JPH02245189A

JPH02245189A - 固定化生理活性物質及びその製造方法

Info

Publication number: JPH02245189A
Application number: JP6716289A
Authority: JP
Inventors: Tetsuo Asakura; 哲郎朝倉; Motohiro Kitaguchi; 源啓北口; Harutoshi Sakai; 酒井　治利
Original assignee: Japan Vilene Co Ltd
Current assignee: Japan Vilene Co Ltd
Priority date: 1989-03-17
Filing date: 1989-03-17
Publication date: 1990-09-28
Anticipated expiration: 2010-03-01
Also published as: JPH0716408B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はバイオセンサー、バイオリアクターなどに利用
される酵素、微生物などの生理活性物質を固定化した繊
維集合体に関する。

［従来技術及び問題点］近年、医療、化学工業、環境工業、食品なとの分野竪お
いては、特異な触媒活性を有する酵素、微生物など（以
下「生理活性物質」という）を安定に、操作性よく利用
するため、これらを担体に固定化した、いわゆる固定化
酵素、固定化微生物が種々提案されている。

これらの内、担体に繊維集合体を用いたものは、他の形
態のものに比べて、単位体積当たりの基質との接触面積
が大きく、しかも、バイオリアクターなどに使用する際
に、シート形状であるため、特別な充填装置などが必要
なく、取り扱いやすいという利点がある。

この繊維集合体に、酵素、酵母、糸状菌などの生理活性
物質を固定化する方法としては、例えば特開昭６０−２
２４６１８号公報に示されるような繊維表面にアミノ基
、カルボキシル基、フェノール基などの特定の官能基を
導入し、これを生理活性物質の持つ官能基と反応させ、
共有結合させる方法や、特開昭６０−１２０９８８号公
報に示されるような耐熱性繊維からなる繊維集合体に、
生理活性物質を混合したゼラチンなとの天然凝固剤を付
着させ、天然凝固剤を加温凝固させる方法が知られてい
る。

し・かじながら、前者の方法では、繊維に官能基を導入
したり、共有結合させたりするための操作が煩雑であり
、しかも、共有結合の反応の際に、生理活性物質の活性
が低下する、いわゆる失活が生じやすいという問題があ
った。

一方、後者の方法では、・繊維と生理活性物質との間に
は実質的に結合はなく、天然凝固剤に包囲される形で生
理活性物質は繊維に固定化されるから、前者の場合のよ
うな問題は生じない。しかし、包囲する天然凝固剤が、
反応させるべき基質が生理活性物質の活性中心に移動す
るのを阻害して、活性を低下させる場合があり、また、
加温凝固を必要とするため熱に強い生理活性物質しが利
用できないという欠点があった。

［発明が解決すべき課題］本発明は」二記従来技術の問題点を解決すべくなされた
ものであり、生理活性物質を活性の高い状態で、かつ基
質との接触面積の大きい状態で固定化した担体を提供す
ることを目的とする。

［課題を解決する手段］本発明は親水性繊維を主体とする繊維集合体の構成繊維
の表面に、タンパク質などの大きな分子は通過できない
が、反応基質などの小さな分子は通過できる絹フィブロ
インのゲル層が形成されており、該ゲル層に生理活性物
質が内包されていることを特徴とする固定化生理活性物
質に関する。

また、本発明は親水性繊維を主体とする繊維集合体に、
生理活性物質を含む絹フィブロイン水溶液を含浸する工
程と、これを乾燥する工程と、アルコールにより不溶化
する工程とからなる固定化生理活性物質の製造方法に関
する。

［作用］本発明の固定化生理活性物質は、親水性繊維を主体とす
る繊維集合体の表面に、絹フィブロインのゲル層を形成
しているため、繊維とゲル層との親和性が高く、ゲル層
は繊維表面にしっかりと付着する。

絹フィブロインのゲル層は、表面部では結晶構造領域が
集中し、内部ではこの領域が少ない不均一構造になって
いると推定される。このため、酵素などの生理活性物質
は分子が大きいのでゲル層からでることはできな：いが
、低分子である基質や、反応生成物は自由に出入りでき
る。また、ゲル層内では生理活性物質は自由度が大きい
ので、基質などと反応しやすい状態となっている。故に
、生理活性物質は非常に活性が高く、基質と接触しやす
い状態で、１ｍ紺表面に固定化されている。

