JPS6134796B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は医療用分析計等に用いられる固定化酵
素膜の製造方法に関するものである。 従来、生体内における医学的に重要な物質であ
る糖類、コレステロール等その他溶液中の微量成
分等を選択性よく定量する方法として、固定化酵
素膜を用いた分析法が種々提案されている。これ
らの方法は、酵素のもつ基質特異性及び高い触媒
活性を利用して多成分液中の微量成分の検出に有
効な手段となつている。しかしながら、これらの
方法においては、酵素の固定化方法に問題があ
り、未だ広く実用化されていない。従来報告され
ている酵素を膜状又は膜に固定化する方法として
は、(1)酵素をポリアクリルアミドゲルで包括する
方法〔Nature，vol214，986（1967）参照〕、(2)ア
ルブミン等の不活性蛋白質をマトリツクス剤とし
て混合し、これを架橋剤で架橋する方法
〔Biotechnology and Bioengineering，vol15，
359（1973）参照〕、(3)紙又はセロフアンに酵素
を吸収させ、これをグルタルアルデヒドで架橋す
る方法〔Biotechonology and Bioengineering，
vol15，359（1973）参照〕、(4)イオン交換性のセ
ルロースに酵素をイオン結合させる方法
〔Biotechnology and Bioengineering，vol13，
（1971）参照〕、(5)コラーゲン繊維の溶液に酵素を
加えて電解槽に入れて通電し、電極上に酵素を包
括したコラーゲン膜を電着させる方法
〔Biochemistry，Biophysics Uesearch
Communication，vol47，51（1972）参照〕、(6)多
孔質有機高分子膜に酵素を物理化学的に固定化す
る方法（特開昭52―17889号公報参照）及び(7)２
枚の膜の間に酵素ゲルをサンドイツチする方法
（特開昭52―55691号公報参照）等がある。 しかしながら、(1)の方法は、酵素を多量に固定
化できるが、強度が不十分で基質及び生成物の拡
散が悪いという欠点がある。(2)の方法は、酵素負
荷量は大きいが、やはり強度が不足し又蛋白質で
あるため微生物に対する耐性が不十分である。又
(3)の方法は、手軽ではあるが、酵素負荷量が十分
でなく、又強度を上げるため膜を厚くすると基質
等の拡散が悪くなり、薄くすると強度が不十分で
ある。(4)及び(5)の方法も手軽であるが、酵素と担
体の結合が弱く担体から酵素が容易に脱離する。
(6)の方法は、上記の欠点を補つた方法であるが、
多孔質膜の孔の中に酵素を十分入れることができ
ず、又、空隙率も十分でないため酵素負荷量が不
足するという欠点がある。又、(7)の方法は、酵素
負荷量が多く欠点も少ないが、薄い二枚の膜の間
に酵素ゲルをサンドイツチするため製造方法が煩
雑で製造費用が高くなるという欠点がある。 これらの欠点の改良方法として、薄い緻密な層
とそれよりも厚い多孔質層とが一体となつている
有激高分子膜（以後多孔性不均質膜と記す）の膜
孔内に酵素を内蔵させた後、その膜を架橋剤に浸
漬して酵素を固定化する方法が試みられている。
この方法によれば、固定化酵素膜に関する従来の
諸問題をかなり解消することができるが、なお次
の問題点が残つている。 (1) 多孔性不均質膜中に多量の酵素を内蔵させる
ことができるが、架橋時に酵素が膜孔から脱出
するので定着する酵素は比較的少なく、高価な
酵素を浪費する。 (2) 架橋剤が膜孔内細部まで浸入しないので固定
化が不十分で、長時間使用すると固定化酵素が
脱落する。 (3) 固定化作業時は比較的濃度の高い酵素溶液を
用いる必要があり、無駄になる酵素量が多く不
経済となり易い。 (4) 固定化酵素膜の活性は膜の孔径や厚さ等に影
響され易い。 本発明は長期間高活性であり経済的な固定化酵
素膜の製造方法を提供することを目的とし、その
特徴とするところは、薄い緻密な層とそれよりも
厚い多孔質層とで形成された多孔性不均質膜中に
酵素を内蔵させた後、多孔性不均質膜中に架橋剤
を強制過して注入し、酵素を多孔性不均質膜中
に架橋固定化することにある。 即ち、前記の諸問題点を解決するため鋭意検討
した結果、薄い緻密な層（以下均質層と記す）と
が一体に形成された上記多孔性不均質膜に酵素を
内蔵させた後、架橋剤で架橋して酵素を保持させ
るようにして目的を達成することができた。 上記不均質膜は、逆滲透膜として一般に知られ
ており、その製造方法及び構造は既知である。例
えば、次の文献等に記載されている。 (a) S.Manjikan，S.Loep and J.W.
