CN102260662A - 用于固定化酶的载体及其用途和固定有酶的载体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型渗透性良好的用于固定化酶的载体，该载体是一种不仅具有小于90nm的中小孔，还具有上百纳米大孔道的聚合物微球。该载体既可以用于单酶固定也可以用于复酶固定。微球表面的利用率可达70％-100％。本发明还涉及用于固定化酶的载体在固定化酶方面的用途以及固定有酶的载体。由于酶能够固定于载体内部，可以受到载体的良好保护，因此稳定性、活性和重复使用性良好，尤其适于装柱进行连续反应。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，涉及用于固定化酶的载体，具体地说是一种具有超大孔的聚合物微球，作为用于固定化酶的载体。本发明还涉及用于固定化酶的载体在固定化酶方面的用途以及固定有酶的载体。
背景技术
酶作为一种天然的高分子催化剂，因具有极高的选择性、催化反应、条件温和、无污染等诸多优点，在食品加工、医药等产业中有着极为广阔的应用前景。然而，自由酶的不稳定和容易变形等缺点使其难以在工业中得到更为广泛的应用。此外，在反应体系中分离和提纯酶也增加了生产成本，因此，固定化酶研究日益受到人们的重视。固定化酶经过几十年的发展，已经得到广泛应用，有的已进行工业性运转，被广泛用于食品生产与建材、生物制药、生物传感器、医药工业、环保技术及生物技术等多种领域。作为固定化酶的一部分，载体材料的结构和性能对固定化酶有着巨大的影响。由于载体材料的重要性，自固定化酶技术兴起以来，很多学者就一直致力于对载体的研究。迄今为止，固定化酶的载体材料已从最初的天然高分子材料发展到合成高分子材料、无机材料、复合材料等。
天然高分子载体材料一般对生物无毒、传质性能好，原料比较易得，比较适合担当酶的载体材料。目前常用的天然高分子材料有琼脂糖、卡拉胶、海藻酸盐、纤维素、明胶、胶原、壳聚糖等。然而，天然高分子材料的机械强度较差，在厌氧条件下易被微生物分解，使用寿命较短，而且天然高分子原料来源往往受产地所限，这在一定程度上限制了它的应用。因此，合成有机高分子材料被用以替代天然高分子材料作为固定化酶的载体。合成有机高分子材料由于其化学、物理性能都有很大的可变性，从理论上来讲，可以担当任何一种酶的固定化载体，而且它们对微生物的腐蚀也有较强的抵抗力。与天然高分子材料相比，合成高分子材料强度较大是一个突出的优点。
聚苯乙烯材料是世界上第一个被用来担当用于固定化酶的载体的合成有机高分子，主要通过吸附作用来固定化酶。其后，带有功能基团的聚甲基缩水甘油酯(PGMA)聚合物、聚丙烯酸甲酯聚合物、以及亲水性能更强的聚丙烯酰胺类聚合物等也被用作用于固定化酶的载体。
但是，合成高分子材料的传质性能较差是其作为用于固定化酶的载体的一个不利之处。
因此，有必要提供一种具有良好传质性能的合成高分子材料。
发明内容
本发明的目的正是针对上述问题，提出使用一种具有特定孔道大小分布的聚合物微球作为固定化酶的载体。该载体除具有常规十至几十纳米的孔道外，还具有90-1000nm的大孔结构。
根据本发明的第一个方面，提供了一种用于固定化酶的载体，该载体是一种具有90-1000nm大孔道的聚合物微球，小于90nm的孔道占微球总孔隙率的1％-30％，90nm以上且小于100nm的孔道占微球总孔隙率的5％-30％；100nm以上且小于300nm的孔道占微球总孔隙率的15％-75％，300nm以上且小于500nm的孔道占微球总孔隙率的15％-75％，500nm以上且小于800nm的孔道占微球总孔隙率的5％-20％，800-1000nm的孔道占微球总孔隙率的1％-20％，最可几孔径为90-600nm。
根据本发明的第二个方面，提供了上述载体在固定化酶中的用途，其中酶通过吸附或化学交联的方法固定于载体上。
本发明的第三个方面，提供了一种固定有酶的载体，其包括如上所述的载体以及固定于所述载体上的酶。
本发明用于固定化酶的载体，渗透性能良好，酶可以固定于载体内部，微球表面的利用率可以达到70％-100％。本发明的固定有酶的载体，酶受到载体的良好保护，稳定性、活性、重复使用性良好，尤其适于装柱进行连续反应。
附图说明
图1表示现有技术中仅固定于载体表层的固定化酶的图片
图2表示本发明超大孔聚苯乙烯微球的电镜照片。
图3表示本发明超大孔聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物微球的电镜照片。
图4表示本发明超大孔聚苯乙烯微球(图4a-最可几孔径313nm、图4b-最可几孔径104nm)和常规多孔聚苯乙烯微球(图4c-最可几孔径14.7nm)固定脂肪酶后的激光共聚焦照片(其中，白色部分是用荧光标记的酶，可以看出图4a和图4b的固定有酶的载体上，酶已固定于微球内部，而图4c中酶仅固定于载体的壳层)。
