JP2787507B2

JP2787507B2 - 生理活性物質を固定化した担持物とその製造方法

Info

Publication number: JP2787507B2
Application number: JP16387890A
Authority: JP
Inventors: 哲郎朝倉; 治利酒井; 計一小松; 聡栗岡
Original assignee: DAINIPPON SANSHIKAI; NIPPON BAIRIIN KK
Current assignee: DAINIPPON SANSHIKAI; NIPPON BAIRIIN KK
Priority date: 1990-06-21
Filing date: 1990-06-21
Publication date: 1998-08-20
Anticipated expiration: 2013-08-20
Also published as: JPH0453490A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）この発明は、バイオセンサー、バイオリアクターなど
に利用される酵素や微生物などの生理活性物質を固定化
した担持物とその製造方法に関する。

（従来の技術）近年、触媒活性を有する酵素、微生物など（以下「生
理活性物質」という）を担体に固定化した担持物が開発
され、医療業界、医薬品業界、食品業界、環境浄化業界
など、幅広い分野で利用されている。

そして、この担持物の担体として繊維集合体を用いる
と、例えば、フィルムなどの場合よりも、単位体積当た
りの基質との接触面積が大きくなるので、その分、反応
の効率がよくなる。しかも、繊維集合体を用いれば、バ
イオリアクターなどに使用するときに、特別な充填装置
がいらないので、取り扱いが簡単になる。

このような利点を考慮して、従来から繊維集合体を用
いた担持物が種々開発されているが、この種のものとし
て、例えば、特開昭60−224618号公報及び特開昭60−12
0988号公報に開示された発明が従来から知られている。

上記特開昭60−224618号公報所載の発明（以下「前者
の従来例」という）は、繊維表面にアミノ基、カルボキ
シル基、フェノール基などの特定の官能基を導入し、こ
れを生理活性物質の持つ官能基と反応させ、共有結合さ
せるようにしている。

また、特開昭60−120988号公報所載の発明（以下「後
者の従来例」という）は、耐熱性繊維からなる不織布
に、生理活性物質を混合したゼラチンなどの天然凝固剤
を付着させ、天然凝固剤を加温凝固させるようにしてい
る。

（発明が解決しようとする課題）上記前者の従来例では、繊維に官能基を導入したり、
共有結合させたりしなければならないので、その操作が
煩雑になるという問題があった。しかも、共有結合の反
応の際に、生理活性物質の活性が低下する、いわゆる失
活が生じやすいという問題もあった。

これに対して、後者の従来例には、繊維と生理活性物
質との間に実質的な結合がなく、天然凝固剤に包囲され
る形で生理活性物質が繊維に固定化されるので、前者の
従来例のような問題は生じない。

しかし、この後者の従来例では、生理活性物質の活性
中心に向う基質の移動を、天然凝固剤が阻害するので、
基質が反応しにくくなるという問題があった。しかも、
加温凝固を必要とするので、熱に強い生理活性物質しか
使えないという問題もあった。

この発明の目的は、生理活性物質を活性の高い状態
で、かつ、基質との接触面積の大きい状態で固定化でき
る担持物とその製造方法を提供することである。

（課題を解決するための手段）この発明の担持物は、親水性繊維を主体とする不織布
の構成繊維の表面に、タンパク質などの大きな分子は通
過できないが、反応基質などの小さな分子は通過できる
絹セリシン又は絹セリシンと絹フィブロインとの混合物
からなるゲル層を形成し、このゲル層に生理活性物質を
内包した点に特徴を有する。

また、この発明の担持物の製造方法は、親水性繊維を
主体とする不織布に、生理活性物質を含む絹セリシン水
溶液又は生理活性物質を含む絹セリシンと絹フィブロイ
ンとを混合した水溶液を含浸させる工程と、これを乾燥
する工程と、アルコール水溶液により不溶化する工程と
からなる点に特徴を有する。

