JPH0448438B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素を繊維状担体上に固定化するこ
と、およびこの種の固定化酵素を酵素触媒反応に
使用すことに関する。

酵素は化学反応を触媒する蛋白質である。しか
し種々の用途に対するそれらの有用性は限られて
いる。酵素を反応媒質から分離するのが困難であ
り、従つて生成物の純度が限定されるからであ
る。さらに可溶性酵素は一般にバツチ反応におい
て１回使用できるにすぎず、多くの酵素が高価で
あるためそれらがきわめて有効な触媒であるにも
かかわらずそれらの工業的利用は限られていた。

長年にわたつて、酵素が固定化されるがなお触
媒活性を維持する様式で酵素を水不溶性担体に付
着または結合させることによつて酵素を固定化す
る技術を案出するために多大な研究努力が向けら
れてきた。しかし既知の固定化酵素担体構造物は
幾つかの欠点をもつ。たとえばあるものは使用に
際して不満足な流れ特性または低い酵素活性収率
または低い酵素結合性もしくは安定性低下を示
す。従つて改良された固定化酵素担体構造物を開
発する必要性が増大している。

酵素を各種の繊維状高分子材料から製造された
繊維状担体内に閉じ込めることにより酵素を固定
するために種々の試みがなされた。

繊維はチヨツプドフアイバー、トウ、長フイラ
メント、ヤーン、布帛（織物、編物または不織布
であることができる）を含めて多くの形態で、お
よび複合体の形で使用できる。さらに、転化率を
高める比表面積を備えた多孔質繊維を製造するこ
ともできる。繊維構造中への拡散が必要である場
合には、繊維について可能な小径によつて、速度
制御因子としての拡散を本質的に除くことができ
る。理想的に化学的不活性である、良好な機械的
強度および耐久性を備えた繊維状担体を製造する
ことができ、これらは通常、反応媒質から容易に
分離することができる。

繊維状固体化酵素の利用に関する最初の研究の
１つは、酵素と混合したポリマーの溶液を湿式紡
糸したダニエリのものであつた。（Process
Biochem.7(8)，９−15（1972）。ポリマーにはセル
ロースジアセテート、セルローストリアセテー
ト、エチルセルロース、ナイロン、ポリ塩化ビニ
ルおよびα−メチリポリグルタルメートが含めれ
ていた。酵素にはインベルターゼ、β−ガラクト
シダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナ
ーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼ、フルクト
ースホスヘエートキナーゼおよびアルドラーゼが
含まれていた。

グレージらはダニエリの方法により、スクロー
スホスホリラーゼが埋込まれたセルローストリア
セテート繊維を製造した。ジヤーナルオブモレキ
ユラーキヤタリシス（Ｊ Mol Catal）２(6)，
453−458（1977）。

イチジヨーらはアミノ化したきわめて細いポリ
ビニルアルコール繊維に吸着させることによりイ
ンベルターゼを固定化した。彼らはインベルター
ゼはイオン力によりアミノ化繊維に結合したと仮
定している。ジヤーナルオブアプライドポリマー
サイエンス（Ｊ Appl Polym Sci）27，1665−
1674（1982）。

イチジヨーはこれらのアミノ化繊維をインベル
ターゼの固定化に使用することにつき、追加の報
文を発表した。ジヤーナルオブアプライドポリマ
ーサイエンス（Ｊ Appl Polym Sci）28 1447
−1455（1983）。彼はこの方法で酵素を固定化する
ことに対する利点を下記のように要約している。

