CN102676624A

CN102676624A - 利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法

Info

Publication number: CN102676624A
Application number: CN2012101619024A
Authority: CN
Inventors: 芦鑫; 黄纪念; 孙强; 侯传伟; 宋国辉; 张丽霞
Original assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-05-23
Filing date: 2012-05-23
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2032-05-23
Also published as: CN102676624B

Abstract

本发明属于花生蛋白深加工技术领域，具体涉及一种利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法，具体为：采用化学改性的磁性壳聚糖微粒固定碱性和中性两种蛋白酶，以此进行酶法水解，离心、脱色、纳滤脱盐、超滤分级、喷雾干燥获得花生活性肽。较传统制备方法，该方法具有生产成本低、生产周期短、产品得率高、纯度高、生产工艺具有温和、绿色、节能等特点。采用本发明方法生产出的花生功能肽除了具有良好的溶解性外，还具有降血压和抗氧化功能，因此具有广阔的市场开发价值。

Description

利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法

技术领域

本发明方法涉及花生副产物的深加工技术领域，具体涉及一种花生活性肽的酶法制备工艺，是以花生饼粕为原料，利用化学改性的磁性壳聚糖微粒固定复合蛋白酶水解，从而获得花生活性肽的方法。

背景技术

花生是世界上种植的主要农作物之一。我国是花生的生产大国，花生产量常年稳居世界首位，花生年产量在1400万吨左右。花生营养丰富，富含优质蛋白和油脂，脂肪含量在44－50%，蛋白质含量在24－34%，且含有多种维生素和矿物质。花生蛋白含有人体所必需的8种氨基酸，消化性可达99%，是营养价值高且资源丰富的植物蛋白资源。由于花生营养丰富且风味独特，所以深受我国人民的喜爱。目前，花生除一部分用于食品加工以外，50%以上的花生用于榨油。由此，我国每年产生数百万吨的蛋白含量大于50%的花生饼粕。由于我国花生深加工技术和产业化水平低，花生饼粕中蛋白的利用有限，大量的花生饼粕用作动物饲料或肥料，产品附加值低，资源浪费严重。因此，有必要开展花生饼粕中蛋白深加工方面的研究。

生物活性肽是通过酶法水解、化学改性或物理作用得到的具有特殊生理功能的肽类。生物活性肽具有的生理功能有抗氧化、调节血压、促进微量元素吸收、调节免疫、调节睡眠等功效。与化学药物相比，生物活性肽具有毒副作用小、功效平缓、成本低等优势，因此国内外已经有活性肽药品、保健品上市，并得到了消费者的认可。研究表明，花生蛋白采用酶法水解具有显著的抗氧化、降低血压功能，研究花生饼粕制备花生活性肽有利于开发花生饼粕这一潜在的蛋白资源，生产高附加值的蛋白产品。

目前，花生蛋白生产活性肽的工艺主要有化学处理和酶法水解两大类。化学处理会降低花生肽的品质，且生产过程中产生的酸碱废液污染环境，这限制了化学处理的发展。采用酶法水解花生蛋白时，蛋白酶成本较高，单一酶水解蛋白有限，且酶在热、酸碱及有机溶剂中不稳定，这也限制酶法制备花生活性肽的工业化转化。固定化酶技术虽然一定程度上提高酶的利用率，但是酶解效果不佳。主要是酶与载体结合后，形成空间位阻阻碍酶与底物的结合，同时，加入的化学交联剂也会影响酶活。因此，提高酶稳定性、回收率和酶解效率是酶法生产活性肽工艺中需要解决的难题。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法，采用该方法所得花生活性肽纯度高且活性好。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法，其包括如下步骤：

1）制备化学改性的磁性壳聚糖微粒：

在碱性条件下，将壳聚糖粉末与环氧氯丙烷混合后于50-70℃搅拌反应1-2 h，然后加入二胺化合物继续反应1.5-2.5 h，反应结束后固液分离，取固体备用，投料比按照每1g壳聚糖粉末添加3-5ml环氧氯丙烷和1-5ml二胺化合物计；将固体用稀酸（所用稀酸可以是乙酸、盐酸、硫酸等）溶解后，加入三聚磷酸钠和粒径≤100nm、纯度不小于95%的四氧化三铁超声波搅拌处理，三聚磷酸钠的加入量为固体重量的0.05-0.1倍，四氧化三铁的加入量为固体重量的0.25-0.75倍，反应完毕后用磁铁吸附体系中的固体颗粒，即为改性后的磁性壳聚糖微粒，记为固体颗粒a；

