JPS63177790A - 酵素固定膜の再生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は酵素固定膜の再生方法に関するものである。

〈従来の技術〉 近年、酵素反応を利用した工業的規模での実施は医薬晶
子食品工業の分野で盛んに行なわれているが、酪素自体
の価格が高価なことや、溶液状態にて使用した場合に反
応後に２ける生成物と酵素の分離や回収が困難であるこ
となどの問題点から、担持体に酵素を固定する、所謂固
定化酵素の手法が種々検討されている。

反応生成物と酵素の分離を酵素反応と同時に処理できる
方法として限外濾過膜の如き膜を利用した方法が研究さ
れており、精密分離精製の前処理として分子分画による
粗分離処理が極めて容易になるものとして注目されてい
る。その一つとして、酵素を固定したメンブレンリアク
ターが提案され、酵素を異方性限外濾過膜の多孔質部に
閉じ込めて被覆を施とす方法（特開昭５９−２５６８６
号公報）や、多孔質部に酵素をデルと共に封入包括する
方法（特公昭５７−／１１２３８号公報）などが開示さ
れているが、いずれも酵素を安定に保持することができ
ず、安定に保持できる膜が開発されていないのが現状で
ある。

一方、酵素を安定に保持した酵素固定膜として、異方性
限外濾過膜の多孔質層に少なくとも２個の官能基を有す
る水溶性高分子を架橋状態に保持し、且つ該官能基を介
して酵素を共有結合してなる酵素固定膜も庇に提案され
−Ｃいる（特願昭６０−２２５４３５号）。

〈発明が解決しようとする問題点〉 しかし、上記いずれの方法で得られるひ素固定膜を採用
しても長期間にわたって連続酵素反応を行なった場合に
は酵素活性の低下や膜面へ付着するケーク層による透過
流束の低下が徐々に生じるようになり、その結果酵素反
応阻害が起こるようになる。

通常、ケーク層の付着等は逆洗性を行なうことによっで
ある程度解消され透過流束の回復を行なえるが、酵素が
失活した場合は回復の術がなく膜交換もしくは酵素の除
去、再固定する必要が生じる。ところが、膜交換におい
てはモジュール内から取り外して交換を行なうため作業
が煩雑、且つコスト高となり、また、酵素の除去および
再固定においては共有結合法にて膜担体に酵素固定をし
ていると酵素を除去する際に膜担体を損傷し、酵素の再
固定に支障をきたすようになり、好ましくないとされて
いるう く問題点を解決するための手段〉 そこで、本発明者らは上記問題点に鑑み、長期間にわた
る連続酵素反応を行なうに際し、膜交換を行なわずとも
通常の逆洗性工程によって酵素固定膜の再生を簡単に行
なえる方法を見い出すべく検討を重ねた結果、異方性限
外濾過膜の多孔質層に、少なくとも２個の官能基を有す
る水溶性高分子が一部官能基を残した架橋状態で保持さ
れ、且つ該官能基を介して酵素が共有結合されてなる酵
素固定膜においては次亜塩素酸すｈ　ＩＪウム処理、場
合によりさらに塩酸処理を行なうことで水溶性高分子お
よび酵素が比較的簡単に除去でき、膜担体の損傷も生じ
ないことが判明した。

従って、本発明の目的は長期間の連続酵素反応に使用し
て固定化された酵素の失活や膜汚染のために生産性の低
下した酵素固定膜を、使用前と同程度の高活性で且つ高
い透過流束を有する酵素固定膜に再生する方法を提供す
ることにある。

本発明において再生可能な酵素固定膜に用いる異方性限
外濾過膜は、分画分子量が１．０００〜１．０００，０
００の性能を有する緻密層と、該層を担持する孔径が数
μｍ〜１００μｍの多孔質ｌ−とからなるものであり、
その形状は平板状、管状、中空糸状など任意に選択する
ことができる。好ましくは有効膜面積を太きくし、固定
化された酵素と基質との接触面積を犬きくするために中
空糸状膜とすることが望ましい。

