JPS61197600A - ヒトインターフェロン―βの精製方法 - Google Patents
ヒトインターフェロン―βの精製方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、インターフェロンの精製方法に係り、特に特
定吸着担体を用いてインターフェロンを精製する方法に
関するものである。
定吸着担体を用いてインターフェロンを精製する方法に
関するものである。
（従来の技術）
インターフェロンは長野ら（Ｃｏｍｐｔ、 Ｒｅｎｄ。
Ｓｏｃ％Ｂｉｏｔ、 １４８巻、１７００頁、１９５
４年）およびｌ５ａａｃｓら（Ｐｒｏｃ、 Ｂ＋Ｏｙ、
Ｓｏｃ、 Ｓｅｒ 、 Ｂ＋ １４７巻、２５８頁、１
９５７年）によって発見された抗ウイルス物質であり、
近年、抗腫瘍効果を含む多岐にわたる生物学的作用を有
することが報告され（Ｇｒｅｓｓｏｒ、 １．ら、 Ｂ
、１３人、５１６巻、２３１頁、１９７８年）、 医薬
としての可能性が注目を集めている。
４年）およびｌ５ａａｃｓら（Ｐｒｏｃ、 Ｂ＋Ｏｙ、
Ｓｏｃ、 Ｓｅｒ 、 Ｂ＋ １４７巻、２５８頁、１
９５７年）によって発見された抗ウイルス物質であり、
近年、抗腫瘍効果を含む多岐にわたる生物学的作用を有
することが報告され（Ｇｒｅｓｓｏｒ、 １．ら、 Ｂ
、１３人、５１６巻、２３１頁、１９７８年）、 医薬
としての可能性が注目を集めている。
インターフェロンの製造は一般に細胞培養あるいは遺伝
子組み換え法によって行なわれているが、通常、生産さ
れるインターフェロンの含有址は極めて少なく、そのた
め医薬として使用しうるインターフェロンを得るには、
粗インターフェロン液を出発材料として、高度に純化さ
れたインターフェロンを得ることのできる精製方法を確
立する必要がある。
子組み換え法によって行なわれているが、通常、生産さ
れるインターフェロンの含有址は極めて少なく、そのた
め医薬として使用しうるインターフェロンを得るには、
粗インターフェロン液を出発材料として、高度に純化さ
れたインターフェロンを得ることのできる精製方法を確
立する必要がある。
ところで、これまでに各種のヒトインターフェロンの精
製方法が報告されておシ、例えばインターフェロン−ａ
については、亜鉛キンートカラムクロマトグラフィー法
（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ 、 Ｍ。
製方法が報告されておシ、例えばインターフェロン−ａ
については、亜鉛キンートカラムクロマトグラフィー法
（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ 、 Ｍ。
ら、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
Ｕ、８．Ａ、 、 ７６巻。
Ｕ、８．Ａ、 、 ７６巻。
６４Ｇ頁、１９７９年）や、ブルーセファロースカラム
クロマトグラフィー法（Ｚｏｏｎ、 Ｋ、Ｃ，らＰｒｏ
ｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ
、 、 ７６巻、 ５６０１頁、１９７９年）を使用し
た精製方法等が報告されている。またインターフェロン
ーーに関しては、硫安塩析法、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー法および０Ｍセファデックスカラムクロマトグラフ
４−法を使用した方法（Ｋｎｉｇｈｔ ｅ Ｅ、 Ｊｒ
、 ＊Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
Ｕ、８．Ａ、 、 ７５巻、５２０頁、１９７６年）
やＳＰセファデックスカラムクロマトグラフィー法およ
び亜鉛キレートカラムクロマトグラフィー法を使用した
方法（細井和男ら、特開昭５５−６４７９９．１９８０
年）等が報告されている。さらにインターフェロン−Ｔ
の精製方法としては、多孔質ガラスクロマトグラフィー
法、コンカナバリンＡアガロースカラムクロマトグラフ
ィー法あるいはそれらの方法を組み合わせた方法（Ｙｉ
ｐ、 Ｙ、に、らｗ Ｐｒｏｃ。
クロマトグラフィー法（Ｚｏｏｎ、 Ｋ、Ｃ，らＰｒｏ
ｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ
、 、 ７６巻、 ５６０１頁、１９７９年）を使用し
た精製方法等が報告されている。またインターフェロン
ーーに関しては、硫安塩析法、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー法および０Ｍセファデックスカラムクロマトグラフ
４−法を使用した方法（Ｋｎｉｇｈｔ ｅ Ｅ、 Ｊｒ
、 ＊Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
Ｕ、８．Ａ、 、 ７５巻、５２０頁、１９７６年）
やＳＰセファデックスカラムクロマトグラフィー法およ
び亜鉛キレートカラムクロマトグラフィー法を使用した
方法（細井和男ら、特開昭５５−６４７９９．１９８０
年）等が報告されている。さらにインターフェロン−Ｔ
の精製方法としては、多孔質ガラスクロマトグラフィー
法、コンカナバリンＡアガロースカラムクロマトグラフ
ィー法あるいはそれらの方法を組み合わせた方法（Ｙｉ
ｐ、 Ｙ、に、らｗ Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、 、
７８巻、１６０１頁。
７８巻、１６０１頁。
１９８１ 年）等が報告されている。
（発明が解決しようとする問題点）
しかしながら、これらの従来報告されている各種の精製
方法は、それぞれ単独では精製度を十分上昇させること
ができず、したがって医薬として使用し得る純度のイン
ターフェロン全書るには種々の精製方法を複数個組み合
わせて使用せざるを得す、そのため、最終的に得られた
インターフェロンは、高純度にまで精製された場合でも
、その収率は極めて小さくなることが避けられなかった
のである。
方法は、それぞれ単独では精製度を十分上昇させること
ができず、したがって医薬として使用し得る純度のイン
ターフェロン全書るには種々の精製方法を複数個組み合
わせて使用せざるを得す、そのため、最終的に得られた
インターフェロンは、高純度にまで精製された場合でも
、その収率は極めて小さくなることが避けられなかった
のである。
本発明者らは、高純度のインターフェロンを収率良く得
る方法について研究を重ねた結果、特定の吸着担体を用
いてその精製ヲ行なえば１回の精製操作のみで高純度の
インターフェロンを高収率で得ることを見出し、本発明
を完成したのである。
る方法について研究を重ねた結果、特定の吸着担体を用
いてその精製ヲ行なえば１回の精製操作のみで高純度の
インターフェロンを高収率で得ることを見出し、本発明
を完成したのである。
（問題点を解決するための手段）
すなわち本発明は、粗インターフェロン液を吸着担体に
接触させ、該吸着担体にインターフェロンを吸着させ、
次いで浴用液でインターフェロン全溶出することからな
るインターフェロンの精製法において、 吸着担体として、有機高分子量物質からなる水不溶性の
担体に、リガンドとして芳香環ヲ有するアミノ酸または
芳香環含有するアミノ酸誘導体の少なくとも１個を有し
、かつ、前記水不溶性の担体に直接結合し得るか、また
は該担体に結合しているスペーサー分子に結合し得るア