なお、繊維集合体に繊維が三次元的に絡合した不織布を
用いると、基質と接触できる繊維表面の面積が増加して
反応の効率をあげることができ、しかも、基質の通過抵
抗を低くすることができる。

本発明の製造方法では、親水性繊維を主体とする繊維集
合体に生理活性物質を含む絹フィブロイン水溶液を含浸
するため、絹フィブロイン水溶液を効率よく、しかも均
一に繊維表面に付着することができる。また、この付着
した絹フィブロイン水溶液はこの後、乾燥し、アルコー
ルにより不溶化されるが、とくにアルコールを用いる方
法は短時間の不溶化を可能にする。

［実施例］以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。

本発明に用いられる生理活性物質とは、例えば、グルコ
ースオキシターゼ、アルカリ性フォスファターゼ、アス
パルターゼ、アミラーゼ、インベルターゼなとの酵素、
ニコチンアミドアテニンジヌクレオチド、アデノシント
リホスフェート、補酵素−Ａなとの補酵素、ムコール、
リソプスなどの糸状菌、サツカロミセス、ビヒア、ハン
セヌラなとの酵母などであり、生体触媒活性を有する物
質が用いられる。

また、本発明に使用される繊維集合体には、不織布、フ
ェルト、織物、編み物、またはこれらの複合体が適して
いる。これらのうち、繊維が三次元的に絡合された不織
布は１．基質の通過に対する抵抗が低く、基質と繊維表
面との接触面積が増大するので好ましく、とくに高速柱
状水流により絡合（水流絡合）された１ものは、繊維以
外の界面活性剤、接着剤などの余分な成分を実質的に含
まないため望ましい。

上記繊維集合体は親水性繊維を主体として構成される。

親水性繊維の並は少なくとも繊維集合体の５０重重量は
必要であり、好ましくは７０重重％以上、更に好ましく
は１００重量％であるのがよい。

この親水性繊維としては、例えば、絹繊維、レーヨン繊
維などがとくに好適に用いられる。

繊維集合体の密度は０　、０’１〜０　、２５ｇ／　ｃ
ｍ　３のＷ！囲にあるのがよ＜　、０．０４ｇ／ｅ＋ｎ
３未溝てはゲルの担持量が少なくなるため生理活性物質
による活性が低下し、一方、０．２５ｇ／（４）３を超
えると基質の通過抵抗が大きくなってしまう。

また、繊維集合体の厚さは０．１〜３．０關の範囲にあ
るのがよく、０．１ｍｍ未満では繊維集合体の機械的強
度が低いため実用に耐えず、３ｍｍを超えると繊維集合
体への生理活性物質含有溶液の均一な含浸が極めて困難
となる。

上記親水性繊維を主体とする繊維集合体の構成繊維の表
面に、生理活性物質を内包する絹フィブロインのゲル層
が形成される。このゲル層の形成は例えば次の手順で行
なわれる。

まず、絹フィブロイン水溶液を調整し、これに生理活性
物質を混合する。次に、繊維集合体にこの混合液を含浸
して、繊維集合体に含まれる親水性繊維の絹フィブロイ
ン水溶液とのなじみのよさを利用して、構成繊維の表面
に混合液を付着させる。この際、絹フィブロイン水溶液
をより均一に同着させ、かつ繊維集合体内に良好な空隙
を確保させるために、ローラーなどを用いて圧搾しても
よい。この後、室温で風乾し、水を一部除去する。

最後にメタノールなどのアルコールに浸漬して絹フィブ
ロインを不溶化し、ゲル層を形成する。

なお、絹フィブロインの不溶化はアルコールによる方法
に限らず、場合によっては、中性塩や希薄酸を用いる方
法や、絹フィブロインに延伸等の応力を加える方法によ
り不溶化してもよい。

この様にして繊維表面に形成された絹フィブロインのゲ
ル層は、結晶領域ｂ（表面部へ集中し、ゲル層内部は結
晶領域が少ない、厚み方向に不均一な構造となる。この
ため、ゲル層に内包された生理活性物質は、ゲル層内部
では比較的自由度の大きな状態で存在するが、表面部を
通過して外部へ出ることはできず、ゲル層内にとじ込め
られて繊維表面に固定化される。

