JPS6248382A - 酵素固定膜の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は酵素固定膜の製造方法に関するものでおる。

〈従来の技術〉 酵素反応を利用した工業的な実施は医薬品、食品の製造
において一部行なわれており、荷に廣応後における生成
物と酵素の分離、反応後の活性酵素の回収などの点で比
較的操作が簡便である固定化酵素の開発や利用が近年試
みられている。例えば水不溶性の担持体の表面を活性化
し、反応性を高くしたのちに酵素を結合、固定化する担
体結合法や、担持体へ物理的に酵素を吸着させる物理吸
着法、水溶性重合体に酵素を添加せしめたのち架橋手段
によって該重合体をゲル化して酵素を封入する包括法な
どが行われているが、担体結合法では特殊な担持体を必
要とし、ト１つ固定化操作が煩雑なために一般に高活性
の固定化酵素が得られていない。また、物理吸着法によ
る固定化では担持体と酵素との結合が充分ではなく、使
用中に酵素が脱離、流出しやすいので酵累反に：を安定
に行えないという欠点を有している。上記二つの方法と
比べて包括法は比較的固定化操作が簡単であり、工業的
には有用な方法であるが、水溶性重合体の架橋、ゲル化
に際して含有する酵素の活性が低下し、また反応基質の
重合体中での透過拡散移動性が悪いので、固定化された
酵素の反応に対する有効性に乏しいなどの欠点を有して
いる。

−万、膜材料の分９ｓ機能を利用して膜材料に酵素を固
定化し、酵素反応と生成物分離を同時に処理出来る複合
機能膜の研究も行われており、食品工業界においては多
糖類の加水分解による単糖化や、蛋白質の加水分解によ
る低ペプチド化、及びこれらの分離操作などに大きく貢
献するものとして期待される。

しかし、単に膜表面に酵素を固定化したり、膜内に酵素
を討入するだけでは、前記担体結合法や包括法と差異は
なく、生成物の分離操作を同時に行えるという機能を付
与するにすぎず、酵素活性の高いものが得られていなか
ったっ 〈発明が解決しようとする問題点〉 従って、本発明の目的は酵素の固定化量が多く、且つ高
活性に維持できて基質との反応生成物、特に高分子基質
との反応生成物である低分子生成物の分離機能に階れた
酵素固定膜を製造するための方法を提供することにある
。

〈問題点を解決するための手段〉 本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結
果、芳香族ポリアミド高分子に特定の水溶性高分子をス
ペーサーとして結合させて得られる非対称性膜に特定条
件下で酵素を反応させることによって、酵素が膜表面お
よび膜内部に固定化され、酵素活性が非常に高い酵素固
定膜となることを見い出し、本発明に至ったものである
。

即ち、本発明は芳香族ポリアミド高分子の官能基を介し
て少なくとも２個の官能基を有する水溶性高分子を共有
結合させて得られる多官能性高分子単独、もしくは該多
官能性高分子と前記芳香族ポリアミド高分子との混合物
の溶液を製膜して、微細孔を有する緻密層とこれを担持
する比較的粗な空隙を有する多孔質層とからなる非対称
性膜を得る第１工程と、前記工程にて得られた非対称性
膜の多孔質層側から酵素水溶液を加圧条件下にて強制透
過させ、前記水溶性高分子の官能基を介して酵素を共有
結合させる第２工程とからなる酵素固定膜の製造方法に
関するものである。

本発明において用いられる芳香族ポリアミド高分子は分
子内に芳香環を有し、且つアミド結合を有するものであ
シ、分子末端にカルボキシル基及びアミノ基の両方又は
一方を含有するものである。

この芳香族ポリアミド高分子は、本発明によって得られ
る酵素固定膜の膜材料となるものであり、第１工程にお
いてその分子末端にスペーサーとしての水溶性高分子を
共有結合によって結合して多官能性高分子としたのち、
非対称性膜に製膜される。これらの芳香族ポリアミド高
分子としては、例えばアミノベンズヒドラジドと塩化フ
タロイルとの縮重合体、ｍ−フェニレンジアミンと塩化
イソフタロイルとの縮重合体、ｍ−フェニレンジアミン
と塩化ニトロペンゾールとの縮重合体などが挙げられ、
これらの縮重合体は加水分解処理によって容易に分子内
のアミド結合が開裂するので、官能基量を該処理の程度
によって任意に変化させることができる。後述する水溶
性高分子の結合量を増大させるためにはアミド結合の１
０％以下を加水分解することが好ましく、１０％を超え
て加水分解すると、非対称性膜に製膜した際に膜強度が
低下し、第２工程における酵素水溶液の強制透過に際し
、膜破断などが生じる恐れがある。

