JPH0372881A - 酵素固定用中空糸状膜の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産栗圭立机里光立 本発明は、酵素固定用中空糸状膜の製造方法に関し、詳
しくは、酵素を共有結合にて固定することができるアミ
ノ基を有する酵素固定用中空糸状膜であって、長期間に
わたって保存した後も、当初の高い酵素固定能を保持す
る酵素固定用中空糸状膜の製造方法に関する。

ｋ朱生技歪 近年、酵素反応は、医薬品や食品工業の分野において、
工業的規模にて行なわれているが、酵素自体が高価であ
り、或いは溶液中にて酵素反応を行なったときに、反応
後の生成物と酵素との分離や回収が困難であることから
、水不溶性の担体に酵素を固定した固定化酵素の利用が
すすめられている。

このような固定化酵素の一例として、酵素反応と同時に
、反応生成物と酵素とを分離し得る点から、限外濾過膜
に酵素を固定した所謂膜リアクターが注目されている。

この膜リアクターとしては、特開昭５９−２５６８６号
公報に記載されているように、酵素を異方性の多孔質構
造を有する限外濾過膜の多孔質層に封入したものや、或
いは特公昭５７−４１２３８号に記載されているように
、限外濾過膜の多孔質層に酵素をゲルと共に封入包括し
たもの等が知られているが、しかし、いずれも、酵素を
長期間にわたって安定に保持することができない。

そこで、膜リアクターにおいて、酵素を安定に保持する
ために、官能基を有する膜に、その官能基を利用して酵
素を直接共有結合にて膜に結合し、固定する方法も提案
されている。しかし、この方法には、膜への酵素の固定
時に酵素活性が低下したり、或いは酵素が失活した際の
再生が困難である等の問題があり、従って、このような
膜リアクターも工業的な酵素反応には採用し難い。

他方、膜リアクターの工業的な製造において、官能基を
有する膜が長期間の保存後も、安定して高い酵素固定能
を有することが重要である。例えば、従来、膜に官能基
としてアルデヒド基を有せしめた酵素固定用膜が知られ
ているが、このような膜は、長期間にわたって保存した
場合、アルデヒド基が酸化され、酵素固定能が低下する
。

■が”しようと　る１ 本発明は、従来の膜リアクターにおける上記した問題を
解決するためになされたものであって、長期間にわたっ
て保存しても、酵素固定能の低下がなく、しかも、酵素
を固定したとき、その酵素の活性を長期間にわたって安
定に保持することができる酵素固定用中空糸状膜の製造
方法を提供することを目的とする。

量、　　°　るための 本発明による酵素固定用中空糸状膜の製造方法は、多孔
質構造を有する中空糸状膜の多孔質層に、少なくとも２
つのアミノ基を有する水溶性ボリアくン重合体を物理吸
着させた後、ジアルデヒドにて上記水溶性ポリアミンを
架橋させると共に、部のジアルデヒドを未架橋状態にて
上記水溶性ポリアミンに結合させ、次いで、上記未架橋
状態のジアルデヒドに再度、水溶性ポリアミンを反応さ
せ、結合させることを特徴とする。

即ち、本発明によるかかる酵素固定用中空糸状膜によれ
ば、膜の多孔質層に少なくとも２つのアごノ基を有する
水溶性ポリアミンがジアルデヒドによって架橋されて、
保持されていると共に、このポリアミンに未架橋状態に
て結合しているジアルデヒドを介して、更に、水溶性ポ
リアミンが結合されている。

かくして、酵素は、このように自由度の大きいポリアミ
ンに共有結合にて固定されて、膜リアクターを与える。

本発明において用いる中空糸状膜は、内面又は外面に緻
密層を有する非対称多孔質構造を有する中空糸状膜であ
ってよいが、膜全体にわたってほぼ均一に酵素を固定し
得ることと、酵素の固定時や酵素反応時に目詰まりを起
こさないこと等から、緻密層をもたない実質的に均質な
多孔質構造を有する中空糸状膜であることが好ましい。

