JPH0453490A

JPH0453490A - 生理活性物質を固定化した担持物とその製造方法

Info

Publication number: JPH0453490A
Application number: JP16387890A
Authority: JP
Inventors: Tetsuo Asakura; 哲郎朝倉; Harutoshi Sakai; 酒井　治利; Keiichi Komatsu; 小松　計一; Satoshi Kurioka; 栗岡　聡
Original assignee: DAINIPPON SANSHIKAI; Japan Vilene Co Ltd
Current assignee: DAINIPPON SANSHIKAI; Japan Vilene Co Ltd
Priority date: 1990-06-21
Filing date: 1990-06-21
Publication date: 1992-02-21
Anticipated expiration: 2013-08-20
Also published as: JP2787507B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）この発明は、バイオセンサー、バイオリアクターなどに
利用される酵素や微生物などの生理活性物質を固定化し
た担持物とその製造方法に関する。

（従来の技術）近年、触媒活性を有する酵素、微生物など（以下「生理
活性物質」という）を担体に固定化した担持物が開発さ
れ、医療業界、医薬品業界、食品業界、環境浄化業界な
ど、幅広い分野で利用されている。

そして、この担持物の担体として繊維集合体を用いると
、例えば、フィルムなどの場合よりも、単位体積当たり
の基質との接触面積が大きくなるので、その分、反応の
効率がよくなる。しかも、繊維集合体を用いれば、バイ
オリアクターなどに使用するときに、特別な充填装置が
いらないので、取り扱いが簡単になる。

このような利点を考慮して、従来から繊維集合体を用い
た担持物が種々開発されているが、この種のものとして
、例えば、特開昭６０−２２４６１８号公報及び特開昭
６０−１２０９８８号公報に開示された発明が従来から
知られている。

上記特開昭６０−２２４６１８号公報所載の発明（以下
「前者の従来例」という）は、繊維表面にアミノ基、カ
ルボキシル基、フェノール基、などの特定の官能基を導
入し、これを生理活性物質の持つ官能基と反応させ、共
有結合させるようにしている。

また、特開昭６０−１２０９８８号公報所載の発明（以
下「後者の従来例」という）は、耐熱性繊維からなる不
織布に、生理活性物質を混合したゼラチンなどの天然凝
固剤を付着させ、天然凝固剤を加温凝固させるようにし
ている。

（発明が解決しようとする課題）上記前者の従来例では、繊維に官能基を導入したり、共
有結合させたりしなければならないので、その操作が煩
雑になるという問題があった。

しかも、共有結合の反応の際に、生理活性物質の活性が
低下する、いわゆる失活が生じやすいという問題もあっ
た。

これに対して、後者の従来例には、繊維と生理活性物質
との間に実質的な結合がなく、天然凝固剤に包囲される
形で生理活性物質が繊維に固定化されるので、前者の従
来例のような問題は生じない。

しかし、この後者の従来例では、生理活性物質の活性中
心に向う基質の移動を、天然凝固剤が阻害するので、基
質が反応しにくくなるという問題があった。しかも、加
温凝固を必要とするので、熱に強い生理活性物質しか使
えないという問題もあった。

この発明の目的は、生理活性物質を活性の高い状態で、
かつ、基質との接触面積の大きい状態で固定化できる担
持物とその製造方法を提供することである。

（課題を解決するための手段）この発明の担持物は、親水性繊維を主体とする不織布の
構成繊維の表面に、タンパク質などの大きな分子は通過
できないが、反応基質などの小さな分子は通過できる絹
セリシン又は絹セリシンと絹フィブロインとの混合物か
らなるゲル層を形成し、このゲル層に生理活性物質を内
包した点に特徴を有する。

また、この発明の担持物の製造方法は、親水性繊維を主
体とする不織布に、生理活性物質を含む絹セリシン水溶
液又は生理活性物質を含む絹セリシンと絹フィブロイン
とを混合した水溶液を含浸させる工程と、これを乾燥す
る工程と、アルコル水溶液により不溶化する工程とから
なる点に特徴を有する。