上記限外濾過膜を製造するに際して用いる材料は、後述
する水溶性高分子や酵素と反応するような官能基を特に
有する必要はなく、耐塩素性に優れ異方性限外濾過膜と
して製膜できるものであれば特に制限はない。これらの
膜材料のうち、食品や医薬品の製造工程において要求さ
れる厳格な分画分子量や耐熱性、機械的強度を満足する
ものとして、ポリスルホン膜が好適に使用できる。

上記異方性限外濾過膜は既知の方法で製造することがで
きる。その−例としては上記膜材料を水と混和しうる極
性有機溶剤、例えばジメチルスルホキシド、ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルアセトアミド、フェノール、クレ
ゾール、エチレンクロルヒドリン、エチレングリコール
、プロピレングリコール、セルソルブ、グリセリン、メ
タノール、エタノール、プロパツール、ブタノール、ア
セトン、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのうち一
種以上に溶解せしめたのち、主として水からなる凝固液
と接触させることによって接触界面に緻密層を有する名
種形状の異方性限外濾過膜とすることができるが、緻密
層と多孔質層を有する異方性限外濾過膜であれば如何な
る方法、形状のものであっても本発明の技術を適用する
ことができる。

本発明の再生方法を適用する酵素固定膜は上記で得られ
た異方性限外濾過膜の多孔質層に、少なくとも２個の官
能基を有する水溶性高分子を加圧条件下にて含浸し、架
橋剤によって架橋せしめるが、このような水溶性高分子
としては、例えばポリエチレンイミン、ポリプロピレン
イミン、ポリブチレンイミンの如きポリアルキレンイミ
ン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコー
ルの如きポリアルキレングリコール、ポリリジン、ポリ
アルギニンの如きポリアミノ酸、ポリアリールアミンな
どが挙げられ、通常、重量平均分子量が約１，０００〜
２００，０００、官能基数が数十〜数百のものが好まし
く、使用する酵素の種類や膜材料の種類、膜の形状に応
じて適宜選択することが出来る。これらの水溶性高分子
のうち、ポリエチレンイミンは官能基数の調節が容易で
、反応性も高いので好適に用いることができる。

上記水溶性高分子の溶液を異方性限外濾過膜の多孔質層
に含浸するにあたり、該溶液の溶質濃度は１重量％以下
、好ましくは０．０５〜０．２５重量％の範囲に設定す
る。溶質濃度が１重量％を超えた場合は溶液粘度が高く
なり、含浸した水溶性高分子が膜孔を閉塞し、基質溶液
の透過水量が低下して限外濾過性能が低下することがあ
ろうまた、水溶性高分子の溶液を含浸する場合の加圧条
件と１〜ては限外濾過膜の多孔質層側と緻密層の圧力差
が０．１〜１　ｋ！７／ｃ、Ｉ、さらに０．１〜０．５
　ｋｇ／、４の範囲が好ましく、高加圧下での含浸では
多孔質層内部、特に緻密層側に水溶性高分子の圧密化が
生じ、膜孔を閉塞する恐れがある。また加圧条件が低く
すぎると水溶性高分子の多孔質層への含浸に時間がかか
ったり、多孔質層全体への均一な含浸を行ない難く、表
層部のみへの含浸となり酵素の結合量の低下を招く恐れ
がある。

上記の如く含浸を行なった水溶性高分子は異方性限外濾
過膜の多孔質層に保持されるが、数回の膜洗浄操作によ
って不純物質や極度に低分子量の水溶性高分子が除去さ
れる。しかるのち架橋剤溶液を前記水溶性高分子溶液含
浸時の加圧条件範囲内、通常は前記と同条件下にて多孔
質層側から透過せしめて前記水溶性高分子を架橋せしめ
る。このような架橋手段を施こすことによって水溶性高
分子は三次元化して不溶化し、分子のかさげりゃ立体障
害が大きくなるので、異方性限外濾過膜の膜自体に結合
せずとも多孔質層の孔内に保持することができ、後の逆
洗浄によっても流出しないものとなる。

