JPH0566108B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は酵素固定膜の製造方法に関するもので
ある。

＜従来の技術＞ 酵素反応を利用した工業的な実施は医薬品、食
品の製造において一部行なわれており、特に反応
後における生成物と酵素の分離、反応後の活性酵
素の回収などの点で比較的操作が簡便である固定
化酵素の開発や利用が近年試みられている。例え
ば水不溶性の担持体の表面を活性化し、反応性を
高くしたのちに酵素を結合、固定化する単体結合
法や、担持体へ物理的に酵素を吸着させる物理吸
着法、水溶性重合体に酵素を添加せしめたのち架
橋手段によつて該重合体をゲル化して酵素を封入
する包括法などが行われているが、担体結合法で
は特殊な担持体を必要とし、且つ固定化操作が煩
雑なために一般に高活性の固定化酵素が得られて
いない。また、物理吸着法による固定化では担持
体と酵素との結合が充分ではなく、使用中に酵素
が脱離、流出しやすいので酵素反応を安定に行え
ないという欠点を有している。上記二つの方法と
比べて包括法は比較的固定化操作が簡単であり、
工業的には有用な方法であるが、水溶性重合体の
架橋、ゲル化に際して含有する酵素の活性が低下
し、また反応基質の重合体中での透過拡散移動性
が悪いので、固定化された酵素の反応に対する有
効性に乏しいなどの欠点を有している。

一方、膜材料の分離機能を利用して膜材料に酵
素を固定化し、酵素反応と生成物分離を同時に処
理出来る複合機能膜の研究も行われており、食品
工業界においては多糖類の加水分解による単糖化
や、蛋白質の加水分解による低ペプチド化、及び
これらの分離操作などに大きく貢献するものとし
て期待される。

しかし、単に膜表面に酵素を固定化したり、膜
内に酵素を封入するだけでは、前記担体結合法や
包括法と差異はなく、生成物の分離操作を同時に
行えるという機能を付与するにすぎず、酵素活性
の高いものが得られていなかつた。

＜発明が解決しようとする問題点＞ 従つて、本発明の目的は酵素の固定化量が多
く、且つ高活性に維持できて基質との反応生成
物、特に高分子基質との反応生成物である低分子
生成物の分離機能に優れた酵素固定膜を製造する
ための方法を提供することにある。

＜問題点を解決するための手段＞ 本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究を
重ねた結果、芳香族ポリアミド高分子に特定の水
溶性高分子をスペーサーとして結合させて得られ
る非対称性膜に特定条件下で酵素を反応させるこ
とによつて、酵素が膜表面および膜内部に固定化
され、酵素活性が非常に高い酵素固定膜となるこ
とを見い出し、本発明に至つたものである。

即ち、本発明は芳香族ポリアミド高分子の官能
基を介して少なくとも２個の官能基を有する水溶
性高分子を共有結合させて得られる多官能性高分
子単独、もしくは該多官能性高分子と前記芳香族
ポリアミド高分子との混合物の溶液を製膜して、
微細孔を有する緻密層とこれを担持する比較的粗
な空隙を有する多孔質層とからなる非対称性膜を
得る第１工程と、前記工程にて得られた非対称性
膜の多孔質層側から酵素水溶液を加圧条件下にて
強制透過させ、前記水溶性高分子の官能基を介し
て酵素を共有結合させる第２工程とからなる酵素
固定膜の製造方法に関するものである。

本発明において用いられる芳香族ポリアミド高
分子は分子内に芳香環を有し、且つアミド結合を
有するものであり、分子末端にカルボキシル基及
びアミノ基の両方又は一方を含有するものであ
る。この芳香族ポリアミド高分子は、本発明によ
つて得られる酵素固定膜の膜材料となるものであ
り、第１工程においてその分子末端にスペーサー
としての水溶性高分子を共有結合によつて結合し
て多官能性高分子としたのち、非対称性膜に製膜
される。これらの芳香族ポリアミド高分子として
は、例えばアミノベンズヒドラジドと塩化フタロ
イルとの縮重合体、ｍ−フエニレンジアミンと塩
化イソフタロイルとの縮重合体、ｍ−フエニレン
ジアミンと塩化ニトロベンゾールとの縮重合体な
どが挙げられ、これらの縮重合体は加水分解処理
によつて容易に分子内のアミド結合が開裂するの
で、官能基量を該処理の程度によつて任意に変化
させることができる。後述する水溶性高分子の結
合量を増大させるためにはアミド結合の10％以下
を加水分解することが好ましく、10％を超えて加
水分解すると、非対称性膜に製膜した際に膜強度
が低下し、第２工程における酵素水溶液の強制透
過に際し、膜破断などが生じる恐れがある。