なお、以下には、絹セリシン、及び絹セリシンと絹フ
ィブロインの混合物、の両者を同時に表現するときには
「絹タンパク質」という。

（本発明の作用）この発明の担持物は、不織布とゲル層との親和性が非
常に高いので、この不織布の表面に薄くて均一なゲル層
がしっかりと付着し、そのゲル層が脱落したりしない。

絹タンパク質からなるゲル層は、表面部では結晶構造
領域が集中し、内部ではこの領域が少ない不均一な構造
になっている。そのために、分子が大きい酵素などの生
理活性物質はゲル層から出られないが、低分子である基
質や反応生成物は自由に出入できる。また、ゲル層内で
は生理活性物質の自由度が大きいので、基質などと反応
しやすい状態になっている。

特に、繊維が三次元的に絡合した不織布は、基質と接
触できる繊維表面の面積が大きくなるので、反応効率が
よくなるとともに、基質の通過抵抗を低くできる。

この発明の担持物の製造方法では、親水性繊維を主体
とする不織布に、生理活性物質を含む絹タンパク質水溶
液を含浸させるようにしたので、その含浸効率はきわめ
て良好となる。また、この含浸した水溶液は、アルコー
ルによって不溶化されるので、その不溶化に要する時間
が短くてすむ。

（本発明の実施例）この発明に用いられる生理活性物質とは、例えば、グ
ルコースオキシターゼ、アルカリ性フォスファターゼ、
アスパルターゼ、アミラーゼ、インベルターゼなどの酵
素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、アデノシ
ントリホスフェート、補酵素−Ａなどの補酵素、ムコー
ル、リゾプスなどの糸状菌、サッカロミセス、ピヒア、
ハンゼヌラなどの酵母等で、生体触媒活性を有する物質
が用いられる。

また、この発明に使用される不織布は、基質の通過に
対する抵抗が低いだけでなく、基質と繊維表面との接触
面積が大きいので、その反応効率がきわめて良好にな
る。また、高速柱状水流により絡合（水流絡合）された
ものは、繊維以外の界面活性剤、接着剤などの余分な成
分を実質的に含まないので、特に望ましい。

上記不織布は親水性繊維を主体として構成される。親
水性繊維の量は少なくとも不織布の50重量％は必要であ
り、好ましくは70重量％以上、さらに好ましくは100重
量％であるのがよい。

また、この親水性繊維としては、例えば、絹繊維、レ
ーヨン繊維などが特に好適にである。

不織布の密度は0.04〜0.25g/cm³の範囲にあるのがよ
く、0.04g/cm³未満ではゲル担持量が少なくなるため生
理活性物質による活性が低下し、一方、0.25g/cm³を超
えると基質の通過抵抗が大きくなってしまう。

上記不織布の厚さは、0.1〜3.0mmの範囲にあるのがよ
く、0.1mm未満では不織布の機械的強度が低いために実
用に耐えず、3mmを超えると不織布への生理活性物質含
有溶液の均一な含浸がきわめて困難になる。

上記親水性繊維を主体とする不織布の構成繊維の表面
には、生理活性物質を内包する絹タンパク質からなるゲ
ル層が形成される。このゲル層の形成は、例えば次の手
順で行なわれる。

まず、絹タンパク質の水溶液を調整し、これに生理活
性物質を混合する。次に、不織布に生理活性物質を混合
した混合溶液を含浸させる。そして、不織布には親水性
繊維が含まれているので、不織布と上記水溶液との親和
性が非常に高い。そのために、上記混合液が不織布に効
率よく含浸される。

なお、上記混合液を不織布により均一に含浸させ、し
かも、不織布内に良好な空隙を確保するために、この不
織布をローラなどで圧搾しても良い。

上記のように不織布に混合液を含浸させた後に、それ
を室温で風乾し、水を除去する。その後、この不織布に
メタノールなどのアルコールに浸漬して絹タンパク質を
不溶化し、ゲル層を形成する。

なお、絹タンパク質の不溶化は、中性塩や希薄酸を用
いる方法、絹タンパク質に延伸等の応力を加える方法、
グルタールアルデヒド処理の方法、又は高湿度下に放置
する方法などによっても達成できる。