ミノ基またはカルボキシル基を有する化合物を結合させ
た吸着担体を使用する、インターフェロンの精製方法に
関するものである。
接触させ、該吸着担体にインターフェロンを吸着させ、
次いで浴用液でインターフェロン全溶出することからな
るインターフェロンの精製法において、 吸着担体として、有機高分子量物質からなる水不溶性の
担体に、リガンドとして芳香環ヲ有するアミノ酸または
芳香環含有するアミノ酸誘導体の少なくとも１個を有し
、かつ、前記水不溶性の担体に直接結合し得るか、また
は該担体に結合しているスペーサー分子に結合し得るア
ミノ基またはカルボキシル基を有する化合物を結合させ
た吸着担体を使用する、インターフェロンの精製方法に
関するものである。
この場合の本発明の実施は、一般に次の様にして行なわ
れる。すなわち、インターフェロンを含有する粗インタ
ーフェロン液を、それ自体公矧のカラム法あるいはパッ
チ法にて吸着担体に接触させてインターフェロンを吸着
担体に吸着させた後、適切な緩衝液にて吸着担体を洗浄
し、次いで適切な溶出液にてインターフェロンを溶出さ
せることより、インターフェロンを精製するのである。
れる。すなわち、インターフェロンを含有する粗インタ
ーフェロン液を、それ自体公矧のカラム法あるいはパッ
チ法にて吸着担体に接触させてインターフェロンを吸着
担体に吸着させた後、適切な緩衝液にて吸着担体を洗浄
し、次いで適切な溶出液にてインターフェロンを溶出さ
せることより、インターフェロンを精製するのである。
したがって本発明は特にインターフェロンの吸着−溶出
において、特定の吸着担体を使用する点に特徴を有する
ものである。
において、特定の吸着担体を使用する点に特徴を有する
ものである。
（作 用）
本発明において使用する吸着担体は、前述の如く、有機
高分子量物質からなる水不溶性の担体部分、所望により
スペーサ一部分、およびリガンド部分より構成される吸
着担体である。
高分子量物質からなる水不溶性の担体部分、所望により
スペーサ一部分、およびリガンド部分より構成される吸
着担体である。
この場合、吸着担体を構成する水不溶性の担体部分とし
ては、アガロース、セルロース、デキストランまたはポ
リアクリルアミド等の有機高分子量化合物が挙げられ、
そのいずれも使用可能であるが、特にアガロースを担体
部分として使用するのが好ましい。
ては、アガロース、セルロース、デキストランまたはポ
リアクリルアミド等の有機高分子量化合物が挙げられ、
そのいずれも使用可能であるが、特にアガロースを担体
部分として使用するのが好ましい。
一方、本発明で使用するりガントは、芳香環含有するア
ミノ酸または芳香環を有するアミノ酸誘導体の少なくと
も１個を有し、かつ、保有するアミノ基あるいはカルボ
キシル基を介して水不溶性の担体またはその担体に結合
しているスペーサー分子と結合可能な化合物である。
ミノ酸または芳香環を有するアミノ酸誘導体の少なくと
も１個を有し、かつ、保有するアミノ基あるいはカルボ
キシル基を介して水不溶性の担体またはその担体に結合
しているスペーサー分子と結合可能な化合物である。
芳香３Ｊｌを有するアミノ酸としては、αアミノ酸に限
らず、それ以外のアミノ酸、例えば、βアミノ酸、ｒア
ミノ酸、βアミノ酸などを使用することが可能であるが
、一般に麿アミノ酸が入手しやすく、好ましい。芳香環
を有するＣアミノ酸の中では、とりわけＬ−）リプトフ
ァン、Ｄ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｄ −？ロ
ジン、Ｌ−７エニルアラニンｔたはＤ−７二二ルアラニ
ンが好ましい。これらの６ｍ類のアミノ酸は、単量体の
状態でリガンドとして使用することも可能であるが、同
一のアミノ酸のみから構成された多量体、または、少な
くとも二種類以上のアミノ酸より構成された多量体を使
用してもよい。多量体としては二量体または二量体が好
ましい。
らず、それ以外のアミノ酸、例えば、βアミノ酸、ｒア
ミノ酸、βアミノ酸などを使用することが可能であるが
、一般に麿アミノ酸が入手しやすく、好ましい。芳香環
を有するＣアミノ酸の中では、とりわけＬ−）リプトフ
ァン、Ｄ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｄ −？ロ
ジン、Ｌ−７エニルアラニンｔたはＤ−７二二ルアラニ
ンが好ましい。これらの６ｍ類のアミノ酸は、単量体の
状態でリガンドとして使用することも可能であるが、同
一のアミノ酸のみから構成された多量体、または、少な
くとも二種類以上のアミノ酸より構成された多量体を使
用してもよい。多量体としては二量体または二量体が好
ましい。
これらのアミノ酸の単量体またはアミノ酸の多量体にお
いて、含有する遊離のカルボキシル基がアルキルエステ
ル化、好ましくはメチルエステル化、エチルエステル化
またはプロピルエステル化された該アミノ酸の単量体の
誘導体あルイハ該アミノ酸の多量体の誘導体をリガンド
として使用することも可能である。
いて、含有する遊離のカルボキシル基がアルキルエステ
ル化、好ましくはメチルエステル化、エチルエステル化
またはプロピルエステル化された該アミノ酸の単量体の
誘導体あルイハ該アミノ酸の多量体の誘導体をリガンド
として使用することも可能である。
リガンドとして使用する各化合物は５例えば和光純薬株
式会社、国産化学株式会社または半井化学薬品株式会社
から購入することが可能である。多量体は国産化学株式
会社から購入するか、またはカルボジイミドを使用した
縮合反応によって合成することも可能である。カルボジ
イミドとしてはＮ−エチル−Ｎ’−（５−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（日本バイ
オラクトラボラトリーズ）などを使用することができる
。
式会社、国産化学株式会社または半井化学薬品株式会社
から購入することが可能である。多量体は国産化学株式
会社から購入するか、またはカルボジイミドを使用した
縮合反応によって合成することも可能である。カルボジ
イミドとしてはＮ−エチル−Ｎ’−（５−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（日本バイ
オラクトラボラトリーズ）などを使用することができる
。
リガンドとして使用可能な化合物は、上記に示した化合
物にのみ限定されるものではなく、芳香環を有するアミ
ノ酸および芳香環を有するアミノ酸誘導体の少なくとも
１個をその化合物分子の構成成分として含み、かつ、そ
の化合物分子内のアミノ基またはカルボキシル基ｔ 介
して水不溶性担体に直接、あるいはスペーサー分子を介
して結合可能な化合物であれば本質的に使用することが
可能である。
物にのみ限定されるものではなく、芳香環を有するアミ
ノ酸および芳香環を有するアミノ酸誘導体の少なくとも
１個をその化合物分子の構成成分として含み、かつ、そ
の化合物分子内のアミノ基またはカルボキシル基ｔ 介
して水不溶性担体に直接、あるいはスペーサー分子を介
して結合可能な化合物であれば本質的に使用することが
可能である。
本発明において使用する吸着担体は、特に水不溶性の担
体部分にリガンドが結合したものであるが、リガンドを
水不溶性担体に結合させる手段としては、前述の如く直
接結合させる方法ならびにスペーサーを介して結合させ
る方法とがある。
体部分にリガンドが結合したものであるが、リガンドを
水不溶性担体に結合させる手段としては、前述の如く直