一方、生理活性物質を用いて処理される反応基質は低分
子であるので、結晶領域の集中したゲル層の表面部も通
過できるため、ゲル層内に侵入し、生理活性物質の活性
中心に到達し、触媒作用を受けて目的とする反応物を生
成する。得られる生成物も低分子であるため、ゲル層の
内部から外部へと移動できる。

以上のような繊維集合体に固定化された生理活性物質は
、フィルム状やビーズ状のゲルに固定化されたものに比
べて比活性が高く、かつ機械的な損傷を受けに＜＜、安
定性に優れている。

（実施例１）長さ５０ｍｍにカットした家蚕精練絹よりなる繊維ウェ
アを水流絡合法により、厚さ０．２５ｍｍ、見かけ密度
帆２ｇ／ｃＷＩ３の不織布に成形した。別に、家蚕精練
絹より得た絹フィブロインの水溶液（２，４％）を調整
し、グルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）（ＥＣ，１，１
，３，４，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）を絹
フィブロインに対して２％の割合で加え静かに溶解させ
た。

この溶液を不織布に塗布し、マングルにて圧搾した。絹
フィブロイン溶液の不縁布への付着量は、不織布重量に
対して約１．５倍であった。氷晶を２０°Ｃ１５０％相
対湿度で風乾後、８０％メタノール水溶液中に３０秒間
浸漬して絹フィブロインを不溶化させ、酵素固定化不織
布を得た。

固定化ＣＯＤのグルコース酸化反応における酵素活性を
Ｏ，１Ｍリン酸緩衝液中で測定したところ、第１表に示
すように、２５℃、ｐＨ７の条件で比活性が１１．７Ｕ
／ｍｇ、遊離酵素に対する活性収率が９゜５％の値が得
られた。

固定化酵素の安定性を検討した結果、６０℃以上では遊
離酵素よりもむしろ高い活性を維持しており、熱安定性
に極めて：ｇｉれていることがわかった。

また、至適ｐ）ｌは遊離酵素が５．５１を近であるのに
対して、７付近にあり、遊離酵素よりも高ｐ　Ｈ側へ移
動した。また、水中への絹フィブロインと酵素の溶出度
をローリ−法及びＵＶ法により測定したところ、４０日
後においても絹フィブロインの溶出度は０．１％以下で
あり、酵素の溶出は検出されず、極めて良好であった。

絹フィブロインの付着状態を走査型電子顕微鏡で観察し
たところ、繊維表面に絹フィブロインがまんへんなく付
着しており、かつ不織布の繊維間の空隙は絹フィブロイ
ンに寒がれることなく残っていた。

更に、上記絹フィブロイン水溶液の濃度及び酵素配合量
の影響を調べた結果、絹フィブロイン水溶液の濃度１〜
３％の範囲で活性収率が変化せず、一方、絹フィブロイ
ンに対する酵素の添加側、合を２％から０．００２％と
減らずにつれて活性収率が増加した。酵素添加割合が０
．００２％のとき、活性収率は９４，２％であり、はと
んど遊離酵素ｔこ近い値が得られた。

（実施例２）ビスコースレーヨン（繊度１．５デニール、長さ３８ｍ
ｍ）のウェアを水流絡合法により厚さ０．３ｍｍ、見か
け密度０−２ｇ／ｃ−ＩＴ１３の不織布に成形した。実
施例１と同様の操作によりＣＯＤをレーヨン不織布に固
定化して酵素活性を測定し、その結果を第１表に示した
。

また、絹フィブロインの１′：Ｊ着状態を走査型電子顕
微鏡で観察したところ、繊維表面への絹フィブロインの
付着は均一であり、かつ不織布の繊維間の空隙は絹フィ
ブロインに塞がれることなく充分残されていた。

（比較例１）繊維をポリエステル繊維（繊度１．５デニール、長さ３
８’ｍｍ）に変えたこと以外は実施例１と全く同様にし
て酵素固定化不織布を得た。実施例１と同様の操作によ
りＣＯＤをレーヨン不織布に固定化して酵素活性を測定
し、実施例１．２と合わせて第１表に示した。

