制透過させる場合の加圧
条件としては、０．１〜２ｋｇ／ｃｊ、さらに０．１〜
１．０ｋｇ／ｃｎｌの範囲が好ましく、高加圧下での強
制透過の場合、多孔質層内部、特に緻密層側に水溶性高
分子の圧密化が生じるために均一な眼疾状態を維持出来
ず、酵素反応によって得られた反応生成物の透過障害が
生じたり、多孔質層内部での結合されたスペーサーとし
ての水溶性高分子鎖の易動性が悪くなり、酵素反応に悪
影響を及ぼすこととなる。加圧条件が低すぎると水溶性
高分子の含浸に時間がかかったり、多孔質層に対する該
高分子の均一な結合が出来ず、表層部分、即ち原液側表
面のみへの結合が多くなり酵素固定膜として有効な結合
が出来なくなることがある。

第１工程において、前記水溶性高分子の水溶液を非対称
性膜の多孔質層に強制透過させて、該層内部に共有結合
させるが、結合方法は膜材料が既に官能基を有する場合
は、直接に水溶性高分子を共有結合させても良く、また
官能基を有さない膜材料の場合は、活性化処理したのち
に水溶性高分子を共有結合させるという間接的な方法で
も良いが、公知の何れの方法、例えば結合反応に関与す
る官能基として多孔質層内に存在する水酸基をエピクロ
ルヒドリンで活性化させて水溶性高分子の水酸基と結合
させる方法、トリクロロトリアジン、臭化シアン、ジア
ルデヒド化合物などで活性化させてアミノ基と結合させ
る方法、アミノ基同士をジアルデヒド化合物、ジイソシ
アネート化合物、ジイソチオシアネートなどで結合する
方法、アミノ基とカルボキシル基を水溶性カルボジイミ
ドなどで結合する方法などがあり、膜材料や水溶性高分
子の有する官能基の種類に応じて適宜選択することが出
来る。これらの結合試薬は予め非対称性膜の多孔質層に
作用させ、活性化させたのちに水溶性高分子水溶液を加
圧条件下にて強制透過させるか、該高分子水溶液を多孔
質層に加圧条件下にて強制含浸せしめたのちに結合試薬
を作用させる方法の何れでもよいが、多孔質層への水溶
性高分子の結合効率の向上、均質な結合、水溶性高分子
同士の三次元結合に伴うゲル化の防止のためには前者の
方法が好ましい。

本発明の酵素固定膜を製造するに当たり、第２工程にて
使用する酵素は特に制限はないが、該固定膜を利用した
反応装置として多Ｗ類や蛋白質の加水分解に用いること
が有用である。このような高分子基質に作用して低分子
物質を生成する酵素として、例えばα−アミラーゼ、グ
ルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼの如き多［
８加水分解酵素、パパイン、ペプトン、トリプシン、キ
モトリプシン、プロメラインのごとき蛋白質加水分解酵
素、リゾチーム、ザイモリアーゼの如き細胞壁溶解酵素
などが挙げられ、これらを二種類以上併用して用いるこ
とも出来る。

上記酵素を含む溶液は第１工程にて得られた水溶性高分
子を結合した非対称性膜に加圧条件下にて強制透過させ
て水溶性高分子末端に酵素中のアミノ酸残基の官能基と
共有結合させるが、この場合の結合方法は、前記多孔質
層と水溶性高分子との結合方法に記載した方法に準じて
行なうことが出来る。

酵素溶液の強制透過に際しての加圧条件は、第１工程よ
りも低い加圧条件下、好ましくは０．１〜０．５ｋｇ／
ｃｄの範囲とする。加圧度合が大きすぎると既に結合さ
れている水溶性高分子が圧密化された層を新たに形成し
たり、三次元化してゲル化を生じたりするために、基質
溶液を透過させて酵素反応をさせる場合に、基質の透過
移動の障害となり、固定化した酵素を反応に有効的に活
用させることが出来なくなる。

本発明によって得られた酵素固定膜は、基質溶液を透過
させて反応生成物を得る目的で使用するが、該固定膜を
有効に利用するためにはモジュール化して酵素反応装置
とすることが好ましく、例えば平板型、管状型、スパイ
ラル型、中空糸型などの形状にして用いることが出来る
。このような酵素反応装置は、基質溶液、特に高分子基
質溶液を反応原液として流入させると、本発明によって
得られた酵素固定膜が高活性で、且つ高濃度に酵素固定
されているので、基質溶液は迅速に、且つ効果的に非対
称性膜の多孔質層に分配されて酵素反応が生じ、反応生
成物を反応装置外に流出させることが出来る。この時の
基質溶液の透過圧は確実な酵素反応のために酵素溶液透
過時と同程度にすることが好ましく、０．１〜０．５ｋ
ｇ／ｃＩ１１の範囲で使用することが望ましい。