接結合させる方法ならびにスペーサーを介して結合させ
る方法とがある。
直接リガンドを水不溶性担体に結合させる方法としては
、例えば水不溶性担体としてアガロースを選択した場合
には、ブロムシアンで活性化されたアガロースに、リガ
ンドの有するアミノ基を介してリガンドを導入すること
ができる。
、例えば水不溶性担体としてアガロースを選択した場合
には、ブロムシアンで活性化されたアガロースに、リガ
ンドの有するアミノ基を介してリガンドを導入すること
ができる。
また、カルボジイミドを使用してリガンドのアミノ基と
担体のカルボキシル基間、または、リガンドのカルボキ
シル基と担体のアミノ基との間に縮合反応を生ぜしめる
ことによって導入することも可能である。ブロムシアン
で活性化したアガロースとしては、例えばブロムシアン
活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア・ジャパン株式
会社）を使用することが可能である。
担体のカルボキシル基間、または、リガンドのカルボキ
シル基と担体のアミノ基との間に縮合反応を生ぜしめる
ことによって導入することも可能である。ブロムシアン
で活性化したアガロースとしては、例えばブロムシアン
活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア・ジャパン株式
会社）を使用することが可能である。
また、スペーサーを介してリガンドを水不溶性担体に結
合させる方法としては、リガンドの有するアミノ基まだ
はカルボキシル基と、スペーサー分子のアミノ官能基ま
たはカルボキシル官能基との間に縮合反応を生ぜしめる
ことによって導入する手段が採用される。
合させる方法としては、リガンドの有するアミノ基まだ
はカルボキシル基と、スペーサー分子のアミノ官能基ま
たはカルボキシル官能基との間に縮合反応を生ぜしめる
ことによって導入する手段が採用される。
コノスペーサー分子を介してリガンドを導入する場合の
スペーサーの長さとしては、炭素、窒素、酸素または硫
黄原子より構成される直鎖部分の原子の数の総和が２な
いし１５であることが好ましく、５ないし１５の長さの
スペーサーが特に好ましい。
スペーサーの長さとしては、炭素、窒素、酸素または硫
黄原子より構成される直鎖部分の原子の数の総和が２な
いし１５であることが好ましく、５ないし１５の長さの
スペーサーが特に好ましい。
なお、水不溶性担体への各種のスペーサー分子の導入は
、化学合成によって行なうことが可能であるが、一般に
は以下のようなすでにスペーサーを有する水不溶性担体
の市販品を使用することも可能である。例えば、アガロ
ースのＮ−ヒドロキシサクシンイミド活性化エステル誘
導体であるアフィ・ゲル１０ オラッドラボラトリーズ）や活性化Ｃｌ−１−セフルマ
シア・ジャパン株式会社）、また末端に遊離のカルボキ
シル基あるいはアミノ基を有する一ＣＯＮＨ（ＣＩ（、
）２ＮＨ２） （いずれも日本バイオラッドラボラトリ
ーズ）、ＡＨ−セファロース４Ｂルマシア・ジャパン株
式会社）などを使用することが可能である。
、化学合成によって行なうことが可能であるが、一般に
は以下のようなすでにスペーサーを有する水不溶性担体
の市販品を使用することも可能である。例えば、アガロ
ースのＮ−ヒドロキシサクシンイミド活性化エステル誘
導体であるアフィ・ゲル１０ オラッドラボラトリーズ）や活性化Ｃｌ−１−セフルマ
シア・ジャパン株式会社）、また末端に遊離のカルボキ
シル基あるいはアミノ基を有する一ＣＯＮＨ（ＣＩ（、
）２ＮＨ２） （いずれも日本バイオラッドラボラトリ
ーズ）、ＡＨ−セファロース４Ｂルマシア・ジャパン株
式会社）などを使用することが可能である。
水不溶性担体あるいはスペーサー分子を結合した水不溶
性担体へのリガンドの導入量は、水不溶性担体１−当り
、ブロムシアン活性化水不溶性担体、例えばブロムシア
ン活性化セファロース４Ｂの場合には１ないし１０ ｐ
ｍｏｌｅが好ましく％ ２ないし４声ｍｏｌｅが最も好
ましい。カルボジイミドを用いた縮合反応により、リガ
ンドを導入する場合には水不溶性担体およびスペーサー
の種類によっても異なるが、一般に水不溶性担体１ｄ当
り５ないし２０μｍｏＩ！ｅが好ましい。
性担体へのリガンドの導入量は、水不溶性担体１−当り
、ブロムシアン活性化水不溶性担体、例えばブロムシア
ン活性化セファロース４Ｂの場合には１ないし１０ ｐ
ｍｏｌｅが好ましく％ ２ないし４声ｍｏｌｅが最も好
ましい。カルボジイミドを用いた縮合反応により、リガ
ンドを導入する場合には水不溶性担体およびスペーサー
の種類によっても異なるが、一般に水不溶性担体１ｄ当
り５ないし２０μｍｏＩ！ｅが好ましい。
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド活性化エステル誘導体に
リガンドを導入する場合には水不溶性担体１ｄ当り５な
いし１５ｐｍｏｌｅが好ましい。
リガンドを導入する場合には水不溶性担体１ｄ当り５な
いし１５ｐｍｏｌｅが好ましい。
水不溶性担体へ直接、あるいはスペーサー分子を介して
水不溶性担体ヘリガントを導入する具体的方法としては
、通常以下のようにして行なわれる。即ち、ブロムシア
ンで活性化された水不溶性担体へ直接リガンドを導入す
る場合には、ｐＨ８ないし１０の炭酸緩衝液あるいはホ
ウ酸緩衝液中にて室温下１ないし４時間あるいは４℃に
て一晩攪拌すること罠より行なう。カルボジイミドを使
用した縮合反応によってリガンドを導入する場合ては、
ｐＨ４，５ないし６に調整した蒸留水中にて、通常−晩
反応させることにより実施する。
水不溶性担体ヘリガントを導入する具体的方法としては
、通常以下のようにして行なわれる。即ち、ブロムシア
ンで活性化された水不溶性担体へ直接リガンドを導入す
る場合には、ｐＨ８ないし１０の炭酸緩衝液あるいはホ
ウ酸緩衝液中にて室温下１ないし４時間あるいは４℃に
て一晩攪拌すること罠より行なう。カルボジイミドを使
用した縮合反応によってリガンドを導入する場合ては、
ｐＨ４，５ないし６に調整した蒸留水中にて、通常−晩
反応させることにより実施する。
また、スペーサー分子を介してリガンドを導入する場合
、例えばＮ−ヒドロキシサクシンイミド活性化エステル
誘導体にリガンドを導入する場合には、該担体とリガン
ドを、ｐＨ５ないし１０の条件下にて室温で１ないし４
時間、あるいは４℃にて一晩反応させることにより実施
する。
、例えばＮ−ヒドロキシサクシンイミド活性化エステル
誘導体にリガンドを導入する場合には、該担体とリガン
ドを、ｐＨ５ないし１０の条件下にて室温で１ないし４
時間、あるいは４℃にて一晩反応させることにより実施
する。
以上のように、本発明のインターフェロンの精製方法と
しては、吸着担体として有機高分量物質からなる水不溶
性担体に直接リガンドを結合させた吸着担体、あるいは
適切なスペーサー分子を介して前記水不溶性担体にリガ
ンドを結合させた吸着担体を使用しインターフェロンノ
精製を行なうのであるが、特にスペーサー分子を介して
水不溶性担体にリガンドを結合させた吸着担体を使用す
るのが好ましい。
しては、吸着担体として有機高分量物質からなる水不溶
性担体に直接リガンドを結合させた吸着担体、あるいは
適切なスペーサー分子を介して前記水不溶性担体にリガ
ンドを結合させた吸着担体を使用しインターフェロンノ
精製を行なうのであるが、特にスペーサー分子を介して
水不溶性担体にリガンドを結合させた吸着担体を使用す
るのが好ましい。