なお、以下には、絹セリシン、及び絹セリシンと絹フィ
ブロインの混合物、の両者を同時に表現するときには「
絹タンパク質」という。

（本発明の作用）この発明の担持物は、不織布とゲル層との親和性が非常
に高いので、この不織布の表面に薄くて均一なゲル層が
しっかりと付着し、そのゲル層が脱落したりしない。

絹タンクバク質からなるゲル層は、表面部では結晶構造
領域が集中し、内部ではこの領域が少ない不均一な構造
になっている。そのために、分子が大きい酵素などの生
理活性物質はゲル層から出られないが、低分子である基
質や反応生成物は自由に出入できる。また、ゲル層内で
は生理活性物質の自由度が大きいので、基質などと反応
しゃすい状態になっている。

特に、繊維が三次元的に絡合した不織布は、基質と接触
できる繊維表面の面積が大きくなるので、反応効率がよ
くなるとともに、基質の通過抵抗を低くできる。

この発明の担持物の製造方法では、親水性繊維を主体と
する不織布に、生理活性物質を含む絹タンパク質水溶液
を含浸させるようにしたので、その含浸効率はきわめて
良好となる。また、この含浸した水溶液は、アルコール
によって不溶化されるので、その不溶化に要する時間が
短くてすむ。

（本発明の実施例）この発明に用いられる生理活性物質とは、例えば、グル
コースオキシターゼ、アルカリ性フォスファターゼ、ア
スパルターゼ、アミラーゼ、インベルターゼなどの酵素
、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、アゾンシン
トリホスフェート、補酵素−Ａなどの補酵素、ムコール
、リゾプスなどの糸状菌、サツカロミセス、ビヒア、ハ
ンセヌラなどの酵母等で、生体触媒活性を有する物質が
用いられる。

また、この発明に使用される不織布は、基質の通過に対
する抵抗が低いだけでなく、基質と繊維表面との接触面
積が大きいので、その反応効率がきわめて良好になる。

また、高速柱状水流により絡合（水流絡合）されたもの
は、繊維以外の界面活性剤、接着剤などの余分な成分を
実質的に含まないので、特に望ましい。

上記不織布は親水性繊維を主体として構成される。親水
性繊維の量は少な（とも不織布の５０重量％は必要であ
り、好ましくは７０重量％以上、さらに好ましくは１０
０重量％であるのがよい。

また、この親水性繊維としては、例えば、絹繊維、レー
ヨン繊維などが特に好運にである。

不織布の密度は０，０４〜０．２５ｇ／ｃｍ”の範囲に
あるのがよく、０．０４ｇ／ｃｍ３未満ではゲル担持量
が少なくなるため生理活性物質による活性が低下し、方
、０．２５ｇ／ｃｍ３を超えると基質の通過抵抗が大き
くなってしまう。

上記不織布の厚さは、０．１〜３．０開の範囲にあるの
がよく、０．１ｍｍ未満では不織布の機械的強度が低い
ために実用に耐えず、３ｍｍを超えると不織布への生理
活性物質含有温液の均一な含浸がきわめて困難になる。

上記親水性繊維を主体とする不織布の構成繊維の表面に
は、生理活性物質を内包する絹タンパク質からなるゲル
層が形成される。このゲル層の形成は、例えば次の手順
で行なわれる。

まず、絹タンパク質の水溶液を調整し、これに生理活性
物質を混合する。次に、不織布に生理活性物質を混合し
た混合温液を含浸させる。そして、不織布には親水性繊
維が含まれているので、不織布と上記水溶液との親和性
が非常に高い。そのために、上記混合液が不織布に効率
よ（含浸される。

なお、上記混合液を不織布により均一に含浸させ、しか
も、不織布内に良好な空隙を確保するために、この不織
布をローラなとで圧搾しても良い。

上記のように不織布に混合液を含浸させた後に、それを
室温で風乾し、水を除去する。その後、この不織布にメ
タノールなどのアルコールに浸漬して絹タンパク質を不
溶化し、ゲル層を形成する。

なお、絹タンパク質の不溶化は、中性塩や希薄酸を用い
る方法、絹タンパク質に延伸等の応力を加える方法、ゲ
ルタールアルデヒド処理の方法、又は高湿度下に放置す
る方法などによっても達成できる。