更に、本発明において用いる中空糸状膜は、分画分子量
が１０．０００〜５，０００，０００　、好ましくは、
１００．０００〜１゜ｏｏ、ｏｏｏの範囲にあるのが好
ましい。ここに、分画分子量とは、阻止率９０％以上の
ポリエチレンオキサイドの分子量から求められる。

本発明において、中空糸状膜を構成する重合体素材とし
ては、例えば、芳香族ポリスルホン、芳香族ポリエーテ
ルスルホン、芳香族ポリアミド、ポリイミド、酢酸セル
ロース、ポリアクリロニトリル等を挙げることができる
が、これらのなかでも、耐熱性、機械的強度、耐薬品性
等の点から、特に、芳香族ポリスルホンが好ましく用い
られる。

本発明にて膜素材として用いる重合体は、官能基を有す
る必要はない。

中空糸状膜を製造する方法は、既に、種々知られており
、本発明は、中空糸状膜自体の製造方法において何ら限
定されるものではないが、以下、芳香族ポリスルホン中
空糸状膜の製造方法の好ましい一例を挙げる。

芳香族ポリスルホンを溶解する極性有機溶剤と、この溶
剤と混和するが、芳香族ポリスルホンを溶解しない溶剤
（以下、非溶剤という。）との混合溶剤に芳香族ポリス
ルホンを溶解して、製膜溶液を調製し、次に、二重前型
ノズルの外管に製膜溶液を、また、内管に内部凝固液と
しての上記極性有機溶剤と水との混合溶液を通液して、
相対湿度８０％以上の加湿雰囲気中に押し出した後、水
中に浸漬して、脱溶剤、凝固させることによって、本発
明において好適に用い得る芳香族ポリスルホン中空糸状
膜を得ることができる。

上記芳香族ポリスルホンを溶解する極性有機溶剤として
は、例えば、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセドア
ミド等が好ましく用いられ、非溶剤としては、例えば、
エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレ
ングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン等
の脂肪族多価アルコール、メタノール、エタノール、イ
ソプロピルアルコール等の低級脂肪族アルコール、アセ
トン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン等が好
ましく用いられる。これら極性溶剤及び非溶剤は、勿論
、用いる重合体に応じて、適宜に選ばれるものであって
、膜素材として、芳香族ポリスルホン以外の重合体を用
いるときは、上記以外の溶剤を用いることができるのは
いうまでもない。

混合溶剤中の非溶剤の割合は、得られる混合溶剤及び製
膜溶液が均一であれば、特に、限定されるものではない
が、通常、５〜５０重量％、好ましくは、２０〜４５重
量％の範囲である。

また、二重前型ノズルの内管に通液する内部凝固液中の
極性有機溶剤の含有量は、通常、７０〜９０重量％、好
ましくは、７５〜８５重量％の範囲である。極性有機溶
剤の含有量が多いほど、得られる中空糸状膜の内面が多
孔質化するので、中空糸状膜の多孔度を内部凝固液中の
極性有機溶剤の含有量にて調整することができる。

上記二重前型ノズルから製膜溶液及び内部凝固液を加湿
雰囲気中に押出した後、水中に浸漬するまでの空気中走
行距離は、通常、２〜５０ｃｍ、好ましくは、５〜２０
ｃｍである。また、この空気中走行の間の速度は、５〜
５０ｍ／分、好ましくは、１０〜３０ｍ７分の範囲であ
る。

本発明による酵素固定用中空糸状膜は、好ましくは、上
記のようにして得られた芳香族ポリスルホン中空糸状膜
に、少なくとも２つのアミノ基を有する水溶性ポリアミ
ン重合体の水溶液を含浸させて、中空糸状膜の多孔質層
に上記水溶性ポリアミンを物理吸着させ、次いで、中空
糸状膜をジアルデヒドにて処理して、上記水溶性ポリア
ミンを架橋させると共に、一部のジアルデヒドを未架橋
の状態にて上記水溶性ポリアミンに結合させ、この後、
更に、膜に少なくとも２つのアミノ基を有する水溶性ポ
リアミン重合体の水溶液を含浸させることによって、上
記未架橋状態のジアルデヒドのＪ１！離アルデヒド基に
上記水溶性ポリアミン重合体を結合させることによって
得ることができ、かくして、本発明による酵素固定用中
空糸状膜は、酵素を共有結合にて固定するために、アミ
ノ基を有する。