上記芳香族ポリアミド高分子に共有結合せしめる水溶性
高分子は分子内に少なくとも２個の官能基を有するもの
であり、該高分子は第２工程にて共有結合させる酵素と
の間にてスペーサーとしての役割を果たすものである。

このような水溶性高分子としては、例えばポリエチレン
イミン、ポリプロピレンイミン、ポリブチレンイミンの
如きポリアルキレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニ
ンの如きポリアミノ酸、ポリエチレングリコール、ポリ
プロピレングリコールの如きポリアルキレングリコール
、ポリアリルイミンなどが挙げられ、通常、重量平均分
子量が約１０００〜２０００００、官能基数が数十〜数
百のものが好ましく、使用する酵素の種類によって適宜
選択することができる。

上記水溶性高分子を共有結合させる方法としては前記芳
香族ポリアミド高分子に存在するカルボキシル基又はア
ミノ基と、水溶性高分子に存在するカルボキシル基、ア
ミン基又はヒドロキシル基とを任意に選択し、例えば直
接に結合させるか、或いはアミン基同士の場合はジアゾ
カップリング法や、ジアルデヒド化合物、ジイソシアネ
ート化合物などにて結合させ、アミノ基とカルボキシル
基の場合は水溶性カルボジイミドなどにて結合させるこ
とができ、これらの方法は各官能基の種類に応じて適宜
選択する。

本発明の第１工程においては、前記したように芳香族ポ
リアミド筒分子に水溶性高分子を共有結合した多官能性
高分子単独、もしくは該多官能性高分子と前記芳香族ポ
リアミド高分子との混合物から微細孔を有する緻密層と
これを担持する比較的粗な空隙を有する多孔質層からな
る非対称性膜を得るが、これら非対称性膜は既知の方法
で製膜することができる。その−・例としては、上記膜
材料を水と混和しうる極性有機溶剤、例えばジメチルス
ルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトア
ミド、フェノール、クレゾール、エチレンクロルヒドリ
ン、エチレングリコール、フロピレンゲリコール、セル
ソルブ、グリセリン、メタノール、エタノール、プロパ
ツール、ブタノール、アセトン、ジオキサン、テトラヒ
ドロフランなどのうち一種以上に溶解せしめたのち膜状
に成形し、主として水からなる凝固液と接触させて各種
形状の非対称性膜とすることが出来るが、緻密層と多孔
質層を有する非対称性膜であれば如何なる方法、形状の
ものであっても本発明の技術を適用することが出来る。

第１工程にて得られる非対称性膜は、逆浸透膜または限
外濾過膜として分画分子量が５００〜１ｏｏｏｏｏの性
能を有する緻密層と、該層を担持する孔径数ｐｍ〜１０
０　、ｔｔｒｎの多孔質層とからなるものであり、平板
状、管状、中空糸状など酵素反応装置に応じて形状は任
意に選択することが出来る。好ましくは、有効膜面積を
大きくし、固定化された酵素と基質との接触を多くする
ために中空糸状膜とすることが望ましい。

前記第１工程によって得られる非対称性膜に酵素を共有
結合させる第２工程を経て酵素固定膜を得ることができ
る。第２工程にて使用する酵素の種類には特に制限はな
いが、該固定膜を利用した反応装置として多糖類や蛋白
質の加水分解に用いることが有用である。このような高
分子基質に作用して低分子物質を生成する酵素として、
例えばα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナー
ゼ、七ルラーゼの如き多糖類加水分解酵素、ハハイン、
ペプトン、トリプシン、キモトリプシン、プロメライン
のごとき蛋白質加水分解酵素、リゾチーム、ザイモリア
ーゼの如き細胞壁溶解酵素などが挙げられ、これらを二
種類以上併用して用いることもできる。

第２工程において酵素を共有結合させるに当たり、上記
酵素を水溶液状態とし、非対称性膜の多孔質層側から加
圧条件下にて強制透過させ、該非対称性膜にスペーサー
として共有結合している水溶性高分子末端の官能基に酵
素を共有結合させる。

上記酵素を含む溶液は第１工程にて得られた水溶性高分
子を結合した非対称性膜に加圧条件下にて強制透過させ
て水溶性高分子末端に酵素中のアミノ酸残基の官能基と
共有結合させるが、この場合の結合方法は、前記第１工
程に記載した方法に準じて行なうことが出来る。

