JPS6344885A

JPS6344885A - 酵素固定化ダイナミツクス膜

Info

Publication number: JPS6344885A
Application number: JP10103387A
Authority: JP
Inventors: Shigemitsu Abe; 重光阿部; Naomi Kikuchi; 菊地　直見; Tetsuya Kawakita; 川喜田　哲哉
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1986-04-26
Filing date: 1987-04-23
Publication date: 1988-02-25

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、多孔質支持体上に酵素固定物質を付着したダ
イナミックス膜の、当該酵素を固定化する物質に酵素を
固定化してなる酵素固定化ダイナミックス膜に関する。

このようなダイナミックス膜は酵素による分解反応およ
び合成反応し有効に使用される。

（従来技術）酵素の膜への固定化法としては、数多くの方法がある。

大きく分類すると、担体結合法、担体架橋法、イオン結
合法、物理吸着法などによる固定化法がある（千畑一部
蝙集”固定化酵素＃）。

尋とえは、担体結合法としては、コラーゲン膜のアジド
誘導体へのＬ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼを結合さ
せたもの（Ｄ、Ｃ，Ｇａｕｔｈｅｒｏｎ　ａｔａｌ、、
、　ＦＥＢ８　Ｌｅｔｔｅｒ＠、　１４　ｅ　１８５　
（１９７１）　）、担体架橋法としては・コロジオン膜
をビスジアゾペンジゾン訪導体によりパ・母インを膜の
表面で＃素を介して架橋させ固定化したもの（Ｅ、　Ｋ
ａｔｃｈａｌａ、ｋｌａｔ　ｍｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ
、　１５０　＋　７５８（１９６５す、イオン結合法と
しては、ＤＥＡＥ−セルロースペーｉＱ　−Ｋ　ラクタ
ーゼをイオン結合させて固定化したもの（Ｍ、Ｄ、　Ｌ
ｉ１ｌｙ＋　Ｂｉｏ、ｔｅｃｈｎｏｌ、、　Ｂｉｏｅｎ
ｇ、＋　１３　＋　５８９（１９，７１）　）、そして
物理吸着法としては、コラーグ／ｐＡにリゾチームを吸
着させたものがある（　Ｓ、Ｓ、　Ｗａｎｇ＋　Ｊ、　
Ｆｅｒｍｅｎｔ、　ｔｅｃｈｎｏｌ、、　５０　ｗ　６
０　Ｑ（１９７２））。

これらの固定化法は、いずれも高価な酵素を担体に固定
化し、水に不溶化することによって一長期にわたシ酵累
を繰シ返し利用し、かつ熱やＰＩ′１変化に不安定な酵
素を固定化によシ安定なものとすることを目的とはして
いるが、その目的は充分にｒ９．）達成されているとは言い難い。

ゾ：：：：゛ｌ：：二ｇｍ（７）１４！ｉｉｉ（ｌＺｍ
”ｔ’、６゜６゜酵素固定化膜では、酵素固定化量が少
なくならざるを得ないため、充分な酵素活性が得られな
い。

また、担体結合法、′担体架橋法で得られる酵素固定化
膜は、酵素が一度失活すると、固定化担体である膜その
ものが使用できなくなる。イオン結合法や物理吸着法で
得られる酵素固定化膜は、酵素反応条件に制限があった
り、酵素が膜から遊−してしまい不安定である楊竺が多
い。また、物理吸着法で得られる固定化酵素膜の場合に
は、固定化時に大量の酵素を必要とする場合が多い。そ
して１、これらの従来方法によって得られる固定化酵素
膜は、膜の孔径が制御困難な場合が多□いなど、多く（
問題点の解決手段と効果の概要）本発明者はこれら問題点の解消を目的として鋭意研究の
結果、酵素固定化担体である膜としてダイナミックス膜
を使用すれば良いことを発見し、′これに基づき本発明
を完成した。

