JPS63304000A - 生体由来物質の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、タンパク質、糖タンパク質及びこれらの誘導
体などの生体由来物質を変性させることなく担体に固定
化することができる生体由来物質の固定化方法に関する
。

［従来技術］ 一般に、タンパク質、糖タンパク質など生体山来物質を
高分子材料に固定化する方法としては、生体由来物質が
荷電を有するものであれば、反対の荷電を高分子材料に
導入してイオン相互作用により固定化する方法を適用す
ることができ、生体由来物質が疎水性ドメインを有する
ものであれば、疎水性高分子材料に疎水性相互作用によ
り固定化する方法を適用することができ；生体由来物質
の存在下で網目状高分子を生成させることにより、形成
される網目の中に封じ込む方法を適用することができる
。さらに、これらの方法以外に、生体由来物質を確実に
高分子材料に固定化する方法としては、化学的に結合せ
しめることにより固定化する共有結合法がある。この共
有結合法により高分子材料に生体由来物質を固定化する
方法としては、下記のものを例示することができる。な
お、ここで■は高分子材料（担体）を表し、■は生体由
来物質を表す。

り　担体に７ミノ基を導入したのち、ジアゾ化し、生体
由来物質が有するアミノ基とカップリングを行う方法。

２）ＢｒＣＮによる活性化法。

ＯＨ０ ３）　スクシンイミド基を導入する方法。

４）　塩化シアヌルによる固定化法。

５）　ハロゲン化アセチル化による固定化法。

６）担体をアミノ化したのち、グルタルアルデヒドなど
の二官能性試薬を反応させる方法。

７）トレシルクロリドで処理する方法。

８）　過ヨウ素酸による酸化によってアルデヒド基を導
入する方法。

■−〇ＨＯ＋■−ＮＨ２ 一一→■−ＣＮ＝Ｎ−■ ９）　担体にカルボキシル基を導入したのち、カルボジ
イミドで処理する方法。

上記した生体由来物質の固定化法の中でも、確実性、特
に血液適合性材料として担体に固定化した生体由来物質
を用いる場合には、異種の生体由来物質の流出の危険性
を考慮すると、共有結合による固定化法は有用である。

［発明が解決しようとする問題点］ タンパク質、糖タンパク質等の生体由来物質を高分子材
料に固定化する際に最も注意しなければならない点は、
固定化処理において、生体由来物質の変性を最小にする
ことである。生体由来物質はその機能発現において、高
次構造が深く関与していることは既知の通りであり、固
定化処理条件は、固定化後の生体由来物質の機能発現に
際し、その性能の大小に大きな影響を与えるものである
。

生体由来物質の担体への固定化方法として、共有結合法
を適用する場合には、生体由来物質が他の固定化方法と
比べて、より厳しい環境におかれる場合が多い０例えば
、線溶系賦活化酵素であるウロキナーゼ、ストレプトキ
ナーゼ又はプラスミンを高分子材料へ共有結合法により
固定化する場合は、例えば、カルボジイミド試薬または
ウッドワード試薬を用いることができるが、カルボジイ
ミドを使用する場合、酸性領域（ｐＨ６以下）で１夜攪
拌反応させなければならない（特公昭５３−１５９１３
号公報及び特公昭ｓ５−：ｘ５２２＋号公報参照）。

また、特開昭５８−１１８７６１号公報には。

「材料表面に固定化されたアルブミン上に抗凝固性物質
及び／又は線溶系賦活化酵素が固定化されていることを
特徴とする抗血栓性材料」に係る技術が開示されている
が、活性化したポリアミドへのアルブミンの固定化及び
それに続く、ウロキナーゼの固定化に際し、カルボジイ
ミドをカップリング剤として使用しているために、ｐＨ
４，８で１夜攪拌し目的物を得ている。この場合、高分
子材料とウロキナーゼを直接結合したものより、アルブ
ミンを介して結合させた方が、線溶活性は高いことが示
されている。理由として、アルブミンを介することによ
る担持量の増加として説明されている。