上記したように、ジアルデヒドが未架橋の状態にて水溶
性ポリアミンに結合している状態は、ジアルデヒドが一
方のアルデヒド基にてポリアミンのアミノ基に結合して
いるが、他方のアルデヒド基が遊離の状態にあることを
いい、このように、一部のジアルデヒドを未架橋の状態
にて水溶性ポリアミンに結合させるには、膜の多孔質層
に物理吸着させた水溶性ポリアミンに対して過剰量のジ
アルデヒドにて膜を処理すればよい。

上記少なくとも２つのアミノ基を有する水溶性ポリアミ
ン重合体としては、例えば、ポリエチレンイミン、ポリ
プロピレンイミン、ポリブチレンイミン等のようなポリ
アルキレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン等のよ
うなポリアミノ酸、ポリアリルアミン等を挙げることが
でき、特に、本発明においては、重量平均分子量が約１
０００〜２０００００、分子中のア藁ノ基数が数十乃至
数百であるものが好ましく用いられる。特に、これらの
なかでは、官能基数の調整が容易であり、また、反応性
が高い点から、ポリエチレンイミンが好ましく用いられ
る。

尚、本発明においては、中空糸状膜に水溶性ポリアミン
重合体の水溶液を含浸させ、中空糸状膜の多孔質層に上
記水溶性ポリアミンを物理吸着させる第１段の水溶性ポ
リアミン処理と、次いで、中空糸状膜をジアルデヒドに
て処理して、上記水溶性ポリアミンを架橋させると共に
、一部のジアルデヒドを未架橋の状態にて上記水溶性ポ
リアミンに結合させた後、再度、膜に水溶性ポリアミン
重合体の水溶液を含浸させることによって、上記未架橋
状態のジアルデヒドの遊離アルデヒド基に上記水溶性ポ
リアミン重合体を結合させる第２段の水溶性ボリア５ン
処理とにおけるこれら水溶性ポリアミンは、同じでも、
異なっていてもよいが、第１段における水溶性ポリアミ
ンは分岐構造を有し、第２段における水溶性ポリアミン
は直鎖構造を有するものが好ましい。

第１段及び第２段の処理において、水溶性ポリアミン水
溶液は、濃度が１重量％以下、特に、０゜０５〜０．２
５重量％の範囲にあるのがよい。濃度が１重量％を越え
るときは、溶液粘度が高く、中空糸状膜の多孔質層に水
溶性ボリア主ンが十分に含浸されず、或いは水溶性ポリ
アミンが膜の細孔を閉塞して、透水性能を低下させるこ
とがあるからである。

上記のように、水溶性ポリアミンを中空糸状膜の多孔質
層に含浸させ、吸着させるには、中空糸状膜を水溶性ポ
リアミン水溶液に浸漬する方法や、中空糸状膜の内表面
側又は外表面側から水溶性ポリアミン水溶液を通過させ
る方法等によることができるが、短時間にて水溶性ポリ
アミンを中空糸状膜の多孔質層に含浸、吸着させるには
、加圧下に水溶性ポリアミン水溶液を膜を透過させるの
が好ましい。

このように、加圧下に水溶性ポリアミン水溶液を膜を透
過させるには、圧力は、０．１〜０．５　ｋｇ／ｃｒＢ
の範囲が好ましい。高加圧下にポリアミン水溶液を膜を
透過させるときは、膜の多孔質層内部でボリア５ンの圧
密化が生じて、膜孔を閉塞したり、或いは逆に膜に吸着
されずに、膜を透過するおそれがある。反対に、圧力が
低すぎるときは、ポリアミンの含浸に不必要に長時間を
必要とし、或いは多孔質層全体に均一に含浸させること
が困難である。