このようにして不織布の表面に形成された絹タンパク質
のゲル層は、結晶領域が表面部に集中し、ゲル層内部は
結晶領域が少な（なる。換言すれば、この結晶領域はゲ
ル層の厚み方向に不均一な構造になる。このために、ゲ
ル層に内包された生理活性物質は、ゲル層深部で比較的
自由度の大きな状態で存在するが、上記のように集中し
た結晶領域を通過して外部へ出ることはできず、ゲル層
内にとじ込められて繊維表面に固定化される。

一方、生理活性物質を用いて処理される反応基質は低分
子なので、結晶領域が集中したゲル層の表面部を通過す
ることができる。そのために、ゲル層内に浸入した反応
基質は、生理活性物質の活性中心に容易に到達し、触媒
作用を受けて目的の反応物を効率的に生成する。そして
、このようにして得られた生成物も、低分子なので、ゲ
ル層の内部から外部へと移動できるものである。

以上のような不織布に固定化された生理活性物質は、フ
ィルム状やビーズ状のゲルに固定化されたものに比べて
比活性が高く、かつ機械的な損傷を受けに（いので安定
性に優れている。

（実施例１）家蚕精練絹糸を５０ｍｍにカットし、フラットカードで
十分に開繊された目付８０ｇ／ｃｍ２のウェブを作成し
た。そして、水圧６０ｋｇ／ｃｍ”の柱状水流により、
ウェブの表面及び裏面のそれぞれから各１回ずつの絡合
処理を施し、みかけ密度０．２ｇ／ｃｍ３の不織布を作
成した。

別に、家蚕マユを薄く剥したものを浴比１：２０ぐらい
で蒸留水に加え、約４０分間煮沸した。その後、ガラス
フィルターにより濾別して、濃度１．４Ｗ／Ｖ％の絹セ
リシン水溶液を得た。この絹セリシン水溶液の濃度［Ｃ
］は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度Ａの測定により、［Ｃ］
　＝０．１２５　Ａの式を用いて決定したところ、１．
４Ｗ／Ｖ％であった。

このセリシン水溶液に、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ
Ｄ）　　（ＥＣ，１，Ｌ、３．４．活性：　２２０Ｕ／
ｍｇ　）を絹セリシンに対して２重量％の割合で混合し
た。

この混合液を不織布に塗布するとともに、それをマング
ルで圧搾した後、２０℃の温度下で５０％の相対湿度条
件の下で６時間乾燥した。この乾燥した不織布を、８０
％のメタノール水溶液に３０分間浸漬して、絹セリシン
を不溶化させるとともに、蒸留水で洗浄し、ｐＨ７のリ
ン酸緩衝液中に保存して、酵素固定化不織布を得た。

固定化ＧＯＤのグルコース酸化反応における酵素活性を
、２５℃でｐＨ７に調整した０、１Ｍリン酸緩衝液中で
測定したところ、第１表に示す結果が得られた。

不織布の構成繊維表面のゲル付着状態を知るために、走
査型電子顕微鏡を用いて観察した結果、この不織布の構
成繊維の表面には万遍なく均一にゲル層が付着され、か
つ、この不織布の繊維間の空隙は絹セリシンにふさがれ
ることなく残っていた。

（実施例２）この第２実施例は、絹セリシン単独の水溶液の代りに、
絹セリシンと絹フィブロインの混合物（絹セリシン＝７
〜６０重量％）の水溶液を用いたもので、その他は第１
実施例と同様の実験を行なった。

絹フイブロイン水溶液は、次のようにして得たものであ
る。

家蚕マユを約１ｃｍ角に切り、浴比２００倍にて、マル
セル石けん０．５％の水溶液中で、９８℃の温度で３０
分間煮沸し、温水での洗浄を２回繰り返して精練した。

このようにしたものを４０℃の９　Ｍ　ＬｉＢｒ水溶液
に溶解させ、純水で透析して脱イオン化し、絹フイブロ
イン水溶液を得た。この水溶液の濃度［Ｃ］は、２７６
ｎｒｎのＵＶ吸光度Ａの測定により、［Ｃ］　＝０．０
９５　Ａの式を用いて決定したところ、３１１／Ｖ％で
あった。