このような架橋剤としては、グリオキサール、グルタル
アルデヒド、アジピンアルデヒド、マロンジアルデヒド
、ジアルデヒド澱粉の如きジアルデヒド類、ヘキサメチ
レンジイソシアネート、トルエンジイソシアネートの如
きジイソシアネート類、ヘキサメチレンジイソチオシア
ネートの如きジイソチオシアネート類などが挙げられ、
水溶性高分子にポリアミノ酸を使用した場合には水溶性
カルボジイミドなどの縮合試薬を用いることもできる。

これらのうち、特にジアルデヒド類は水溶液中で比較的
安定で反応性も高いために好適に用いることができる。

上記架橋剤は溶液状態で使用するが、水溶性高分子中の
官能基量と該架橋剤中の官能基量とのモル濃度比を２〜
５０、好ましくは６〜２０とすることによって、のちに
酵素と結合する官能基量を充分に残存させることができ
る。また、用いた架橋剤の官能基を一部利用してのちに
酵素を結合させることもできるが、この場合は上記量の
１．５〜２０倍量の架橋剤を用いることが望ましい。

次に異方性限外濾過膜の多孔質層に水溶性高分子を含浸
、架橋したのち、緻密層側から通常の洗浄処理である逆
洗浄によって多孔質１凶に残存する未架橋の水溶性高分
子を除去する。しかるのち酵素溶液を多孔質層側より透
過させて前記水溶性高分子の官能基を介して共有結合さ
せる。

前記水溶性高分子はその分子末端や側鎖にアミノ基、カ
ルボキシル基、ヒドロキシル基などの官能基を有してい
るので、既知の手法を用いて酵素が有する官能基と直接
、または前記架橋剤やカップリング剤によって間接的に
共有結合させる　さらに、固定化された酵素の可動性を
太きくし、酵素反応を高めるためにスペーサーを介在さ
せることもできる、 酵素固定膜に固定される酵素としては特に限定されるも
のではないが、限外濾過膜としての分離特性を充分に発
揮するためには多糖類や蛋白質の加水分解に用いる酵素
が有用であり、例えばα−アミラーゼ、グルコアミラー
ゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、ムラミダーゼの如き多
糖類加水分解酵素、パパイン、ペプシン、トリプシン、
キモトリプシン、ブロメライン、プロテアーゼの如き蛋
白質加水分解酵素などが高分子基質から低分子物質を生
成するものとして挙げられる。

上記酵素を含む溶液を透過させるに際しての加圧条件は
、前記水溶性高分子や架橋剤を含浸する時の条件、即ち
０．１〜１に９／ｃ４の範囲に設定し、且つ前記含浸時
の加圧条件以下とする。加圧度合が大きすぎると、既に
保持されている水溶性高分子が圧密化された層を新たに
形成するために、基質溶液を透過させて酵素反応をさせ
る場合に、基質の透過移動の障害となシ、固定化した酵
素を反応に有効活用することができなくなる。

本発明の再生方法は、上記のようにして得られた酵素固
定膜に固定されている酵素を水溶性高分子と共に除去し
たのち、再び上記の方法にて酵素を再固定するものであ
り、酵素および水溶性高分子の除去には次亜塩素酸すｌ
−ＩＪウム水溶液を用いる。

該次亜塩素酸ナトリウム水溶液は酵素固定膜の緻密層側
から多孔質層側へ逆洗性と同様にして透過させて膜面、
特に多孔質層内に付着した汚染物質を除去し、固定化さ
れた酵素および水溶性高分子を除去する。この時の水溶
液の透過は５０〜７０℃の温度下、０．１〜１．５に９
／ｃ４の圧力下にて１〜２０時間程時間外うことが好ま
しく、温度が低すぎ゛ると洗浄能力の低下を生じたり酵
素等の除去を充分に行ない難く、温度が高すぎると限外
濾過膜自体を傷めることになシ膜劣化を早めるようにな
る。

また、上記次亜塩素酸す）−ＩＪウム水溶液の濃度によ
って酵素等の除去効率が異なるが、有効塩素濃度がＳＯ
Ｏ〜１０００　ｐＩ）ｍの範囲に調製した水溶液を用い
ることが除去効率および限外ｆ１１過膜の劣化防止の観
点から好ましいものである。