また、酵素水溶液を強制透過させる場合の加圧条件とし
ては０．１〜２　Ｋ９／、−ｄ、好ましくは０．１〜０
．６１’ｆ／−の範囲であり、２即を超える場合は既に
スペーサーとして結合されている水溶性高分子が圧密化
された層を新たに形成したり、該高分子が三次元化して
ゲル化状態となるためにスペーサーとしての水溶性高分
子の易動性が悪くなり、基質溶液を透過させて酵素反応
を行なうに際し、基質の透過障害となったり、反応生成
物の透過障害となり、固定化した酵素の反応を有効的に
活用させることができなくなる。

本発明によって得られた酵素固定膜は、基質溶液を透過
させて反応生成物を得る目的で使用するが、該固定膜を
有効に利用するためにはモジュール化して酵素反応装置
とすることが好ましく、例えば平板型、管状型、スパイ
ラル型、中空糸型などの形状にして用いることが出来る
。このような酵素反応装置は、基質溶液、特に高分子基
質溶液を反応原液として流入させると、本発明によって
得られた酵素固定膜が高活性で、且つ高濃度に酵素固定
されているので、基質溶液は迅速に、且つ効果的に非対
称性膜の多孔質層に分配されて酵素反応が生じ、反応生
成物を反応装置外に流出させることが出来る。この時の
基質溶液の透過圧は確実な酵素反応のために酵素溶液透
過時と同程度にすることが好ましく、０．１〜０．５に
９／−の範囲で使用することが望ましい。

これらの酵素反応装置の一例を示すと、内径約０．３Ｍ
〜１顛、長さ数十側〜数ｍの中空糸膜を数百本ないし数
千本の単位で束ねて、中空糸状限外濾過膜装置としたも
のが挙げられ、中空糸膜外側の多孔質層に酵素を固定化
して膜外側に基質溶液を送液し、生成物を含む透過液を
膜内側から得るようにする。このとき、中空糸膜として
は内側への圧力に耐えうるものが望ましい。

また、スパイラル型限外濾過膜装置も単位面積当たりの
膜面積を大きくできるので酵素反応装置としても有効で
あり、この装置も前記反応装置と同様に通常多孔質層側
から反応基質溶液を送液し、緻密層側から反応生成物を
含む透過液を回収するようにして連続反応を行なうこと
ができるものである。

〈発明の効果〉 以上のように、本発明によって得られる酵素固定膜は、
微細孔を有する緻密層と比較的粗な空隙を有する多孔質
層とからなる非対称性膜にスペーサーとして存在する水
溶性高分子を介して酵素が固定化されているので、固定
化された酵素は高い活性を有するように自由度が確保さ
れていると共に、基質溶液との反応に際して酵素の溶出
がないので高活性を維持した状態で長時間の使用に耐え
得るものである。また、本発明の製造方法によれば芳香
族ポリアミド高分子をその膜材料に用いているので、加
水分解処理によって容易に官能基量を増大させることが
でき、固定化する酵素量も調節が容易となるものである
。

さらに、酵素を特定の非対称性膜に適度な加圧条件下で
固定化するので多孔質層内部に確実に固定化され、本発
明の製造方法によって得られる酵素固定膜にて基質浴液
を短時間で大量に処理、分離できるものである。

／実施例〉 以下に本発明の実施例を示し、さらに詳しく説明するが
、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲で種々の応用が
可能である。

実施例１ 芳香族ポリアミド高分子（ｍ−フェニレンジアミン／塩
化インフタロイル縮重合物）をｐＨ３０３重量％の次亜
塩素酸ナトリウム水溶液中にて１時間加水分解処理を行
ない、アミド結合の０．５％が加水分解された芳香族ポ
リアミド高分子を得た。

次に１重量％のポリエチレンイミン（重量平均分子ｆ７
万、１分子当りの官能基数４００　）水溶液に上記で得
た芳香族ポリアミド高分子を常温にて４時間浸漬して共
有結合反応を行ない、多官能性高分子を得、水洗ののち
、５０゛Ｃにて乾燥を行なった。

次に上記多官能性高分子と全く処理していない芳香族ボ
リアばド高分子を１＝１の重量比にて混合し、ジメチル
スルホキシド中１２重量％の：ａ度となるように溶解し
て常法に従って非対称性の中空糸限外２１．ｉｉ過膜（
外径１．（１１、内径０．６ｙａ、分画分子量５万、外
表面側：多孔質層）を製膜した。