图5表示本发明超大孔聚苯乙烯微球(最可几孔径313nm、104nm)和常规多孔聚苯乙烯微球(最可几孔径14.7nm)固定脂肪酶的热稳定性对比实验(图5a-50℃，图5b-70℃)。
图6表示本发明超大孔聚苯乙烯微球(最可几孔径313nm、104nm)和常规多孔聚苯乙烯微球(最可几孔径14.7nm)固定脂肪酶的储存稳定性实验。
图7表示本发明超大孔聚苯乙烯微球(最可几孔径313nm、104nm)和常规多孔聚苯乙烯微球(最可几孔径14.7nm)固定脂肪酶的重复使用性。
图5、6、7中：
自由酶◇，超大孔聚苯乙烯固定化酶(最可几孔径313nm)△，超大孔聚苯乙烯固定化酶(最可几孔径104nm)●，常规多孔聚苯乙烯微球固定化酶(最可几孔径14.7nm)×。
具体实施方式
根据本发明的第一个方面，提供了一种用于固定化酶的载体，该载体是一种具有90-1000nm大孔道的聚合物微球，小于90nm的孔道占微球总孔隙率的1％-30％，90nm以上且小于100nm的孔道占微球总孔隙率的5％-30％；100nm以上且小于300nm的孔道占微球总孔隙率的15％-75％，300nm以上且小于500nm的孔道占微球总孔隙率的15％-75％，500nm以上且小于800nm的孔道占微球总孔隙率的5％-20％，800-1000nm的孔道占微球总孔隙率的1％-20％，最可几孔径为90-600nm。最可几孔径的优选范围为100-400nm。
所述载体的表面既可以为疏水性也可以为亲水性，或兼有疏水和亲水性。
所述载体的组成可以为(1)含有聚苯乙烯交联结构的聚合物，或(2)含有聚丙烯酸结构的聚合物，或(3)含有聚丙烯酰胺结构的聚合物，或(4)含有环氧基的聚合物，或(5)含有羟基的聚合物，或(6)含有羧基的聚合物，或(7)含有胺基的聚合物；具体包括聚苯乙烯类聚合物，聚(甲基)丙烯酸类聚合物、聚(甲基)丙烯酸酯类聚合物、聚丙烯酰胺类聚合物、聚乙酸乙烯酯类聚合物、聚乙酸类聚合物；更具体的指聚苯乙烯聚合物、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物、聚羟乙基丙烯酸甲酯聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯聚合物，及其复合聚合物。
所述的用于固定化酶的载体的交联度可以为5％-75％，优选范围为10％-40％。载体的交联度指交联剂占单体与交联剂总量的百分比。
具有亲水性表面的用于固定化酶的载体可以是(1)本身即为亲水性的聚合物或亲水-疏水复合聚合物载体，如聚羟乙基丙烯酸甲酯聚合物、聚甲基丙烯酸聚合物、聚丙烯酰胺类、聚乙烯醇聚合物；或(2)疏水性微球或亲水-疏水复合微球经化学反应，如胺化、羧化、水解等得到的亲水性聚合物，或(3)将亲水性物质通过物理吸附或化学交联的方法修饰到微球表面得到的具有亲水性表面的微球。
所述的亲水性物质可以为聚乙烯醇、魔芋葡甘聚糖、葡聚糖、壳聚糖、明胶、海藻酸盐、胶原、纤维素、卡拉胶、阿拉伯胶。
所述的用于固定化酶的载体微球的粒径可以为5-300微米，优选范围为10-200微米，更优选范围为30-100微米。
酶可以通过吸附或化学交联的方法固定于载体上，可以是单酶固定也可以是复酶固定。
根据本发明的第二个方面，提供了上述载体在固定化酶中的用途，其中酶通过吸附或化学交联的方法固定于载体上。
本发明的第三个方面，提供了一种固定有酶的载体，其包括如上所述的载体以及固定于所述载体上的酶。
本专利所述的具有超大孔结构的聚合物微球既具有几十纳米的中小孔，又具有上百纳米的大孔和超大孔。小孔提供了足够的比表面积，保证了酶的固载量。大孔和超大孔提供了足够大的空间，使酶分子能够固定于载体内部。同时，大的孔道又保证了底物和产物进出载体的良好的传质性能，促进了反应的进行。具有超大孔结构的聚合物微球可以通过表面活性剂反胶团溶胀法[1、2]、纳米颗粒凝聚法[3]、溶剂-有机颗粒双致孔剂法[4]、复乳法[5]等多种方法制备。下面是制备具有超大孔结构的聚合物微球的方法的更具体实例。
具有超大孔结构的疏水性或亲水-疏水复合微球的制备：
参考中国专利申请200510087138.0，在单体和交联剂的混合液中，加入引发剂、稀释剂和油溶性表面活性剂，搅拌，直至引发剂完全溶解，制备成油相；其中，油溶性表面活性剂在油相中的质量含量为5％～80％，稀释剂在油相中的质量含量为0％～80％。将稳定剂(如聚乙烯醇或明胶等)溶于蒸馏水，配制成质量含量为0.1～10％的溶液，作为水相。将油相加入水相，搅拌，升温聚合。反应结束后，过滤，用蒸馏水和乙醇清洗数次，将稀释剂、表面活性剂组分洗净，干燥后，即得超大孔聚合物微球。