2）磁性壳聚糖固定复合蛋白酶：将上述改性后的磁性壳聚糖微粒（即固体颗粒a）加入到含2-5V%戊二醛的磷酸缓冲液中室温下搅拌1-3 h，然后加入含复合蛋白酶的磷酸缓冲液继续搅拌3-6 h，结束后用磁铁将体系中的固体颗粒吸附出，记为固体颗粒b，备用（固体颗粒b可4℃储存于磷酸缓冲液中，长期储存时，应冷冻干燥保存）；其中，所述磷酸缓冲液浓度为0.05－0.2 mol/L，pH 6.8-8.0；投料比按照每1g改性后的磁性壳聚糖微粒添加10-30mL含戊二醛的磷酸缓冲液和2-6 mL含复合蛋白酶的磷酸缓冲液计，复合蛋白酶在体系中的质量终浓度为0.1-2.5%；

3）制备花生蛋白：将花生饼粕粉碎、脱油后，采用碱提酸沉提取花生蛋白；

4）制备花生活性肽：将花生蛋白用蒸馏水溶解（以每1g花生蛋白用8－12ml蒸馏水溶解为宜）并调至pH为 8.0－10.5，然后加入固体颗粒b于35－50 ℃酶解2－4h，酶用量为3000－4000 u/g蛋白，反应结束后调至酶解反应体系pH为7.0；酶解过程搅拌转速以80－120 rpm为宜。

5）肽液纯化处理：取步骤4）所得酶解反应体系，将除去固体颗粒后的剩余溶液离心，取上清液用活性炭吸附脱色、纳滤膜脱盐、超滤膜分离得花生活性肽精制液，花生肽精制液再经浓缩、喷雾干燥制得花生活性肽干粉。除去固体颗粒的具体操作可以为：用磁铁从酶解反应体系中吸附固体颗粒，吸附后将其加入到稀碱液中浸泡10－20 min，蒸馏水洗至中性，4℃保存。

其中，活性炭吸附脱色条件具体为：40－60℃搅拌30－60 min，活性炭加入量为花生饼粕重量的1－4%。纳滤膜截留分子量为70－200 Da，超滤膜截留分子量为5000 Da，操作压力0.15－0.25 Mpa。喷雾干燥选用压力喷雾干燥机，3－5%肽液浓度，进口温度160－180℃，出口温度为70－80℃，压力为1.2－1.6 Mpa。

具体的，步骤1）中，将壳聚糖用碱液浸泡6－9 h后，加入环氧氯丙烷于50－100℃搅拌（搅拌速度在100－300 rpm为宜）反应1-2 h；所述的二胺化合物为乙二胺、1，4-丁二胺、1，6-已二胺、1，8-辛二胺或1，12-二氨基十二烷等。其中，1g壳聚糖以用8－15ml、浓度1 mol/L的碱液浸泡为佳，所述碱液可以是NaOH水溶液、KOH水溶液等。

步骤1）中，超声波搅拌处理条件为：20 kHZ，500－800 W，30－60 min，150－250 rpm。

步骤2）中，复合蛋白酶由碱性蛋白酶和中性蛋白酶按酶活比2:1混合而成，所述碱性蛋白酶为蛋白酶2709或蛋白酶Alcalase，所述中性蛋白酶为胰蛋白酶、蛋白酶Neutrase或蛋白酶AS1.398。

步骤3）具体为：将花生饼粕粉碎后过60－80目，与正己烷混合（以每1克花生饼粕添加4-8mL正己烷为宜）回流2－4 h进行脱油，脱油后的花生饼粕粉与水按质量比1:6－12混合，用碱试剂（如NaOH、KOH等）调至pH值为8－12，机械搅拌1－2h（搅拌速度100－250 rpm），4000－4500 rpm离心10－20 min，取沉淀重复碱提过程，合并两次上清液，用80－100目滤网过滤，滤液加酸调至pH 为4.10－4.60，静置10－20 min，4000－4500 rpm转速下离心10－20 min，收集沉淀，即为花生蛋白。