得られた中菟糸限外濾過膜をモジュール化し、該濾過膜
の外表面側から２．５重量％グルタルアルデヒド水溶液
（リン酸緩衝液ｐＨ６，５）を１）、２）１／−の加圧
下にて４時間、常温で透過・含？）させ、次いで２ｍ９
　／　ｒａｅのゲルコアｉラーゼ水溶液（リン酸緩衝液
ｐＨ６，５）を０．３　Ｋ９／ｄの加圧条件下にて４時
間、４℃で膜の外表面側から強制透過させたのち、２Ｍ
塩化ナトリウム水溶液、酢酸緩衝液の順で充分に洗浄を
繰り返して酵素固定膜を得た。

得られた酵素固定膜からなる中空糸限外濾過膜モジエー
ルの外表面側から１重量％可溶性澱粉（０，１Ｍ酢酸緩
衝液、ｐＨ６，＋１　）を４０℃、０．２に９／ｃＡの
加圧条件下にて透過させて酵素反応を行なった。

透過液中の還元糖濃度、グルコース濃度をそれぞれ８ｏ
ｍｏｇｙｉ　−Ｎｅ１ｓｏｎ法、グルコスタット法で測
定した結果を第１図に示した。

比較例１ 水溶性高分子を共有結合していない芳香族ボリアばド高
分子を用いた以外は実施例１と全く同様の操作にて酵素
固定膜からなる中空糸限外濾過膜モジュールを得た。

この場合の透過中の還元糖濃度は約０．３　ｍ９／ｒｎ
ｌ！であった。

実施例２ 実施例１にて得た多官能性高分子を単独で膜材料とし、
１２重量％のジメチルスルホキシド溶液としたのち、ガ
ラス板上に２００　）１ｍの厚みに塗布した。これを２
０℃の水中に３時間浸漬したの敷水洗して分画分子量致
方の非対称性膜を得た。

得られた非対称性膜を円形に切り抜いて限外濾過用透過
セルに設置し、常温にて２．５重量％グルタルアルデヒ
ド水溶液（リン酸緩衝液ｐＨ６，５）を０．２１’ｌ／
ｃｄの加圧条件下にて多孔質層側から４時間強制的に透
過、含浸させ、次いでウレアーゼ（１，５Ｕ／■）の０
．１％水溶液（リン酸緩衝液ｐＨ７，０）を常温にて０
．２に９７−の加圧条件下で４時間多孔質層側から強制
透過し、５０　ｍｍｏ／　！ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）で充分に洗浄して酵素固定膜を得た。

得られた酵素固定膜に２重量％の尿素水溶液（リン酸緩
衝液ｐＨ７，０）を多孔質層側から、２０℃、０．２　
Ｋ９／ｃｄの加圧条件下にて透過させて酵素反応を行な
った。

透過中のアンモニアをｐＨ６，７にて０．０１　Ｎ塩酸
を用いて滴定性なったところ、該固定膜は１０．５　Ｕ
／−の活性を示した。なお、上記で１単位（Ｕ）とは上
記条件で５分間にてｔ　ｍｇのアンモニアを発生させる
活性をいう。

比較例２ 水溶性高分子を共有結合していない芳香族ポリアミド高
分子を用いた以外は実施例２と全く同様の操作にて酵素
固定膜を得た。

この場合の活性量は４．３　Ｕ／ｄであった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１にて得られた酵素固定膜の活性を測
定したものであり、可溶性澱粉の分解反応によって得ら
れる還元糖およびグルコースの濃度と反応時間との関係
を図示したものである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）芳香族ポリアミド高分子の官能基を介して少なく
   とも２個の官能基を有する水溶性高分子を共有結合させ
   て得られる多官能性高分子単独、もしくは該多官能性高
   分子と前記芳香族ポリアミド高分子との混合物の溶液を
   製膜して、微細孔を有する緻密層とこれを担持する比較
   的粗な空隙を有する多孔質層とからなる非対称性膜を得
   る第１工程と、前記工程にて得られた非対称性膜の多孔
   質層側から酵素水溶液を加圧条件下にて強制透過させ、
   前記水溶性高分子の官能基を介して酵素を共有結合させ
   る第２工程とからなる酵素固定膜の製造方法。
2. （２）芳香族ポリアミド高分子は、そのアミド結合の１
   ０％以下が加水分解されている特許請求の範囲第１項記
   載の酵素固定膜の製造方法。
3. （３）水溶性高分子がポリアルキレンイミン、ポリアミ
   ノ酸及びポリアリルイミンから選ばれる少なくとも１種
   である特許請求の範囲第１項記載の酵素固定膜の製造方
   法。