すなわち、本発明の酵素固定化膜の製造に用いた画定化
法では、ダイナミックス＠製造時に用いるポリアクリル
酸などの安価な酵素固定物質を微少量用いることにより
、高価な酵素を少蓋用いて効率的に固定化でき、得られ
た固定化酵素膜は酵素がイオン結合又は共有結合で酵素
固定物質に固定化しているため、きわめて安定である。

また、酵素が失゛活した場合には、例えば、１規牢程度
の水酸化ナトリウ台で洗浄すやことにより、膜を形成し
ているポリアクリル酸などの酵素固定物質は、容易に爵
鋼しダイナミックス膜の基体である多孔質支持体力陽失
活した酵素を、酵素固定化膜とともに取り除くことがで
き、得られた多孔質支持体から同様の方法で酵素膜を再
生できる。

因みに、膜を用いた酵素反応では、基質が強制的に透過
させられるた応に、反応収率を高められることが知られ
ている（渡辺ら、第５１回化学工学協会研究兄表簡演要
旨集ｐ、４８８）。

そして、さらに本発明の酵素固定化ダイナミ。

クス膜の大きな特徴は、膜の孔径を自由に調整しうるた
め、酵素分解反応において酵素反応の進行と同時に酵素
分解により分子葉の低下した酵素分解反応生成物のみを
反応系外に除去でき、゛分解反応生成物を精製できると
ともに酵素反応条件を移行させ、反応収率を高められる
などのきわめて有利な点がある。

（解決手段の詳細な説明）ダイナミックス膜の基体となる多孔質支持体としては、
種々のもの、たとえば、アルミナ、シリカ、カーがンな
ど材質を問わず使用できる。多孔質支持体の孔径として
は、通常は１０μｍＪＪ、下のものを使用するが、これ
以上の孔径のものも必要に応じて使用する。多孔質支持
体がアルミナである場合の例としては、ＴＤＫ　（株）
製アルミナ（孔径０．０５μｍ、膜厚１．　Ｏｍ　）や
、日本碍子＠）製アルミナ（孔径０．２μｍ、膜厚３．
’Ｏ’ｍ　）がある。しかし、多孔質アルミナであれば
、これ以外でもどれでも使用することができ、また、そ
の形状もチューブ状、板状などのどれでもよい。他の材
質のものについても同様なことが言える。

酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、ウレアー
ゼ、アミノアシラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペル
オキシダーゼ、ソノ膏−ゼ、クルコースイソメラーゼな
どの種々の酵素が適用でき、加水分解、合成、転移反応
、酸化還元反応、および異性化反応など多くの反応が可
能である。

酵素固定物質としては、オキシ塩化ジルコニウム、ポリ
アクリル酸、ポリメタアクリル酸、ポリメサコン酸、−
リイタコン酸、ポリエチレンイミンなど多孔質支持体に
付着して、ダイナミックス膜をうくるものであり、かつ
、酵素を固定化しうるものであればどれでも使用できる
。□また、この物質を単独に用いても、あるいは、二種
類、三種類を組み合せて用いてもよい。

多孔質支持体上にこれらの酵素を付着させ、ダイナミッ
クス膜をつくる方法はすでに多くの検討がなされており
、たとえば、Ｔ、　Ｎｏｍｕｒａｅｔ　ａｌ　、　。

Ｄｅｓａｌｌｎａｔｉｏｎｅ　３２　ａ　３６　（，１
９８１）がある。

多孔質支持体上に酵素固定化物質を付着したダイナミ、
クス膜の製膜方法としては、上記の多孔質支持体を、限
外濾過膜あるいは逆浸透膜のかわりに、限外い過あるい
は逆浸透用セルに装着し、酵素固定物質の水浴液（たと
えば、濃度１００〜１００、ＯＯＯｐｐｍ）を、たとえ
ば、圧力１〜７０’ｑｌ／ｃｍ”で適当時間循環し、こ
の後、この液を取り除き、水洗して使用する。