このようにして不織布の表面に形成された絹タンパク
質のゲル層は、結晶領域が表面部に集中し、ゲル層内部
は結晶領域が少なくなる。換言すれば、この結晶領域は
ゲル層の厚み方向に不均一な構造になる。このために、
ゲル層に内包された生理活性物質は、ゲル層深部で比較
的自由度の大きな状態で存在するが、上記のように集中
した結晶領域を通過して外部へ出ることはできず、ゲル
層内にとじ込められて繊維表面に固定化される。

一方、生理活性物質を用いて処理される反応基質は低
分子なので、結晶領域が集中したゲル層の表面部を通過
することができる。そのために、ゲル層内に浸入した反
応基質は、生理活性物質の活性中心に容易に到達し、触
媒作用を受けて目的の反応物を効率的に生成する。そし
て、このようにして得られた生成物も、低分子なので、
ゲル層の内部から外部へと移動できるものである。

以上のような不織布に固定化された生理活性物質は、
フィルム状やビーズ状のゲルに固定化されたものに比べ
て比活性が高く、かつ機械的な損傷を受けにくいので安
定性に優れている。

（実施例１）家蚕精練絹糸を50mmにカットし、フラットカードで十
分に開繊された目付80g/cm²のウエブを作成した。そし
て、水圧60kg/cm³の柱状水流により、ウエブの表面及び
裏面のそれぞれから各１回ずつの絡合処理を施し、みか
け密度0.2g/cm³の不織布を作成した。

別に、家蚕マユを薄く剥したものを浴比1:20ぐらいで
蒸留水に加え、約40分間煮沸した。その後、ガラスフィ
ルターにより濾別して、濃度1.4W/V％の絹セリシン水溶
液を得た。この絹セリシン水溶液の濃度［Ｃ］は、280n
mのUV吸光度Ａの測定により、［Ｃ］＝0.125Aの式を用
いて決定したところ、1.4W/V％であった。

このセリシン水溶液に、グルコースオキシダーゼ（GO
D）（EC.1.1.3.4,活性:220U/mg）を絹セリシンに対して
２重量％の割合で混合した。

この混合液を不織布に塗布するとともに、それをマン
グルで圧搾した後、20℃の温度下で50％の相対湿度条件
の下で６時間乾燥した。この乾燥した不織布を、80％の
メタノール水溶液に30分間浸漬して、絹セリシンを不溶
化させるとともに、蒸留水で洗浄し、pH7のリン酸緩衝
液中に保存して、酵素固定化不織布を得た。

固定化GODのグルコース酸化反応における酵素活性
を、25℃でpH7に調整した0.1Mリン酸緩衝液中で測定し
たところ、第１表に示す結果が得られた。

不織布の構成繊維表面のゲル付着状態を知るために、
走査型電子顕微鏡を用いて観察した結果、この不織布の
構成繊維の表面には万遍なく均一にゲル層が付着され、
かつ、この不織布の繊維間の空隙は絹セリシンにふさが
れることなく残っていた。

（実施例２）この第２実施例は、絹セリシン単独の水溶液の代り
に、絹セリシンと絹フィブロインの混合物（絹セリシ
ン:7〜60重量％）の水溶液を用いたもので、その他は第
１実施例と同様の実験を行なった。

絹フィブロイン水溶液は、次のようにして得たもので
ある。

家蚕マユを約1cm角に切り、浴比200倍にて、マルセル
石けん0.5％の水溶液中で、98℃の温度で30分間煮沸
し、温水での洗浄を２回繰り返して精練した。このよう
にしたものを40℃の9MLiBr水溶液に溶解させ、純水で透
析して脱イオン化し、絹フィブロイン水溶液を得た。こ
の水溶液の濃度［Ｃ］は、276nmのUV吸光度Ａの測定に
より、［Ｃ］＝0.095Aの式を用いて決定したところ、3W
/V％であった。