更に、加圧下に水溶性ボリアもン水溶液を膜を透過させ
るに際しては、膜の内表面側、外表面側のいずれの側か
らでもよいが、膜リアクターとして中空糸状膜を数百本
乃至数千本束ねてモジュール化する場合は、束ねたそれ
ぞれの中空糸状膜に均一に水溶性ポリアミン水溶液を透
過させるために、内表面側から加圧下に透過させるのが
好ましい。

次いで、このように、水溶性ボリアごン水溶液を多孔質
層に含浸させた後、膜を水洗して、未吸着の水溶性ポリ
アミンや、極度に低分子量のポリアミンを除去すること
によって、膜の多孔質層に水溶性ポリアミン重合体を吸
着状態にて保持させることができる。

本発明によれば、次いで、かかる中空糸状膜をジアルデ
ヒド水溶液に浸漬したり、或いは前述した水溶性ポリア
ミン水溶液を膜に含浸させた際と同じ加圧条件範囲、通
常は、同じ加圧条件下に、水溶性ポリアミン水溶液を透
過させた同じ側から透過させて、前記吸着されている水
溶性ボリア主ンをジアルデヒドにて架橋させる。このよ
うに、水溶性ポリアミンを架橋することによって、水溶
性ポリアミンは三次元化し、水不溶化して、分子の嵩張
りや立体障害が大きくなるので、最早、中空糸状膜の多
孔質層から脱離することがなく、安定に多孔質層に保持
される。

上記ジアルデヒドとしては、例えば、グリオキサール、
グルタルアルデヒド、アジピンアルデヒド、マロンアル
デヒド、ジアルデヒドデンプン等を挙げることができる
が、特に、水溶液中で比較的安定であって、且つ、低廉
であるので、グルタルアルデヒドが好ましく用いられる
。

これらジアルデヒドは、通常、０．５〜１０重量％、好
ましくは、１〜５重量％濃度の水溶液として用いられる
。

このような水溶性ポリアミンの架橋処理の後、中空糸状
膜を未反応のジアルデヒドが検出されなくなるまで洗浄
し、この後、再度、中空糸状膜を前記と同じ条件範囲内
にて水溶性ポリアミン水溶液にて処理して、一部、未架
橋状態にてボリア壽ンに結合しているジアルデヒドに結
合させる。

この後、膜を逆洗浄して、膜の多孔質層に残存する未反
応の水溶性ポリアミンを除去することによって、本発明
による酵素固定用中空糸状膜を得る。

このようにした得られる本発明による酵素固定用中空糸
状膜においては、前記未架橋状態のジアルデヒドに結合
したボリアごンがその分子末端や側鎖にアミノ基を有し
ているので、既に知られている方法によって、このアミ
ノ基に酵素を直接に共有結合にて固定することができ、
或いは適宜の架橋剤やカップリング剤を用いて間接的に
酵素を共有結合にて固定することができる。

本発明にて固定することができる酵素は、特に、限定さ
れるものではないが、しかし、得られる膜リアクターに
おいて、透過膜としての特性をも十分に発揮させる見地
からは、例えば、多糖類やタンパク質の加水分解酵素を
好適に用いることができる。このような酵素としては、
例えば、α−ア箋ラうゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナ
ーゼ、セルラーゼ、ムラ果ダーゼ等の多ｌＪ！！加水分
解酵素、パパイン、ペプシン、トリプシン、キモトリプ
シン、プロメライン、プロテアーゼ等のタンパク質加水
分解酵素等を挙げることができる。

光映生勉果 本発明による酵素固定用中空糸状膜は、以上のように、
膜の多孔質層全体にわたってほぼ均一にポリアミンが架
橋状態にて安定に保持されており、更に、このような架
橋重合体の上にジアルデヒドを介してボリア【ンが結合
されている。