具有超大孔结构的亲水性聚合物微球的制备：
参考文献5，配制含有乳化剂的水相，乳化剂的含量为1-10％，将内油相(内油相与水相的体积比为1∶4至3∶2)分散到水相，得到水包油初乳液。配制含有乳化剂的外油相，乳化剂的含量为1-10％，将上述水包油初乳液分散到外油相，通过加热交联或胶凝等方法成球。用乙醇和水依次清洗，去除内油相后，即可得超大孔微球。
本专利所述的用于固定化酶的载体既可以为疏水性表面也可以为亲水性表面，具有疏水性表面的载体包括聚苯乙烯类聚合物，聚甲基丙烯酸类聚合物、聚甲基丙烯酸酯类聚合物、聚乙酸乙烯酯类聚合物、聚乙酸类聚合物，及其复合聚合物。
具有亲水性表面的载体包括三类：(1)本身即为亲水性聚合物或亲水-疏水复合聚合物载体，如聚羟乙基丙烯酸甲酯聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯聚合物、聚丙烯酰胺类、聚乙烯醇聚合物；或(2)疏水性微球或亲水-疏水复合微球经化学反应，如胺化、羧化、水解等得到的亲水性聚合物，或(3)将亲水性物质如聚乙烯醇、魔芋葡甘聚糖、葡聚糖、壳聚糖、明胶、海藻酸盐、胶原、纤维素、卡拉胶、阿拉伯胶等，通过物理吸附或化学交联的方法修饰到微球表面得到的具有亲水性表面的微球。所述的物理吸附方法除常规的吸附方法外，还包括将亲水性物质偶联上一定的疏水基团，如苯基、苯氧基、碳链等，增强亲水性物质与疏水微球间的结合力，而后进行吸附。吸附的亲水层可以通过后交联，使修饰层更为稳定。所述的疏水修饰剂可以是缩水甘油醚类，如苯基缩水甘油醚、丁基缩水甘油醚、烯丙基缩水甘油醚、甲苯基缩水甘油醚等。所述的交联剂可使用环氧氯丙烷或乙二醇二缩水甘油醚等。
本发明提出的用于固定化酶的载体可以为规则球形，是一种具有90-1000nm大孔道的聚合物微球，小于90nm的孔占微球总孔隙率的1％-30％，90nm以上且小于100nm的孔道占微球总孔隙率的5％-30％；100nm以上且小于300nm的孔道占微球总孔隙率的15％-75％，300nm以上且小于500nm的孔道占微球总孔隙率的15％-75％，500nm以上且小于800nm的孔道占微球总孔隙率的5％-20％，800-1000nm的孔道占微球总孔隙率的1％-20％，最可几孔径为90-600nm，优选范围为100-400nm。其中，小于90nm的孔以及90nm以上且小于100nm的孔道能够提供足够高的比表面积，由此保证了足够的酶载量。100nm以上且小于300nm的孔道适于粒径较小的微球载体或分子量较小的酶，既减小了酶进入微球内部的传质阻力，又能够保证酶的载量，从而提高固定化酶的催化效果。300nm以上且小于500nm的孔道适于粒径较大的微球载体或分子量较大的酶，能够提高微球的渗透性，提供足够通透的孔道结构，使酶分子能够进入微球内部，而不会堵塞在孔道入口处。500nm以上且小于800nm的孔道以及800-1000nm的孔道主要提供了酶分子进入微球内部的大的通道，能够有效减少酶固定化过程的传质阻力以及底物和产物进出载体受到的传质阻力。实验证明，符合以上载体特征的固定化酶其米氏常数Km比自由酶的米氏常数还要低，说明与底物具有良好的亲合性，底物进入载体内部不受传质阻力影响(实施例13)。本专利所述的用于固定化酶的载体基本没有超过1000nm的大孔径。如果孔径过大(超过1000nm)，会影响微球的机械强度，造成易碎等问题。
本专利所述微球的机械性能良好，尤其对于装柱进行连续生产时，多糖类微球受压容易变形，无法在较高流速下操作，而本发明提出的用于固定化酶的载体则能够耐受高达20MPa的压强，同时由于具有超大孔结构，载体的渗透性良好，能够在高流速下操作，有效提高生产效率。另外，虽然有研究人员通过本体聚合法也制备出具有大孔径的块状PGMA聚合物，然后研磨成颗粒[6]，但这种颗粒的外形并不规则，在装柱操作时易造成沟流等流动不均匀的情况。即使是在搅拌情况下进行批次操作，规则球形的固定化酶微载体也更为有利。
