JPS62296876A - 酵素固定膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〈産業上の利用分野〉 本発明は酵素固定膜に関するものである。

〈従来の技術〉 近年、酵素反応を利用した工業的規模での実施は医薬品
や食品工業の分野で盛んである。しかしながら酵素が高
価なことや、溶液状態で使用した場合に反応後の生成物
と酵素との分離や回収が困難であることなどの問題から
、担体に酵素を固定する、所謂固定化酵素の手法が種々
検討されているＯ こハらのうち、反応生成物と酵素の分離を、酵素反応と
同時に行なうことができる方法として限外濾過膜の如き
膜を利用する方法が研究されており、精密分離精製の前
処理として分子分画による粗分離処理が極めて容易にな
るものとして注目されている。その一つとして、酵素を
固定化したメンブレンリアクターが提案され、酵素を限
外濾過膜の多孔質部に閉じ込めて被償を施こす方法（特
開昭５９−２５６８６号公報）や、多孔質部に酵素をゲ
ルと共に封入包括する方法（特公昭５７−４１２３８号
公報）などが開示されている。しかしながら、これらの
方法ではいずれも透過流束や除去率などの模本来の機能
が大幅に低下し、また比較的分画分子量の大きな膜に酵
素を固定化する際、その固定化量が少なくなるという問
題点がある。

〈発明が解決しようとする問題点〉 従って、本発明の目的は酵素の固定化量が多い酵素固定
膜を提供することにある。更に他の目的として、酵素を
高活性に維持できて基質との反応生成物、特に高分子基
質からの反応生成物である低分子生成物の分離機能に優
れた酵素固定膜を提供することにある。

〈問題点を解決するための手段〉 本発明者らは上記目的を連成するために鋭意研究を重ね
た結果、限外濾過膜の多孔質部もしくは精密濾過膜の空
隙部に、特定の水溶性高分子と酵素との複合体を含浸、
保持することによって、酵素の自由度が優れ、酵素活性
が非常に高くなり、且つ模の透過流束も高く維持できる
ことを見い出し５本発明を完成させるて至ったものであ
る。

即ち、本発明の酵素固定膜は限外濾過膜の多孔質部もし
くは精密濾過膜の空隙部に、少なくとも２個の官能基を
有する水溶性高分子に酵素を共有結合させた複合体を保
持してなるものである。

本発明において水溶性高分子と酵素との複合体Ｃ以下、
酵素複合体という）を保持するための限外濾過膜は、緻
密層と多孔質層とからなる選択付透過膜であり、本発明
の酵素固定膜でＶｉ絨密層によって反応生成物を分離す
るものである。該緻密層の分画分子量は１０万〜１００
万の範囲に設定することが特に高分子基質を用いた際に
好ましく、透過流束の点から多孔質層の孔径は０．１　
＝　１１００ｐの範囲とすることが好ましい。

尚、本発明における分画分子量は、異なった分子量のデ
キストランを用いて１．　Ｏ＃／３”、　２５℃の条件
下で透過液中のデキストランを示差屈折計にて定量し、
デキストラン阻止率が９０チのときの分画分子量の値で
おる。

一方、酵素複合体を保持するためのＮ密濾過膜は上記限
外濾過膜と比べ比較的大きな粒子の分離に適した選択性
分離膜であり、本発明では空隙部の孔径を０．１〜１０
０μｍとすることによって、保持させる複合体のｆ＃が
増大でき、効率よ〈酵素反応を行なうことができるので
好ましい。

上記限外濾過膜および精密濾過膜は通常用いられる膜素
材、例えばポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリ
アミド、ポリイミド、酢酸セルロース、ポリアクリロニ
トリル、ポリプロピレンなどが使用できるが、特に厳格
な分画分子量が要求される医薬品や食品工業の分野でに
ポリスルホン。

ポリアミド、ポリイミドを用いることが好まＬ＜。

更に耐熱性や機械的強度の点からはポリスルホン膜が好
適に使用できる。

また上記限外濾過膜および精密濾過膜は設置される装置
によってその形状は平板状、管状、中空糸状など任意に
選択することができる。膜の有効面積を増大せしめ、酵
素複合体の保持量を多ぐして、固定化された酵素と基質
との接触機会をさらに増加させるためには、これらの形
状のうち中空糸状膜とすることが望ましいものである。