(1) 官能基が容易に繊維に組み込まれる。

(2) 繊維はそれらの多孔性および大きな表面積の
ため大量の酵素を吸着する。

(3) 繊維は各種の酵素反応に適した種々の形状に
成形しうる。

(4) 酵素がイオン結合により固定化されるので、
固定化の実験処理が簡単である。

イチジヨーは吸着されたインベルターゼを含む
そのアミノ化ポリビニルアルコール繊維から不織
布または紙を製造した。（Bulletin of Res
Inst for Polymers and Textiles，Japan.No.
139，65−70（1984）。彼はこの紙をホルダーに
挿入し、シヨ糖溶液を連続的にこの紙に導通す
ることにより酵素反応器を作成した。この固定化
酵素は高いグルコース産生活性を示したが、シヨ
糖濃度の増大に伴つて紙の流れ抵抗が増大し
た。

彼はその後、インベルターゼを吸着したそのポ
リビニルアルコール繊維から編物を製造し、反応
器内でこの編物に平行しかつこれと接触した細い
流路に沿つてシヨ糖溶液を導通した。バイオテク
ノロジーアンドバイオエンジニアリング
（Biotechnol Bioeng）27，1077−1080（1985）。
この反応器はシヨ糖をグルコースに転化するため
に有効に作動した。

欧州特許第8498A号明細書は改質ナイロン粒子
に酵素を固定化することに関する。

アーノルドはアルカリホスフアターゼをナイロ
ン繊維の表面に共有結合により固定化することに
よつて、新規な酵素系フアイバーオプチツクセン
サーを開発した、（Anal Chem）57，565−566
（1985）。

他の多数の文献にナイロン繊維を用いて酵素を
固定化することが示されている。これには下記の
ものが含まれる。ビツセら−（1977）FEBSレタ
ーズ（FEBS Letters）81，326−330；カルバジ
ヤルら−（1978）Biochem Biophys Acta612，
305−316；ダニエリら−酵素工学３巻、477−481
頁、イー・ケー．パイおよびエツチ・エツチ・ウ
イートール編、プレナム・プレス．ニユーヨー
ク。

また中空繊維の出現に伴つて、これらの構造内
に酵素を固定化することにおいてもかなりの研究
が行われた。

本出願人により出願中の特許出願第8611974号
明細書の、２種の高分子繊維成分を有し、第１成
分30〜70重量部および第２成分70〜30重量部を含
有し、各成分は繊維の軸に実質適に整列したフイ
ブリルとして繊維中に存在し、この種の整列した
フイブリルは相互にランダムに連結し、この連結
が他方の成分のフイブリルを貫通し、従つて両成
分が繊維中に相互貫通した網状構造物として存在
する新規な溶融紡糸繊維が記載されている。

この種の繊維の特色は、いずれかの成分を適切
な溶剤により浸出させることよつて他方の成分の
高表面積多孔質繊維を製造しうることである。さ
らに第１成分がナイロンである場合、第２成分
（たとえばポリプロピレン）が浸出したのち、形
成された多孔糸は活性アミン残基をもつナイロン
末端を含み、これに酵素を通常のカツプリング剤
により結合させ、多孔質繊維内の穴に保持させる
ことができる。

従つて本発明によれば、１種又は２種以上の酵
素の分子が構造物中の表面に位置する化学的に活
性な基に結合しており、この構造物は互いに離間
しているが相互にランダムに結合されている、繊
維の軸に対して実質的に整列しているポリアミド
フイブリルよりなる熔融紡糸ポリアミド繊維から
構成されている、固定化酵素構造物が提供され
る。

酵素は、１種又は２種以上の酵素の分子が構造
物中の表面に位置する化学的に活性な基に共有し
ており、この構造物は互いに離間しているが相互
にランダムに連結されている、繊維の軸に対して
実質的に整列しているポリアミドフイブリルより
なる熔融紡糸した多孔室ポリアミド繊維から構成
されている固定化酵素構造物の形態をないしてい
る、酵素触媒反応を実施するための方法が提供さ
れる。