第１表第１表から明らかなように、繊維に親水性繊維を用いた
実施例１．２の酵素固定化不織布の比活性は高かったが
、疎水性繊維であるポリエステル繊維を用いた比較例１
では比活性が劣っていた。

また、走査型電子顕微鏡で観察した結果、絹フィブロイ
ンのポリエステル繊維への付着は絹やレーヨンの場合と
比へて不均一でその付着量も著しく少なかった。

（比較例２）実施例１て用いたＣＯＤを含む絹フィブロイン水溶液を
、ポリエチレンフィルム上にキャストして風乾した後、
８０％メタノール水溶液中に３０秒間浸漬して厚さ２０
μｍの固定化酵素フィルムを作成した。

この固定化酵素フィルムの酵素活性を測定したところ、
（、Ｏ，Ｄの比活性が３．ＩＵ／ｍｇ、活性収率が２．
６％であり、実施例１の不織布に固定化した場合に比べ
て活性がかなり低かった。

（比較例３〜４）酵素の固定化剤として、絹フィブロインをアルギン酸す
ｊ・リウム又はに−カラギーナンに代え、アルギン酸ナ
トリウムの不溶化は２％塩化カルシウム水溶液で、／（
−カラギーナンの不溶化は１％水酸化カリウム水溶液で
行なったこと以外は、実施例２と同様にして酵素固定化
不織布を得た。

この酵素固定化不織布の酵素活性を測定し、実施例２の
結果とともに第２表に示した。

第２表第２表から明らかなように、絹フィブロインを用いた場
合、アルギン酸ナトリウムやに一カラギーリーンのゲル
を固定化剤に用いた場合に比へて活性収率がかなり優れ
ていた。

また、走査型電子顕微鏡で観察したところ、アルギン酸
ナトリウムやに一カラギーナンのゲルは１ノ一ヨン表面
に均一付着していなかった。

［以下余白コ［発明の効果コ本発明の固定化生理活性物質は上述のような構成からな
るため、以下に示す効果を奏する。

■繊維集合体の構成繊維の表面に生理活性物質を内包す
る絹フィブロインのゲル層が形成されているため、反応
に有効なゲル層の表面積が大きく、固定化生理活性物質
の比活性が高い。

■生理活性物質の固定化が穏やかな条件下で行なえるた
め、担体結合法や天然凝固剤などを用いる場合のような
失活のおそれがない。

■絹フィブロインのゲル層は厚み方向に不均一構造をな
すため、ゲル層内の生理活性物質は自由度が大きく、遊
離状態と変らない活性を有し、しかも、ゲル層からの生
理活性物質の溶出はほとんどない。

■ゲル層は繊維集合体に固定化されるため、機械的劣化
を受けにくい。

■とくに、繊維集合体に三次元的に絡合した不織布を用
いると、単位体積当たりの反応に有効なゲル層の表面積
が大きくなり、しかも、基質の通過に対する抵抗が低く
なる。

■ゲル層を繊維表面に：コーティングすればよいので、
親水性繊維を主体とする繊維集合体であれば、どの様な
形態のものであっても、繊維種のものであっても担体に
利用できる。

以上のように、本発明の固定化生理活性物質は優れた効
果を持つため、バイオリアクターやバイオセンサーとし
て利用するのに極めて有用である。

特許出願人　日本バイリーン株式会社１７一

Claims

【特許請求の範囲】

（１）親水性繊維を主体とする繊維集合体の構成繊維の
表面に、タンパク質などの大きな分子は通過できないが
、反応基質などの小さな分子は通過できる絹フィブロイ
ンのゲル層が形成されており、該ゲル層に生理活性物質
が内包されていることを特徴とする固定化生理活性物質
。
（２）繊維集合体が繊維が三次元的に絡合した不織布で
ある請求項１に記載の固定化生理活性物質。
（３）親水性繊維を主体とする繊維集合体に、生理活性
物質を含む絹フィブロイン水溶液を含浸する工程と、こ
れを乾燥する工程と、アルコールにより不溶化する工程
とからなる固定化生理活性物質の製造方法。