たとえば、酵素固定物質として、オキシ塩化ジルコニウ
ムを用いる場合は、上記の製脱方法に従う。

酵素固定物質として、ポリアクリｆｉｖＷｔｚｙｌリメ
タクリル酸などのポリカルデン酸を用いた場合は、上記
の製膜方法に従い、まず、これらの水溶液をｐＨ２〜３
で適当時間、循環する。〆Ｉを２〜３に調整する理由は
ポリアクリル酸などのポリカルダン酸がこの一範囲で分
子間会合し、グルを形成するためと推定される。ついで
この循環液の−を２〜７に調整後、この液を除き、水洗
して使用する。

′　　−をこの範囲に調整する理由は、ダイナミックス
膜の洗浄と定着を行なうためである。

さらに、酵素固定物質として、オキシ塩化ジルコニウム
とポリカルがン酸、１ｆｃＩｉ、ポリカルがン酸とポリ
エチレンイミンなどの組み合せＫより、さらに安定なダ
イナミックス膜を得ることができる。たとえば、切出ら
、第５１回化学工学協会研究発表講演槻旨集ｐ、４５４
参照。この場合、１度、オキシ塩化ジルコニウムやポリ
カルがン酸で上記と同様に製膜しておき、これにイオン
交換させるように、それぞれ、ポリ力ルビ／酸やポリエ
チレンイミンを付着させる。このときも、濃度は、たと
えは、１００〜１００，０００　ｐＨ１ｍ１圧力は、た
とえは１〜７０　ｋｇ／ｍ”で適当時間これらの水溶液
を循環させて、付着させる。すなわち、オキシ塩化ジル
コニウムとポリアクリル酸などのポリカルデン散の組み
合せでは、前者がカチオン性コロイドであり、それに対
して後者がアニオンとしてイオン交換し、結合する。ま
た、ポリアクリル酸などのポリカル？ン醸と４リエチレ
ンイミンの系についても、前者がアニオンとして働き、
後者がそれに対しカチオンとしてイオン交換、結合する
ため非常に安定なダイナミックス膜をつくるＯこれら、多くの方法で、多孔質支持体に対して酵素固定
物質を付着し、ダイナミックス膜をつくることができる
。これらのダイナミックス膜の膜孔径は、いずれの方法
も酵素固定物質水溶液の濃度や、この水溶液を循環する
際の圧力などが主に、ダイナミックス膜の膜孔径を決定
する。これに加え、ポリアクリル酸などのポリカル？／
酸を用いた場合には、これらのポリカルがン除の水溶液
を適当時間循環した後、この水溶液をｐＨＲ整し、この
ときの声によシダイナミ、クス膜の膜孔径が決定される
。

たとえば、オキシ塩化ジルコニウムの上にプリアクリル
酸を付着させてダイナミックス型限外濾過膜をつくる場
合には、圧力５　ｋｇ／ｃｍ”でオキシ塩化ジルコニウ
ム（１，０００ｐｐｍ　）水溶液を循環し、これを除き
、さらに、ポリアクリルｃ＆（２，５００ｐｐｍ　）水
溶液を圧力５　ｋｇ／ｃｍ２で循環し、これを除去し、
−を２〜７の塩酸水＊ｉで洗浄、装着を行なう。このと
き、ｐｔｌを２にすると膜の分画分子量は６，０００程
度で、−を４にすると１０，０００程度に、−を７にす
ると５０，０００程度に鬼９、分画分子量を調整するこ
とができる。分画分子量は、膜の孔径と直接関係づけら
れ、その測定は平均分子量の異なるプリエチレングリコ
ールを用いて阻止率を測定し、阻止率９０％のときの分
子量を分画分子量とした。なお、阻止率は次のように定
義される。