酵素中の官能基をポリアミド上の遊離アミノ末
端に結合させうる通常のカツプリング剤、たとえ
ばグルタルアルデヒドおよび二官能性ジイミデー
トたとえばジメチルピメルイミデートを用いて、
種々の酵素をこの種の繊維性構造物上に固定化す
ることができる。これはカツプリング剤を添加し
て活性化かれた構造物を得たのち、酵素を溶液状
で添加することによつて達成される。酵素はそれ
自体共有結合によりカツプリング剤に結合し、多
孔繊維構造物内に保持される。

構造物において達成できる酵素負荷の密度は、
構造物上の活性末端の密度、および細孔の開口を
通して特定の酵素と結合するについてのこれら末
端の有効性に依存する。他方、酵素負荷が高くな
るほど生物反応を触媒する際の固定化酵素の活性
は低下することを本発明者らは見出した。固定化
構造物において活性末端の10〜50％が酵素の分子
に結合していることが好ましい。

固定化のために好ましい酵素は200000までの分
子量をもつ比較的小型の酵素であり、これにはＤ
−２−モノクロルプロピオネートデハロゲナーゼ
（欧州特許第179603A号明細書に記載）、ワサビダ
イコン（horse−radish）ペルオキシダーゼおよ
びアミダーゼ（後者は本出願人の出願中の英国特
許出願第8630029号および第8630012号明細書中に
述べられている）が含まれる。ただし、これより
も高い分子量をもつより大型の酵素を上記構造物
上に固定化することもできる。

本発明は精製された酵素、すなわち微生物細胞
から抽出された酵素に適用する方が好ましいが、
本発明は精製酵素に限定されず、無傷の細胞に含
まれる酵素にも適用できる。

本発明に用いられる繊維状構造物は安価な、化
学的に不活性な担体を提供し、これに１種または
２種以上の酵素を共有結合させて比較的強固な結
合を得ることができ、これによつて酵素が安定化
される。この繊維性構造物中に固定化された酵素
は再使用できる。

繊維状構造物は個々の繊維の形であつてもよ
く、またはこの種の繊維から製造される織物もし
くは編物であつてもよい。

本発明の様式で固定化された酵素は多種のバイ
オリアクターに使用できる。酵素を布地の表面に
固定化し、これを通して処理すべき液体を流す
か、あるいは酵素を小片状の材料に固定化し、こ
れを反応液中で撹拌回転させることができる。前
記のように同一の繊維性構造物上に同時に２種以
上の酵素を固定化することができる。

ここで以下の実施例を参照して本発明を記述す
る。

実施例 相対粘度40をもち、約45のアミノ末端基を含む
乾燥ナイロン６，６の560ｇを乾燥ナイロン11（相
溶化剤）40ｇおよびポリプロピレン（MF1 25）
400ｇとチツプブレンドし、次いで290℃で小型の
スクリユー押出機を用いて、60グレードのアルミ
ナフイルターおよび127〜229ミクロン（５×９ミ
ル〔thou〕）孔の紡糸口金を通して紡糸した。こ
うして形成された糸を500ｍ／分で巻取り、紡糸
仕上げを施し、130f5の糸を製造した。これを85
℃のフイードロールを用いて100ｍ／分おいて延
伸し、39f5の糸を製造した。

ナイロン66およびポリプロピレンは、繊維の軸
に実質的に整列したフイブリルとして繊維糸中に
存在し、この種の整列したフイブリルは相互にラ
ンダムに連結し、一方の成分におけるこの種の連
結が他方のフイブリルを貫通し、従つて両成分が
繊維中に相互貫通した網状構造物として存在す
る。

この糸を次いで布パネルに編成し、これを布の
繊維中に存在するポリプロピレンの実質的部分を
抽出するためにｐ−キシレン中で３時間煮沸し
た。ここで布中の繊維は、実質的に繊維の軸に整
列した、間隔を置いたナイロン66のフイブリルか
らなり、この種の整列した、間隔を置いたフイブ
リルが相互にランダムに連結した多孔室構造を備
えていた。