上記芳香族ポリアミド高分子に共有結合せしめ
る水溶性高分子は分子内に少なくとも２個の官能
基を有するものであり、該高分子は第２工程にて
共有結合させる酵素との間にてスペーサーとして
の役割を果たすものである。このような水溶性高
分子としては、例えばポリエチレンイミン、ポリ
プロピレンイミン、ポリブチレンイミンの如きポ
リアルキレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニ
ンの如きポリアミノ酸、ポリエチレングリコー
ル、ポリプロピレングリコールの如きポリアルキ
レングリコール、ポリアリルイミンなどが挙げら
れ、通常、重量平均分子量が約1000〜200000、官
能基数が数十〜数百のものが好ましく、使用する
酵素の種類によつて適宜選択することができる。

上記水溶性高分子を共有結合させる方法として
は前記芳香族ポリアミド高分子に存在するカルボ
キシル基又はアミノ基と、水溶性高分子に存在す
るカルボキシル基、アミノ基又はヒドロキシル基
とを任意に選択し、例えば直接に結合させるか、
或いはアミノ基同士の場合はジアゾカツプリング
法や、ジアルデヒド化合物、ジイソシアネート化
合物などにて結合させ、アミノ基とカルボキシル
基の場合は水溶性カルボジイミドなどにて結合さ
せることができ、これらの方法は各官能基の種類
に応じて適宜選択する。

本発明の第１工程においては、前記したように
芳香族ポリアミド高分子に水溶性高分子を共有結
合した多官能性高分子単独、もしくは該多官能性
高分子と前記芳香族ポリアミド高分子との混合物
から微細孔を有する緻密層とこれを担持する比較
的粗な空隙を有する多孔質層からなる非対称性膜
を得るが、これら非対称性膜は既知の方法で製膜
することができる。その一例としては、上記膜材
料を水と混和しうる極性有機溶剤、例えばジメチ
ルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチ
ルアセトアミド、フエノール、クレゾール、エチ
レンクロルヒドリン、エチレングリコール、プロ
ピレングリコール、セルソルブ、グリセリン、メ
タノール、エタノール、プロパノール、ブタノー
ル、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン
などのうち一種以上に溶解せしめたのち膜状に成
形し、主として水からなる凝固液と接触させて各
種形状の非対称性膜とすることが出来るが、緻密
層と多孔質層を有する非対称性膜であれば如何な
る方法、形状のものであつても本発明の技術を適
用することが出来る。

第１工程にて得られる非対称性膜は、逆浸透膜
または限外濾過膜として分画分子量が500〜
100000の性能を有する緻密層と、該層を担持する
孔径数μｍ〜100μｍの多孔質層とからなるもの
であり、平板状、管状、中空糸状など酵素反応装
置に応じて形状は任意に選択することが出来る。
好ましくは、有効膜面積を大きくし、固定化され
た酵素と基質との接触を多くするために中空糸状
膜とすることが望ましい。

前記第１工程によつて得られる非対称性膜に酵
素を共有結合させる第２工程を経て酵素固定膜を
得ることができる。第２工程にて使用する酵素の
種類には特に制限はないが、該固定膜を利用した
反応装置として多糖類や蛋白質の加水分解に用い
ることが有用である。このような高分子基質に作
用して低分子物質を生成する酵素として、例えば
α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナー
ゼ、セルラーゼの如き多糖類加水分解酵素、パパ
イン、ペプトン、トリプシン、キモトリプシン、
ブロメラインのごとき蛋白質加水分解酵素、リゾ
チーム、ザイモリアーゼの如き細胞壁溶解酵素な
どが挙げられ、これらを二種類以上併用して用い
ることもできる。

第２工程において酵素を共有結合させるに当た
り、上記酵素を水溶液状態とし、非対称性膜の多
孔質層側から加圧条件下にて強制透過させ、該非
対称性膜にスペーサーとして共有結合している水
溶性高分子末端の官能基に酵素を共有結合させ
る。

上記酵素を含む溶液は第１工程にて得られた水
溶性高分子を結合した非対称性膜に加圧条件下に
て強制透過させて水溶性高分子末端に酵素中のア
ミノ酸残基の官能基と共有結合させるが、この場
合の結合方法は、前記第１工程に記載した方法に
準じて行なうことが出来る。