更に前記公報によれば、アルブミンは抗凝血物質及び／
又は線溶系賦活化酵素を固定化するための二次的な担体
を形成し、それ自体は何ら抗凝血活性を有するものでは
ないから、固定化方法及び条件は任意であるとしている
。しかし、に、Ｓ。

Ｍａｎｒｏら（ＴｒａｎＳ、　Ａｍ、　Ｓｏｃ、　Ａｒ
ｔｉｆ、　Ｉｎｔ、　Ｒｏｇａｎｓ。

２７、４１１９　（＋９８１））によれば、アルブミン
を安定に吸着した表面においては、十分な抗凝血栓性を
示すことが報告されている。即ち、積極的な抗凝血活性
を示さないアルブミンも、変性を著しく抑制して表面に
導入可能であれば、抗血栓性材料としては、十分に機能
することを意味している。

しかしながら、かかる方法においても、第１に固定化す
るアルブミン、ｗＩＪ２に固定化するウロキナーゼにお
いて、タンパク質の安定性に好ましくない反応条件であ
ることは言うまでもない。

また、血液適合性材料の開発において、ミクロ相分離構
造の有用性が指摘されているが、これは、血中のタンパ
ク質をできるだけ変性を小さくして高分子材料表面に吸
着させて、血球成分、特に血小板の活性化を抑制しよう
というものである。このように、一般に高分子材料にタ
ンパク質が直接吸着する際、高次構造の変化に伴う、性
質変化は、大小はともあれ免れない、生体由来物質を導
入する際にも、これと同様なことが言える。

即ち、高分子表面にカップリング試薬を用いて、直接、
共有結合により導入した生体由来物質は、変性を免れ得
ない、特公昭５９−５０３３９号公報に開示されている
セルロース又はその誘導体を担体とし１表面にウロキナ
ーゼが固定化された抗血栓性医療材料においても、担体
が親水性であるセルロースであるため、担体が疎水性材
料である場合よりは変性は軽度であるが、変性による活
性低下を免れることはできない。

したがって、本発明は、上記の問題点を解決し・担体に
生体由来物質を固定化する場合において、該生体由来物
質が変性することなく・固定化後においてそれが有して
る機能を充分に発現できる生体由来物質の固定化法を提
供することを目的とする。

［問題点を解決するための手段］ 上記のとおり、生体由来物質を担体に固定化する場合に
は、固定化に際してのｐＨ１温度及び溶媒などの条件に
より該生体由来物質が変性されてしまい、それが本来的
に有している優れた機能を有効に発現できなくなる。し
たがって、本発明者らは、かかる問題点を解決するべく
鋭意研究を行った結果、■固定化による生体由来物質の
変性を防ぐためには生理的条件下で固定化を行えばよい
こと及び■そのためには担体と生体由来物質との間に適
当な！ａ衝域（スペーサー）を設け、担体と生体由来物
質との直接的な相互作用を制限すること、により生体由
来物質の変性を防止できることを見出し１本発明を完成
するに至った。

すなわち、本発明の生体由来物質の固定化方法は、担体
に生体由来物質を固定化する方法において、該生体由来
物質が有する第１級アミノ基と、予め担体に結合させた
多官能性の親水性高分子化合物に導入した生理的条件下
でｉ１級アミノ基と結合可能な官能基とを、生理的条件
下で結合させることを特徴とする。

本発明で用いる担体は、特に制限されるものではなく、
水不溶性の高分子材料又は無機材料を用いることができ
る。水不溶性の高分子材料としては、例えば、セルロー
ス、アミノエチルセルロース、エチレンと酢酸ビニルの
共重合体の加水分解物、ポリウレタン、ポリビニルアル
コール、ポリエステル、ポリアミドなどを用いることが
でき、無機材料としては、例えばガラス板などを用いる
ことができる。

本発明で用いる多官能性の親水性高分子化合物は、担体
に生体由来物質を結合させる場合にスペーサーの役目を
するものである。かかる多官能性の親水性高分子化合物
としては、担体と結合可能であり、かつ、生体由来物質
が有する第１級アミノ基と生理的条件下で反応可能な官
能基を導入することができるものであれば如何なるもの
であってもよく１例えば、ポリエチレングリコール及び
ポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコ
ール又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリ
コールとのランダムもしくはブロック共重合体並びにこ
れらの誘導体、例えば。