McCutchan；Proc.lst Int.Symp.on Water
Desalination，Washington，D.C.（1965） (b) G.T.Gittens，P.A.Hitchcock，D.C.Sammon
and G.E.Wakley；Desalination，vol8，369
（1970） 不均質膜の材料は、アセチルセルロース、エチ
ルセルロース、プロピオン酸セルロース及び酪酸
セルロース等のセルロース誘導体、脂肪族及び芳
香族ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリペンゾ
イミダゾール、アクリロニトリル系共重合体、ポ
リカーボネート、ポリエステル、ポリアミノ酸樹
脂その他の所謂逆滲透膜を形成できる材料であれ
ばいずれも可能である。特に望ましいものとして
は、酵素と親和性のあるセルロース誘導体、例え
ばアセチルセルロース及びポリアミド等を挙げる
ことができる。 多孔性不均質膜の厚さは１〜1000μｍで、５〜
500μｍが適当であり、均質層の厚さは0.01〜10
μｍで、0.05〜５μｍが適当である。この均質層
内には孔径が10mm以上の孔は存在しないが、均質
層から多孔質層に行くにしたがつて孔径が拡大
し、多孔質層の表面では５〜1000mmとなる。実験
の結果によれば10〜100mmの範囲の孔が多孔質層
の検体液接触面に開いているのが適当である。こ
の多孔質層の孔から酵素及び架橋剤は導入され、
固定化酵素膜として完成した後は検体液の浸入路
となる。多孔性不均質膜の空隙率は膜の製造条件
によつてある程度変化するが、通常は40〜90％と
するのが適当である。 次に固定化酵素膜の一般的製造方法について順
を追つて説明する。 まず、多孔性不均質膜中への酵素の注入は浸漬
法あるいは加圧過法等の周知の方法でも行うこ
とができるが、本発明においては、逆浸透膜の性
質を利用して酵素を多孔質層に注入して内蔵させ
る方法を用いている。注入時の酵素溶液の濃度は
任意で0.1〜30mg／mlの範囲である。 このようにして酵素を内蔵させた後、架橋剤溶
液を加圧過又は減圧過あるいは両者を併用し
て架橋剤を多孔質層に含ませ、これに架橋反応を
行わせて固定化する。使用する架橋液の濃度は
0.5〜25％程度であるが、１〜15％程度が適当で
ある。上記加圧又は減圧過するとき多孔性不均
質膜に加わる圧力は、多孔性不均質膜が圧縮され
て緻密化したり破れたりしない限り任意である。
しかし加圧過法における圧力は0.1〜7MPa
（1MPaは約0.1Kg／cm²に相当する）が適当であ
り、減圧過法では２×10^-1〜１×10^-3mmＨｇが
望ましい。 また、架橋溶液の過時間は通常１分以上で、
特に限定されないが、膜の多孔質層の孔径あるい
は架橋剤溶液の濃度にも左右される。なお、架橋
剤溶液の温度は酵素が失活しない温度範囲とし−
10℃〜50℃の範囲内で行うが、特に０〜５℃の範
囲が好適である。 上記酵素の架橋剤としては、グルタルアルデヒ
ド及びジアルデヒドデンプン等のジアルデヒド、
ヘキサメチレンジイソシアネート及びトリレンジ
イソシアネート等のイソシアネート化合物、ビス
ジアゾベンジジン、Ｎ，N′―ポリメチレンビス
ヨードアセトアミド及びＮ，Ｎ―エチレンビスマ
レイミド等を使用することができる。この中でも
特に望ましいのは、グルタルアルデヒドのような
ジアルデヒド類である。 これらの架橋剤は固定化される酵素の10〜1000
倍量を用い、架橋剤溶液の濃度は0.1〜20重量％
とすることが望ましい。また、架橋反応時間は膜
の孔径や架橋剤溶液の濃度等にも依るが、通常15
〜24時間である。 本発明に用いられる酵素としては、グルコース
オキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、コレステ
ロールオキシダーゼ及びウリカーゼ等のオキシダ
ーゼ類、ウレアーゼ、クレアチニナーゼ、グルタ
ミナーゼ、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、パーオ
キシターゼ、インベルターゼ、ムタロターゼ、ア
ミラーゼ、パパイン及びトリプシン等のプロテア
ーゼ及びグルコースアイソメラーゼ等がある。又
これらの酵素は、単独又は二種以上混合して固定
化することも可能である。すなわち、例えば、コ
レステロールエステラーゼとコレステロールオキ
シダーゼ、グルコースオキシダーゼとカタラーゼ
及びインベルターゼとグルコースオキシダーゼ又
はムタロターゼ等がある。 上記は本発明の固定化酵素膜の製造方法である
が、次に多孔性不均質膜の製造方法に遡つて具体
的な製造方法を説明する。 実施例 １ 25ｇのアセチルセルロース（米国イーストマン
コダツク社製、39.8％のアセチル基含有）、45ｇ