従って、かかる酵素固定用中空糸状膜によれば、酵素を
共有結合にて固定するための官能基として、アミノ基を
有しており、アミノ基は、例えば、アルデヒド基よりも
安定であり、従って、長期間にわたって保存しても、酵
素固定能が殆ど変化しない。

また、未架橋状態のジアルデヒドに結合されているポリ
アミンは、自由度が大きく、従って、かかるポリアミン
に結合された酵素も自由度が高く、かくして、高い活性
を示すので、本発明による酵素固定用中空糸状膜を用い
れば、酵素活性の高い膜リアクターを得ることができる
。勿論、このような膜リアクターによれば、酵素が共有
結合にて固定されているので、長期間にわたる酵素反応
によっても、酵素が膜から離脱せず、従って、長期間に
わたって高い酵素活性を保持する。

更に、本発明による酵素固定用中空糸状膜を用いて得ら
れる膜リアクターに基質溶液を接触させれば、例えば、
前述したような加水分解反応の場合、低分子量の反応生
成物は、容易に膜を透過するので、酵素反応と生成物の
分離を同時に行なうことができ、酵素反応を効率的に行
なうことができる。

遺」１嘲 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例により何ら限定されるものではない。

実施例Ｉ Ｎ−メチル−２−ピロリドン５８重量部とジエチレング
リコール２５重量部との混合溶剤に芳香族ポリスルホン
（ＵＣＣ社製−３５００）１７重量部を溶解させて、製
膜溶液を調製した。

二重管壁ノズルの外管から上記製膜溶液を、また、内管
から内部凝固液として８０重量％のＮ−メチル−２−ピ
ロリドン水溶液を相対湿度９０％、温度４０℃の空気中
にそれぞれ押出し、空気中を速度２０ｍ／分にて１０ａ
ａ走行させた後、温度２５°Ｃの水中に浸漬し、芳香族
ポリスルホンを水中にて脱溶剤、凝固させることによっ
て、内径１．１鵬、外径１．８Ｂの中空糸状膜を得た。

この中空糸状膜は、走査型電子顕微鏡にて観察したとこ
ろ、内表面には０．１〜１．５μｍの孔径を有する不定
形孔が存在し、外表面には孔径０．１５〜０．２μｍの
ほぼ円形の孔が存在する多孔質構造を有することが認め
られた。また、膜の分画分子量は、ポリエチレンオキサ
イドの阻止率から測定した結果、約１００万であった。

上記中空糸状膜６０本を組み込んだ小型モジュール（有
効膜長１５ｃ釘、有効膜面積３００ｃｆｆｌ）を製作し
、膜の内表面側から０．１重量％濃度のポリエチレンイ
ミン（重量平均分子量７００００．１分子当りのアミノ
基数約４００）水溶液を０．３　ｋｇ　／　ｃ＋ｆｌの
加圧下に約３０分間透過させた。

約５１の水を同圧力下に膜を透過させて、膜を洗浄した
後、モジュール全体を４０°Ｃに保持しつつ、１重量％
濃度のグルタルアルデヒド溶液（リン酸緩衝液ｐＨ７，
０）を０．３　ｋｇ　／　ｃｆｆｌの加圧下に透過させ
て、膜の多孔質層に保持されているポリエチレンイミン
を架橋させた。

次に、膜に０．３ｋｇ／ａｆｌの加圧下に純水を通過さ
せて、洗浄水にグルタルアルデヒドが検出されなくなる
まで、洗浄した後、０．０５重量％の前記と同じポリエ
チレンイミン水溶液を０．１　ｋｇ　／　Ｃ４の加圧下
に約３０分間透過させて、遊離アルデヒド基を有するグ
ルタルアルデヒドにポリエチレンイミンを結合させた。

この後、室温下、１　ｋｇ　／　ｃｌｉｌの加圧下に中
空糸状膜の外表面側から純水を通過させて、膜を逆洗浄
し、未反応のポリエチレンイくンを除去して、本発明に
よる酵素固定用中空糸状膜を得た。この膜の２５℃での
純水透過速度は、平均圧力１ｋｇ／ｃｆｆｌ下、２８４
　ｆｉ／ｎ（・時・気圧であった。