阻止率＝（１−（透過液濃度／フィード液＃度））Ｘ１
００％ここで得られたダイナミックス膜への酵素の固定
化方法を以下に述べる。

酵素固定物質をオキシ塩化ジルコニウムとし、これを付
着させてダイナミックス膜とした場合には、これを充分
水洗した後、たとえば、限外濾過用セルに限外濾過膜の
代りに装永しｗ累をたとえは、１００　ｐｐｍ以上の濃
度に調製した水溶液を圧力をたとえば１〜７０　ｋｇ／
ｃｍ”で循環し、酵素をオキシ塩化ジルコニウムの上に
イオン結合させて固定化し、水洗後、使用する。

酵素固定物質をポリアクリル酸などのポリカルがン酸や
プリエチレンイミンを用いて製膜した場合には、これら
の酵素固定物質に直接共有結合により結合させ、酵素を
固定化する。酵素はポリペプチドであるので、酵素分子
中には種々のアミノ酸がペプチド結合で結合している。

そのため、酵素分子末端や酵素分子側鎖には、リジン、
アルイ二ン、ヒスチジンのアミノ基や、グルタミン酸、
アスノＪ？ラギン酸のカルボキシル基が存在し、これを
固定化反応に用いることができる。ポリアクリル酸を用
いてダイナミックス膜を形成している場合は、ポリアク
リル酸中のカルぎキシル基と酵素分子中のアミノ基とを
ペプチド結合で結合させることによって、ダイナミック
ス膜に固定化できる。

また、ダイナミックス膜がアミノ基をもつ一すマーで形
成されている場合には、逆に酵素分子中のカルボキシル
基とペプチド結合で、結合させることができる。

これらのペプチド結合は、種々の方法でつくられる。す
なわち、縮合剤を用いる方法、酸クロライド法、アジド
遊導体を用いる方法などがあるが、縮合剤を用いる方法
が最適であると考えられる。

酸クロライド法やアシド誘導体を用いる方法などでは、
酵素固定物質と酵素との反応が制御困難で、反応が進み
すぎることで、酵素機能を失なったり、反応試薬が強す
ぎて、例えは、大きなＰＨ変化をまねくなどのため、や
はり酵素の失活をまねく場合が多い。

縮合剤としては、１−　Ｅｔｈｙｌ　−３−（３−ｄｉ
ｍｓｔｈｙｌ　ａｍｉｎｅ　ｐｒｏｐｙｌ　）　−ｅａ
ｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｈｙｄｒｏａｈｌｏｒｉｄｅ　（
和光紬薬工業＠）製）、１）ｉｃｙａｌｏｈｓｘｙｌ　
ｃａｒｂｏｄｉｉｍｌｄｅなどが苗げられるが、前者の
試薬は、非常に温和な条件で（プチド結合をつくること
ができ、また、水中で反応が可能であるため、操作が容
易である。また、縮合剤の量を調節することにより、ｗ
床固定物質に対して結合する酵素の量を調節したシ、酵
素１分子あたりの酵素固定物質の結合部位の数を調節す
ることができる。

縮合剤を用いて酵素の固定化反応をするには、酵素固定
物質が、たとえば、官能基としてカルボキシル基を有す
る場合、その声を４〜７にｉｌａ！整して反応させる必
要がある。また、官能基がアミノ基である場合には、ｐ
Ｈ７〜８程度で反応しなければならない。これは、酵素
固定物質の官能基が完全に解離する声を除き、さらに酵
素のＰＩ（Ｋよる失活を防止するために必要な条件であ
る。酵素固定化の際の反応条件としては、たとえば濃度
０．１〜５チ程度の酵素溶液をダイナミックス膜の膜面
積１０ｃＩｎ２について２０ｍ７程度用いて反応させる
。この場合、上記縮合剤を酵素１１につき０．０５ｇ以
上用いれば充分である。

酵素固定化反応は、ダイナミックス膜を適当時間酵素溶
液に浸漬するか、酵素溶液をたとえば１〜７０　ｋｌ／
ｃｍ”の圧力をかけて膜透過させながら反応固定化させ
る方法のいずれでもよい。