本专利提出的用于固定化酶的载体，酶可以通过吸附法固定到载体上，也可以通过化学交联的方法固定到载体上。所述的吸附法包括物理吸附和离子交换吸附。这种方法的优点在于操作简单，可选用不同的载体，固定化的同时可与纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。所述的化学交联方法指酶分子的功能基团与载体表面的活性功能基团通过形成化学共价健实现结合的酶固定方法。能够与载体以共价键结合的酶的功能团，包括：(1)氨基：赖氨酸的ε-氨基和多肽键的N-末端的α-NH2基；(2)羧基：天门冬氨酸的β-羧基、谷氨酸的α-羧基和末端羧基；(3)酚羟基：酪氨酸的酚羟基；(4)巯基：半胱氨酸的巯基；(5)羟基：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基；(6)咪唑基：组氨酸的咪唑基；(7)吲哚基：色氨酸的吲哚基。最常见的为氨基、羧基、酪氨酸和组氨酸的芳环。对于本身具有官能团如环氧基、胺基、羧基的载体，可以直接用于酶固定化。对于多数载体，不具备与酶直接作用的能力，在固定化前需要经过活化。载体的活化可能是简单的一步过程，也可能是复杂的多步过程。常用的共价结合方法包括重氮化法、叠氮法、戊二醛法、烷化法、芳基化法、肽鳌合法、肽键法等。以上各种酶的固定方法各有所长，几种方法联用往往效果更好。
本专利提出的超大孔固定化酶微载体具有大的孔径，因此，另一个突出的优点就在于载体的渗透性能良好，酶可以固定于载体内部，微球表面的利用率为70％-100％。受到载体的良好保护。稳定性、活性、重复使用性良好，尤其适于装柱进行连续反应
酶可以通过多种方法固定到载体上。物理吸附法可以用去离子水将超大孔微球充分润湿(对于疏水性载体可用乙醇预先浸润，而后用去离子水置换完全)，称取一定量的酶加入缓冲液中，溶解完全。将已润湿的载体加入酶液中，室温下缓慢振荡至达到吸附饱和。离心，去掉上清液，用缓冲液清洗3次，即得到固定化酶。使用化学交联法时，操作与上述步骤相同，但酶与载体的反应时需要的缓冲液以及pH值、反应温度等条件需要视酶与载体反应的官能团而定。
超大孔微球的孔径分布、孔隙率等结构特征由压汞仪进行测定，粒径由激光粒度仪进行测定，微球表面的利用率是由激光共聚焦亮点与暗点的相对比例得到的半定量数据。酶在微球内部的分布情况由激光共聚焦逐层扫描表征得到。固定有酶的载体的传质性能通过对固定化酶进行动力学研究得到的米氏常数说明，固定化酶的米氏常数等于或小于自由酶，说明底物和产物进出载体不受传质阻力的影响；大于自由酶时，说明受到传质阻力影响，相差越大，传质阻力越为严重。
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明并不仅仅限制于以下实施例。
实施例1[最可几孔径为313nm的超大孔PST微球]
超大孔聚苯乙烯(PST)微球(图2)，该载体小于90nm的孔占微球总孔隙率的8％，90nm以上且小于100nm的孔道占微球总孔隙率的12％；100nm以上且小于300nm的孔道占微球总孔隙率的39％，300nm以上且小于500nm的孔道占微球总孔隙率的35％，500nm以上且小于800nm的孔道占微球总孔隙率的5％，最可几孔径为313nm。平均粒径为100微米，孔隙率60％，比表面积34m2/g，交联度12％。
实施例2[最可几孔径为104nm PST微球)
超大孔聚苯乙烯微球，该载体小于90nm的孔占微球总孔隙的10％，90nm以上且小于100nm的孔道占总孔隙的30％，100nm以上且小于300nm的孔占微球总孔隙的40％，300nm以上且小于500nm的孔道占微球总孔隙率的10％，最可几孔径为104nm。平均粒径为40微米，孔隙率60％，比表面积86m2/g，交联度25％。
实施例3[最可几孔径为400nm PGMA微球]
超大孔聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)微球(图3)，该载体小于90nm的孔占微球总孔隙率的4％，90nm以上且小于100nm的孔道占微球总孔隙率的8％；100nm以上且小于300nm的孔道占微球总孔隙率的30％，300nm以上且小于500nm的孔道占微球总孔隙率的45％，500nm以上且小于800nm的孔道占微球总孔隙率的10％，800-1000nm的孔道占微球总孔隙率的3％，最可几孔径为400nm。平均粒径为30微米，孔隙率70％，比表面积29m2/g，交联度25％。
实施例4[最可几孔径为200nm的PST-GMA复合微球]
超大孔PST-GMA复合微球，该载体小于90nm的孔占微球总孔隙率的5％，90nm以上且小于100nm的孔道占微球总孔隙率的10％；100nm以上且小于300nm的孔道占微球总孔隙率的40％，300nm以上且小于500nm的孔道占微球总孔隙率的30％，500nm以上且小于800nm的孔道占微球总孔隙率的10％，800-1000nm的孔道占微球总孔隙率的5％，最可几孔径为200nm。平均粒径为20微米，孔隙率80％，比表面积80m2/g，交联度50％。
实施例5[最可几孔径为90nm的PHEMA微球]
超大孔聚羟乙基丙烯酸甲酯(PHEMA)微球，该载体小于90nm的孔占微球总孔隙率的25％，90nm以上且小于100nm的孔道占微球总孔隙率的30％；100nm以上且小于300nm的孔道占微球总孔隙率的20％，300nm以上且小于500nm的孔道占微球总孔隙率的15％，最可及孔径为90nm。平均粒径为10微米，孔隙率50％，比表面积50m2/g，交联度25％。