（実施列）
本発明のインターフェロンの精製方法は、上記の如く作
製された吸着担体に粗インターフェロン液を接触させ、
該吸着担体にインターフェロンを吸着させ、次いで溶出
液にて吸着したインターフェロンを溶出させることから
なる方法であるが、具体的な各段階は例えば以下のよう
にして実施される。
製された吸着担体に粗インターフェロン液を接触させ、
該吸着担体にインターフェロンを吸着させ、次いで溶出
液にて吸着したインターフェロンを溶出させることから
なる方法であるが、具体的な各段階は例えば以下のよう
にして実施される。
すなわち、吸着担体とインターフェロンを含有する溶液
（粗インターフェロン液）を接触させる場合にあっては
、その接触させる際のｐＨは４ないし９が好ましく、例
えばｐＨ７の（ＬＯＩＭ ＩＪン酸緩衝液を溶媒として
使用することが可能である。また、吸着担体と接触する
際のインターフェロン含有液のイオン強度は特に限定す
る必要はなく、例えば塩化ナトリウムにてイオン強度を
調整する場合には、その終濃度が０１４Ｍであってもイ
ンターフェロンは吸着担体に吸着可能である。また、イ
オン強度を更に上昇させた場合、例えば、塩化ナトリウ
ムを終濃度３Ｍに添加した場合でもインターフェロンは
吸着担体に十分吸着可能である。吸着担体とインターフ
ェロン含有液との接触は、バッチ法で行なってもカラム
法で行なっても可能であるが、カラム法で行なうのが精
製効率が高く好ましい。
（粗インターフェロン液）を接触させる場合にあっては
、その接触させる際のｐＨは４ないし９が好ましく、例
えばｐＨ７の（ＬＯＩＭ ＩＪン酸緩衝液を溶媒として
使用することが可能である。また、吸着担体と接触する
際のインターフェロン含有液のイオン強度は特に限定す
る必要はなく、例えば塩化ナトリウムにてイオン強度を
調整する場合には、その終濃度が０１４Ｍであってもイ
ンターフェロンは吸着担体に吸着可能である。また、イ
オン強度を更に上昇させた場合、例えば、塩化ナトリウ
ムを終濃度３Ｍに添加した場合でもインターフェロンは
吸着担体に十分吸着可能である。吸着担体とインターフ
ェロン含有液との接触は、バッチ法で行なってもカラム
法で行なっても可能であるが、カラム法で行なうのが精
製効率が高く好ましい。
インターフェロンを吸着した吸着担体は、非吸着の混在
蛋白質などを除去する目的で、インターフェロンを溶出
する操作の前に、十分量の緩衝液、例えば１１４Ｍの塩
化ナトリウムを含有するｐＨ７の［Ｉ Ｑ Ｉ Ｍ リ
ン酸緩衝液にて洗浄することが好ましい。
蛋白質などを除去する目的で、インターフェロンを溶出
する操作の前に、十分量の緩衝液、例えば１１４Ｍの塩
化ナトリウムを含有するｐＨ７の［Ｉ Ｑ Ｉ Ｍ リ
ン酸緩衝液にて洗浄することが好ましい。
次いでインターフェロンを吸着した吸着担体からインタ
ーフェロンを溶出させる方法としては、エチレングリコ
ールあるいはグロピレングリコールなどの液状多価アル
コール’１）３Ｇないし８０チ（Ｗ／ｖ）に含有するｐ
Ｈ４ないし８の緩衝液を使用して実施することができる
。
ーフェロンを溶出させる方法としては、エチレングリコ
ールあるいはグロピレングリコールなどの液状多価アル
コール’１）３Ｇないし８０チ（Ｗ／ｖ）に含有するｐ
Ｈ４ないし８の緩衝液を使用して実施することができる
。
以上のようにして高度に純化されたインターフェロンが
得られるが、本発明の上記方法にて精製し得るインター
フェロンは、主としてヒトインターフェロン−Ｃ１ヒト
インターフェロンーーおよびヒトインターフェロン−ｒ
である。
得られるが、本発明の上記方法にて精製し得るインター
フェロンは、主としてヒトインターフェロン−Ｃ１ヒト
インターフェロンーーおよびヒトインターフェロン−ｒ
である。
しかしながら、精製するインターフェロンはこれらのヒ
トインターフェロンに限られず、他の補乳類動物のイン
ターフェロン、例えばマウスのインターフェロンも本発
明の精製方法にて精製することが可能である。また、細
胞培養法によって製造したインターフェロンだけでなく
、遺伝子組み換えの手法を使用して生産したインターフ
ェロン、例えば大腸菌、酵母あるいは哺乳類動物細胞に
ヒトインターフェロン遺伝子を組み込んで生産したヒト
インターフェロンを精製することも可能である。
トインターフェロンに限られず、他の補乳類動物のイン
ターフェロン、例えばマウスのインターフェロンも本発
明の精製方法にて精製することが可能である。また、細
胞培養法によって製造したインターフェロンだけでなく
、遺伝子組み換えの手法を使用して生産したインターフ
ェロン、例えば大腸菌、酵母あるいは哺乳類動物細胞に
ヒトインターフェロン遺伝子を組み込んで生産したヒト
インターフェロンを精製することも可能である。
本発明の精製方法で使用する吸着担体は、大腸照が生産
した糖を含有しないインターフェロンを吸着することが
可能表ことから、インター７工ロン分子中の吸着担体と
の結合部位は、糖部分ではなくベグチド部分であると推
測される。
した糖を含有しないインターフェロンを吸着することが
可能表ことから、インター７工ロン分子中の吸着担体と
の結合部位は、糖部分ではなくベグチド部分であると推
測される。
したがって、本発明の吸着担体は、天然のインターフェ
ロンの精製ばかりでなく、アミノ酸配列が僅かに変化し
たインターフェロンあるいは糖部分が変化したインター
フェロンの精製にも使用し得るものと期待される。
ロンの精製ばかりでなく、アミノ酸配列が僅かに変化し
たインターフェロンあるいは糖部分が変化したインター
フェロンの精製にも使用し得るものと期待される。
このように本発明で使用する吸着担体は、粗インターフ
ェロン液の精製だけでなく、他の公知の精製手段によっ
て部分的に精製されたインターフェロンの精製度を、更
に上昇させる目的にも使用することが可能である。また
本発明で使用する各種の吸着担体を組み合せて使用する
ことにより、インターフェロン以外の混在蛋白質を完全
に除去することも可能である。
ェロン液の精製だけでなく、他の公知の精製手段によっ
て部分的に精製されたインターフェロンの精製度を、更
に上昇させる目的にも使用することが可能である。また
本発明で使用する各種の吸着担体を組み合せて使用する
ことにより、インターフェロン以外の混在蛋白質を完全
に除去することも可能である。
以下に本発明を実験例および実施例により更に具体的に
説明するが、本発明はこれらの実験例および実施例に限
定される本のではない。なお、実験例および実施例中に
示したヒトインターフェロンの力価は、ＰＬ細胞および
シンドビスウィルスを使用したＣ Ｐ Ｅ （Ｃｙｔｏ
ｐａｔｈｉｃ Ｅｆｆｅ−ｃｔ ） 法にて測定した
。ヒトインターフェロン−αおよびヒトインターフェロ
ン−ｒの力１面はヒトインターフェロン−αの国際［単
品（Ｇｏｚ３−ｑｏｔ−５２７） を基準として表示
し、ヒトインターフェロンーーの力価はヒトインターフ
ェロンーーの国際標準品（Ｇｏｚ３−９０２−５２７
）乞基準として表示した。
説明するが、本発明はこれらの実験例および実施例に限
定される本のではない。なお、実験例および実施例中に
示したヒトインターフェロンの力価は、ＰＬ細胞および
シンドビスウィルスを使用したＣ Ｐ Ｅ （Ｃｙｔｏ
ｐａｔｈｉｃ Ｅｆｆｅ−ｃｔ ） 法にて測定した
。ヒトインターフェロン−αおよびヒトインターフェロ
ン−ｒの力１面はヒトインターフェロン−αの国際［単
品（Ｇｏｚ３−ｑｏｔ−５２７） を基準として表示
