JP2781990B2 - 固定化酵素の製造法 - Google Patents
固定化酵素の製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、酵素活性が高く、且つ担体としての強度が
大きく、バイオリアクターとして有利に利用し得る固定
化酵素の製造法に関する。
大きく、バイオリアクターとして有利に利用し得る固定
化酵素の製造法に関する。
従来の技術 酵素反応を工業的規模で実施する場合、従来は、回分
式で行い、酵素は一度だけしか利用されず、その不経済
性から、水不溶性媒体に酵素を固定した固定化酵素が数
多く提言されている。
式で行い、酵素は一度だけしか利用されず、その不経済
性から、水不溶性媒体に酵素を固定した固定化酵素が数
多く提言されている。
特に、食品工業分野では、安全性の面から天然物であ
るキチンを脱アセチル化して得られるキトサンを利用し
て固定化方法の検討がなされている。例えば、特開昭59
−213390号公報には、多孔質固体とキトサン誘導体から
成る担体に酵素を吸着固定させる方法が開示されてお
り、特公昭53−10150号公報には、キトサンを担体と
し、これに吸着またはペプタイド結合により酵素を附加
する方法が記載されている。また、特公昭62−16637号
公報には、無機質粒子をキトサンで被覆し、これをグル
タルアルデヒドで活性化あるいは安定化させた後、酵素
を固定化する方法が示されている。
るキチンを脱アセチル化して得られるキトサンを利用し
て固定化方法の検討がなされている。例えば、特開昭59
−213390号公報には、多孔質固体とキトサン誘導体から
成る担体に酵素を吸着固定させる方法が開示されてお
り、特公昭53−10150号公報には、キトサンを担体と
し、これに吸着またはペプタイド結合により酵素を附加
する方法が記載されている。また、特公昭62−16637号
公報には、無機質粒子をキトサンで被覆し、これをグル
タルアルデヒドで活性化あるいは安定化させた後、酵素
を固定化する方法が示されている。
しかし、特公昭53−10150号公報に記載の方法は、キ
トサンゲルを担体とするものであるため、得られた固定
化酵素の機械的強度が弱く、変形による圧損増加あるい
は損壊が起り易いという問題がある。また、特公昭62−
16637号公報に開示された方法では、予め架橋されたキ
トサンゲルを利用するものであり、該ゲル内には酵素が
浸透し難いため、固定化酵素の活性が低いという問題が
ある。
トサンゲルを担体とするものであるため、得られた固定
化酵素の機械的強度が弱く、変形による圧損増加あるい
は損壊が起り易いという問題がある。また、特公昭62−
16637号公報に開示された方法では、予め架橋されたキ
トサンゲルを利用するものであり、該ゲル内には酵素が
浸透し難いため、固定化酵素の活性が低いという問題が
ある。
因に、機械的強度が高く、水不溶性である多孔質固体
は、酵素と結合する反応基を有しないので酵素を固定す
ることができない。
は、酵素と結合する反応基を有しないので酵素を固定す
ることができない。
発明が解決すべき課題 本発明は、如上の従来技術にみられる問題点を解決す
るためになされたものであって、機械的強度が高く、高
活性であり、かつ食品工業分野に安全に利用し得る固定
化酵素を提供することを課題とする。
るためになされたものであって、機械的強度が高く、高
活性であり、かつ食品工業分野に安全に利用し得る固定
化酵素を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段 本発明は、多孔質固体にキトサン類および酵素の混合
溶液を含浸させ、次いでこの含浸多孔質固体をジアルデ
ヒドと反応させて架橋することを特徴とする固定化酵素
の製造法である。
溶液を含浸させ、次いでこの含浸多孔質固体をジアルデ
ヒドと反応させて架橋することを特徴とする固定化酵素
の製造法である。
本発明で用いる多孔質固体は、水に不溶性かつ不活性
な物質であれば特に限定はなく、珊瑚、セライト、珪藻
土、パーライト、シラスバルーン、木炭、コルク等を例
示することができる。これら多孔質固体は、通常粒径0.
2〜3mm程度の粒状物としてカラムに充填し使用するが、
同程度の比表面積を有することができるならば管状ある
いは板状等の任意の形状で使用することができる。な
お、ここに言う多孔質固体とは、少くとも0.2ml/g以
上、望ましくは0.5ml/g以上の孔容積を有する固体物質
を意味する。
な物質であれば特に限定はなく、珊瑚、セライト、珪藻
土、パーライト、シラスバルーン、木炭、コルク等を例
示することができる。これら多孔質固体は、通常粒径0.