实施例6[PVA修饰超大孔PST微球]
超大孔PST微球表面修饰聚乙烯醇(PVA)形成的具有亲水性表面的用于固定化酶的载体。取0.8g聚苯乙烯微球(实施例1所述微球)置于20mL二氯甲烷中，加入无水三氯化铝1.2g，搅拌均匀后，滴加氯乙酰氯0.8mL，30℃下反应5h。无水状态下抽滤，依次用冰盐酸、去离子水、无水乙醇清洗，干燥后即得氯乙酰化聚苯乙烯微球。将所得氯乙酰化聚苯乙烯微球0.6g，在5mL DMF中溶胀过夜，加入35mL PVA的DMF溶液(PVA浓度为20mg/mL)，在搅拌状态下依次加入四丁基溴化铵0.4g，氢氧化钠0.8g，70℃下反应24h。过滤，用热水洗去未偶联上的PVA，真空干燥，即得PVA覆层聚苯乙烯微球。PVA偶联量可以控制在0.8-1.0mg/m2，激光共聚焦显微镜观察及BSA吸附实验证明，微球的全部表面(包括所有内部孔道表面)都已修饰上PVA。其他亲水性化合物的化学修饰方法与此相同。
实施例7[琼脂糖修饰超大孔PST微球]
取1.0g琼脂糖粉，在去离子水中加热溶解后，加入1M NaOH溶液。在搅拌条件下加入一定量的苯基缩水甘油醚，在60℃下反应24h，将所得反应液在无水乙醇中沉淀2次，再用去离子水透析、冻干后得到苯氧基琼脂糖。将所得的苯氧基琼脂糖加热溶解后配成一系列不同浓度的溶液，加入实施例1所述超大孔聚苯乙烯微球，浓度为70ml/g干球，在55℃恒温振荡水浴槽中吸附24h。吸附后的微球，用热水清洗掉未吸附的琼脂糖，收集滤液，用紫外分光光度计测定溶液在269nm的吸光度，确定琼脂糖的吸附量。取所得琼脂糖修饰微球2.0g，置于去离子水中，根据琼脂糖的吸附量，加入环氧氯丙烷或乙二醇二缩水甘油醚进行后交联，在室温下反应24h，反应后再用去离子水清洗，并测定亲水性物质的吸附量。
实施例8[葡聚糖修饰超大孔PST微球]
取1.0g葡聚糖粉，在去离子水中加热溶解后，加入1M NaOH溶液。在搅拌条件下加入一定量的丁基缩水甘油醚，在60℃下反应24h，将所得反应也在无水乙醇中沉淀2次，再用去离子水清洗、冻干后得到丁基葡聚糖。将所得的丁基葡聚糖加热溶解后配成一系列不同浓度的溶液，加入实施例1所述超大孔聚苯乙烯微球，浓度为70mL/g干球，在55℃恒温振荡水浴槽中吸附24h，吸附后的微球过滤后用热水清洗掉未吸附的葡聚糖。取所得葡聚糖修饰微球2.0g，置于去离子水中，根据亲水性物质的吸附量，加入环氧氯丙烷或乙二醇二缩水甘油醚进行后交联，在室温下反应24h，反应后再用去离子水清洗，即得葡聚糖修饰超大孔PST微球。
实施例9[壳聚糖修饰超大孔PGMA微球]
取实施例2中所述的超大孔PGMA微球1.0g，放入200mL二氧六环中充分溶胀，加入壳聚糖，用BF3-乙醚为催化剂，在搅拌条件下反应4h。所得产物用乙醇和去离子水反复洗涤，室温下真空干燥24h，得到壳聚糖修饰的超大孔PGMA微球。
实施例10[超大孔聚苯乙烯微球物理法固定脂肪酶]
取实施例1中的超大孔聚苯乙烯微球，在乙醇中充分浸润，而后用去离子水置换完全。精确称取一定量的脂肪酶(Amano Lipase PS，from Burkholderia cepacia)加入Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液(0.1M，pH 7.0)中，4℃下搅拌至酶完全溶解。取15mL脂肪酶溶液置于反应瓶中，加入0.5g已润湿的聚苯乙烯微球，25℃下缓慢振荡(20rpm)至达到吸附饱和。将混合物于20000rpm离心5min，去掉上清液，用缓冲液清洗3次，得到超大孔聚苯乙烯-脂肪酶固定化酶。使用激光共聚焦显微镜进行观察，发现酶能够固定于载体内部(图4a)，明显区别于对照例中酶仅能在微球表层吸附的情况。微球表面的利用率约为90％。
实施例11[104nm PST微球物理法固定脂肪酶]
取实施例2中的超大孔聚苯乙烯微球，按实施例10进行固定化酶操作，同样发现，酶可以固定于微球内部(图4b)。微球表面的利用率约为85％。
实施例12[常规多孔PST微球]
取常规多孔聚苯乙烯微球进行对照实验，该载体小于90nm的孔占微球总孔隙的100％，最可几孔径为14.7nm。平均粒径为40微米，孔隙率60％，比表面积220m2/g，交联度25％。按照实施例10所述方法进行固定化酶，在饱和吸附情况下，仍发现酶主要分布于微球的表层，无法进入微球内部(图4c)。微球表面利用率约为39％。