末端カルボン酸又は末端アミノ化物を用いることができ
る。

本発明においては、上記の担体に親水性高分子化合物を
生体由来物質の固定化に先立って予め結合・固定する。

この場合に、担体として水不溶性の高分子材料を用いる
場合には、適当な溶媒中で高分子材料と親水性高分子化
合物を反応させることにより両者を結合させることがで
きる。担体として無機材料を用いる場合には、予め無機
材料表面を親水性高分子化合物の官能ノ、（と結合可能
な官能基を有する化合物、例えばシランカップリング剤
で処理したものを、同様に親水性高分子化合物と反応さ
せることにより両者を結合させることができる。

また、担体に親水性高分子化合物を結合させる場合には
、親水性高分子化合物に生体由来物質の第１級アミノ基
と生理的条件下で結合可能な官能基を導入したのち行う
か又は担体に親水性高分子化合物を結合させたのち官能
基を導入することができる。

ここで導入可能な官能基としては、生体由来物質の第１
級アミノ基と生理的条件下で反応可能なものであれば如
何なるものであってもよく１例えば、次式： ％式％ （式中、又は強電子吸引基を表す） で示されるものがあり、ここで、Ｘとしては例えＩｆ。

を挙げることができる。この場合、生体由来物質の有す
る第１級アミノ基と生理的条件下で速やかに反応し、ア
ミド結合により化学的に結合する。

また、ヒドロキシ基又はアミノ基を塩化シアヌール化す
ることにより活性官能基化したもの、例えば、 を挙げることができる。この場合、生体由来物質の有す
るｉｆ級アミノ基は生理的条件下で速やかに、トリアジ
ニル基と化学的に結合する。さらには、 を挙げることができる。この場合、生体由来物質の有す
るｉｆ級アミノ基と生理的条件下で速やかに反応し、ウ
レタン結合により化学的に結合する。

導入方法は特に制限されないが、例えば、末端にカルボ
キシル基を有する親水性高分子化合物とＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド又はペンタクロロフェニールとをカルボ
ジイミドの存在下で縮合反応させる方法が、簡便で、か
つ、高い収率で目的とする官能基を導入できることから
好ましい。

このように、官能基を有する親水性高分子化合物を担体
に結合・固定したのち、生理的条件下で担体に親水性高
分子化合物を介して生体由来物質を固定化する。

なお、本発明の固定化法においては、１０体とスペーサ
ーとなる親水性高分子化合物とを結合せしめたのち、該
スペーサーを介して生体由来物質を結合争固定化させる
が、スペーサーとなる親水性高分子化合物と生体由来物
質を結合させたものを担体に結合・固定化させることも
可能である。

本発明の固定化法を適用可能な生体由来物質としては、
生体から得られるタンパク買、糖タンパク質及びアミノ
癩などの生体由来物質又は生体由来の誘導体であれば如
何なるものであってもよいが、その有用性から例えばア
ルブミン、グロブリンなどの血しょうタンパク買、線溶
系賦活化酵素、ヘパリメイド、細胞接着因子及びアミノ
酸などを用いることができ、これら以外にも生体由来物
質の誘導体として、例えば、生理的に活性なペプチドな
ども用いることができる。

ここでいう生理的条件とは、固定化処理により生体由来
物質を変性させることがない条件であり、例えば通常い
うところの中性付近の電解質を含む水溶液中で、室温〜
３７℃付近の条件である。

本発明の固定化法により担体に固定化した生体由来物質
は、診断用ディバイス、バイオセンサー、バイオリアク
ター、血液適合性材料及び細胞培養ｎ１基材などに適用
することができる。