反応に使用する縮合剤の蓋は、これが多すぎると、膜の
酵素活性を低下させる。これは酵素ができるだけ自由に
動ける状態で固定化される必要があるためと考えられる
。

このようにして酵素を固定した酵素固定化ダイナミック
ス膜は、酵素が失活した場合には、前述のように、１規
定程度のアルカリ水溶液を用いることによシ、多孔質支
持体が充分再生し、再度固定化に用いることができる。

しかし、縮合剤の酵素に対する制令が酵素１．９に対し
、０．５ｇを越える場合や、固定化酵素ダイナミックス
膜を用いた反応時における目づまシの場合には、アルカ
リ水溶液で再生しにくい場合がある。このようなときに
は、膜を電気炉等で焼くことにより多孔質支持体が再生
でき、また、焼くことにより無機物が残存する場合には
、膜を水で逆循環洗浄して無機物を取り除き、再生する
ことができる。

この酵素固定化ダイナミックス膜を用いての酵素分解反
応および酵素合成反応は、たとえば限外濾過装置又は逆
浸透装置に限外ｒ過膜又は逆浸透膜の代シに酵素固定化
ダイナミックス膜を装着し、たとえは７０睦／百２以下
の圧力を用いて、基質溶液を循環し、限外濾過あるいは
逆浸透により生成物のみを、あるいは、基質及び生成物
を強制的に透過させながら行なうととができるため、酵
素分解反応では、生成物の精製ができかつ反応収率を高
められ、酵素合成反応においても、反応収率を高められ
る。また、この酵素固定化ダイナミックス膜は、多孔質
支持体の表面にも、かなりの酵素が酵素固定物質を介し
て反応固定化されているため、圧力をかけずに基質を循
環するだけでも酵木反応しうる。

酵素固定化ダイナミックス膜に、固定化されている酵素
量は、固定化膜をアルカリ洗浄し、この洗浄液中に存在
する酵素量を窒素分析により、標品の酵素溶液と比較し
て算出できる。なお、窒素分析は、たとえば、三菱化成
工業（株）　！ｉｌ！ｌ　ＭＣＩ　ＴＮ−０１型窒素分
析計を用いて行なえる。

（実施例）以下に１実施例にて、さらに本発明を説明する。

実施例１　オキシ塩化ジルコニウムによるダイナミック
ス膜の製膜と酵素固定化方法および酵素反応ＴＤＫ　（株）製アルミナチューブ状セラミ、クス（膜
面積７５　ａｍ”　、孔径０．０５μｍ１膜厚１．Ｏｍ
）をＴＤＫ　（＆）製ＤＣＯＯＯ５型限外ヂ過装置に限
外濾過膜の代９に装着し、１１００ｐｐのオキシ塩化ジ
ルコニウム水溶′ｆ１２ｉ５４を１５時／謂鵞で１５分
間循環し、水炉速が２７　ｄ７　ｍｉｎとなったところ
で循環水を排出し、これに１／１５Ｍリン酸パ、ファー
（ｐＨ７，４）５１に溶解した０、５ｇの蛋白分解酵素
Ａｃｔｉｎａｓｅ　Ｅ（科研製薬（株）製、この酵素は
ペプチドからそのロイシン部分を特異的に切断する。）
を同様に１５　ｋｔｉ／ｃｍ”で１５分間循環し、酵素
の固定化を行なった。

この後酵素溶液を排出して、酵素固定化ダイナミックス
膜を水洗した。この水洗は、洗液に酵素が含まれなくな
るまで行なった。すなわち、水洗液を血粉水溶液に加え
て、酵素分解活性をみた。

これにより、酵素の漏出がみられなくなってから血粉水
溶＃３Ｊ（ｌｌｋ展１０係−／、、　）を循環させた。

１時間に生成したロイシン蓋は、１０．４ｍ９であった
。

また、このとき同時に、循環液をサンブリングして放置
し、この中のロイシン裏展を測定すると、２０分後の３
．４ダ／ｄｉから３時間後の５７．Ｏダ力ｔまで増加し
て循環液中に膜中の酵素が漏出したことを示した。