本発明において用いられる上記限外濾過膜および精密濾
過膜は通常知ら九でいる方法にて作製することができる
。例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルアセトアミド、フェノール、クレゾール、
エチレンクロルヒドリン、エチレングリコール、フロピ
レンゲリコール、セルソルブ、メタノール、エタノール
、プロパツール、ブタノール、アセトン、ジオキサン、
テトラヒドロフラン、グリセリンなどから選ばれる水と
混和可能な極性有機浴剤の一神もしくはそれ以上の混合
溶剤に、前記ポリスルホンの如き膜素材を溶解してドー
プとｌ−、キャスティングやノズルからの吐出を行なっ
たのち、主として水からなる凝固液と接触させること罠
よって製膜する。製膜時に無機塩やグリセリンの如き膨
潤化剤をドープや凝固液中に添加することによって多孔
質層や空隙部の孔径を所望の大きさに調節することも可
能である。

本発明の酵素固定ｉは上記のようにして得られた限外濾
過膜の多孔質部もしくは精密濾過膜の空隙部に、少なく
とも２個の官能基を有する水溶性高分子に酵素を共有結
合させた複合体を保持させることによって得られるが、
該複合体を構成する水溶性高分子としては、例えばポリ
エチレンイミン、ポリアルキレンイミンの如きポリアル
キレンイミン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレ
ングリコールの如きポリアルキレングリコール。

ポリリジン、ポリアルギニンの如きポリアミノ酸、その
他としてポリアリールアミンなどが挙げられ、通常、重
量平均分子量が約１０００〜２０万、好ましくは７〜１
０万、官能基数が数十〜数百のものが複合体を形成する
うえで効果的であり、使用する酵素の種類や膜素材の種
類、膜の形状に応じて適宜選択することができる。これ
らの水溶性高分子のうち、ポリエチレンイミンやボリア
リールアミンは官能基数の調節が容易であるので共有結
合させやすく好適に用いることができる〇 一方、複合体を構成する酵素としては特に限定されるも
のではないが、本発明の酵素固定膜によって基質と反応
生成物の選択分離特性を充分に発揮させるためには多糖
類や蛋白質の加水分解に用いらねる酵素、例えばα−ア
ミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、セルラー
ゼ、ムラミダーゼの如き多ＯＲ類加水分解酵累、パパイ
ン、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、プロメラ
イン、プロテアーゼの如き蛋白質加水分解酵素−などを
好ましく使用することができる。

上記水溶性高分子および酵素はジアゾ法やペプチド法、
アルキル化法などの共有結合法によって複合体とする。

こ九らの結合法のうち、ペプチド法Ｖｉ酵素の安定性や
反応操作の簡便さの点で好ましく、例えば下記の如くし
て結合を行なうものである。

即ち、水溶性高分子溶液と酵素溶液とを前者の溶質濃度
が１重′ｆチ以下、好ましくｆ′ｉ０．０５〜０．２５
重ｉ％、後者の酵素濃度が２重量％以下、好ましくは０
．０５〜０．２重分チの範囲となるように混合し、次に
縮合試薬として水溶性カルボジイミドを使用酵素の１〜
１００倍モル量、好ましくは１０〜２０倍モル危の範囲
で過剰に添加し、ｐｉ＋を５、５〜６．　ＯＫ維持し７
２　カラ０〜５℃にで１８〜２４時間反応させることに
よって複合体とすることができる○水溶性高分子や酵素
の濃度が高くなりすき゛ると、水溶液状態で得られる複
合体の溶液粘度が高くなり、後述するような選択性透過
膜への含び保持の工程での操作が行ない難くなる場合が
ある０ 本発明の酵素固定膜に前述した限外濾過膜もしくは精密
濾過膜の如き選択性透過膜の空隙部に適度な加圧条件下
、例えば０．１〜ｌ、　Ｑ　ｋｇ／ｃｖ、好ましくは０
．１〜０．５　ｈ／ｃｔ’の範囲で、水浴性高分子と酵
素との複合体の俗液を通過させて含浸保持させて得るこ
とができる。限外濾過膜を用いる場合、多孔質層側から
の通過によって多孔質部への保持が行なえ、精密濾過膜
を用いる場合、前記複合体溶液を繰り返し通過させるこ
とによってその空隙部に付着、保持させることができる
。本発明において複合体は選択性透過膜の空隙部に保持
されるが、基質溶液の透過流束や酵素反応に支障をきた
さない限り、膜の表面部に付着、保持する複合体が存在
してもよいものである。

このようにし、で保持される複合体の量は、酵素活性を
高く維持して効率よ〈酵素反応させるために、膜面積１
ゴ当り０．１〜１００ｇ、好ましくは１０〜３０９に調
節する。