［実施例］ 実施例１ 内径３５■■ガラス製シヤーレに７ミノエチルセルロー
スのジメチルホルムアミド溶液を注ぎ、減圧下、４０℃
で加熱して溶媒を留去し、キャスト膜を得た。ここに、
分子［１０００のポリエチレングリコールジカルボン酸
のジスクシンイミドエステル（′ｃＲ度０−１　ｇ／＋
ａＺ）　水溶液ヲ注ｆｆ、４０℃で３時間放置した。そ
の後、水溶液を捨て、十分に水洗したのち、血しょうフ
ィブロネクチンを２０ｐ−ｇ／ｗＪの濃度になるように
溶解させた０、１モルのリン酸緩衝液（ｐ）１７　、４
）を注ぎ、１時間放置した０次いで、溶液を捨て、十分
にリン酸緩衝液でリンスしたのち、アミノエチルセルロ
ースにポリエチレングリコールを介して固定化された血
しょうフィブロネクチンの活性を肝実質細胞の接着活性
及び伸展活性の測定より求めた。

すなわち、ラット肝臓より、Ｓｅｇｌｅｎ　（Ｓｅｇｌ
ｅｎ。

Ｐ、　Ｏ，；　Ｍｅｔｈａｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、　１３．２９〜８３（＋９７１１１））ら
の方法に準じ、肝実質細胞を分離し、Ｗｉｌｌｉａｍｓ
’　Ｅ培地（無血清）に９．　％させた。この懸濁液を
シャーレに細胞数が約４５万個／皿となるように注入し
、一定時間インキュベートしたのち、非接着細胞をカウ
ントすることにより接着率を算出した。また位相差ＷＪ
微鏡観察による形態変化で伸展活性を測定した。

この結果、」：述した血しょうフィブロネクチンをポリ
エチレングリコールを介して、アミノエチルセルロース
に固定化した材料について、接着活性はインキュベーシ
ョン３０分で９０％と高い接着率が得られ、しかも伸展
活性についても形態変化が１時間後に観察された。

実施例２ 実施例１において血しょうフィブロネクチンの代わりに
オリゴペプタイド（アルギニン−グリシン−アスパラギ
ン酸−セリン）を用いて、これを固定化させた。

このものの接着活性は、インキュベーション１５分で９
０％と高い接着率であり、伸展活性についても実施例１
の場合より優れていた。

比較例１ 実施例１と同様にアミノエチルセルロースのキャスト膜
をシャーレ上に作製した。ここに、血しょうフィブロネ
クチン溶液（２０ｇｇ／ｓＪ、０．１モルのリン酸緩衝
液、ｐＨ＝７．４）を注ぎ、３０分間、室温で放はした
のち、溶液を捨て、冷所で風乾した。風乾後、シャーレ
に１％−グリタールアルデヒドリン酸！［液（ｐＨニア
、４）を注ぎ、１０℃で一晩放置した。その後、生理食
塩水で十分に洗ｆｉｌ　したのち、実施例１と同様にし
て肝実質細胞の接着活性及び伸展活性を測定した。

その結果、接着活性はインキュベーション３時間におい
て接着率が５０％と低く、伸展活性も観察されなかった
。

実施例３ 両末端にカルボキシル基を有するポリエチレングリコー
ルを脱水した有機溶媒中において、カルボジイミドの存
在下Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、ポリ
エチレングリコールの両末端をスクシンイミド化した０
次いで、アミノエチル化セルロース又はジイソシアネー
トでウレタン化したセルロースを水で処理したアミノ化
セルロースとスクシンイミド化したポリエチレングリコ
ールを反応させた。この反応によりスクシンイミド化し
たポリエチレングリコールをアミノ化セルロース表面に
固定した。固定化されたことはＸ線光電子分析解析によ
ってＮ／Ｃ比の減少および０／Ｃ比の増大により確認し
た。

次いで、このアミノ化セルロースをアルブミンのリン酸
緩衝液（７３度０．１．ｐＨ７，４）中に浸漬し、３７
°Ｃで一昼夜放塁した。放置後に取り出し、リン酸緩衝
液で洗浄したのちＸ線光電分析を行ったところ、アルブ
ミンの導入が確認された（Ｎ／Ｃ比の増大及びＯ／Ｃ比
の減少）、また、インプロパツール／水の混合溶媒で洗
浄を行ったが、Ｎ／Ｃ比及びＯ／Ｃ比には変化がなく、
アルブミンはアミノ化セルロースに化学的に結合された
ものといえる。なお、このものは、緩衝液中に長時間放
置した場合にも何ら変化はなかった。