これは、イオン結合法でつくった酵素固定化ダイナミッ
クス膜では循環液を循環することによｐ１酵素が漏出し
てしまい、不安定であることが判明した。因みに、この
ような不安定さであっても、従来のイオン結合法による
膜に比較して膜孔径を調整し得るという点で優れている
。

因みに、本実施例の酵素固定化ダイナミックス膜の分画
分子量は２０，０００であった。

実施例ＩＡ　　／リアクリ／Ｌ’ｌＷによるダイナミッ
クス膜の成膜と＃素固定化方法および酵素反応日本碍子（株）製平板状多孔質アルミナ（孔径０．２μ
ｍＳ＠厚３．０　ｍ　）を面積１２譚２の円板状に切断
し、アルパ、り（株）製限外濾過装置（ＭＣ−２Ａ）に
限外テ過膜のかわりに装着し、水炉速を測定した。との
ときの水戸速は、圧力３．５に９／ｃｍ”で３６３１／
／ｍｉｎであった。これに、ポリアクリル酸水溶液（濃
［２，５００ｐｐｍ　）　５０　ｍを圧力３．５ｋｇ／
ｃｍ”で５分間通じた後、この溶液を排出して、次圧、
純水を３．５　ｋｇ／ｃｍ”で通じて、膜の洗浄、定着
を行なった。

この膜を取り出し、膜面の水をＦ紙でふきとり、酵素を
付着させた。酵素は、蛋白分解酵素Ａｅｔｉｎａｓｅ　
Ｅ　（科研製薬＠）Ｍ）を用い、これを１係（ｗ／ｗ　
）溶液とし、２０ｍ１用いた。これに縮合剤１−、Ｅｔ
ｈｙｌ　−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ａｍｉｎｅ　
ｐｒｏｐｙｌ　）−ｅａｒｂｏｄｉｉｍｌｄｓ＋　ｈｙ
ｄｒｏｅｈｌｏｒｉｄｅ　　３０ｍｌを加えて、ｐＨを
４．ＯＫ調整した。この液に、上記で製膜したダイナミ
ックス膜を浸漬し、２４時間反応した。

この後、膜を取り出し、水洗し、０．１１アジ化ナトリ
ウム水酸液（防腐剤）中に保存した。

この固定化酵素にの酔素址は、金木分析により、３０■
であることがわかった。また、膜の分画分子量は、約２
０，０００であった。

この固定化酵素膜を水洗して防腐剤を除去した後、上記
限外濾過装置に装着し、血粉の酵素分解を行なった。血
粉水溶液１０１００ｌ血粉濃厩１０％　（ｖ／ｗ）　、
ｐ’　８．０　）を限外Ｖ過装置に入れ、４５℃で５時
間、圧力０．１’　ｋｇ／ｃｍ”で酵素分解した。この
ときの水枦速は０．１５　Ｒ／／ｍｉｎであり、５時間
後透過液中には、１８′ＩＩ９のロイシンが生成してい
た。

実施例２　オキシ塩化ジルコニウムと？リア夛すル酸に
よるダイナミックス膜の製膜と酵素固定化方法および酵素反応日本碍子＠）製平板゛状多孔質アルミナ（孔径０、２　
μｍ　％膜厚３．　Ｏｍ　’）を面積１２　’ｃｍ２の
円板状に切断し、アルミパック（株）製限外ｐ過装置（
ｙｃ’−２Ａ’）　　に限外濾過膜のかわりに装着し、
水戸速を測定した。このときの水Ｐ速は、圧力３．５ゆ
１５＋２で３６　ｍ／ｍｉｎであった。

これに、オキシ塩化ジルコニウム水溶液（濃度１．００
０　ｐｐｍ　）　５０ｄ！を圧力３．５　ｋｇ／ｃｒｓ
”で５分間通じ喪後、この溶液を排出して、次に、ポリ
アクリル酸水溶液（濃度２，５００　ｐｐｍ　）を塩酸
でｐＨ２，０に調製した液を２０１１／用いて圧力３．
５　ｋｇ／ｃｍ”で１゜分間通じた。この′稜、ポリア
クリル酸水溶液を排出し、純水１００１を用いて５分間
、圧力３．５に９／ｃｍ”で膜の洗浄および定着を行な
った。このときの水ヂ速は、０．４４　ｄ／ｍｌｎであ
った。

この後、膜を取り出し、水洗して、膜面の水をｐ紙でふ
きとりＳ酵素を付着させた。すなわち、酵素は、蛋白分
解酵素Ａｅｔｉｎａｓｅ　Ｅ　（科研製薬（株）ｊＢ）
を用い、これを１　’４　（ｖｒ／ｗ　）溶液として２
０ｊｔ／用いた。これに、縮合剤１−　ｇｔｈｙｌ−３
−（３−ｄ１ｍ＠ｔｈｙ１　ａｍｌｎｏ　ｐｒｏｐｙｌ
　）　−ｅａｒｂｏｄｉｉｍｌｄｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏ
ｒｉｄｍ　３０　ＴＩＱ加えて−１を４．０に調整し元
。

この１１ｆ［、上記で製膜したダイナミックス膜を浸漬
し、２４蒔間反応させた。この抜、膜を取り出し、水洗
し、０．１％アジ化ナトリウム水溶液（防腐剤）中に保
存した。

この固定化酵素膜の酵素蓋は、仝素分析により６０１Ａ
９であることがわかった。また、膜の分画分子量は約５
０，０００であった。

この固定化酵素膜を水洗して防腐剤を除去した後、上記
限外濾過装置に装置し、血粉の酵素分解を行なった。血
粉水溶液１００Ｉｎｌ！（血粉濃度１０％（ｗ／ｖｒ）
、ｄ（８，０）を限外濾過装置に入れ、４５℃で５時間
、圧力０．２　’ｋｇ　７ｃｍ”で酵素分解した。この
ときの水炉速は、０．１　ｍ／／ｍｉｎであ夛、５時間
後透過液中には３５１Ｒ９のロイシンが生成していた。

実施例３　縮合剤の量と酵素活性縮合剤の濃度を０．８Ｘ１０−２Ｍから３．Ｉ　Ｘ　１
０−２Ｍまで変化させた以外は実施例２と同様の実数を
行ない、縮合剤の量と酵素活性とめ間の関係を調べた。

酵素活性は生成したロイシン量で示した。

結果を第１図に示した。第１図に示すように、縮合剤が
多すぎるとロイシン生成量は低下し、酵素の活性の低下
が認められた。このことから、この場合は、縮合剤の童
は酵素ＩＩＩに対し２００１ｎ９程度あれはよいことが
わかった。

実施例４　酵−固定化ダイナミックス膜の安定性実施例
２の酵素分解反応を繰シ返し行なうことによって、膜の
安定性を検討した゛。

実施例２で用いた酵素固定化ダイナミックス膜を圧力２
．０　ｋｙ／ｃｍ２で水洗し、１５時間、０．１１（Ｗ
／Ｗ　）アジ化ナトリウム水溶液中に保存し、再度、同
様の酵素分解反応を２時間行ない、生成したロイシン量
を測定した結果、１５回目までの使用でも第２図に示す
ように、はぼ一定の酵素活性が得られ、本発明の酵素固
定化ダイナミックス膜の安定性が示された。

実施例５　インベルターゼの固定化によるスクロースの
転化反応日本碍子（株）製平板状多孔質アルミナ（孔径０．２μ
ｍ１膜厚３．　Ｏｗｒｍ　）を面＆１２ｔＹｎ２の円板
状に切断し、アルパック（株）製限外涙過装置（’ＭＣ
−２Ａ）に限外ν過膜のかわりに装着し、水涙速を測定
した。このときの水戸速は、圧力３．５　ｋｇ／ｃ＊２
で、３６１１１７ｍ　ｉ　ｎ　であった。これに、ポリ
アクリル酸水浴液（濃度２００ｐｐｍ）１００＋ＩＬｌ
を圧力３．５　ｋｇ／ｃｍ２で５分間通じた後、この溶
液を排出して、次に純水を３．５　ｋｌ／ｃｍ２で通じ
て、膜の洗浄、定着を行なった。

この膜を取り出し、膜面の水をｐ紙でふきとり、酵素を
付着させた。酵素は、インベルターゼ（和光紬薬（株）
酵母製）を用い、これを１１（Ｗ／ｖ）溶液として２０
１１Ｌｌを用いた。これに縮合剤１−Ｅｔｈｙｌ　　−
３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ　　ａｒｎｌｎｏ　ｐｒｏ
ｐｙｌ　　）　−ｅａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ　ｈｙｄｒ
ｏａｈｌｏｒｉｄｅ　　３０Ｑを加えて、ＰＩ（４，０
に０．ＩＮ塩酸水溶液で調整した。

との液に、上記で製膜したダイナミックス膜を浸漬し、
２４時間反応させた。

反応稜、固定化ダイナミックス膜を水洗して、１．０１
１７ｄｉのスクロースを圧力０．５　ｋＩＩ／ｃｔｐｔ
”　、温度２５℃、透過速度０．２５１Ｖｍｉｎで通じ
た。これにより為基質が５０ＴＩＬ！透過したとき、グ
ルコースが約９２憾の収率で得られた。

実施例６　サーモライシンの固定化によるペグチドの合
成上記実施例と同様の方法で、ダイナミックス膜を製膜し
、この膜をサーモライシン（大和化成（株）製）を１．
０　％　（ｗ／ｖ）　Ｍ液として２０ｍ用い、上記と同
様の縮合剤を加え、ｐＨ４，ＯＫ　０．　Ｉ　Ｎ塩酸水
溶液で調整し、２４時間４℃で浸漬固定化した。

反応援、酵素固定化ダイナミックス膜を水洗して、２０
ｍｎｏ）ｔのＬ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸
塩と１０ｍｍｏｔのＺ−Ｌ−アスｔ４ライン酸を含むり
ん酸緩衝液（ｐｉ４６．５　）　１００ｖＩｌを３０℃
、圧力０．５ｋｇ／ｃｒｎ２、透過速度Ｑ、　２ｒｎｌ
／ｍ　ｉｎで通じた。

これ罠より、Ｚ−Ｌ−アスＡ？ルチルーＬ−フェニルア
ラニンメチルエステルが、５０１Ｌｌの基質透過時にお
いて０．１８ｍｍｏｔ生成した。

注Ｚ−Ｌ−アスハラギン酸：ヘンジロキシカルデニルーし
一アスパラギン酸（Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−レＡｓｅ）Ｚ
−Ｉ、−７ス／ｌルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチル
エステル：ベンジロキシカルＩニルーＬ−アスｉ４ルチ
ル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｅａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−Ａｓｐａ
ｒｔｙｌ−Ｌ−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ｍｅｔｈ
ｙｌｅｓｔｅｒ　）

【図面の簡単な説明】

第１図は、縮合剤の量と酵素活性との間の関係（実施例
３参照）を示し、第２図は酵素固定化ダイナミックス膜
の繰シ返し使用回数と酵素活性との間の関係（実施例４
参照）を示す。第１図０　　　　１．０　　　２．０　　　３Ｑ縮合剤の濃度
（ｘｉσ２（Ｍｌｌ第２図繰り返し使用回数

Claims

【特許請求の範囲】

多孔質支持体上に酵素固定物質を付着したダイナミック
ス膜の、当該酵素を固定化する物質に酵素を固定化して
なる酵素固定化ダイナミックス膜。