2〜3mm程度の粒状物としてカラムに充填し使用するが、
同程度の比表面積を有することができるならば管状ある
いは板状等の任意の形状で使用することができる。な
お、ここに言う多孔質固体とは、少くとも0.2ml/g以
上、望ましくは0.5ml/g以上の孔容積を有する固体物質
を意味する。
また、本発明に用いられるキトサン類とは、キチンの
脱アセチル化物の総称であり、酢酸、塩酸等の一塩基酸
の存在によりカチオンに解離して水溶性になるものを意
味する。なお、上記キトサン類を再度アセチル化を行つ
たもの、あるいは低分子量化を行ったとものであって
も、上記の水溶性を呈するかぎり、本発明で用いるキト
サン類に包含される。
脱アセチル化物の総称であり、酢酸、塩酸等の一塩基酸
の存在によりカチオンに解離して水溶性になるものを意
味する。なお、上記キトサン類を再度アセチル化を行つ
たもの、あるいは低分子量化を行ったとものであって
も、上記の水溶性を呈するかぎり、本発明で用いるキト
サン類に包含される。
本発明では、上述の多孔質固体に、上記キトサン類お
よび酵素の混合溶液を含浸させる。その際、キトサン類
の溶液と酵素の溶液とを予め混合して含浸させてもよ
い。含浸は、減圧により固体空隙内の空気を除去した
後、液に浸漬させて行うと効率的である。
よび酵素の混合溶液を含浸させる。その際、キトサン類
の溶液と酵素の溶液とを予め混合して含浸させてもよ
い。含浸は、減圧により固体空隙内の空気を除去した
後、液に浸漬させて行うと効率的である。
含浸液は低粘度であることが望ましく、100cp以下で
あることが好ましい。含浸液のpHは、酵素が失活せず、
キトサンが析出しない範囲に制限される。
あることが好ましい。含浸液のpHは、酵素が失活せず、
キトサンが析出しない範囲に制限される。
酵素は等電点以上のpHにおいてアニオンに解離してい
るため、キトサンのカチオンとイオンコンプレックスを
つくり白濁する場合もあるが、通常は多孔質固体の孔径
より微小であるため、含浸の妨げとはならないばかりで
なく、適度の上記白濁による析出は、ジアルデヒドによ
る含浸多孔質固体の架橋反応に好ましい影響を与えて、
酵素の固定化に好結果をもたらす。
るため、キトサンのカチオンとイオンコンプレックスを
つくり白濁する場合もあるが、通常は多孔質固体の孔径
より微小であるため、含浸の妨げとはならないばかりで
なく、適度の上記白濁による析出は、ジアルデヒドによ
る含浸多孔質固体の架橋反応に好ましい影響を与えて、
酵素の固定化に好結果をもたらす。
菌体等の懸濁質が酵素溶液中に存在する場合に於いて
も、該懸濁質が多孔質固体の孔径より微小であれば本発
明の実施を妨害しない。
も、該懸濁質が多孔質固体の孔径より微小であれば本発
明の実施を妨害しない。
上記架橋反応は、キトサン類および酵素の混合溶液を
含浸させた多孔質固体をジアルデヒド溶液に浸漬させて
行うとよく、その際、酵素が失活しない条件、すなわ
ち、pHと温度で反応を行う必要がある。
含浸させた多孔質固体をジアルデヒド溶液に浸漬させて
行うとよく、その際、酵素が失活しない条件、すなわ
ち、pHと温度で反応を行う必要がある。
ここで用いるジアルデヒドとしては、グルタルアルデ
ヒド、グリオキザール、マロンアルデヒド、スクシンア
ルデヒド、アジポアルデヒド等を例示でき、特にグルタ
ルアルデヒドが一般的に用いられる。
ヒド、グリオキザール、マロンアルデヒド、スクシンア
ルデヒド、アジポアルデヒド等を例示でき、特にグルタ
ルアルデヒドが一般的に用いられる。
本発明に従って固定化し得る酵素については、特に限
定されることなく、ほとんど全ての酵素に適応すること
ができる。
定されることなく、ほとんど全ての酵素に適応すること
ができる。