图4d至图4f是实施例10、实施例11和实施例12所制备固定化酶对应的荧光强度图。图4d和图4e的强度曲线比较平稳，说明酶分子在整个微球内分布都比较均匀，而图f在微球的壳层部分的强度表现为明显双峰，而球内部强度很低，说明内部基本没有酶分子分布，酶分子主要分布于壳层。
实施例13[超大孔(孔径313nm和104nm)和常规多孔PST微球固定化酶的对照实验]
参照文献的标准方法，以橄榄油乳液为底物，检测自由酶和实施例10、11、12所述固定化酶的活性。固定化酶的比活性(specific activity，U/mg protein)：定义为每毫克固定化蛋白的活性单位；固定化酶的活性回收率(activity retention，％)：定义为固定化酶的比活性与自由酶的比活性之比。三种固定化酶在载体上的载量和酶活差别较大，实施例10的固定化酶比活可达到自由酶的146％(表1)。酶的热稳定性实验发现，在50℃进行操作时，6h后，自由酶的保留活性只有57.0％，实施例10所得固定化酶的保留活性高达94.3％，实施例11所得固定化酶的保留活性为85.9％，实施例12(对照例)所得固定化酶的保留活性为78.5％(图5a)。在70℃下进行评价，酶活的差别更大，自由酶几乎失活，其保留活性只有3.9％，实施例10所得固定化酶的保留活性仍可达84.7％，实施例11所得固定化酶的保留活性为56.3％，实施例12(对照例)所得固定化酶的保留活性为31.9％(图5b)。实验说明，超大孔用于固定化酶的载体能够有效提高固定化酶的热稳定性，拓展了酶的使用范围，能够满足较高温度下进行反应的需要。
对于上述三种固定化酶的储存稳定性研究发现，固定于超大孔载体上的酶在室温储存15天的条件下，保留酶活可达到93％以上，而常规多孔固定化载体上保留酶活为86.2％(图6)。
根据参考文献[7]提供的方法，选用模拟体系对固定化酶的重复利用性进行了考察，超大孔微球在使用100次后，酶活仍保持95％以上，尤其是实施例10的固定化酶，酶活几乎没有降低。而实施例12的常规多孔固定化酶的酶活仅保持了60％(图7)。
比较实施例10所得固定化酶和自由酶的米氏常数Km，自由酶的米氏常数为0.441mM，实施例11所得固定化酶的米氏常数与自由酶相近，为0.438mM，而实施例10所得固定化酶的米氏常数为0.402mM，比自由酶还要低，说明与底物具有良好的亲和性，反应不受传质阻力的影响，载体具有良好的传质性能。
表1
实施例14[超大孔PGMA微球化学法直接固定脂肪酶]
取实施例3中的超大孔PGMA微球，在乙醇中充分浸润，而后用去离子水置换完全。精确称取一定量的脂肪酶(Candida antarctica Lipase B)加入Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液(0.1M，pH 8.0)中，4℃下搅拌至酶完全溶解，置于4℃下备用。取15mL脂肪酶溶液置于反应瓶中，加入0.5g已润湿的PGMA微球，25℃下缓慢振荡(20rpm)至达到吸附饱和。将混合物于20000rpm离心5min，去掉上清液，用缓冲液清洗3次，得到超大孔PGMA-脂肪酶固定化酶。使用激光共聚焦显微镜进行观察，发现酶能够固定于载体内部。微球表面的利用率约为98％。自由酶的比活为4.2U/mg，固定后酶的负载量可达47.5mg/g-support，酶活为327.3U/g-support，比活可达6.89U/mgprotein，相对活性为164.1％。
实施例15[超大孔PST-GMA复合微球化学法直接固定脂肪酶]
取实施例4中的超大孔PST-GMA微球，在乙醇中充分浸润，而后用去离子水置换完全。精确称取一定量的脂肪酶(Candida antarctica Lipase B)加入Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液(0.1M，pH 7.0)中，4℃下搅拌至酶完全溶解，置于4℃下备用。取15mL脂肪酶溶液置于反应瓶中，加入0.5g已润湿的PGMA微球，25℃下缓慢振荡(20rpm)至达到吸附饱和。将混合物于20000rpm离心5min，去掉上清液，用缓冲液清洗3次，得到超大孔PGMA-脂肪酶固定化酶。使用激光共聚焦显微镜进行观察，发现酶能够固定于载体内部。微球表面的利用率约为95％。自由酶的比活为4.2U/mg，固定后酶的负载量可达24.4mg/g-support，酶活为149.5U/g-support，比活可达6.12U/mg protein，相对活性为145.7％。
实施例16[超大孔PGMA微球戊二醛法固定脂肪酶]