さらに、本発明においては上記次亜塩素酸ナトリウム水
溶液透過後、引き続いて塩酸を緻密層側から透過させる
ことによって、より確実に水溶性高分子および酵素を除
去することができる。この塩酸は希塩酸を使用すれば充
分であり、好ましくは０．００５〜０．０５規定の濃度
のものを用いる。また、透過条件としては次亜塩素酸す
ｈ　ＩＪウム水溶液の透過時と同様でよく、透過時間は
酵素等の除去率や膜汚染物質の除去の程度によって任意
に設定する。

本発明においては以上のようにして透過流束の低下や酵
素反応効率の低下が生じた酵素固定膜から水溶性高分子
と共に酵素を除去し、固定化前の限外濾過膜の状態まで
戻し１次に該膜の多孔質層側から再度少なくとも２個の
官能基を有する水溶性高分子を含浸したのち、架橋剤水
溶液によって架橋せしめ、さらに酵素水溶液を透過させ
共有結合によって酵素を再固定するのである。

本発明の再生方法によって得られる再生後の酵素固定膜
は高活性および高い透過流束を有する膜となる。

〈発明の効果〉 以上のように本発明の酵素固定膜の再生方法は。

比較的安定性が高く再生が困難とされていた共有結合法
によって得られる酵素固定膜を再生可能としたものであ
る。

即ち、異方性限外濾過膜を固定用担体として用い、多官
能性の水溶性高分子を介して酵素を共有結合した酵素固
定膜においては次亜塩素酸すｌ−ＩＪウム水溶液もしく
は該水溶液と塩酸を併用して逆洗性透過させることによ
って簡単に水溶性高分子を共に酵素を除去することがで
き、長期間連続酵素反応によって酵素活性の低下等が生
じた酵素固定膜を再生することができるものである。

−！た、上記再生方法は膜自体の劣化や他の要因により
劣化、変性するまでは繰り返し採用することができるも
のである。

〈実施例〉 以下に本発明の実施例を示し、さらに詳細に説明するが
、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲で種々の応用が
可能である。

実施例１ ポリスルホン製限外濾適用中空糸状膜（日東電工■製、
ＮＴＵ−３２５０）の小型モジュール（２φ×２０ＣＴ
Ｌ、５７本人、膜面積約２７５ｃｙｔｉ）の多孔質層側
から０．１％重量％濃度のポリエチレンイミン水溶液（
重量平均分子量７０，０００．１分子当りのアミン基数
約４００）を０−３’９／ｃｌｔの加圧下にて約３０分
透過させた。

さらに大量の水を用い同圧下にて洗浄したのち、モジュ
ール全体を４０℃に維持しながら架橋剤として０．１重
量％のグルタルアルデヒド溶液（りん酸緩衝液ｐＨ７，
０）を同加圧下で透過し、多孔質層に保持されているポ
リエチレンイミンを架橋した。

室温下にて逆洗浄を行ない多孔質層に保持されないポリ
エチレンイミンを除去し、次に４０℃にて多孔質層側か
ら２．５重量％のグルタルアルデヒド溶液（りん酸緩衝
液ｐ　Ｈ７，０）　ｋ　０．１　’に９／ｃｉ＆の加圧
条件にて透過し、ポリエチレンイミンのアミノ基を活性
化した。同加圧条件にて洗浄したのち０．２重量％のグ
ルコアミラーゼ溶液（酢酸緩衝液ｐＨ６，０）を２℃で
前記加圧下にて透過し共有結合によって固定化を行ない
、酵素固定膜を得た。

得られた酵素固定膜に１重量％の可溶性澱粉溶液（酢酸
緩衝液ｐＨ６，０）を０．５　ｋ！９／ｃｔｌの加圧下
で供給し、一定期間毎に緻密層側からの逆洗浄を行なっ
て透過流束を出来る限り維持しながら、４０℃にて連続
的に酵素反応を続け、透過流束および生成グルコース量
を測定した。結果を第１図に示した。