本发明中所用的粒径≤100nm、纯度不小于95%的四氧化三铁可以购买符合条件的市售产品，也可以按照下述方法制备：氮气保护下，在Fe³⁺和Fe²⁺盐溶液中加入氨水（Fe³⁺和Fe²⁺摩尔比为2：1，所加氨水与Fe³⁺的摩尔比不小于20），然后于60－90℃搅拌反应0.5－1.5 h，反应过程中可通过补加氨水使体系pH始终保持在10以上；反应结束后固液分离，所得固体为四氧化三铁微球；可暂储存于pH 2-4的乙酸水溶液中，备用。

本发明提供了一种利用固定化酶制备花生肽的生产工艺，该方法采用化学共价方法改性磁性壳聚糖微粒，使酶与载体之间通过碳链连接，既提高了固定化酶的酶活又不影响固定化酶的稳定性；固定复合蛋白酶，提高了酶法水解的效率；膜分离、脱盐和干燥获得的花生活性肽纯度高且活性好。本发明方法提高花生副产物的综合利用率，不但能为社会带来可观的经济价值，而且具有生理保健功能的活性肽产品可以提高我国居民身体素质，具有积极的社会价值。

与现有技术相比，本发明方法的优点和有益效果如下。

1、采用本发明方法生产出来的花生肽纯度高、活性好。其中肽含量高于85%，灰分含量小于5%，脂肪含量小于2%，干燥失重小于5%，分子量小于1000 Da的短肽含量大于60%，三氯乙酸氮溶解指数大于99%；花生活性肽ACE抑制活性(降血压)的IC₅₀小于0.6 mg/mL，20 mg/mL花生活性肽抗氧化活性大于50%。

2、采用改性磁性壳聚糖微粒固定复合蛋白酶酶活高，性质稳定，耐储藏。通过增加酶与载体间的碳链，固定化酶的水解活性较传统固定化酶提高2倍以上。经过上述改性磁性壳聚糖微粒固定的复合蛋白酶，适用pH范围增宽，且45－55℃依然具有较好的热稳定性。前五次重复使用后酶活力可保留同等量游离酶活力的50－95%，重复使用10次，残留酶活力为原有酶活的10－20%。

3、采用喷雾干燥制备活性肽粉，一方面提高缩短了干燥时间，提高生产效率，另一方面提高了肽粉的复水溶解性。

4、本发明中在常温下采用膜分离技术对料液进行分离纯化脱盐，高效节能且无污染。

5、本发明方法生产效率高，成本低，生产工艺安全、环保、节能，产品品质高，可广泛用于化妆品、食品、药品等领域。

具体实施方式

以下通过优选实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例 1 ：

1）制备化学改性的磁性壳聚糖微粒：

氮气保护下，取13.9914 g FeCl₃·6H₂O和5.1465 g的FeCl₂·4H₂O加入到240 mL蒸馏水中，于80℃搅拌1h（转速400 rpm），随即逐滴加入80 mL质量浓度28%的氨水反应30 min，反应过程中需补加氨水使体系pH始终保持在10以上；反应结束后冷却至室温，固液分离，所得固体为四氧化三铁；用水洗涤后，暂存于pH 2-4的乙酸水溶液中，备用。

称取36 g壳聚糖粉末，加入到360 mL 1mol/L的NaOH中室温浸泡6 h，然后加入110 mL环氧氯丙烷于60℃、120 rpm搅拌反应1h，随后加入72 mL 1,6-已二胺继续反应2h，反应结束后固液分离，固体水洗后沥干水，备用，记为改性壳聚糖微粒。

取20g上述所得固体（即改性壳聚糖微粒）用3000 mL 1%乙酸溶液搅拌溶解后，加入5g四氧化三铁和2.0 g三聚磷酸钠，超声波搅拌处理40 min（条件为20 kHZ，600 W，150 rpm）。反应完毕后用磁铁吸附体系中的固体颗粒，该固体颗粒即为改性后的磁性壳聚糖微粒，记为固体颗粒a，水洗后沥干水，备用。