また本発明によれば架橋剤溶液を複合体溶液を通過させ
た条件と同条件下にて通過させ、複合体を架橋して分子
の嵩張りや立体障害を大きくすることによ−７て、酵素
固定膜へ複合体をさらに確実に固定できる。

このような架橋剤としては、グリオキサール、グルタル
アルデヒド、？ｙ−１ビンアルデヒド、マロンジアルデ
ヒド、ジアルデヒド澱粉の如きジアルデヒド類、ヘキサ
メチレンジイソシアネート、トルエンジインシアネート
の如きジイソシアネート類、ヘキサメチレンジイソチオ
シアネートの如きジイソチオシアネート類などが挙げら
れ、水溶性高分子にポリアミノ酸を使用した場合には水
溶性カルボジイミドなどの縮合試薬を用いることもでき
る。これらのうち、特にジアルデヒド類やジインシアネ
ート類は水溶液中で比較的安定で反応性も高いために好
適に用いることができる。

上記架橋剤は溶液状態で使用するが、水溶性高分子中の
官能基量と該架橋剤中の官能基量とのモル＃＃度比を２
〜５０．好ましくｕ６〜２０とすることによって、架橋
剤中の官能基を有効に利用することができる。

〈発明の効果〉 以上のように、本発明の＃素固定膜は限外濾過膜の多孔
質部もしく＃−Ｃ楕密濾過膜の空隙部に、特定の水溶性
高分子と酵素との複合体を保持した構成であるので、多
孔質部の多孔層や、複合体中の結合酵素量が自由に調節
でき、多針の酵素を固定化することが可能となるもので
ある。しかも、固定化畑れた酵素は膜と化学的には結合
していないので、自由度が大きく、高活性を維持できる
ものであり、基質との９℃素反応性が高いものである。

特に、選択性透過膜を酵素の保持担体として使用してい
るので基質と反応生成物との分離機能をも兼備するもの
であり、分離工程が省略でき工業的プロセスにおいて優
れた効果を発揮するものである。

〈実施例〉 以下に本発明の実施例を示し、具体的に説明するが、本
発明の技術的思想を逸脱しない限り種々の変形が可能で
ある。

実施例１ ポリエチレンイミン水溶ｇ（重量平均分子量７万、１分
子当りのアミン基数的４００）とグルコアミラーゼ水溶
液を均一に混合した。水溶液中のポリエチレンイミンと
グルコアミラーゼの鎖式はそれぞれ０．１］ｉｉ１チお
よび０．２貞虹饅であり、この水溶液５００ｇｊに水溶
性カルボジイミド０．１２ｇを添加し、ｐＨを６．０に
維持しながら２℃で１８時間反応を続け、ポリエチレン
イミン−グルコアミラーゼ複合体溶液を得た。

次に、ポリプロピレン製精密濾適用中空糸膜モジー−ル
（日東電工製、ＮＴＭ−９００２−ＣＩ　）の内側から
上記複合体溶液５００ｍ１を２℃で０．３φ・の加圧条
件下、約２４時間循環させ、複合体を充分に含浸、保持
させたのち、逆洗浄のためＫ　ｐＨ６，０の酢酸緩衝液
を２℃、０．５．ψ・の加圧条件下にて透過させて本発
明の酵素固定膜を得た。

得られた醇素固定喚に基質溶液として１重量％の可溶性
澱粉溶液（酢酸４ｉ　＠液ｐＨ６，０）を０．５１９７
ＣＭ”の加圧条件下にて供給して４０℃で酵素反応を続
け、透過液中の還元糖ｔあ・よび全糖量を測定した。結
果を第１図に示す。

実施例２ 実施例１にて得ら九た酵素固定膜に架橋剤として０．０
５ｉ−［％グルタルアルデヒド溶液（すん酸緩衝液ｐＨ
７，０）を２°Ｃｓ　０．５　ｋｑ／ｅｘ・の加圧条件
下にて循環させて空隙部に保持されている複合体を架橋
処理し１次いでｐｉ（６，０の酢酸緩衝液にて逆洗浄を
行なうた。

上記のようにして得られた酵素固定膜に基質溶液として
１重量％の可溶性澱粉溶液（酢酸緩衝液ｐＨ６，０）を
０．５　ｈ／ｃｖの加圧条件下にて供給して４０℃で酵
素反応を続は、透過液中の還元糖量卦よび全糖量を測定
した。結果を第２図に示す。