これらの酵素反応装置の一例を示すと、内径約０、３　
＋ｕ〜１１１、長さ数十ａ〜数ｍの中空糸膜を数百本な
いし数千本の単位で束ねて、中空糸状限外濾過膜装置と
したものが挙げられ、中空糸膜外側の多孔質層に酵素を
固定化して膜外側に基質溶液を送液し、生成物を含む透
過液を膜内側から得るようにする。このとき、中空糸膜
としては内側への圧力に耐えうるちのが望ましい。

また、スパイラル型限外濾過膜装置も単位面積当たりの
膜面積を大きくできるので酵素反応装置としての有効で
あり、この装置も前記反応装置と同様に通常多孔質層側
から反応基質溶液を送液し、緻密層側から生成物を含む
透過液を回収するようにして連続反応を行うことができ
るものである。

〈発明の効果〉 以上のように、本発明の酵素固定膜は、微細孔を有する
緻密層と、比較的粗な空隙を有する多孔質層とからなる
非対称性膜の多孔質層に水溶性高分子を介して酵素が固
定化されているので、該酵素は大きい活性を存するよう
に自由度が確保されていると共に、基質溶液との反応に
際しての酵素の溶出がないので、高活性を維持したまま
で長期間の使用に耐えうるものである。また、本発明の
製造方法によれば、ゲル化させることなく加圧条件下に
て段階的に酵素固定膜を製造できるので、多孔質層へ水
溶性高分子を確実に、且つ短時間で結合出来、酵素も多
孔質層内部に確実に、且つ高濃度に固定化される。従っ
て、本発明の酵素固定膜は基質溶液の大量処理及び分離
を短時間で達成出来るものである。

〈実施例〉 以下に本発明の実施例を示し、さらに詳しく説明するが
、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲で種々の応用が
可能である。

実施例Ｉ エチレン−酢酸ビニル共重合体（酢酸ビニル単位含量８
７重量％）の酢酸ビニル単位の９８モル％鹸化物をジメ
チルスルホキシドに溶解し、２０重量％溶液としてガラ
ス板上に３００μｍの厚みに塗布した。これを５０℃の
水中に１時間浸漬したのち、冷水で洗浄して分画分子量
致方の非対称性膜を得た。次いで、この非対称性膜をガ
ラス板より剥離し、１０重量％グルタルアルデヒドを含
むＩＮ塩酸水溶液で４０°Ｃにて一晩処理したのち、洗
浄して表裏を逆にしてポリエチレン不織布からなる多孔
性支持体板上に貼り付け、さらに円形に切り抜いて限外
法適用透過セルに固定した。

得られた非対称性膜を設置したセルを用いて、第１工程
として１．５重量％のポリエチレンイミン水溶液（重量
平均分子量７００００，１分子当たりの官能基数約４０
０）を０．５　ｋｇ　／　ｃｎＴの加圧条件下にて１５
分間多孔質層側から強制的に透過、含浸させて遊離のア
ルデヒドと反応させ、多孔質層にポリエチレンイミンを
共有結合させた。この円形平膜を充分に水洗したのち、
第２工程として２■／ｍｌのグルコアミラーゼ溶液（り
ん酸緩衝液、ｐ　Ｈ６，５）を０．３　ｋｇ／ｄ（Ｄ加
圧条件下にて１０分間多孔質層側から強制的に透過、含
浸させ、次いで２．５重量％グルタルアルデヒド溶液（
りん酸綴衝液、ｐ　Ｈ６，５）を０．２　ｋｇ　／　ｃ
＋＋Ｉの加圧下にて多孔質層側から１時間透過させてポ
リエチレンイミン末端にグルコアミラーゼを共有結合に
て固定化し、２Ｍ塩化すｌ−ＩＪウム水溶液、酢酸緩衝
液の順で充分に洗浄して本発明の酵素固定膜とした。

得られた酵素固定膜を限外濾過用セルに設置し、１重量
％可溶性澱粉（０，１Ｍ＃酸緩衝液、ｐ　Ｈ５゜２）を
多孔質層側から４０℃、０．２ｋｇ／ｃｎｌの加圧下に
て透過させて酵素反応を行った。

透過液中の還元糖濃度、グルコース濃度をそれぞれＳｏ
ｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法、グルコスタット法で測定
した結果を第１図に示した。

実施例２ 非対称性の多孔質膜として分画分子量約５００００の中
空糸状限外濾過膜（膜材質ポリアミド、外径１．０龍、
内径０．６ｍ）のモジュール（有効膜面積１．８６ｍ）
の外側から３Ｎ塩酸水溶液を５０°Ｃ１０，２ｋｇ／ｃ
ｏｔの加圧下にて２時間透過させ、該濾過膜を加水分解
した（加水分解率０．５％）。