2）磁性壳聚糖固定复合蛋白酶：将上述所得改性后的磁性壳聚糖微粒（即固体颗粒a）加入到1000 mL含3V%戊二醛的磷酸缓冲液中室温下搅拌1h，然后加入含6wt%复合蛋白酶（复合蛋白酶由酶活比为2:1的碱性蛋白酶2709和胰蛋白酶混合而成）的磷酸缓冲液200 mL继续搅拌4 h，结束后用磁铁将体系中的固体颗粒吸附出，记为固体颗粒b，该固体颗粒b即为固定复合蛋白酶的壳聚糖微粒，备用；其中，所述磷酸缓冲液浓度为0.05mol/L，pH 8.0；复合蛋白酶在体系中的质量终浓度为1%。

3）制备花生蛋白：将花生饼粕粉碎、脱油后，采用碱提酸沉提取花生蛋白，具体为：称取1000 g市售低温压榨花生饼粕（蛋白质含量54.85%），用粉碎机粉碎至80目，加入8L 正己烷于85℃回流3 h进行脱油。回流完毕冷却至室温，除去正己烷，将脱油后的花生饼粕粉转移到反应器中，加入脱油后花生饼粕粉6倍重量份的蒸馏水，机械搅拌至分散均匀，用1 mol/L的食品级NaOH调整体系pH到9.0，搅拌60 min，随后4000 rpm离心15 min，取沉淀重复碱提过程，合并两次上清液用100目滤网过滤，用1mol/L食品级盐酸调节滤液pH 值在4.3－4.4之间，静置15 min，4000 rpm离心20 min，收集沉淀，即为花生蛋白。

4）制备花生活性肽：将花生蛋白用蒸馏水溶解（每1g花生蛋白用8ml蒸馏水溶解）并调至pH为 9－10，然后加入固体颗粒b于45℃酶解2h，酶用量为3500 u/g蛋白，反应结束后调至酶解反应体系pH为7.0；酶解过程中需要搅拌，搅拌转速以80－120 rpm为宜。

5）肽液纯化处理：取步骤4）所得酶解反应体系，将除去固体颗粒后的剩余溶液离心，取上清液用活性炭吸附脱色（50℃搅拌40 min，抽滤除去活性炭）、脱色后的酶解液用截留分子量为150 Da的纳滤膜稀释10倍脱盐，脱盐后的酶解液用截留分子量为5000 Da的超滤膜分离得花生活性肽精制液，花生肽精制液旋转蒸发浓缩至肽浓度3%左右，经喷雾干燥制得245.32 g花生活性肽干粉。

获得的花生活性肽干粉是一种乳白色粉末，干基情况下，肽含量为89%，灰分为3%，脂肪含量为0.8%，糖含量为7.2%；三氯乙酸氮溶解指数为99%，分散指数为99.7%。花生活性肽ACE抑制活性(降血压)的IC₅₀小于0.52 mg/mL, 20 mg/mL花生活性肽抗氧化活性56%。

实施例 2 ：

1）制备化学改性的磁性壳聚糖微粒：

氮气保护下，取27.9828 g FeCl₃·6H₂O和11.5862 g的FeSO₄·4H₂O加入到240 mL蒸馏水中，于60℃搅拌1h（转速400 rpm），随即逐滴加入100 mL质量浓度28%的氨水反应60 min，反应过程中需补加氨水使体系pH始终保持在10以上；反应结束后冷却至室温，固液分离，所得固体为四氧化三铁；用水洗涤后，暂存于pH 2-4的乙酸水溶液中，备用。

称取40 g壳聚糖粉末，加入到360 mL 1mol/L的NaOH中室温浸泡8 h，然后加入160 mL环氧氯丙烷于55℃、150 rpm搅拌反应2h，随后加入120mL 1,4-丁二胺继续反应2.5h，反应结束后固液分离，固体水洗后沥干水，备用，记为改性壳聚糖微粒。

将30g上述所得固体（即改性壳聚糖微粒）用3000 mL 1%乙酸溶液搅拌溶解后，加入10 g四氧化三铁和1.5g三聚磷酸钠，超声波搅拌处理30 min（条件为20 kHZ，800 W，150 rpm）。反应完毕后用磁铁吸附体系中的固体颗粒，该固体颗粒即为改性后的磁性壳聚糖微粒，记为固体颗粒a，水洗后沥干水，备用。