実施例３ 実施例１にて得られたポリエチレンイミン水溶ＨＩＰ１
００−２０）の多孔質層側から２°Ｃで０．３にφ電の
加圧条件下、約２４時間循環させ、複合体を充分に含浸
、保持させたのち、逆洗浄のためにｐＨ６，０の酢酸緩
衝液を２℃、０．５に一嘗の加圧条件下にて透過させて
本発明の酵素固定膜を得た。

得られた酵素固定膜に基質溶液としてＩＭ量嘱のマルト
ース溶液（酢酸緩衝液ｐＨ６，０）を０．５１９／ＣＭ
”の加圧条件下にて供給して４０℃にて酵素反応を続け
、透過液中のマルトース量およびグルコース量を測定し
た。結果を第３図に示す。

実施例４ 実施例３にて得られた酵素固定膜に架橋剤として０．０
５重量％グルタルアルデヒド溶液（りん酸緩衝液ｐＨ７
，０）を２℃、０，５款優の加圧条件下にて循環させて
多孔質部に保持されている複合体を架橋処理し、次いで
ｐＨ６，０の酢酸緩衝液てて逆洗浄を行な−、た。

上記のようにして得られた酵素固定膜に基質溶液として
１重量％のマルトース溶液（酢酸緩衝液ｐＨ６，０）を
Ｑ、　５　ｋｇ／ｌｙｐの加圧条件下にて供給して４０
°Ｃで酵素反応を続け、透過液中のマルトース量および
グルコース量を測定した。結果を第４図に示す。

実施例５ 実施例１において使用したポリエチレンイミンの代わり
にボリアリールアミンを、グルコアミラーゼの代わりに
グロテアーゼを用いた以外は実施例１と同様の方法でボ
リアリールアミンーグロテアーゼ複合体溶液を得た０ 次にポリスルホン製限外濾適用中空糸膜モジー−ル（ア
ミコン製、ＨＩＰ　１００−２０）の多孔質層側から上
記複合体溶液５００　ｍｌを２°ＣでＱ、　３１ｇ／ｌ
ａｐの加圧条件下、約２４時間循環させ、複合体を充分
に含浸、保持させたのち、逆洗浄のためにｐＨ７，０の
りん酸緩衝液を２℃、０．５ｋＶ／ｃＩ１１の加圧条件
下にて透過させた。

さらに架橋剤として、０．０５　重量％へキサメチレン
ジイソシアネート溶液（りん酸緩衝液ＰＨ７，０）を２
　’Ｃ、０，５ｋｇ／Ｐの加圧条件下にて透過させ多孔
質部に保持されている複合体を架橋処理し、次いでＰＨ
７，０のりん酸緩衝液にて逆洗浄を行ない、本発明の酵
素固定膜を得た。

上記のようにして得られた酵素固定膜に基質溶液として
１重ｔ％の大豆カゼイン溶液（りん酸緩衝液ｐＨ７，０
）を０．５　＃／ｃｔ”の加圧条件下にて循環して４０
℃で酵素反応を続けた。一定時間毎に循環液（基質溶液
）と透過液をサンプリングし、過塩素酸処理（終濃度を
１ＯｔｓＫｖ４整）したのち、６６０大覗での吸光度を
ｍｌｌ定した０同時に、過塩素酸処理しないものの２８
０４＝−＝での吸光度も測定し、結果を第５図に示した
。

各図から明らかなように、本発明の酵素固定膜によれば
酵素反応が効果的に行なわれ、且つ高活性に維持できる
ことが判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１にて得られた酵素固定膜の酵素活性を
測定した結果であり、第２図は実施例２、第３図は実施
例３、第４図は実施例４、第５図は実施例５にて得られ
た酵素固定膜の酵素活性を測定した結果である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）限外濾過膜の多孔質部もしくは精密濾過膜の空隙
   部に、少なくとも２個の官能基を有する水溶性高分子に
   酵素を共有結合させた複合体を保持してなる酵素固定膜
   。
2. （２）限外濾過膜がポリスルホン膜である特許請求の範
   囲第１項記載の酵素固定膜。
3. （３）精密濾過膜がポリプロピレン膜である特許請求の
   範囲第１項記載の酵素固定膜。
4. （４）水溶性高分子がポリエチレンイミンまたはポリア
   ーリルアミンである特許請求の範囲第１項記載の酵素固
   定膜。
5. （５）複合体がジアルデヒドまたはジイソシアネートに
   よって架橋されている特許請求の範囲第１項記載の酵素
   固定膜。