例えば、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、トリプシ
ン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、パンクレア
チン、アミノアシラーゼ、ヌクレアーゼ、リポヌクレア
ーゼ、ATPデアミナーゼ、ホスファターゼ、ストレプト
キナーゼ、アピラーゼ（ATP−ジキスフアターゼ）、ATP
クレアチンリン酸転移酵素、ペクチナーゼ、マルター
ゼ、ラクターゼ、ウレアーゼ、タンナーゼ、リパーゼ、
グルコースイソメラーゼ、メリビアーゼ、アルドラー
ゼ、セルラーゼ、アントシナーゼ、ナリンジナーゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、アスパラキシダーゼ等を挙げる
ことができ、これらはいずれも本発明の方法に従って簡
易に固定し得る。
ン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、パンクレア
チン、アミノアシラーゼ、ヌクレアーゼ、リポヌクレア
ーゼ、ATPデアミナーゼ、ホスファターゼ、ストレプト
キナーゼ、アピラーゼ（ATP−ジキスフアターゼ）、ATP
クレアチンリン酸転移酵素、ペクチナーゼ、マルター
ゼ、ラクターゼ、ウレアーゼ、タンナーゼ、リパーゼ、
グルコースイソメラーゼ、メリビアーゼ、アルドラー
ゼ、セルラーゼ、アントシナーゼ、ナリンジナーゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、アスパラキシダーゼ等を挙げる
ことができ、これらはいずれも本発明の方法に従って簡
易に固定し得る。
発明の作用効果 以上述べたとおり、本発明では酵素およびキトサン類
を水溶液状態で、浸透性の良好な多孔質固体内に含浸さ
せ、次いでこの含浸多孔質固体をジアルデヒドと反応さ
せて架橋するため、酵素は効率的にキトサン分子の網状
構造内に固定されて不溶化するとともに、機械的強度の
高められた多孔質固体に担持される。
を水溶液状態で、浸透性の良好な多孔質固体内に含浸さ
せ、次いでこの含浸多孔質固体をジアルデヒドと反応さ
せて架橋するため、酵素は効率的にキトサン分子の網状
構造内に固定されて不溶化するとともに、機械的強度の
高められた多孔質固体に担持される。
したがって、本発明によると高活性および高強度の固
定化酵素を得ることができる。
定化酵素を得ることができる。
因に、多孔質固体に酵素溶液のみを含浸させたのでは
酵素は固定化されずに容易に流出し、一方多孔質固体を
使用せずにキトサンを架橋させた場合にはキトサンゲル
は機械的強度が小さく、変形による圧損増加あるいは損
壊等が生じ易い。また多孔質固体にキトサン溶液のみを
含浸させ、ジアルデヒドにより架橋させたものに酵素溶
液を含浸させた場合には、キトサン分子の網状構造中へ
の酵素の浸透が困難となるので、活性の高い固定化酵素
は得られない。
酵素は固定化されずに容易に流出し、一方多孔質固体を
使用せずにキトサンを架橋させた場合にはキトサンゲル
は機械的強度が小さく、変形による圧損増加あるいは損
壊等が生じ易い。また多孔質固体にキトサン溶液のみを
含浸させ、ジアルデヒドにより架橋させたものに酵素溶
液を含浸させた場合には、キトサン分子の網状構造中へ
の酵素の浸透が困難となるので、活性の高い固定化酵素
は得られない。
実施例 以下に本発明を実施例により更に詳しく説明するが、
本発明の範囲はその要旨を変更しない限り、以下の実施
例に制限されるものではない。
本発明の範囲はその要旨を変更しない限り、以下の実施
例に制限されるものではない。
実施例１ 低分子量キトサン〔１％溶液粘度（１％酢酸中）＝8.