このようにして得られた絹フイブロイン水溶液と、絹セ
リシン水溶液とを、種々の割合に混合するとともに、こ
れらの水溶液を不織布に含浸させて第１実施例と同様に
酵素活性を測定をしたところ、第１表の結果が得られた
。

また、ＣＯＤをニトロキシトスピンラベル剤でラベルし
、ＥＳＲ測定によりに室温でｐＨ７の０．１Ｍリン酸緩
衝液中における酵素の溶出試験をしたところ、このＧＯ
Ｄは１力月たっても溶出せず、ゲル層内に固定化されて
いた。さらに、絹タンパクの溶出試験を、ｐＨ７，０，
１Ｍリン酸緩衝液中に固定化酵素を浸漬して行ったとこ
ろ、いずれも１週間溶出が見られなかった。

（比較例１）この比較例１は、不織布の代りに絹織物である羽二重を
用いたもので、その他は上記実施例１と全く同様にして
同じ試験を行ったものである。

そして、この比較例１における固定化酵素の活性データ
は第１表に示すとおりで、この表からも明らかなように
、不織布を用いた場合よりも、その活性収率はかなり低
いものとなった。

このように活性収率が低くなったのは、羽二重の繊維の
疎密の差が大きすぎるために、繊維１本１本の表面にゲ
ルが付着せず、空隙もほとんどつぶされる結果、基質と
接触できるゲル層の表面積が小さ（なるためである。

（比較例２．３）凝固剤として、絹タンパク質の代りに、アルギン酸ソー
ダ、ｋ−カラギーナンを用いるととともに、２％塩化カ
ルシウム水溶液、あるいは１％水酸化カリウム水溶液中
に、１分間浸漬して不溶化処理を行ったもので、その他
は実施例１と同様である。

これら比較例２．３の固定化酵素の活性データを第２表
に示した。この第２表からも明らかなように、凝固剤と
してアルギン酸ナトリウムやに−カラギーナンを用いた
場合、絹タンパク質を用いた場合よりも活性収率がかな
り低かった。

第２表（本発明の効果）本発明の固定化生理活性物質は上述のような構成からな
るため、以下に示す効果を奏する。

■不織布の表面に生理活性物質を内包する絹タンパク質
のゲル層が形成されているため、反応に有効なゲル層の
表面積が大きく、固定化生理活性物質の比活性が高い。

■生理活性物質の固定化が緩やかな条件下で行えるため
、担体結合法や天然凝固剤などを用いる場合のような失
活のおそれがない。

■絹タンパク質のゲル層は厚み方向に不均一構造をなす
ため、ゲル層内の生理活性物質は自由度が大きく、遊離
状態と変らない活性を有し、しかも、ゲル層からの生理
活性物質の溶出はほとんどない。

■ゲル層は不織布に固定化されるため、機械的劣化を受
けにくい。

■特に、不織布に三次元的に絡合した不織布を用いると
、単位体積当たりの反応に有効なゲル層の表面積が大き
くなり、しかも、基質の通過に対する抵抗が低（なる。

■ゲル層を繊維表面にコーティングすればよいので、親
水性繊維を主体とする不織布であれば、どの様な形態の
ものであっても担体に利用できる。

以上のように、本発明の固定化生理活性物質は優れた効
果を持つため、バイオリアクターやバイオセンサーとし
て利用するのに極めて有効である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）不織布の構成繊維の表面に、タンパク質などの大
きな分子は通過できないが、反応基質などの小さな分子
は通過できる絹セリシン又は絹セリシンと絹フィブロイ
ンとの混合物からなるゲル層を形成し、このゲル層に生
理活性物質を内包したことを特徴とする生理活性物質を
固定化した担持物。
（２）親水性繊維を主体とする不織布に、生理活性物質
を含む絹セリシン水溶液又は生理活性物質を含む絹セリ
シンと絹フィブロインの混合水溶液を含浸させる工程と
、これを乾燥する工程と、アルコール水溶液により不溶
化する工程とからなる生理活性物質を固定化した担持物
の製造方法。