上記のようにして得た中空糸状膜に４ｏ″Ｃにて内表面
側から２．５重量％のグルタルアルデヒド溶液（リン酸
緩衝液ｐＨ７，０）を０．１　ｋｇ／Ｃｉの加圧下に透
過させ、膜中に固定されているポリエチレンイミンのア
ミノ基を活性化した。同加圧条件下に膜を水洗した後、
１■／ｍｌ濃度のゲルコア旦ラーゼ溶液２００ｍ１（酢
酸緩衝液ｐＨ５，０）を同加圧条件下に通過させ、ゲル
コア５ラーゼを共有結合にてグルタルアルデヒドのアル
デヒド基に結合させ、かくして、グルコアミラーゼ固定
膜を得た。

このグルコアミラーゼ固定膜の純水透過速度は１４０１
／ｎｌ・時・気圧であった。また、膜の酵素固定に供し
た酵素溶液の酵素固定化前後の酵素タンパク質濃度から
次式 ％式％） （ここに、Ｃ０は酵素固定前の酵素溶液中の酵素タンパ
ク質濃度、Ｃは酵素固定前の酵素溶液中の酵素タンパク
質濃度、■は固定化に供した酵素溶液量） によって求めた酵素固定量は１２５■／モジユールであ
った。

次に、このようにして得た酵素固定膜の内表面側に３重
量％のマルトース溶液（酢酸緩衝液ｐＨ５゜０）を０．
１　ｋｇ　／　ｃｄの加圧下に供給して、５０℃にて酵
素反応を行なわせ、酵素反応開始から３０分後の透過流
束及び透過液中のグルコース濃度からグルコース生成速
度を求めたところ、８４■／分・モジュールであった。

比較例１ 実施例１において、第２段のポリエチレンイ≧ン処理を
行なわなかった以外は、実施例１と同様にして、酵素固
定用中空糸状膜を調製し、これに実施例１と同様にして
、グルコアミラーゼを固定した。得られた酵素固定膜の
純水透過速度は、１４５１／ｒｄ・時・気圧であった。

また、酵素固定量は１２１■／モジユールであった。

この酵素固定膜を用いて、実施例１と同様に、酵素反応
を行なったところ、グルコース生成速度は、４８■／分
・モジュールであった。

実施例２及び比較例２ 実施例１及び比較例１にて得た酵素固定用中空糸状膜を
それぞれ５０″Ｃの温水中にて所定期間保存した後、実
施例１と同じ条件にてグルコアミラーゼを固定し、その
固定量を求めた。

結果を第１表に示すように、実施例１にて得た酵素固定
用中空糸状膜によれば、６か月の保存後も、酵素固定能
には殆ど変化はないが、比較例１にて得た酵素固定用中
空糸状膜は、酵素固定能の経時低下が著しい。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）多孔質構造を有する中空糸状膜の多孔質層に、少
   なくとも２つのアミノ基を有する水溶性ポリアミン重合
   体を物理吸着させた後、ジアルデヒドにて上記水溶性ポ
   リアミンを架橋させると共に、一部のジアルデヒドを未
   架橋状態にて上記水溶性ポリアミンに結合させ、次いで
   、上記未架橋状態のジアルデヒドに再度、水溶性ポリア
   ミンを反応させ、結合させることを特徴とする酵素固定
   用中空糸状膜の製造方法。
2. （２）水溶性ポリアミン重合体がポリエチレンイミンで
   あることを特徴とする請求項第１項記載の酵素固定用中
   空糸状膜の製造方法。
3. （３）ジアルデヒドがグルタルアルデヒドであることを
   特徴とする請求項第１項記載の酵素固定用中空糸状膜の
   製造方法。
4. （４）中空糸状膜が芳香族ポリスルホンからなることを
   特徴とする請求項第１項記載の酵素固定用中空糸状膜の
   製造方法。