0cp、脱アセチル化度83％）5.0gを10％酢酸45mlに溶解
した後、2N−NaOHにてpH調整し、全量を100mlとし、５
％低分子量キトサン溶液（pH＝6.1）を調製した。
0cp、脱アセチル化度83％）5.0gを10％酢酸45mlに溶解
した後、2N−NaOHにてpH調整し、全量を100mlとし、５
％低分子量キトサン溶液（pH＝6.1）を調製した。
この５％キトサン溶液10ml及びグルコースイソメラー
ゼ溶液（ナガセ産業社製、1,400GIU/ml）10mlを混合
し、乳濁した混合液を得た。
ゼ溶液（ナガセ産業社製、1,400GIU/ml）10mlを混合
し、乳濁した混合液を得た。
セライト（Manville社製Ｒ−647、粒径:14〜30Mesh、
孔溶積0.97ml/g）5.0gを減圧下に置き、酵素−キトサン
混合液を含浸後、濾過して、11.3gの含浸セライトを得
た。
孔溶積0.97ml/g）5.0gを減圧下に置き、酵素−キトサン
混合液を含浸後、濾過して、11.3gの含浸セライトを得
た。
この含浸セライトに2.5％グルタルアルデヒド4.2mlを
混合し、４℃にて１時間反応後、0.05Mリン酸緩衝液（p
H＝6.5）にて充分洗浄して9.3gの固定化酵素を得た。そ
の活性は162GIU/gであり、10％NaCl溶液50mlで４回洗浄
後の活性は162GIU/gであり、酵素はキトサンと共有結合
され、離脱しないことが判った。このようにして、高活
性、高強度の固定化酵素が得られた。
混合し、４℃にて１時間反応後、0.05Mリン酸緩衝液（p
H＝6.5）にて充分洗浄して9.3gの固定化酵素を得た。そ
の活性は162GIU/gであり、10％NaCl溶液50mlで４回洗浄
後の活性は162GIU/gであり、酵素はキトサンと共有結合
され、離脱しないことが判った。このようにして、高活
性、高強度の固定化酵素が得られた。
なお、固定化酵素の活性の測定は、pH7.2の0.1Mリン
酸緩衝液に溶解したグルコースの40％溶液100g中に固定
化酵素の適量を添加して、60℃で１時間反応させ、その
結果生成したフラクトース量をHPLC法により求め、固定
化酵素1g当り、１時間当りの転換フラクトース量を計算
により求めた。
酸緩衝液に溶解したグルコースの40％溶液100g中に固定
化酵素の適量を添加して、60℃で１時間反応させ、その
結果生成したフラクトース量をHPLC法により求め、固定
化酵素1g当り、１時間当りの転換フラクトース量を計算
により求めた。
実施例２ 実施例１に記載したと同様な方法に従って、インベル
ダーゼ溶液（酵素活性15.9g−SUC/ml）について固定化
を行い、9.6gの固定化インベルターゼを得た。その酵素
活性は2.93gSUC/gであり、10％NaCl洗浄後も2.85gSUC/g
での酵素の離脱はほとんどみられなかった。
ダーゼ溶液（酵素活性15.9g−SUC/ml）について固定化
を行い、9.6gの固定化インベルターゼを得た。その酵素
活性は2.93gSUC/gであり、10％NaCl洗浄後も2.85gSUC/g
での酵素の離脱はほとんどみられなかった。
なお、グルタルアルデヒド処理後の洗浄はpH4.2の0.0
5Mリン酸・クエン酸緩衝液で行い、固定化後の活性の測
定は、固定化酵素の適量をpH4.2の0.05Mリン酸・クエン
酸緩衝液に溶解したサッカロースの10％溶液１中に添
加して40℃において１時間反応させ、生成した還元糖量
をメチレンブルー法により求め、固定化酵素1g当り、１
時間当りのサッカロース分解量を算出した。
5Mリン酸・クエン酸緩衝液で行い、固定化後の活性の測
定は、固定化酵素の適量をpH4.2の0.05Mリン酸・クエン
酸緩衝液に溶解したサッカロースの10％溶液１中に添
加して40℃において１時間反応させ、生成した還元糖量
をメチレンブルー法により求め、固定化酵素1g当り、１
時間当りのサッカロース分解量を算出した。
比較例１ 5.0gのセライトに減圧下、５％低分子量キトサン溶液
10mlを添加し含浸後濾別した。これに2.5％グルタルア
ルデヒド4.2mlを添加し、４℃にて１時間反応後、グル
コース・イソメラーゼ溶液10mlを添加し、１晩反応させ
た。0.05Mリン酸緩衝液にて充分洗浄して9.5gの固定化
酵素を得たが、その活性が21.3GIU/gと低いものであっ
た。
10mlを添加し含浸後濾別した。これに2.5％グルタルア
ルデヒド4.2mlを添加し、４℃にて１時間反応後、グル
コース・イソメラーゼ溶液10mlを添加し、１晩反応させ
た。0.05Mリン酸緩衝液にて充分洗浄して9.5gの固定化
酵素を得たが、その活性が21.3GIU/gと低いものであっ
た。
尚、使用したセライト、低分子量キトサン溶液、及び
グルコースイソメラーゼ溶液は実施例１と同様のもので
ある。
グルコースイソメラーゼ溶液は実施例１と同様のもので
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 広瀬 明 千葉県千葉市高洲１―13―４―502 (56)参考文献 特開 昭58−89185（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 11/00 - 11/18
Claims (2)
- 【請求項１】多孔質固体にキトサン類および酵素の混合
溶液を含浸させ、次いでこの含浸多孔質固体をジアルデ