し、ヒトインターフェロンーーの力価はヒトインターフ
ェロンーーの国際標準品（Ｇｏｚ３−９０２−５２７
）乞基準として表示した。
実験例１
４０ｄのアフィ・ゲル１５を冷蒸留水４Ｉ！にて洗浄後
、α０５ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６）にて更に洗浄
し、同緩衝液にて４０ｍになるように懸濁した。この懸
濁液を１０ｍｊづつに分け、各々に、１ ｍＭ、 ５
ｍＭ１２０ ＋ｎＭ又は４０ｍＭにｇ整し＆Ｄ−フェ
ニルアラニル−Ｄ−７エニルアラニン水溶液１０ｄを添
加し、４°Ｃにて１８時間攪拌することにより、リガン
ドとしてのＤ−フェニルアラニル−Ｄ−７工ニルアラニ
ンヲ結合させたそれぞれの導入量の異なる吸着担体を作
製した。担体に結合したリガンド量は、リガンド結合反
応終了後の液および洗浄液の吸光度を測定することによ
り得られる未吸着リガンドｔｉ、結合反応に使用した全
リガンド量から減じることにより計算した。上記のよう
にして作製した各吸着担体を（Ｌｌ ４Ｍ塩化ナトリウ
ム含有ＣＬ ＯＩ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７）にて
洗浄後、各々１５ｃｍ径のカラムに充填した。次いでＶ
ｉｔｃｅｋら （Ａｎ ｔ ｉｍｉ ｃｒｏｂ、Ａｇ、
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、、 ２巻。
、α０５ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６）にて更に洗浄
し、同緩衝液にて４０ｍになるように懸濁した。この懸
濁液を１０ｍｊづつに分け、各々に、１ ｍＭ、 ５
ｍＭ１２０ ＋ｎＭ又は４０ｍＭにｇ整し＆Ｄ−フェ
ニルアラニル−Ｄ−７エニルアラニン水溶液１０ｄを添
加し、４°Ｃにて１８時間攪拌することにより、リガン
ドとしてのＤ−フェニルアラニル−Ｄ−７工ニルアラニ
ンヲ結合させたそれぞれの導入量の異なる吸着担体を作
製した。担体に結合したリガンド量は、リガンド結合反
応終了後の液および洗浄液の吸光度を測定することによ
り得られる未吸着リガンドｔｉ、結合反応に使用した全
リガンド量から減じることにより計算した。上記のよう
にして作製した各吸着担体を（Ｌｌ ４Ｍ塩化ナトリウ
ム含有ＣＬ ＯＩ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７）にて
洗浄後、各々１５ｃｍ径のカラムに充填した。次いでＶ
ｉｔｃｅｋら （Ａｎ ｔ ｉｍｉ ｃｒｏｂ、Ａｇ、
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、、 ２巻。
４７６頁、１９７２年）の方法に従って生産した正常ヒ
ト線維芽細胞ＭＢＣ−ｓ細胞生産の粗インターフェロン
ーβ液ｓｏｏｍｚ（比活性＆３Ｘ１０４３×１０４単総
インターフェロンカ価７．２×１０６単位）を通過させ
た。次いで、インターフェロンを吸着したカラムを前記
のｐＨ７の緩衝液にて洗浄後、５０ ％ （Ｗ／ｖ）の
エチレングリコールを含有する上記のｐＨ７の緩衝液を
通過させることにより、吸着しているインターフェロン
を溶出した。
ト線維芽細胞ＭＢＣ−ｓ細胞生産の粗インターフェロン
ーβ液ｓｏｏｍｚ（比活性＆３Ｘ１０４３×１０４単総
インターフェロンカ価７．２×１０６単位）を通過させ
た。次いで、インターフェロンを吸着したカラムを前記
のｐＨ７の緩衝液にて洗浄後、５０ ％ （Ｗ／ｖ）の
エチレングリコールを含有する上記のｐＨ７の緩衝液を
通過させることにより、吸着しているインターフェロン
を溶出した。
リガンド結合量の異なる各吸着担体を使用して精製した
結果、得られた溶出液中の精製インターフェロンの回収
率および比活性を第１表に示した。
結果、得られた溶出液中の精製インターフェロンの回収
率および比活性を第１表に示した。
第 １ 表
Ｉ ＰｒｒＫ）ｌｅ ２６ ７．
７Ｘ１０’４ ｐｍＯｌｅ ６３ ２．６ｘ１０”
１５ ｐｍｏｌｅ ８３ ｔ８ｘ１０’２２ Ｐ
ｍｏｌｅ ８８ １．２Ｘ１０’実験例２ インターフェロンの精製度および回収率に及ぼす吸着担
体中のスペーサ一部分の長さを検討する目的で、Ｌ−）
リプトフィル−Ｌ−）リプドアアンメチルエステルをリ
ガンドとし、このリガンドを結合したスペーサーの長さ
の異なる吸着担体を作製した。
７Ｘ１０’４ ｐｍＯｌｅ ６３ ２．６ｘ１０”
１５ ｐｍｏｌｅ ８３ ｔ８ｘ１０’２２ Ｐ
ｍｏｌｅ ８８ １．２Ｘ１０’実験例２ インターフェロンの精製度および回収率に及ぼす吸着担
体中のスペーサ一部分の長さを検討する目的で、Ｌ−）
リプトフィル−Ｌ−）リプドアアンメチルエステルをリ
ガンドとし、このリガンドを結合したスペーサーの長さ
の異なる吸着担体を作製した。
スペーサーを含まない吸着担体は次のようにして作製し
た。すなわち、市販のプロムシアン活性化セファロース
４Ｂ（ファルマシア０ジャパン株式会社）を１ ｍＭ塩
酸液中で膨潤させ、同液にて洗浄後、ＣＬ５Ｍ塩化ナト
リウム含有１１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ＆５）よりなるカッ
プリング緩衝液に溶解したリガンドを、担体１ｄ当り１
０ ｐｒｒＫ）ｌｅになるように添加した。４°Ｃにて
一晩攪拌後、グリシンにて未反応基をブロッキング後、
実験に供した。
た。すなわち、市販のプロムシアン活性化セファロース
４Ｂ（ファルマシア０ジャパン株式会社）を１ ｍＭ塩
酸液中で膨潤させ、同液にて洗浄後、ＣＬ５Ｍ塩化ナト
リウム含有１１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ＆５）よりなるカッ
プリング緩衝液に溶解したリガンドを、担体１ｄ当り１
０ ｐｒｒＫ）ｌｅになるように添加した。４°Ｃにて
一晩攪拌後、グリシンにて未反応基をブロッキング後、
実験に供した。
スペーサーとして炭素原子６個の長さを有する吸着担体
は、市販のＣＨ−セファロース４Ｂ（ファルマシア・ジ
ャパン株式会社）にカルボジイミドを使用した縮合反応
によりリガンドを結合することにより作製した。すなわ
ち、ＣＨ−セファロース４Ｂの乾燥粉末を（Ｌ５Ｍ塩化
ナトリウム液中にて膨潤し、更に同液にて洗浄した。蒸
留水にリガンドを溶牌後ｓ ｐＨを４−５に調整し、
リガンドの２０ｍ１液を調製した。このリガンド液２０
ｄを、前記の洗浄済のＣＨ−セファロース４Ｂの２０ｇ
７と混合し、更に、ｐＨ４，５に調整したｆＬ２Ｍカル
ボジイミド水溶液５ｄを直ちＶこ添加し、混作後室温に
て一晩攪拌し、た。
は、市販のＣＨ−セファロース４Ｂ（ファルマシア・ジ
ャパン株式会社）にカルボジイミドを使用した縮合反応
によりリガンドを結合することにより作製した。すなわ
ち、ＣＨ−セファロース４Ｂの乾燥粉末を（Ｌ５Ｍ塩化
ナトリウム液中にて膨潤し、更に同液にて洗浄した。蒸
留水にリガンドを溶牌後ｓ ｐＨを４−５に調整し、
リガンドの２０ｍ１液を調製した。このリガンド液２０
ｄを、前記の洗浄済のＣＨ−セファロース４Ｂの２０ｇ
７と混合し、更に、ｐＨ４，５に調整したｆＬ２Ｍカル
ボジイミド水溶液５ｄを直ちＶこ添加し、混作後室温に
て一晩攪拌し、た。
原子数が１０および１５の長さのスペーサーを有する吸
着担体は、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド誘導体を有す