取实施例3中所述超大孔PGMA微球0.4g，在65℃下用0.1mol/L HCl水解12h，用去离子水清洗至中性，加入10％的戊二醛酸性溶液25mL，室温下震荡12h，用去离子水洗去戊二醛。称取适量假丝酵母脂肪酶，用pH 8.0的0.1mol/L磷酸缓冲液配成10mg/mL的酶溶液。向装有0.1g载体的三角瓶中加入15mL配好的酶液，室温下在摇床中反应一定时间，吸去酶液，用磷酸缓冲液清洗用于固定化酶的载体，直到洗液中不含蛋白质为止。使用激光共聚焦显微镜进行观察，发现酶能够固定于载体内部。在最适条件下自由酶的活性为88.4U/mg，固定化酶的活性可达118U/mg。
实施例17[超大孔PHEMA微球环氧修饰固定淀粉酶]
取实施例5中的超大孔PHEMA微球1.0g，加入10mL环氧氯丙烷，30mL二甲亚砜，用NaOH调解pH为10-11，常温反应4h。用2mol/L盐酸滴定到中性，再用丙酮与清水洗净，得到环氧活化超大孔PHEMA微球。再加入0.3g β-淀粉酶溶液和10mL pH为8的磷酸缓冲液，在25℃下恒温振荡2h。反应结束后，用磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液(pH 7)充分洗去游离酶，即得固定化酶。使用激光共聚焦显微镜进行观察，发现酶能够固定于载体内部。微球表面的利用率为80％。在优化条件下，固定化酶酶活达到180U/g，其pH稳定性、温度稳定性、储存稳定性和重复使用次数都得到有效提高。
实施例18[PVA修饰超大孔PST微球化学法固定脲酶]
取实施例6中的PVA修饰超大孔聚苯乙烯微球1.0g，置于5％的戊二醛溶液中，25℃恒温振荡2h，用去离子水洗去游离的戊二醛，而后加入10mL脲酶溶液，于4℃下固化2h，得到固定化酶。使用激光共聚焦显微镜进行观察，发现酶能够固定于载体内部。用Lineweaver-Burk双倒数作图法，求得固定化酶的米氏常数Km为1.50mg/mL小于自由酶的Km＝24.8mg/mL，说明固定化酶对底物具有更好的亲和力，载体具有良好的传质性能，同时酶的热稳定性、储存稳定性和重复使用次数明显优于游离酶。
实施例19[琼脂糖修饰超大孔PST微球固定谷氨酰胺转氨酶]
取实施例7中的琼脂糖修饰超大孔聚苯乙烯微球，加入一定浓度的戊二醛溶液，25℃下振荡交联2h，抽滤，用去离子水吸去游离的戊二醛后，再加入适量谷氨酰胺转氨酶酶液，30℃下恒温振荡1.5h，使酶固定到载体上，再用pH 7.0的磷酸缓冲液反复清洗载体，洗掉未交联的游离酶，即得固定化酶。使用激光共聚焦显微镜进行观察，发现酶能够固定于载体内部。使用20次以上仍能保持80％以上的相对酶活，热稳定性和储存稳定性明显优于游离酶。
实施例20[葡聚糖修饰超大孔聚苯乙烯微球固定果胶酶]
取实施例8中的葡聚糖修饰超大孔PST微球0.1g，加入20mL 3％的戊二醛溶液中，25℃下振荡交联2h。洗去多余的戊二醛后，再加入果胶酶液(酶液用pH 3.4的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配制)，4℃下固定12h，用蒸馏水洗去未固定的酶，抽干即得固定化果胶酶。使用激光共聚焦显微镜进行观察，发现酶能够固定于载体内部。以2-10mg/mL果胶为底物，分别测定不同底物浓度下固定化酶与溶液酶的酶活力，用Lineweaver-Burk双倒数作图法，求得固定化酶的米氏常数Km为3.24mg/mL小于自由酶的Km＝5.16mg/mL，说明底物和产物进出载体不受传质阻力影响，具有良好的传质性能，有利于果胶酶催化果胶的水解。
实施例21[磺化超大孔PST微球离子吸附木瓜蛋白酶]
取实施例1中的超大孔聚苯乙烯微球1.0g，加入100mL浓硫酸，搅拌条件下于60℃反应16h。反应结束后用蒸馏水反复清洗，得到磺化超大孔聚苯乙烯微球。将木瓜蛋白酶每溶液的pH调至低于8.75，此时木瓜蛋白酶带正电荷，加入一定量磺化超大孔聚苯乙烯微球，吸附1h，而后洗去未吸附的酶，即得固定化酶。使用激光共聚焦显微镜进行观察，发现酶能够固定于载体内部。酶的热稳定性、储存稳定性和重复使用次数明显优于游离酶。
实施例22[壳聚糖修饰超大孔PGMA微球化学固定复酶]
取实施例9中的壳聚糖修饰超大孔PGMA微球0.5g，加入100mL 3％的戊二醛溶液中，25℃下振荡交联2h。洗去多余的戊二醛后，再加入糖化酶和α-淀粉酶的复合酶液(酶浓度为糖化酶20U/mL，α-淀粉酶24U/mL，用pH为7.0的磷酸缓冲液溶解)，25℃下固定12h，用缓冲液洗去未固定的酶，抽干即得固定化复合酶。使用激光共聚焦显微镜进行观察，发现酶能够固定于载体内部。测定酶的米氏常数为8.9mg/mL，低于游离复合酶，说明载体具有优良的传质性能。酶的热稳定性、储存稳定性和重复使用次数明显优于游离酶。
实施例23[装柱操作]