2）磁性壳聚糖固定复合蛋白酶：将上述改性后的磁性壳聚糖微粒（即固体颗粒a）加入到1000 mL含4V%戊二醛的磷酸缓冲液中室温下搅拌2h，然后加入含10wt%复合蛋白酶（复合蛋白酶由酶活比为2:1的碱性蛋白酶2709和中性蛋白酶Neutrase混合而成）的磷酸缓冲液200 mL继续搅拌6 h，结束后用磁铁将体系中的固体颗粒吸附出，记为固体颗粒b，该固体颗粒b即为固定复合蛋白酶的壳聚糖微粒，备用；其中，所述磷酸缓冲液浓度为0.05mol/L，pH 7.5；复合蛋白酶在体系中的质量终浓度为1.67%。

3）制备花生蛋白：与实施例1中的步骤3）相同。

4）制备花生活性肽：将花生蛋白用蒸馏水溶解（每1g花生蛋白用10ml蒸馏水溶解）并调至pH为 8－9，然后加入固体颗粒b于45℃酶解4h，酶用量为4000u/g蛋白，反应结束后调至酶解反应体系pH为7.0；酶解过程中需要搅拌，搅拌转速以80－120 rpm为宜。

5）肽液纯化处理：取步骤4）所得酶解反应体系，将除去固体颗粒后的剩余溶液离心，取上清液用活性炭吸附脱色（60℃搅拌30 min，抽滤除去活性炭）、脱色后的酶解液用截留分子量为150 Da的纳滤膜稀释15倍脱盐，脱盐后的酶解液用截留分子量为5000 Da的超滤膜分离得花生活性肽精制液，花生肽精制液旋转蒸发浓缩至肽浓度5%左右，经喷雾干燥制得238.68 g花生活性肽干粉。

获得的花生活性肽干粉是一种乳白色粉末，干基情况下，肽含量为89.8%，灰分为2.7%，脂肪含量为0.7%，糖含量为6.8%；三氯乙酸氮溶解指数为99%，分散指数为99.7%。花生活性肽ACE抑制活性(降血压)的IC₅₀小于0.59 mg/mL, 20 mg/mL花生活性肽抗氧化活性51%。

实施例 3

1）制备化学改性的磁性壳聚糖微粒：

氮气保护下，取25.6741 g Fe₂(SO4)₃和7.1909 g的FeSO₄·4H₂O加入到250 mL蒸馏水中，于70℃搅拌1h（转速400 rpm），随即逐滴加入100 mL质量浓度28%的氨水反应60 min，反应过程中需补加氨水使体系pH始终保持在10以上；反应结束后冷却至室温，固液分离，所得固体为四氧化三铁；用水洗涤后，暂存于pH 2-4的乙酸水溶液中，备用。

称取36 g壳聚糖，加入到360 mL 1mol/L的NaOH中室温浸泡8 h，然后加入160 mL环氧氯丙烷于70℃、150 rpm搅拌反应1h，随后加入130mL 1，8-辛二胺继续反应1.5h，反应结束后固液分离，固体水洗后沥干水，备用，记为改性壳聚糖微粒。

将26 g上述所得固体（即改性壳聚糖微粒）用3000 mL 1%乙酸溶液搅拌溶解后，加入6.5 g四氧化三铁和2.6 g三聚磷酸钠，超声波搅拌处理40 min（条件为20 kHZ，600 W，150 rpm）。反应完毕后用磁铁吸附体系中的固体颗粒，该固体颗粒即为改性后的磁性壳聚糖微粒，记为固体颗粒a，水洗后沥干水，备用。

2）磁性壳聚糖固定复合蛋白酶：将上述改性后的磁性壳聚糖微粒（即固体颗粒a）加入到1000 mL含5V%戊二醛的磷酸缓冲液中室温下搅拌2h，然后加入含8wt%复合蛋白酶（复合蛋白酶由酶活比为2:1的碱性蛋白酶Alcalase和胰蛋白酶混合而成）的磷酸缓冲液200 mL继续搅拌4h，结束后用磁铁将体系中的固体颗粒吸附出，记为固体颗粒b，该固体颗粒b即为固定复合蛋白酶的壳聚糖微粒，备用；其中，所述磷酸缓冲液浓度为0.2mol/L，pH7.5；复合蛋白酶在体系中的质量终浓度为1.3%。