布（No.2353）を約１cm²の正方形に切断した。こ
れらを75°の真空炉内で一夜乾燥させて残留ｐ−
キシレンを除去し、水性クアドラレン（qua−
dralene）、脱イオン水中で洗浄し、次いで50ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（PH7.0）中に貯蔵した。

正方形の布（10.8mg）それぞれを0.05％水性グ
ルタルアルデヒド１ml中に室温で２時間入れてお
き、次いで0.1mg／mlのジチオトレイトールを含
有する20ｍＭエタノールアミン緩衝液（PH7.5）
で洗浄した。

0.1mg／mlのジチオトレイトールを含有する20
ｍＭエタノールアミン緩衝液（PH7.5）中の、比
活性14U／mg（蛋白質）および活性10.2U／mlの
Ｄ−２−クロルプロピロロートデハロゲナーゼ溶
液を固定化のために用いた。

１単位（Ｕ）の酵素活性は1μモルノＤ−２−
クロルプロピオネートの転化（Ｌ−ラクテート＋
クロリドへ）を30℃およびPH7.5において１分間
に接触する。

グルタルアルデヒド活性化した布の各片を酵素
溶液0.5ml中に入れ、緩和に撹拌しながら４℃に
48時間置いた。

こうして処理され、20ｍＭエタノールアミン緩
衝液（PH7.5）で洗浄された布の各片を、標準法
でＤ−２−クロルプロピオネートを脱ハロゲン化
する能力について試験した。このアツセイにおい
て0.04ｍＭ放出Cl／分／布片の活性を記録した。
この活性をもとの酵素試料から失われたものと比
較したところ、95％の活性回復、示した。

標準アツセイ法 固定化酵素を含む１片の布を撹拌下に30℃で
1Mリン酸カリウム（PH7.5）1.5mlおよび1Mクロ
ルプロピオン酸ナトリウム（PH7.0）0.5mlの混合
物中でインキユベートした。

数時間にわたつて放出されたクロリドを、この
アツセイ混合物からの試料100μを〓マリウ
ス・クロロカウンター”に注入することにより測
定した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ １種又は２種以上の酵素の分子が構造物中の
   表面に位置する化学的に活性な基に結合している
   固定化酵素構造物であつて、この構造物は互いに
   離間しているが相互にランダムに連結されてい
   る、繊維の軸に対して実質的に整列しているポリ
   アミドフイブリルよりなる熔融紡糸ポリアミド繊
   維から構成されている前記固定化酵素構造物。 ２ １種又は２種以上の酵素の分子が、酵素中の
   官能基をポリアミドフイブリル上の遊離アミン末
   端に結合させる薬剤によつて構造物中の表面に位
   置する化学的に活性な基に結合している、特許請
   求の範囲第１項に記載の固定化酵素構造物。 ３ 薬剤がグルタルアルデヒド又は二官能性ジイ
   ミデートである、特許請求の範囲第２項に記載の
   固定化酵素構造物。 ４ 構造物中のポリアミド繊維において遊離アミ
   ン末端の10〜50％が酵素の分子に結合している、
   特許請求の範囲第２項又は第３項に記載の固定化
   酵素構造物。 ５ 酵素が200000までの分子量を有するものであ
   る、特許請求の範囲第１項乃至第４項のいずれか
   に記載の固定化酵素構造物。 ６ 酵素がＤ−２−モノクロルプロピオネートデ
   ハロゲナーゼ、ワサビダイコンペルオキシダーゼ
   又はアミダーゼから選ばれたものである、特許請
   求の範囲第５項に記載の固定化酵素構造物。 ７ 酵素は、１種又は２種以上の酵素の分子が構
   造物中の表面に位置する化学的に活性な基に共有
   結合している固定化酵素構造物の形態をなし、こ
   の構造物は互いに離間しているが相互にランダム
   に連結されている、繊維の軸に対して実質的に整
   列しているポリアミドフイブリルよりなる熔融紡
   糸多孔質ポリアミド繊維から構成されている、酵
   素触媒反応を実施するための方法。