得られた非対称性膜に充分に水を透過して洗浄したのち
、第１工程として２重量％のポリエチレンイミン水溶液
（重量平均分子量７００００．１分子当たりの官能基数
約４００）を０．３ｋｇ／ｃｒｌの加圧条件下にて１０
分間、膜外側（多孔質層側）から強制的に透過、含浸さ
せ、次いで２．５重量％のグルタルアルデヒド水溶液を
１時間、０．３ｋｇ／ｃａｔの加圧下にて室温で透過さ
せることによって、゛　多孔質層にポリエチレンイミン
を共有結合させ、さらにポリエチレンイミン末端のアミ
ノ基を活性化させた。

次ぎに、膜内部より０．３に＋ｒ／−の加圧条件下にて
水を２時間透過、洗浄したのち、さらに第２工程として
２■／　ｍ　ｌのトリプシン溶液（０，１Ｍりん酸緩衝
液、ｐ　Ｈ７，０）を０．２ｋｇ／ａｎｔの加圧条件下
にて１０分間、膜外側（多孔質層側）から強制的に透過
、含浸させてポリエチレンイミン末端にトリプシンを共
有結合にて固定化し、２Ｍ塩化ナトリウム水溶液、りん
酸緩衝液の順で充分に洗浄して本発明の酵素固定膜とし
た。

得られた酵素固定膜に１重量％カゼイン水溶液（５０ｍ
Ｍりん酸緩衝液、ｐ　Ｈ７，０＞を膜外側（多孔質層側
）から３５℃、０．２ｋｇ／ｃｎｒの加圧下にて透過さ
せて連続的に酵素反応を行った。

透過液は、５重量％トリクロロ酢酸で沈澱物を生じず、
２８０ｎｍでの吸光度やＬｏｗｒｙ法などから０．６重
量％（反応率６０％）の低ペプチドが連続的に生成され
ていることが確認された。

以上の各実施例から明らかなように、本発明の酵素固定
膜は酵素活性が非常に高く、効率良く生成物が得られ、
且つ生成物分離能に優れたものであった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１にて得られた酵素固定膜の活性を測
定したものであり、可溶性澱粉の分解反応によって得ら
れる還元糖およびグルコースの濃度と反応時間との関係
を図示したものである。 第１図 又丸爵間（ん）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）微細孔を有する緻密層と、これを担持する比較的
   粗な空隙を有する多孔質層からなる非対称性膜の多孔質
   層に、少なくとも２個の官能基を有する水溶性高分子を
   介して酵素が共有結合されており、且つ該水溶性高分子
   が実質的に三次元化せずに結合されていることを特徴と
   する酵素固定膜。
2. （２）非対称性膜が酢酸ビニル単位２０〜９７重量％よ
   りなるエチレン−酢酸ビニル共重合体膜の鹸化物であり
   、且つ酢酸ビニル単位の８０モル％以上が鹸化されてい
   る特許請求の範囲第１項記載の酵素固定膜。
3. （３）非対称性膜がポリアミド膜であり、且つアミド結
   合の１０％以下が加水分解されている特許請求の範囲第
   １項記載の酵素固定膜。
4. （４）酵素が高分子基質分解酵素である特許請求の範囲
   第１項記載の酵素固定膜。
5. （５）微細孔を有する緻密層と、これを担持する比較的
   粗な空隙を有する多孔質層とからなる非対称性膜の多孔
   質層に、少なくとも２個の官能基を有する水溶性高分子
   水溶液を加圧条件下にて強制透過させ、多孔質層に該水
   溶性高分子を共有結合させる第１工程と、前記工程より
   低い加圧条件下にて酵素溶液を強制透過させ、水溶性高
   分子末端に酵素を共有結合させる第２工程とからなる酵
   素固定膜の製造方法。
6. （６）非対称性膜が酢酸ビニル単位２０〜９７重量％よ
   りなるエチレン−酢酸ビニル共重合体膜の鹸化物であり
   、且つ酢酸ビニル単位の８０モル％以上が鹸化されてい
   る特許請求の範囲第５項記載の酵素固定膜の製造方法。
7. （７）非対称性膜がポリアミド膜であり、且つアミド結
   合の１０％以下が加水分解されている特許請求の範囲第
   ５項記載の酵素固定膜の製造方法。
8. （８）酵素が高分子基質分解酵素である特許請求の範囲
   第５項記載の酵素固定膜の製造方法。
9. （９）第１工程において強制透過させる少なくとも２個
   の官能基を有する水溶性高分子水溶液の溶質濃度が０．
   １〜１０重量％である特許請求の範囲第５項記載の酵素
   固定膜の製造方法。