のアセトン及び30ｇのホルムアミドを混合し、キ
ヤステイング液を調整した。このキヤステイング
液約10ｇを清浄で平滑なガラス板上にベーカー型
アプリケーターを用いて厚さ約75μｍの厚さにキ
ヤストした。次いで、30秒間溶媒を蒸発させた
後、４℃の冷水中にガラスごと膜を浸漬しゲル化
させ不均質膜を得た。この膜は、その均質層の厚
さが１μｍであり、膜全体としての空隙率は80％
であつた。 次に、グルコースオキシダーゼ（西ドイツ国ベ
ーリンガーマンハイム社製、比活性70U／mg）を
PH6.8の0.1モルリン酸緩衝溶液に溶解し、酵素濃
度10mg／mlの酵素溶液（PH6.0）を調製した。こ
の溶液を上記不均質膜中に加圧（0.5MPa）過
し、グルコースオキシダーゼを注入内蔵させた。 次に、このグルコースオキシダーゼを内蔵した
多孔性不均質膜中に２％グルタルアルデヒド溶液
（PH6.8の0.1モルリン酸緩衝溶液）を加圧
（0.3MPa）過して架橋剤を注入した。酵素及び
架橋剤を内蔵した該膜を更に２％グルタルアルデ
ヒド溶液に浸漬し、４℃で24時間架橋反応させて
固定化した。 このようにして得られた膜は、1.5U／cm²の活
性を有しており、又、室温で30日間蒸留水中に保
管した後の残存活性は93％であつた。 比較例 １ 使用した膜、グルコールオキシダーゼ及びその
濃度、更には膜中への酵素の内蔵方法は実施例１
と同様にして行なつた。次に、グルコースオキシ
ダーゼ内蔵膜を２％グルタルアルデヒド溶液中に
浸漬し、４℃で24時間架橋反応させて固定化し
た。この固定化酵素膜の活性は0.5U／cm²であ
り、室温で30日間蒸留水中に保管した後の残存活
性は80％であつた。即ち、架橋剤の加圧注入が効
果を上げていることを示している。 実施例 ２ まず第１表に示すようなキヤスチング液を調整
した。この中のNo.２は実施例１で用いたものであ
る。

【表】 これらのキヤスチング液を用い溶媒蒸発時間を
15秒〜15分間と変化させて、膜厚が５〜960μｍ
で孔径が５〜950mmとなる10秒のキヤスチング膜
を作つた。これにグルコースオキシターゼの濃度
が0.1〜30mg／mlの溶液を調整し、実施例１と同
様に酵素を固定化させた。このようにして得た膜
の特性を表２に示す。

【表】 第２表より、固定化酵素膜の初期活性（Ｕ／
cm²）は0.6〜1.9の範囲に変化し、残存活性（％）
は81〜95の範囲となつた。 比較例 ２ 第１表に示したキヤスチング液を用いて膜厚が
1000μｍ以上で孔径が1100mm以上の膜を作つた。
グルコースオキシダーゼ及びグルタルアルデヒド
溶液の濃度と酵素の固定化方法は実施例２と同様
にして行つた。その結果を第３表に示す。

【表】 即ち、膜厚が大で孔径が巨大となる程初期活性
および残存活性は低下している。 実施例 ３ 酵素及び架橋剤の種類以外は実施例１と同じ方
法で製膜、膜中への酵素の内蔵と固定化を行つ
た。その固定化酵素膜の活性を測定した結果を第
４表に示す。

【表】 この場合の架橋剤はグルタルアルデヒドであ
り、酵素はウレアーゼ、ペプシンおよびα―アミ
ラーゼである。 上記実施例の固定化酵素膜の製造方法は、多孔
性不均質膜中に酵素を内蔵させた後、その膜中に
架橋剤を強制過して注入し酵素を架橋固定化す
ることによつて、従来法よりも高活性で、かつ長
期間安定である。更に具体的な効果を述べると、 (1) 酵素溶液濃度が低いにもかかわらず酵素を固
定化する量が比較的多くなる。 (2) 酵素使用量が少なくて済み経済的である。 (3) 酵素の固定化が確実で、物理的、化学的およ
び生物学的刺げきに安定であり、膜孔内からの
脱落がなくなり長期間安定である、等の優れた
性質をもつている。 このようにして作られた固定化酵素膜は、通常
水中あるいは緩衝液中に浸漬して保管される。ま
た、固定化酵素膜を凍結乾燥あるいは臨界点乾燥
の技術（電子顕微鏡による試料処理法の一種）を
用いれば、使用状態における膜構造を電子顕微鏡
で観察できるので、本発明の方法で作つた固定化
酵素膜と従来のものとの差異を確認することがで
きる。 本発明の固定化酵素膜は、長期間高活性であり
酵素の固定化率が高いので経済的であるという効
果をもつている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 薄い緻密な層とそれよりも厚い多孔質層とで
   形成された多孔性膜中に酵素を内蔵させた後、上
   記多孔性膜中に架橋剤を強制過して注入し、上
   記酵素を上記多孔性膜中で架橋固定化することを
   特徴とする固定化酵素膜の製造方法。 ２ 上記架橋剤を強制過する方法が、加圧過
   あるいは減圧過させる方法である特許請求の範
   囲第１項記載の固定化酵素膜の製造方法。