第１図から明らかなように、時間の経過と共に生成グル
コース量および透過流束が徐々に低下してくるので、生
成グルコース量および透過流束が初期の約１／２に減少
した時（酵素活性低下時）に、酵素固定膜の緻密１Δ側
から次亜塩累酸すｌ−ＩＪウム水溶液（有効塩素温度約
６００　ｐｌ）ｍ、ＬＡ）を６０℃に加温し、１．Ｏｋ
ｇ／ｃ４の加圧条件にて循環しながら約８時間通洗浄透
過した。次に、０．Ｏ１規定の希塩酸を上記と同様の加
温、加圧条件にて循環しながら約２時間道洗浄透過し、
膜洗浄および水溶性高分子、酵素の除去を行なった。

上記操作により透過流束が回復したポリスルホン製眼外
濾適用中空糸状膜に前記と同様の操作によってグルコア
ミラーゼを再固定化して酵素固定膜を再生した。

再生した酵素固定膜を用いて前記と同様の酵素反応を行
ない、透過流束および生成グルコース量を測定し、その
結果を第１図に示した。

第１図から明らかなように、長期間にわたって酵素反応
を連続的に行なった場合、酵素活性が次第に低下してく
るが１本発明の再生方法によって再び初期と同様の酵素
活性および透過流束が得られることが明らかであり、優
れた再生方法であることが判明した。

実施例２ 実施例１と同様にして得られた酵素固定膜に、１重量％
のマルトース溶液（酢酸緩衝液ｐＨ６，０）を０．５１
Ｖ／ｄの加圧下で供給し、５０°Ｃにて連続的に酵素反
応を続け、透過液中のマルトース量およびグルコース量
を測定した。結果を第２図に示した。

実施例１と比較して酵素活性の低下は緩やかであるが、
次第に低下してくるので、生成グルコース量が初期量の
７割程度となったところで、酵素固定膜の緻密層側から
次咥塩素酸ナトリウム水溶液（有効塩素濃度約６００　
ｐｐｍ、１／ｌ）を６０℃に加温し、０．５に９／ｃＡ
の加圧条件下にて循環しながら約８時間通洗浄透過し、
膜洗浄および水溶性高分子、酵素の除去を行なった。

上記操作により透過流束が回復したポリスルホン製限外
濾適用中空糸状膜に前記と同様の操作によってグルコア
ミラーゼを再固定化して酵素固定膜を再生した。

再生した酵素固定膜を用いて前記と同様の酵素反応を行
ない、透過液中のマルトース量およびグルコース量を測
定し、その結果を第２図に示した。

第２図から明らかなように、本発明の再生方法によれば
酵素活性が初期のものと同程度に回復し、優れた酵素活
性を有する酵素固定膜が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１にて得られた酵素固定膜を再生しなが
ら酵素反応に使用して透過流束およびグルコース生成量
を測定した結果を示し、第２図は実施例２にて得られた
酵素固定膜を再生しながら酵素反応に使用して透過液中
のグルコース量およびマルトース量を測定した結果であ
る。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）異方性限外濾過膜の多孔質層に、少なくとも２個
   の官能基を有する水溶性高分子が一部官能基を残した架
   橋状態で保持され、且つ該官能基を介して酵素が共有結
   合されてなる酵素固定膜の再生方法であって、該固定膜
   の緻密層側から多孔質層側へ次亜塩素酸ナトリウム水溶
   液を、場合により塩酸を続けて透過させて水溶性高分子
   および酵素を除去したのち、多孔質層側から上記水溶性
   高分子、架橋剤水溶液、酵素水溶液を順次透過させるこ
   とを特徴とする酵素固定膜の再生方法。
2. （２）異方性限外濾過膜がポリスルホン膜である特許請
   求の範囲第１項記載の酵素固定膜の再生方法。
3. （３）水溶性高分子がポリエチレンイミンである特許請
   求の範囲第１項記載の酵素固定膜の再生方法。
4. （４）架橋剤がジアルデヒド類である特許請求の範囲第
   １項記載の酵素固定膜の再生方法。
5. （５）次亜塩素酸ナトリウム水溶液が有効塩素濃度５０
   ０〜１０００ｐｐｍである特許請求の範囲第１項記載の
   酵素固定膜の再生方法。
6. （６）塩酸が０．００５〜０．０５規定の濃度である特
   許請求の範囲第１項記載の酵素固定膜の再生方法。