ヒドと反応させて架橋することを特徴とする固定化酵素
の製造法。 - 【請求項２】キトサン類は、キチンの脱アセチル化物、
その低分子量化物、それらの再アセチル化物およびそれ
らの混合物から成る群から選択されるものである請求項
（１）に記載の固定化酵素の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1152214A JP2781990B2 (ja) | 1989-06-16 | 1989-06-16 | 固定化酵素の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1152214A JP2781990B2 (ja) | 1989-06-16 | 1989-06-16 | 固定化酵素の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0319687A JPH0319687A (ja) | 1991-01-28 |
| JP2781990B2 true JP2781990B2 (ja) | 1998-07-30 |
Family
ID=15535568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1152214A Expired - Fee Related JP2781990B2 (ja) | 1989-06-16 | 1989-06-16 | 固定化酵素の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2781990B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100439496C (zh) * | 2006-05-12 | 2008-12-03 | 成都医学院 | 一种新型固定化胰蛋白酶及其制备方法 |
| KR20150124610A (ko) * | 2014-04-29 | 2015-11-06 | 재단법인 전라북도생물산업진흥원 | 효소의 고정화 방법 및 이에 의한 고정화 효소 |
| KR20160092652A (ko) * | 2015-01-28 | 2016-08-05 | 고려대학교 산학협력단 | 키토산 코팅된 효소-다공성물질 복합체 및 이의 제조방법 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1982445B (zh) * | 2005-12-16 | 2011-07-27 | 百瑞全球有限公司 | 用于制备固定化酶或固定化细胞的载体以及使用该载体的固定化方法 |
| JP5572091B2 (ja) | 2008-08-08 | 2014-08-13 | Ｓｕｍｃｏ Ｔｅｃｈｘｉｖ株式会社 | 半導体ウェーハの製造方法 |
| JP2012206084A (ja) * | 2011-03-30 | 2012-10-25 | Cci Corp | 油脂含有排水の処理方法およびその排水処理材 |
| CN104277111B (zh) * | 2013-07-08 | 2020-06-12 | 百瑞全球有限公司 | 用于制备固定化蛋白质、多肽或寡肽的复合载体、制法及用途 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA827728B (en) * | 1981-11-17 | 1983-08-31 | Nestle Sa | A process for the production of enzymatically active biocatalysts and the products obtained |
-
1989
- 1989-06-16 JP JP1152214A patent/JP2781990B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100439496C (zh) * | 2006-05-12 | 2008-12-03 | 成都医学院 | 一种新型固定化胰蛋白酶及其制备方法 |
| KR20150124610A (ko) * | 2014-04-29 | 2015-11-06 | 재단법인 전라북도생물산업진흥원 | 효소의 고정화 방법 및 이에 의한 고정화 효소 |
| KR101644939B1 (ko) | 2014-04-29 | 2016-08-12 | 재단법인 전라북도생물산업진흥원 | 효소의 고정화 방법 및 이에 의한 고정화 효소 |
| KR20160092652A (ko) * | 2015-01-28 | 2016-08-05 | 고려대학교 산학협력단 | 키토산 코팅된 효소-다공성물질 복합체 및 이의 제조방법 |
| KR102276594B1 (ko) | 2015-01-28 | 2021-07-13 | 고려대학교 산학협력단 | 키토산 코팅된 효소-다공성물질 복합체 및 이의 제조방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0319687A (ja) | 1991-01-28 |
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