3）制备花生蛋白：与实施例1中的步骤3）相同。

4）制备花生活性肽：将花生蛋白用蒸馏水溶解（每1g花生蛋白用12ml蒸馏水溶解）并调至pH为 8－9，然后加入固体颗粒b于35℃酶解4h，酶用量为3500u/g蛋白，反应结束后调至酶解反应体系pH为7.0；酶解过程中需要搅拌，搅拌转速以80－120 rpm为宜。

5）肽液纯化处理：取步骤4）所得酶解反应体系，将除去固体颗粒后的剩余溶液离心，取上清液用活性炭吸附脱色（60℃搅拌30 min，抽滤除去活性炭）、脱色后的酶解液用截留分子量为150 Da的纳滤膜稀释12倍脱盐，脱盐后的酶解液用截留分子量为5000 Da的超滤膜分离得花生活性肽精制液，花生肽精制液旋转蒸发浓缩至肽浓度5%左右，经喷雾干燥制得249.75 g花生活性肽干粉。

获得的花生活性肽干粉是一种乳白色粉末，干基情况下，肽含量为89.6%，灰分为2.9%，脂肪含量为0.7%，糖含量为6.8%；三氯乙酸氮溶解指数为99%，分散指数为99.7%。花生活性肽ACE抑制活性(降血压)的IC₅₀小于0.51 mg/mL, 20 mg/mL花生活性肽抗氧化活性54%。

上述各实施例中所用到的相关测定方法如下。

①三氯乙酸氮溶解指数测定方法

分别取两份质量相同（1g）的花生活性肽干粉，将其中一份用10 mL蒸馏水溶解，随后加入10 mL浓度10%的三氯乙酸溶液混匀，静置30min，3500rpm离心5min，采用凯氏定氮法计算上清液中可溶性氮的质量(g)和另外一份中总氮的质量(g)。计算公式如下：

三氯乙酸氮溶解指数（%）=(上清液中氮质量/总氮质量)×100

三氯乙酸氮溶解指数越高，表明肽粉中蛋白、多肽等杂质含量越低，肽粉纯度越高。

② ACE 抑制活性测定方法

将花生活性肽干粉适当稀释（浓度0.5－1mg/mL），使用96孔酶标板作为反应容器。取20µL样液(无抑制的反应液用蒸馏水代替)与40 µL底物溶液（底物是4.66 mmol/L 马尿酰-组氨酰-亮氨酸的氯化钠磷酸缓冲液）混合，然后加入40μL浓度为12.5 mµ/mL血管紧张素转换酶液(对照液中以蒸馏水代替)，在微孔板混合器上混匀后置于37˚C恒温箱中反应1 h，然后加入150µL浓度1.2 mol/L NaOH溶液终止酶反应。接着在反应液中加入2%邻苯二甲醛甲醇溶液40 µL混匀，室温下静置20 min后加入6 mol/L的HCl溶液40 µL终止衍生反应。将上述溶液稀释50倍后，测定荧光吸收强度，测定的激发波长340 nm；发射波长为455 nm；狭缝宽度为5 nm。样液的ACE抑制活性的计算公式如下：

ACE抑制率（%）= [1-(a-c) ÷ (b-d)] × 100

式中，a表示抑制剂与ACE都存在时的荧光吸收强度；

b表示抑制剂不存在而ACE存在时的荧光吸收强度；

c表示抑制剂存在而ACE不存在时的荧光吸收强度；

d表示抑制剂与ACE都不存在时的荧光吸收强度。

ACE抑制率越大，表明该样品的ACE抑制活性越强。以抑制剂浓度的对数值为横坐标，以抑制率为纵坐标，绘制回归曲线，计算抑制率达到50%时抑制剂的浓度，即为半抑制浓度，记为IC₅₀。IC₅₀值越小，说明抑制剂对ACE活性的抑制能力越强。