比較例２ スクシンイミド化したポリエチレングリコールを結合さ
せていないアミノ化セルロースとアルブミンを用い、実
施例２と同様に処理したのち、Ｘ線光電分析を行ったと
ころ、アルブミンの吸着は認められたが、インプロパツ
ール／水の混合溶媒で洗浄を行った場合においてインプ
ロパツール濃度を上げて行った場合には、アルブミンは
アミノ化セルロース表面から容易に脱着されてしまった
。したがって、この場合にはアルブミンは巾に物理的に
吸着していたものと認められる。

実施例４及び比較例３ 実施例３に準じて、アミノ化セルロース表面に強力な線
溶酵素である組織プラスミノーゲンアクチベータ−（Ｔ
ＰＡ）の固定化を行った。ただし、比較例２に準じてＴ
ＰＡの固定化を行ったものを比較例３とする。

このものについて、プラスミノーゲンの活性化を１合成
蛍光基質により評価したところ、実施例３の場合の方（
すなわち、化学的な固定化を行ったもの）が大きかった
。また、スペーサーとして用いたポリエチレングリコー
ルの分子量を表に示すとおりに増加させたところ、分子
量が大きくなるほどプラスミノーゲン活性化の効果は顕
著であった。この事実から、ポリエチレングリコール鎖
の末端に化学的に固定化されたＴＰＡは依然として高い
酵素活性を保持していると共に、立体的にもプラスミノ
ーゲンが接近し易い配位であるものと認められる。

を１００とした場合の値である。

実施例５ まず、ガラス板表面をアミノ基を含むシランカップリン
グ剤で処理してアミノアルキル基をガラス板表面に導入
した０次いで、実施例１と同様にして得た両末端スクシ
ンイミド化ポリエチレングリコールと該ガラス板を接触
させ、スクシンイミド化ポリエチレングリコールで表面
修飾されたガラス板を得た。その後、この表面修飾され
たガラス板を実施例１に準じてインシュリン抗体と接触
させて、該ガラス板の表面にインシュリン抗体を固定化
させた。

［発明の効果］ 本発明の固定化法によれば。

■　生体由来物質の固定化収率を増大させることができ
ること、 ■　固定化反応操作が簡便であること、■　固定化され
た生体由来物質の安定性が非常に高いこと、 ■　生理的条件下で固定化を行っているために、固定化
された生体由来物質が、・酵素活性および抗原抗体反応
における結合性などの優れた機崗を有していること、 などの優れた効果が得られる。

また、本発明の固定化法を適用してインシュリン抗体を
固定化させた担体は、血中インシュリン濃度を測定でき
る診断用キットとして応用できる。とりわけ、この場合
には、従来のグルタルアルデヒドなどを用いる測定方法
に比べて、■　担体とスペーサー、スペーサーと抗体が
、それぞれアミド結合により結合していることから極め
て安定であること、 ■　スペーサーを介しての抗原抗体反応であるので固定
化されるタンパク質（抗原）の抗体の影響による変性が
大幅に抑制される。

という優れた効果も有している。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）担体に生体由来物質を固定化する方法において、
   該生体由来物質が有する第１級アミノ基と、予め担体に
   結合させた多官能性の親水性高分子化合物に導入した生
   理的条件下で第１級アミノ基と結合可能な官能基とを、
   生理的条件下で反応させることを特徴とする生体由来物
   質の固定化方法。
2. （２）多官能性の親水性高分子化合物がポリアルキレン
   グリコール及びその共重合体である特許請求の範囲第１
   項記載の固定化方法。
3. （３）活性官能基が次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘは強電子吸引基を表す） で示されるものである特許請求の範囲第１項記載の固定
   化方法。
4. （４）官能基がヒドロキシ基又はアミノ基を塩化シアヌ
   ール化することにより官能基化されたものである特許請
   求の範囲第１項記載の固定化方法。
5. （５）官能基が次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で、示されるものである特許請求の範囲第１項記載の固
   定化法。
6. （６）生体由来物質が血清タンパク、線溶系賦活化酵素
   、ヘパリノイド、細胞接着因子、生理的に活性なペプチ
   ドである特許請求の範囲第１項記載の固定化方法。