るアフィ・ゲル１ｏおよびアフィ・ゲル１５（いずれも
日本バイオラッドラボラトリーズ）にリガンドを導入す
ることにより作製した。すなわち、各々の樹脂３０ｍを
冷蒸留水にて洗浄し、その後、アフイ・ゲル１０につい
てはｐＨ７の［１０５Ｍリン酸緩衝液、まだ、アフィ・
ゲル１５についてはｐＨ６のα０５Ｍ ＩＪン酸緩衝液
よりなる冷カップリング緩衝液にて洗浄した。洗浄後の
各担体２０Ｊを、各々の冷カップリング緩衝液にて別個
に調製した２０ｍＭのリガンド液２０ａｄと各々混合し
、４℃にて一晩攪拌した。
着担体は、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド誘導体を有す
るアフィ・ゲル１ｏおよびアフィ・ゲル１５（いずれも
日本バイオラッドラボラトリーズ）にリガンドを導入す
ることにより作製した。すなわち、各々の樹脂３０ｍを
冷蒸留水にて洗浄し、その後、アフイ・ゲル１０につい
てはｐＨ７の［１０５Ｍリン酸緩衝液、まだ、アフィ・
ゲル１５についてはｐＨ６のα０５Ｍ ＩＪン酸緩衝液
よりなる冷カップリング緩衝液にて洗浄した。洗浄後の
各担体２０Ｊを、各々の冷カップリング緩衝液にて別個
に調製した２０ｍＭのリガンド液２０ａｄと各々混合し
、４℃にて一晩攪拌した。
上記のように作製した各吸着担体１ｏ−を各々１．５
ａｍ径のカラムに充填後、１１４Ｍ塩化ナトリウム含有
１１０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて平衡化した
。Ｚｏｏｎ ら（Ｊ、 Ｃ／ｉｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
／、 ｐ７巻、４４頁、１９７９年）の方法に従ってＮ
ａｍａｔＷａ細胞にて生産された粗ヒトインター７ｚｏ
ンーａ液５ｏｏｄ（比活性＆ ５ ｘ １０’単位／”
？＊ 総イア ｆｉ ７ ｚ ａ ンカ価２．４ｘ１
０’単位）を各カラムに通過させ、更に上記のｐＨ７，
５の緩衝液にて洗浄した後、プロピレングリコールを６
０％（Ｗ／リ に含有した上記ｐＨ７，５の緩衝液にて
吸着しているインターフェロンを溶出した。
ａｍ径のカラムに充填後、１１４Ｍ塩化ナトリウム含有
１１０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて平衡化した
。Ｚｏｏｎ ら（Ｊ、 Ｃ／ｉｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
／、 ｐ７巻、４４頁、１９７９年）の方法に従ってＮ
ａｍａｔＷａ細胞にて生産された粗ヒトインター７ｚｏ
ンーａ液５ｏｏｄ（比活性＆ ５ ｘ １０’単位／”
？＊ 総イア ｆｉ ７ ｚ ａ ンカ価２．４ｘ１
０’単位）を各カラムに通過させ、更に上記のｐＨ７，
５の緩衝液にて洗浄した後、プロピレングリコールを６
０％（Ｗ／リ に含有した上記ｐＨ７，５の緩衝液にて
吸着しているインターフェロンを溶出した。
各吸着担体による粗インターフェロン−ａの精製効果を
第２表に示した。
第２表に示した。
実験例５
アフィ・ゲル１０ｆ！：冷蒸留水および冷却した１０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７） にて洗浄後、各１０ｄづ
つに分け、各種のＬ型アミノ酸、Ｌ型アミノ酸の多量体
あるいはそれらのメチルエステル体を各々リガンドとし
て導入した吸着担体を、実験例２と同様の方法にて作製
した。リガンド結合反応系に添加したリガンド量は、担
体１ｄ当り２０戸ｒｒ）ｏｌｅであった。このようにし
て作製した吸着担体各１０ｄを、各々ｔ５ｃｓ＋径のカ
ラムに充填し、ＩＭ塩化ナトリウム含有αＯＩ Ｍ １
７ン酸緩衝液（ｐＨ７）Ｋで平衡化後、塩化す） ＩＪ
ウムの終濃庇を１Ｍに調整したＭＢＣ−５細抱生産の粗
ヒトインターフェロン−ｐ液５００ｄ（比活性ａ５ Ｘ
ｌ Ｇ’単位／ｑｙ ａインターフェロンカ価９．６
ｘ １０’単位）を通過させた。上記の塩化ナトリウム
を含有する緩衝液てて洗浄後、同液に５％（Ｗ／Ｙ ）
のグロビレングリコールを添加した液にて更に洗浄
した後、８０％（Ｗ／Ｖ） のグロビレングリコール
を含有する１Ｍ塩化す） ＩＪウム含有ＣＬ ＯＩ Ｍ
ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７） にて吸着しているイン
ターフェロンを溶出した。各吸着担体による粗インター
フェロン−βの精製効果を第５表に示した。
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７） にて洗浄後、各１０ｄづ
つに分け、各種のＬ型アミノ酸、Ｌ型アミノ酸の多量体
あるいはそれらのメチルエステル体を各々リガンドとし
て導入した吸着担体を、実験例２と同様の方法にて作製
した。リガンド結合反応系に添加したリガンド量は、担
体１ｄ当り２０戸ｒｒ）ｏｌｅであった。このようにし
て作製した吸着担体各１０ｄを、各々ｔ５ｃｓ＋径のカ
ラムに充填し、ＩＭ塩化ナトリウム含有αＯＩ Ｍ １
７ン酸緩衝液（ｐＨ７）Ｋで平衡化後、塩化す） ＩＪ
ウムの終濃庇を１Ｍに調整したＭＢＣ−５細抱生産の粗
ヒトインターフェロン−ｐ液５００ｄ（比活性ａ５ Ｘ
ｌ Ｇ’単位／ｑｙ ａインターフェロンカ価９．６
ｘ １０’単位）を通過させた。上記の塩化ナトリウム
を含有する緩衝液てて洗浄後、同液に５％（Ｗ／Ｙ ）
のグロビレングリコールを添加した液にて更に洗浄
した後、８０％（Ｗ／Ｖ） のグロビレングリコール
を含有する１Ｍ塩化す） ＩＪウム含有ＣＬ ＯＩ Ｍ
ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７） にて吸着しているイン
ターフェロンを溶出した。各吸着担体による粗インター
フェロン−βの精製効果を第５表に示した。
実験例４
Ｄ−チロシル−Ｌ−トリプトファンをリガンドとして実
験方法２と同様の方法にてアフィ・ゲル１０に導入し、
吸着担体を１０−作製した。
験方法２と同様の方法にてアフィ・ゲル１０に導入し、
吸着担体を１０−作製した。
この吸着担体を１．５ ｅｘ径のカラムに充填し、ＣＬ
ｌ ４Ｍ塩化ナトリウム含有α０２ＭＩＪン酸緩衝液（
ｐｆ（７） にて平衡化した後、Ｌａｎｇｆｏｒｄ（
Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｒｒｍｕｎ、 、 ２６巻、３６頁
、１９７９年）の方法に従って、ヒト末梢血リンパ球を
使用して生産したヒトインターフェロン−ｒ含有液１０
Ｌｇ／（比活性ｔ５ Ｘ １０’単位／Ｑ’、 総（：
／ター７エロンカ価五１ Ｘ １ Ｇ’単位）ｆｊ！：
通過させた。上記緩衝液にて洗浄した後、５０％エチレ
ングリコールを含有する上記緩衝液にて吸着しているイ
ンターフェロンを溶出した。溶出されたインターフェロ
ンの回収率は６６チであり、その比活性はＬ７ｘｌＯ’
単位／■でめった。
ｌ ４Ｍ塩化ナトリウム含有α０２ＭＩＪン酸緩衝液（
ｐｆ（７） にて平衡化した後、Ｌａｎｇｆｏｒｄ（
Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｒｒｍｕｎ、 、 ２６巻、３６頁
、１９７９年）の方法に従って、ヒト末梢血リンパ球を
使用して生産したヒトインターフェロン−ｒ含有液１０
Ｌｇ／（比活性ｔ５ Ｘ １０’単位／Ｑ’、 総（：
／ター７エロンカ価五１ Ｘ １ Ｇ’単位）ｆｊ！：