また、酵素水溶液を強制透過させる場合の加圧
条件としては0.1〜２Kg／cm²、好ましくは0.1〜0.6
Kg／cm²の範囲であり、２Kgを超える場合は既にス
ペーサーとして結合されている水溶性高分子が圧
密化された層を新たに形成したり、該高分子が三
次元化してゲル化状態となるためにスペーサーと
しての水溶性高分子の易動性が悪くなり、基質溶
液を透過させて酵素反応を行なうに際し、基質の
透過障害となつたり、反応生成物の透過障害とな
り、固定化した酵素の反応を有効的に活用させる
ことができなくなる。

本発明によつて得られた酵素固定膜は、基質溶
液を透過させて反応生成物を得る目的で使用する
が、該固定膜を有効に利用するためにはモジユー
ル化して酵素反応装置とすることが好ましく、例
えば平板型、管状型、スパイラル型、中空糸型な
どの形状にして用いることが出来る。このような
酵素反応装置は、基質溶液、特に高分子基質溶液
を反応原液として流入させると、本発明によつて
得られた酵素固定膜が高活性で、且つ高濃度に酵
素固定されているので、基質溶液は迅速に、且つ
効果的に非対称性膜の多孔質層に分配されて酵素
反応が生じ、反応生成物を反応装置外に流出させ
ることが出来る。この時の基質溶液の透過圧は確
実な酵素反応のために酵素溶液透過時と同程度に
することが好ましく、0.1〜0.5Kg／cm²の範囲で使
用することが望ましい。

これらの酵素反応装置の一例を示すと、内径約
0.3mm〜１mm、長さ数十cm〜数ｍの中空糸膜を数
百本ないし数千本の単位で束ねて、中空糸状限外
濾過膜装置としたものが挙げられ、中空糸膜外側
の多孔質層に酵素を固定化して膜外側に基質溶液
を送液し、生成物を含む透過液を膜内側から得る
ようにする。このとき、中空糸膜としては内側へ
の圧力に耐えうるものが望ましい。

また、スパイラル型限外濾過膜装置も単位面積
当たりの膜面積を大きくできるので酵素反応装置
としても有効であり、この装置も前記反応装置と
同様に通常多孔質層側から反応基質溶液を送液
し、緻密層側から反応生成物を含む透過液を回収
するようにして連続反応を行なうことができるも
のである。

＜発明の効果＞ 以上のように、本発明によつて得られる酵素固
定膜は、微細孔を有する緻密層と比較的粗な空隙
を有する多孔質層とからなる非対称性膜にスペー
サーとして存在する水溶性高分子を介して酵素が
固定化されているので、固定化された酵素は高い
活性を有するように自由度が確保されていると共
に、基質溶液との反応に際して酵素の溶出がない
ので高活性を維持した状態で長時間の使用に耐え
得るものである。また、本発明の製造方法によれ
ば芳香族ポリアミド高分子をその膜材料に用いて
いるので、加水分解処理によつて容易に官能基量
を増大させることができ、固定化する酵素量も調
節が容易となるものである。

さらに、酵素を特定の非対称性膜に適度な加圧
条件下で固定化するので多孔質層内部に確実に固
定化され、本発明の製造方法によつて得られる酵
素固定膜にて基質溶液を短時間で大量に処理、分
離できるものである。

＜実施例＞ 以下に本発明の実施例を示し、さらに詳しく説
明するが、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲
で種々の応用が可能である。

実施例 １ 芳香族ポリアミド高分子（ｍ−フエニレンジア
ミン／塩化イソフタロイル縮重合物）をPH３の３
重量％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液中にて１時
間加水分解処理を行ない、アミド結合の0.5％が
加水分解された芳香族ポリアミド高分子を得た。

次に１重量％のポリエチレンイミン（重量平均
分子量７万、１分子当りの官能基数400）水溶液
に上記で得た芳香族ポリアミド高分子を常温にて
４時間浸漬して共有結合反応を行ない、多官能性
高分子を得、水洗ののち、50℃にて乾燥を行なつ
た。

次に上記多官能性高分子と全く処理していない
芳香族ポリアミド高分子を１：１の重量比にて混
合し、ジメチルスルホキシド中12重量％の濃度と
なるように溶解して常法に従つて非対称性の中空
糸限外濾過膜（外径1.0mm、内径0.6mm、分画分子
量５万、外表面側：多孔質層）を製膜した。