このようにして得られた絹フィブロイン水溶液と、絹
セリシン水溶液とを、種々の割合に混合するとともに、
これらの水溶液を不織布に含浸させて第１実施例と同様
に酵素活性を測定をしたところ、第１表の結果が得られ
た。

また、GODをニトロキシドスピンラベル剤でラベルう
し、ESR測定によりに室温でpH7の0.1Mリン酸緩衝液中に
おける酵素の溶出試験をしたところ、このGODは１カ月
たっても溶出せず、ゲル層内に固定化されていた。さら
に、絹タンパクの溶出試験を、pH7、0.1Mリン酸緩衝液
中に固定化酵素を浸漬して行ったところ、いずれも１週
間溶出が見られなかった。

（比較例１）この比較例１は、不織布の代りに絹織物である羽二重
を用いたもので、その他は上記実施例１と全く同様にし
て同じ試験を行ったものである。

そして、この比較例１における固定化酵素の活性デー
タは第１表に示すとおりで、この表からも明らかなよう
に、不織布を用いた場合よりも、その活性収率はかなり
低いものとなった。

このように活性収率が低くなったのは、羽二重の繊維
の疎密の差が大きすぎるために、繊維１本１本の表面に
ゲルが付着せず、空隙もほとんどつぶされる結果、基質
と接触できるゲル層の表面積が小さくなるためである。

（比較例２、３）凝固剤として、絹タンパク質の代りに、アルギン酸ソ
ーダ、ｋ−カラギーナンを用いるとともに、２％塩化カ
ルシウム水溶液、あるいは１％水酸化カリウム水溶液中
に、１分間浸漬して不溶化処理を行ったもので、その他
は実施例１と同様である。

これら比較例２、３の固定化酵素の活性データを第２
表に示した。この第２表からも明らかなように、凝固剤
としてアルギン酸ナトリウムやｋ−カラギーナンを用い
た場合、絹タンパク質を用いた場合よりも活性収率がか
なり低かった。

（本発明の効果）本発明の固定化生理活性物質は上述のような構成から
なるため、以下に示す効果を奏する。

不織布の表面に生理活性物質を内包する絹タンパク質
のゲル層が形成されているため、反応に有効なゲル層の
表面積が大きく、固定化生理活性物質の比活性が高い。

生理活性物質の固定化が緩やかな条件下で行えるた
め、担体結合法や天然凝固剤などを用いる場合のような
失活のおそれがない。

絹タンパク質のゲル層は厚み方向に不均一構造をなす
ため、ゲル層内の生理活性物質は自由度が大きく、遊離
状態と変らない活性を有し、しかも、ゲル層からの生理
活性物質の溶出はほとんどない。

ゲル層は不織布に固定化されるため、機械的劣化を受
けにくい。

特に、不織布に三次元的に絡合した不織布を用いる
と、単位体積当たりの反応に有効なゲル層の表面積が大
きくなり、しかも、基質の通過に対する抵抗が低くな
る。

ゲル層を繊維表面にコーティングすればよいので、親
水性繊維を主体とする不織布であれば、どの様な形態の
ものであっても担体に利用できる。

以上のように、本発明の固定化生理活性物質は優れた
効果を持つため、バイオリアクターやバイオセンサーと
して利用するのに極めて有効である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 11/00 - 11/18

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】不織布の構成繊維の表面に、タンパク質な
どの大きな分子は通過できないが、反応基質などの小さ
な分子は通過できる絹セリシン又は絹セリシンと絹フィ
ブロインとの混合物からなるゲル層を形成し、このゲル
層に生理活性物質を内包したことを特徴とする生理活性
物質を固定化した担持物。
【請求項２】親水性繊維を主体とする不織布に、生理活
性物質を含む絹セリシン水溶液又は生理活性物質を含む
絹セリシンと絹フィブロインの混合水溶液を含浸させる
工程と、これを乾燥する工程と、アルコール水溶液によ
り不溶化する工程とからなる生理活性物質を固定化した
担持物の製造方法。