取实施例15中的固定有脂肪酶的超大孔PGMA微球20.0mL，装入内径为1.2cm，柱长为20cm的反应柱中。将50g橄榄油加入1000mL异辛烷中，并加入25mM表面活性剂(Aerosol OT)，搅拌均匀，为底物溶液。将底物溶液加入3000mL水中，混匀成乳状液。以0.5mL/L的速度将乳状液加入反应柱中，柱温为35℃，连续反应8h。测定底物转化率为50％以上，酶活基本保持不变。
本专利通过多种结构表征和性能测定手段分析了超大孔微球的结构特征，确定酶可以进入微球内部进行固定，受到载体的良好保护。酶的热稳定性、储存稳定性和重复使用次数明显优于游离酶，也优于常规多孔微球载体。通过动力学研究证明底物和产物进出载体不受传质阻力影响，载体具有良好的传质性能。
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Claims (20)
1.一种用于固定化酶的载体，该载体是一种具有90-1000nm大孔道的聚合物微球，小于90nm的孔道占微球总孔隙率的1％-30％，90nm以上且小于100nm的孔道占微球总孔隙率的5％-30％；100nm以上且小于300nm的孔道占微球总孔隙率的15％-75％，300nm以上且小于500nm的孔道占微球总孔隙率的15％-75％，500nm以上且小于800nm的孔道占微球总孔隙率的5％-20％，800-1000nm的孔道占微球总孔隙率的1％-20％，最可几孔径为90-600nm。
2.如权利要求1所述的用于固定化酶的载体，其特征在于所述载体的表面为选自如下的表面：疏水性表面、亲水性表面、或兼有疏水和亲水性的表面。
3.如权利要求1所述的用于固定化酶的载体，其特征在于所述聚合物选自如下聚合物：(1)含有聚苯乙烯交联结构的聚合物，或(2)含有聚丙烯酸结构的聚合物，或(3)含有聚丙烯酰胺结构的聚合物，或(4)含有环氧基的聚合物，或(5)含有羟基的聚合物，或(6)含有羧基的聚合物，或(7)含有胺基的聚合物，或上述聚合物的复合物。
4.如权利要求1所述的用于固定化酶的载体，其特征在于所述聚合物的交联度为5％-75％。
5.如权利要求2所述的用于固定化酶的载体，其特征在于所述载体具有亲水性表面，并且所述载体是选自如下的聚合物微球：(1)本身即为亲水性的聚合物或亲水-疏水复合聚合物载体；或(2)疏水性微球或亲水-疏水复合微球经化学反应得到的亲水性聚合物，或(3)将亲水性物质通过物理吸附或化学交联的方法修饰到微球表面得到的具有亲水性表面的微球。
6.如权利要求5所述的亲水性物质选自聚乙烯醇、魔芋葡甘聚糖、葡聚糖、壳聚糖、明胶、海藻酸盐、胶原、纤维素、卡拉胶、阿拉伯胶。
7.如权利要求1所述的用于固定化酶的载体，其特征在于，微球的粒径为5-300微米。
8.如权利要求1所述的用于固定化酶的载体，其特征在于，最可几孔径为100-400nm。
9.如权利要求1所述的用于固定化酶的载体，其特征在于所述聚合物选自如下聚合物：聚苯乙烯类聚合物、聚(甲基)丙烯酸类聚合物、聚(甲基)丙烯酸酯类聚合物、聚丙烯酰胺类聚合物、聚乙酸乙烯酯类聚合物、聚乙酸类聚合物、及其复合物。
10.如权利要求1所述的用于固定化酶的载体，其特征在于所述聚合物选自如下聚合物：聚苯乙烯聚合物、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物、聚羟乙基丙烯酸甲酯聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯聚合物、及其复合物。
11.如权利要求1所述的用于固定化酶的载体，其特征在于所述聚合物的交联度为10％-40％。
12.如权利要求5所述的用于固定化酶的载体，其特征在于所述本身即为亲水性的聚合物或亲水-疏水复合聚合物载体是选自如下的聚合物微球：聚羟乙基丙烯酸甲酯聚合物、聚甲基丙烯酸聚合物、聚丙烯酰胺类、聚乙烯醇聚合物。
13.如权利要求5所述的用于固定化酶的载体，其特征在于所述化学反应选自胺化、羧化、水解反应。
14.如权利要求1所述的用于固定化酶的载体，其特征在于，微球的粒径为10-200微米。
15.如权利要求1所述的用于固定化酶的载体，其特征在于，微球的粒径为30-100微米。
16.如权利要求1所述的载体在固定化酶中的用途，其中酶通过吸附或化学交联的方法固定于载体上。
17.如权利要求1所述的载体在固定化酶中的用途，其中所述固定是单酶固定，也可以是复酶固定。
18.如权利要求17的用途，其中所述固定是复酶固定。
19.如权利要求17的用途，其中至少一部分酶固定于载体内部。
20.一种固定有酶的载体，其包括如权利要求1所述的载体以及固定于所述载体上的酶。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |