JPS5998690A - 酵素固定化膜の架橋化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分ヱＪ・〕 本発明は酵素を固定化した膜を架橋化試薬の気相中で架
橋する酵素固定化膜の架橋化方法に関するものである。

〔発明の技術的背景とその問題点〕

近年、酵素の侯れた特性に看目し、これをノ（イオセン
サー等、工業的に応用しようとする趨勢がんまってきて
いる。ところが、酵素は一般ｌこ高価である上、その特
性が不安定であり、しかも水溶性であるため、そのまま
の状態で使用した場合、再使用が不可能となり工業的な
利用価値が少ない。このため酵素を各種の高分子を担体
として、これに固定化する、いわゆる酵素固定化法が開
発され、酵素の再使用が可能となってきた。

従来開発されている酵素固定化法としては大別して■共
有結合法、■架橋化法、■包括法などがある。

前記■の共有結合法は酵素分子と、官能基を有する高分
子担体（例えばアガロースゲル等）とを反応でせて固定
化する方法である。この方法は酵素と担体を直接共有結
合するので酵素の脱離は々いが、固定化方法が煩雑であ
り、固定化操作中の酵素の失活も大きく、活性が不安定
な酵素の固定化には適用することができない。

また■の架橋化法は、酵素分子同志を適滴な架橋化試薬
で架橋化して不溶化するものである。

この方法は、酵素分子が固定化操作中にかなり大きなダ
メージを受けて失活するため、比活性が高く、活性が安
定なごく一部の酵素の固定化にしか適用することができ
ない。

■の包括法は、酵素分子を伺ら修蝕することなしに高分
子マトリックス中に封じ込める方法である。例えばコラ
ーゲン膜に酵素を固定化する場合について説明すると、
０．５％程匿の酵素水溶液（あるいは緩爾溶液）とコラ
ーゲン懸濁液（０，３〜１％：牛皮よシ調整、ｐＨ４前
後）とを良く混合し、真空ポンプを用いて脱泡した後、
テフロン板上（（適当な厚さにキャスティングする。次
いで数時間室温（必要に応じて低温）で風乾した後、テ
フロン板上より剥離して酵素固定化膜を得るものである
。

この包括法による方法は酵素を架橋化しないので、固定
化操作中の酵素の失活に最小限に抑えることができるの
で、比較的不安定な酵素の固定化にも適用できる利点が
ある。

ところがこの包括法では酵素が単に高分子マトリックス
中に包括されているだけであるので、繰り返し使用に伴
ない少しずつ酵素が脱離していく。このような酵素の脱
離・漏出を防止するため、グルタルアルデヒドのような
多官能性架橋化試薬を酵素包括時に混入するか、もしく
は製膜後、架橋化剤の溶液中に数十秒から数分間浸７責
することにより担体となるコラーゲン織細を立体的に架
橋化して、使用中における酵素の脱離・漏出を防止して
いる。

しかしながら、この方法では架橋反応が水系で急速に進
行するため、その反応制御が難しく、担体のみ局部的な
架橋を行がうことができないので、担体のみならず酵素
分子までも架橋化される危険があり、酵素活性の低下を
まぬがれない。特に浸蹟法で行なう場合には、膜の収線
、膨潤によるＣ形が起き易く、その後の乾燥工程が必要
なことがら膜質が劣化する上、処理操作中に酵素が漏出
し、その上工程が複雑で且つ試薬を多量に必要とし、し
かも処理が開放系で行なわれるため環境中への架橋化試
薬の漏洩などの問題があった。

〔発明の目的〕

本発明は、かかる従来方法の欠点を除去し、反応側割が
容易で、酵素活性の低下や膜質の劣化がない上、工程が
簡略で、使用する架橋化試薬も少量で良く、環境中への
試薬の漏洩も少ない酵素固定化膜の架橋化方法を提供す
るものである。

〔発明の概要〕

本発明（１酵素を包括固定化した酵素包括固定化膜を架
橋化試薬の気相中で、温和な条件下で担体のみを架橋化
させることを特徴とするものである。

本発明において用いる酵素としては活性が不安定なもの
から安定なものまで何れの酵素にも適用することができ
る。

有する高分子化合物であればイロＪれでも良く、例えば
アルブミン、ポリエチレンイミン、ポリリジン、コラー
ゲン、寒天、ポリアクリルアミド等が挙られる。また固
定化担体は膜状に限らず、上記官能基を有するブロック
状固定化担体にも適用することができる。

更に本発明に用いる架橋化試薬としては、気相状態にな
る多官能性試薬であれば何れでも良く、例えばクロトン
アルデヒド、）くラホルムアルデヒド、アクロレイン、
グルタルアルデヒド等のアルデヒド類、並びにジチオシ
アナート類、ジイソシアナート類等も使用することかで
きる。

本発明方法は酵素を固定化担体となる高分子化合物溶液
に混合し、これを基板上にキャスティングして包括法に
より酵素固定化膜を形成した後、これを乾燥して基板か
ら剥離する。この酵素固定化膜を、気相状態にある多官
能性架橋化試薬のガス中に放置して固定化担体を架橋化
するものである。なおこの際、酵素分子の大きさく分子
量）や性質に応じて、架橋化試薬の種類および処理時間
等、架橋化処理条件を適宜選定する必要がある。

〔発明の実施例〕

以下本発明の詳細な説明する。

（実施例１） 酵素としてピルビン酸オキシターゼ（以下ＰＯＰという
）を用い、先ず１００　ｍＰのＰＯＰを１０ノ（湿ル：
量）のコラーゲン懸濁液（０，６重＠−％、ｐＨ４，０
）　ＶＣ混合シ、ホモジナイザーで１分間撹拌（３００
ｒ、ｐｌｍ　）［、た後、デシケータ−中にて減圧下（
１０−”　ｔｏｒｒ程度）で５分間脱泡を行なった後、
これをテフロン基板上にキャスティングした。この後、
３０　’Ｃ，通風下で３時間乾燥した後、これを基板か
ら剥離して、得られた爾：素固定化膜の膜厚を測定した
ところ平均６０μｍであった。

一万、第１図ＦＡＩおよび（Ｂｌに示すように、上面中
央に凹部１を設けた支持台２を、ガラス容器３内に設置
し、このガラス容器３内に架橋化試薬４として１％グル
タルアルデヒド（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐ　Ｈ７，４
）　５　ｍ　ｌを封入し、容器円部をグルタルアルデヒ
ドの架橋化試薬蒸気で充満した状態としておいた。

前記酵素固定化膜５を１１１＝Ｘ１偏角に裁断して、こ
ｔ′Ｌを前記ガラス容器３内の凹部ｌにのせて、室温（
２５〜２７°Ｃ０）に放置して架橋化を行なった。

このようにして１０分毎に、酵素固定化膜５をガラス容
器３から取り出し、夫々の試料を４０ｍＭピルビン酸ナ
トリウムを基質として酸素＠極を用い、父応に伴う溶存
酸素の減少用から酵素活性を測定した。この結果、未架
橋処理の酵素活性を１００％とした相対値で、架橋時間
を変えた夫々の酵素活性は第２図のグラフに示すように
なった。このグラフから明らかなように架橋処理時間の
増大に伴い、コラーゲン繊維の内部に包括されているＰ
ＯＰの中心近傍まで架橋化が進行して、酵素活性が低下
したものと推察され、この場合１０分程度の処理により
コラーゲン繊維のみ架橋化するのが最適であることが分
った。

またこの酵素固定膜の保存性、即ち繰り返し使用による
酵素の漏出について、上記方法にょ９１０分間処理して
膜表面の架橋化を行なった試料を用いて測定した。この
結果、保存安定性に第３図のグラフに曲線ａで示すよう
に３週間に亘って初期活性の５０％以上の活性を示し、
曲線すで示す。未架橋の酵素固定化膜に比べて、格段に
優れた保存安定性を有することが確認された。

（実施例２） 上記実施例１ｖｃおいて、酵素としてグルコースオキシ
ターゼを用いた他は同様の方法でコラーゲン膜中に包括
固定化し、第１図に示す装置を用いて同一の条件で１０
分間架橋化処理を行なった。このようにして得られた酵
素固定化膜の保存安定性を調べたところ、未架橋の酵素
固定化膜に比べて活性半減期が約２倍に向上した。

〔発明の効果〕

以上説明した如く、本発明に係わる酵素固定化膜の架橋
化方法によれば、架橋化処理が気相反応で温和な条件下
で進行するため、担体のみの架橋化を行なうような反応
制御が容易であり、非常に不安定な酢累に対しても、酵
素活性の低下を防止して保存安定性を向上てせることか
できる。更に本発明によれば、水系で行なわれる従来の
架橋化に比べて工程が簡略化でき、膜質の劣化や酵素の
漏出も少なく、しかも使用する架橋化試薬が少Ｉで良い
上、密閉系で行なわれるので環境中への試薬の漏洩も少
々いなど顕著な効果を有するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図（Ｎは不発明により架橋化処理を行なう装置の平
面Ｌ、同図（Ｂ）はその縦断面図、第２図は気相状態で
架、橋化処理した酵素固定化膜の処理時間の経過に伴な
う残存活性の変化を示すグラフ、第３図に本発明と未架
橋の酵素固定化膜の保存安定性を比較したグラフである
。 ｌ・・凹部、２・・・支持台、３・・・ガラス容器、４
・・・架橋化試薬、５・・・酵素固定化膜。 出願人代理人　弁理士　鈴　江　武　彦第１図 （Ａ） 第２図 クルクルアルテじトｈ理椅開（り） 第３図 桿ｔ＋田数、（日）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵素を包括固定化した酵素包括固定化膜を架橋化
   試薬の気相中で架橋化させることを特徴とする酵素固定
   化膜の架橋化方法。
2. （２）架橋化試薬が多官能性アルデヒドあるいは