通過させた。上記緩衝液にて洗浄した後、５０％エチレ
ングリコールを含有する上記緩衝液にて吸着しているイ
ンターフェロンを溶出した。溶出されたインターフェロ
ンの回収率は６６チであり、その比活性はＬ７ｘｌＯ’
単位／■でめった。
実験例５
ＣＨ−セファロース４Ｂ（ファルマクア拳ジャパン株式
会社）を［Ｌ５Ｍ塩化ナトリウム液中で彰潤し、四散に
て洗浄した。その後、実験例２と同様のカルボジイミド
を使用しだ縮合反応により、該担体にリガンドとしてＤ
−チロシン、Ｄ−チロシンメチルエステル、Ｄ−チロシ
ンエチルエステルｔたＵ、Ｄ−チロシンプロピルエステ
ルを導入した。結合反応時に添加したリガンド徽は担体
１ｄ当り２Ｑｐ■ｌｅであった。
会社）を［Ｌ５Ｍ塩化ナトリウム液中で彰潤し、四散に
て洗浄した。その後、実験例２と同様のカルボジイミド
を使用しだ縮合反応により、該担体にリガンドとしてＤ
−チロシン、Ｄ−チロシンメチルエステル、Ｄ−チロシ
ンエチルエステルｔたＵ、Ｄ−チロシンプロピルエステ
ルを導入した。結合反応時に添加したリガンド徽は担体
１ｄ当り２Ｑｐ■ｌｅであった。
各リガンドを導入した吸着担体各１０ｍＪを１．５１径
のカラムに充填し、（Ｌ１４Ｍ塩化すｌ−ＩＪウム含有
α０１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７） にて平衡化
した後、Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ （Ｖｉｒｏｌ！ｏｇｙ
＋ ７６巻ｔ６３４頁、１９７７年）の方法に従っ
てＬ９２９細胞を使用して生産した粗マウスインターフ
ェロン液５００ ｒｔｔｔ （比活性２．２ｘ１０単位
／１１ｑ。
のカラムに充填し、（Ｌ１４Ｍ塩化すｌ−ＩＪウム含有
α０１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７） にて平衡化
した後、Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ （Ｖｉｒｏｌ！ｏｇｙ
＋ ７６巻ｔ６３４頁、１９７７年）の方法に従っ
てＬ９２９細胞を使用して生産した粗マウスインターフ
ェロン液５００ ｒｔｔｔ （比活性２．２ｘ１０単位
／１１ｑ。
総インターフェロンカ価１．５ ｘ １０’単位）を各
カラムに通過させた。その後、各カラムを上記緩衝液に
て洗浄後、５０％（Ｗ／ｖ） のエチレングリコール
を含有する上記緩衝液にて吸着しているインターフェロ
ンを溶出した。各吸着担体ｒこよる粗マウスインターフ
ェロンのｎＩ製効果を第４表に示した。
カラムに通過させた。その後、各カラムを上記緩衝液に
て洗浄後、５０％（Ｗ／ｖ） のエチレングリコール
を含有する上記緩衝液にて吸着しているインターフェロ
ンを溶出した。各吸着担体ｒこよる粗マウスインターフ
ェロンのｎＩ製効果を第４表に示した。
第 ４ 表
Ｄ−テｏシｙ ５３
１ｈ６ｘｉＤ’Ｄ−チロシンメチルエステル
７２ ９．７Ｘ１Ｇ。
１ｈ６ｘｉＤ’Ｄ−チロシンメチルエステル
７２ ９．７Ｘ１Ｇ。
Ｄ−チロシンエチルエステル ６７ ７
．８Ｘ１０６Ｄ−チロシンプロピルエステル ５
５ ４５ｘ１０’実施例１ ＡＨ−セファロース４Ｂ（７フルマシア場ジャパン株式
会社）の乾燥粉末を（Ｌ５Ｍ塩化ナトリウム液中で膨潤
し、その４０ａｆｆを更に四散にて洗浄した。Ｌ−１リ
グトフイルーＬ−フェニルアラニンを蒸留水に溶解後、
ｐＨを４．５に調整し、２０成液を調製した。リガンド
液４０ｄと洗浄後の担体４０ゴを混合し、更にｐＨ４，
５に調整した［１２Ｍカルボジイミド水溶液１０ｄを直
ちに添加し、混合後、室温にて一晩攪拌した。反応終了
後の吸着担体を２３径のカラムに充填し、α１４Ｍ塩化
ナトリウム含有αＯＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）にて平
衡化した後、Ｃｅ５ａ−ｒｉｏら（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ
ｂ、 Ａｇ、 Ｃｈａｎｏｔｈｅｒ、 、 ｆ １巻
。
．８Ｘ１０６Ｄ−チロシンプロピルエステル ５
５ ４５ｘ１０’実施例１ ＡＨ−セファロース４Ｂ（７フルマシア場ジャパン株式
会社）の乾燥粉末を（Ｌ５Ｍ塩化ナトリウム液中で膨潤
し、その４０ａｆｆを更に四散にて洗浄した。Ｌ−１リ
グトフイルーＬ−フェニルアラニンを蒸留水に溶解後、
ｐＨを４．５に調整し、２０成液を調製した。リガンド
液４０ｄと洗浄後の担体４０ゴを混合し、更にｐＨ４，
５に調整した［１２Ｍカルボジイミド水溶液１０ｄを直
ちに添加し、混合後、室温にて一晩攪拌した。反応終了
後の吸着担体を２３径のカラムに充填し、α１４Ｍ塩化
ナトリウム含有αＯＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）にて平
衡化した後、Ｃｅ５ａ−ｒｉｏら（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ
ｂ、 Ａｇ、 Ｃｈａｎｏｔｈｅｒ、 、 ｆ １巻
。
２９１頁、１９７７年）の方法に従ってヒトリンパ球を
Ｎｅｗｃａｓｔｌ！ｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓに
よって刺激することにより生産した粗インター７エロン
ーａ／ｉ４Ｉ！（比活性７．５ ｘ １０’単位／ ”
９．４ｇイアター７二０７力価１．６ Ｘ １０’単位
）を通過させた。
Ｎｅｗｃａｓｔｌ！ｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓに
よって刺激することにより生産した粗インター７エロン
ーａ／ｉ４Ｉ！（比活性７．５ ｘ １０’単位／ ”
９．４ｇイアター７二０７力価１．６ Ｘ １０’単位
）を通過させた。
上記ｐＨ７の緩衝液にて洗浄後、５０％（ｗ／ｖ ”）
のエチレングリコールを含有する上記ｐＨ７の緩衝液に
て吸着しているインターフェロンを溶出した。溶出され
たインターフェロンの回収率は７２チであり、その比活
性は２．５ｘ１０’単位／ηでめった。
のエチレングリコールを含有する上記ｐＨ７の緩衝液に
て吸着しているインターフェロンを溶出した。溶出され
たインターフェロンの回収率は７２チであり、その比活
性は２．５ｘ１０’単位／ηでめった。
冥施例２
５０ゴのアフィ・ゲル１Ｇを冷蒸留水および冷却したα
０５ Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７） にて洗浄した後
、上記緩画孜にて２０ ｍＭに、調整したＤ−）リプト
フィルーＤ−）リプト７アン液５０ゴと混合し、ｐＨ７
の条件下、４℃にて一晩攪拌した。リガンドが結合した
吸着担体を′Ｌ５＋：１ｍ径のカラムに充填した後、１
Ｍ塩化ナトリウム含有（ＬＯＩＭ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ
８）にて平衡化した。呑口ら（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ／、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
０５ Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７） にて洗浄した後
、上記緩画孜にて２０ ｍＭに、調整したＤ−）リプト