③抗氧化活性测定方法

将花生活性肽干粉溶于水（浓度15－20 mg/mL），取一定体积的上清液加入10 mL 50 mmol/L pH7.0的磷酸缓冲液和10 mL 1.3%亚油酸乙醇溶液，定容至25 mL，置于40℃暗室中反应10 min。从中取80 µL溶液，加入100 µL 1%KSCN乙醇溶液和100 µl 1.3 mmol/L FeCl₂乙醇溶液于酶标板中，测定波长为492 nm。抗氧化计算公式如下：

AA（%）=A_o-A_s/A_o×100

式中：AA为抗氧化能力；A_o为空白吸光度；A_s为加抗氧化剂的样品吸光度。AA值越高，表明该物质的抗氧化能力越强。

Claims

1.一种利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）制备化学改性的磁性壳聚糖微粒：

在碱性条件下，将壳聚糖粉末与环氧氯丙烷混合后于50－100℃搅拌反应1-2 h，然后加入二胺化合物继续反应1.5-2.5 h，反应结束后固液分离，取固体备用，投料比按照每1g壳聚糖粉末添加3-5ml环氧氯丙烷和1-5ml二胺化合物计；

将固体用稀酸溶解后，加入三聚磷酸钠和粒径≤100nm、纯度不小于95%的四氧化三铁超声波搅拌处理，三聚磷酸钠的加入量为固体重量的0.05-0.1倍，四氧化三铁的加入量为固体重量的0.25-0.75倍，反应完毕后用磁铁吸附体系中的固体颗粒，即为改性后的磁性壳聚糖微粒，记为固体颗粒a；

2）磁性壳聚糖固定复合蛋白酶：将上述改性后的磁性壳聚糖微粒加入到含2-5V%戊二醛的磷酸缓冲液中室温下搅拌1-3 h，然后加入含复合蛋白酶的磷酸缓冲液继续搅拌3-6 h，结束后用磁铁将体系中的固体颗粒吸附出，记为固体颗粒b，备用；其中，所述磷酸缓冲液浓度为0.05－0.2 mol/L，pH 6.8-8.0；投料比按照每1g改性后的磁性壳聚糖微粒添加10-30mL含戊二醛的磷酸缓冲液和2-6 mL含复合蛋白酶的磷酸缓冲液计，复合蛋白酶在体系中的质量终浓度为0.1-2.5%；

4）制备花生活性肽：将花生蛋白用蒸馏水溶解并调至pH为 8.0－10.5，然后加入固体颗粒b于35－50 ℃酶解2－4h，酶用量为3000－4000 u/g蛋白，反应结束后调至酶解反应体系pH为7.0；

5）肽液纯化处理：取步骤4）所得酶解反应体系，将除去固体颗粒后的剩余溶液离心，取上清液用活性炭吸附脱色、纳滤膜脱盐、超滤膜分离得花生活性肽精制液，花生肽精制液再经浓缩、喷雾干燥制得花生活性肽干粉。

2.如权利要求1所述利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法，其特征在于，步骤1）中，将壳聚糖用碱液浸泡6－9 h后加入环氧氯丙烷；所述的二胺化合物为乙二胺、1，4-丁二胺、1，6-已二胺、1，8-辛二胺或1，12-二氨基十二烷。

3.如权利要求1所述利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法，其特征在于，步骤1）中，超声波搅拌处理条件为：20 kHZ，500－800 W，30－60 min，150－250 rpm。

4.如权利要求1所述利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法，其特征在于，步骤2）中，复合蛋白酶由碱性蛋白酶和中性蛋白酶按酶活比2:1混合而成，所述碱性蛋白酶为蛋白酶2709或蛋白酶Alcalase，所述中性蛋白酶为胰蛋白酶、蛋白酶Neutrase或蛋白酶AS1.398。

5.如权利要求1所述利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法，其特征在于，步骤3）具体为：将花生饼粕粉碎后过60－80目，与正己烷混合回流2－4 h进行脱油，脱油后的花生饼粕粉与水按质量比1:6－12混合，用碱试剂调至pH值为8－12，搅拌1－2h，4000－4500 rpm离心10－20 min，取沉淀重复碱提过程，合并两次上清液，用80－100目滤网过滤，滤液加酸调至pH 为4.10－4.60，静置10－20 min，4000－4500 rpm转速下离心10－20 min，收集沉淀，即为花生蛋白。