得られた中空糸限外濾過膜をモジユール化し、
該濾過膜の外表面側から2.5重量％グルタルアル
デヒド水溶液（リン酸緩衝液PH6.5）を0.2Kg／cm²
の加圧下にて４時間、常温で透過・含浸させ、次
いで２mg／mlのグルコアミラーゼ水溶液（リン酸
緩衝液PH6.5）を0.3Kg／cm²の加圧条件下にて４時
間、４℃で膜の外表面側から強制透過させたの
ち、2M塩化ナトリウム水溶液、酢酸緩衝液の順
で充分に洗浄を繰り返して酵素固定膜を得た。

得られた酵素固定膜からなる中空糸限外濾過膜
モジユールの外表面側から１重量％可溶性澱粉
（0.1M酢酸緩衝液、PH6.0）を40℃、0.2Kg／cm²の
加圧条件下にて透過させて酵素反応を行なつた。

透過液中の還元糖濃度、グルコース濃度をそれ
ぞれSomogyi−Nelson法、グルコスタツト法で
測定した結果を第１図に示した。

比較例 １ 水溶性高分子を共有結合していない芳香族ポリ
アミド高分子を用いた以外は実施例１と全く同様
の操作にて酵素固定膜からなる中空糸限外濾過膜
モジユールを得た。

この場合の透過中の還元糖濃度は約0.3mg／ml
であつた。

実施例 ２ 実施例１にて得た多官能性高分子を単独で膜材
料とし、12重量％のジメチルスルホキシド溶液と
したのち、ガラス板上に200μｍの厚みに塗布し
た。これを20℃の水中に３時間浸漬したのち、水
洗して分画分子量数万の非対称性膜を得た。

得られた非対称性膜を円形に切り抜いて限外濾
過用透過セルに設置し、常温にて2.5重量％グル
タルアルデヒド水溶液（リン酸緩衝液PH6.5）を
0.2Kg／cm²の加圧条件下にて多孔質層側から４時
間強制的に透過、含浸させ、次いでウレアーゼ
（1.5U／mg）の0.1％水溶液（リン酸緩衝液PH7.0）
を常温にて0.2Kg／cm²の加圧条件下で４時間多孔
質層側から強制透過し、50ｍmolリン酸緩衝液
（PH7.0）で充分に洗浄して酵素固定膜を得た。

得られた酵素固定膜に２重量％の尿素水溶液
（リン酸緩層液PH7.0）を多孔質層側から、20℃、
0.2Kg／cm²の加圧条件下にて透過させて酵素反応
を行なつた。

透過中のアンモニアをPH6.7にて0.01N塩酸を用
いて滴定行なつたところ、該固定膜は10.5U／cm²
の活性を示した。なお、上記で１単位(U)は上記条
件で５分間にて１mgのアンモニアを発生させる活
性をいう。

比較例 ２ 水溶性高分子を共有結合していない芳香族ポリ
アミド高分子を用いた以外は実施例２と全く同様
の操作にて酵素固定膜を得た。

この場合の活性量は4.3U／cm²であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１にて得られた酵素固定膜の
活性を測定したものであり、可溶性澱粉の分解反
応によつて得られる還元糖およびグルコースの濃
度と反応時間との関係を図示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 芳香族ポリアミド高分子の官能基を介して少
   なくとも２個の官能基を有する水溶性高分子を共
   有結合させて得られる多官能性高分子単独、もし
   くは該多官能性高分子と前記芳香族ポリアミド高
   分子との混合物の溶液を製膜して、微細孔を有す
   る緻密層とこれを担持する比較的粗な空隙を有す
   る多孔質層とからなる非対称性膜を得る第１工程
   と、前記工程にて得られた非対称性膜の多孔質層
   側から酵素水溶液を加圧条件下にて強制透過さ
   せ、前記水溶性高分子の官能基を介して酵素を共
   有結合させる第２工程とからなる酵素固定膜の製
   造方法。 ２ 芳香族ポリアミド高分子は、そのアミド結合
   の10％以下が加水分解されている特許請求の範囲
   第１項記載の酵素固定膜の製造方法。 ３ 水溶性高分子がポリアルキレンイミン、ポリ
   アミノ酸及びポリアリルイミンから選ばれる少な
   くとも１種である特許請求の範囲第１項記載の酵
   素固定膜の製造方法。