フィルーＤ−）リプト７アン液５０ゴと混合し、ｐＨ７
の条件下、４℃にて一晩攪拌した。リガンドが結合した
吸着担体を′Ｌ５＋：１ｍ径のカラムに充填した後、１
Ｍ塩化ナトリウム含有（ＬＯＩＭ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ
８）にて平衡化した。呑口ら（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ／、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
Ｕ、８．Ａ、 、 ７７巻、５５２Ｇ頁、１９８０年）
の方法に従って大腸菌にて生産した粗ヒトインターフェ
ロンーー液２ｊ（比活性４．８ Ｘ １０’単位／岬、
総インターフェロン力価１５ｘ１０単位）に塩化ナトリ
ウムを終濃度１Ｍに添加した後、カラムを通過させた。
の方法に従って大腸菌にて生産した粗ヒトインターフェ
ロンーー液２ｊ（比活性４．８ Ｘ １０’単位／岬、
総インターフェロン力価１５ｘ１０単位）に塩化ナトリ
ウムを終濃度１Ｍに添加した後、カラムを通過させた。
上記ｐＨ８の緩衝液およヒ１０ ％ （Ｗ／ｖ） の
プロピレングリコールを含有する上記ｐＨ８の緩衝液に
てカラムを連続して洗浄した後、 ６０ ％ （ｗ／
ｖ） のプロピレングリコール及び１Ｍの塩化ナトリ
ウムを含有する１０１Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ８）にて
吸着しているインターフェロンを溶出した。溶出された
インターフェロンの回収率は７０％であり、比活性は５
．１ｘ１０単位／■であった。
プロピレングリコールを含有する上記ｐＨ８の緩衝液に
てカラムを連続して洗浄した後、 ６０ ％ （ｗ／
ｖ） のプロピレングリコール及び１Ｍの塩化ナトリ
ウムを含有する１０１Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ８）にて
吸着しているインターフェロンを溶出した。溶出された
インターフェロンの回収率は７０％であり、比活性は５
．１ｘ１０単位／■であった。
実施例３
５Ｑｒｘｌのアフィ・ゲル１０を冷蒸留水および冷却し
た０、 ０５ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７）にて洗浄
した後、上記緩衝液にて２０ ｍＭに調整したＬ−フェ
ニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル液
５０１１１１！と混合し、ｐＨ７の条件下、４゛０にて
一晩攪拌した。反応終了後、リガンドが結合した吸着担
体を２−５１径のカラムに充填した後、ＩＭ塩化ナトＩ
Ｊウム含有α０１Ｍ １７ン酸緩衝液（ｐＨ７）にて平
衡化した。ＭＢＣ−５細胞の生産した粗ヒトインターフ
ェロン−一液１５／（比活性ａｏｘ１ｏ単位／■、総イ
ンター７エロ７カ価４．２ Ｘ １０’単位）に塩化ナ
トリウムを終濃度１Ｍに添加した後、カラムを通過させ
た。上記の塩化ナトリウムを含有する緩衝液にて洗浄後
、開成に３ ｔ４ （ｗ／ｖ）のプロピレングリコール
を添加した液にて更に吸着担体を洗浄した後ｓ ａ
ｏ ｓ （ｗ／ｖ）のプロピレングリコールおよび１Ｍ
塩化ナトリウムを含有する［１０１ Ｍ ＋７ン酸緩衝
液（ｐＨ７）にて吸着しているインターフェロンを溶出
した。溶出されたインターフェロンの回収率は８９チで
あり、その比活性は２．３ｘ１０’単位／ｖｘｉであっ
た。
た０、 ０５ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７）にて洗浄
した後、上記緩衝液にて２０ ｍＭに調整したＬ−フェ
ニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル液
５０１１１１！と混合し、ｐＨ７の条件下、４゛０にて
一晩攪拌した。反応終了後、リガンドが結合した吸着担
体を２−５１径のカラムに充填した後、ＩＭ塩化ナトＩ
Ｊウム含有α０１Ｍ １７ン酸緩衝液（ｐＨ７）にて平
衡化した。ＭＢＣ−５細胞の生産した粗ヒトインターフ
ェロン−一液１５／（比活性ａｏｘ１ｏ単位／■、総イ
ンター７エロ７カ価４．２ Ｘ １０’単位）に塩化ナ
トリウムを終濃度１Ｍに添加した後、カラムを通過させ
た。上記の塩化ナトリウムを含有する緩衝液にて洗浄後
、開成に３ ｔ４ （ｗ／ｖ）のプロピレングリコール
を添加した液にて更に吸着担体を洗浄した後ｓ ａ
ｏ ｓ （ｗ／ｖ）のプロピレングリコールおよび１Ｍ
塩化ナトリウムを含有する［１０１ Ｍ ＋７ン酸緩衝
液（ｐＨ７）にて吸着しているインターフェロンを溶出
した。溶出されたインターフェロンの回収率は８９チで
あり、その比活性は２．３ｘ１０’単位／ｖｘｉであっ
た。
（効 果）
以上記載した如く、本発明のインターフェロンの吸着−
溶出による精製方法にあっては吸着担体として有機高分
子量物質からなる水不溶性の担体部、所望によりスペー
サ一部分およびリガンド部分から構成される吸着担体を
使用し、特にリガンド部分として芳香環を有するアミノ
酸または芳香環を有するアミノ酸誘導体の少なくとも１
個を有し、かつ保有するアミノ基またはカルボキシル基
を介して水不溶性の担体゛またはその担体に結合してい
るスペーサー分子と結合可能な化合物を選択し之もので
あり、かかる吸／＃担体を吏用することにより１回の精
製操作で高純度のインターフェロンを高収率で得ること
ができ、特に従来方法に比し優れたものであるといえる
。
溶出による精製方法にあっては吸着担体として有機高分
子量物質からなる水不溶性の担体部、所望によりスペー
サ一部分およびリガンド部分から構成される吸着担体を
使用し、特にリガンド部分として芳香環を有するアミノ
酸または芳香環を有するアミノ酸誘導体の少なくとも１
個を有し、かつ保有するアミノ基またはカルボキシル基
を介して水不溶性の担体゛またはその担体に結合してい
るスペーサー分子と結合可能な化合物を選択し之もので
あり、かかる吸／＃担体を吏用することにより１回の精
製操作で高純度のインターフェロンを高収率で得ること
ができ、特に従来方法に比し優れたものであるといえる
。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）粗インターフェロンを吸着担体に接触させ、該吸
着担体にインターフェロンを吸着させ、次いで溶出液で
インターフェロンを溶出することからなるインターフェ
ロンの精製法において、 吸着担体として、有機高分子量物質からな る水不溶性の担体に、リガンドとして芳香環を有するア
ミノ酸または芳香環を有するアミノ酸誘導体の少なくと
も１個を有し、かつ、前記水不溶性の担体に直接結合し
得るか、または該担体に結合しているスペーサー分子に
結合し得るアミノ基またはカルボキシル基を有する化合
物を結合させた吸着担体を使用する、前記インターフェ
ロンの精製方法。 （２）リガンドが、芳香環を有するアミノ酸の単量体ま
たは芳香環を有するアミノ酸誘導体の単量体である特許
請求の範囲第１項記載の精製方法。 （５）リガンドが、芳香環を有するアミノ酸または芳香
環を有するアミノ酸誘導体の少なくとも１種以上から構
成された多量体である特許請求の範囲第１項記載の精製
方法。 （４）多量体が二量体または三量体である特許請求の範
囲第３項記載の精製方法。 （５）芳香環を有するアミノ酸誘導体が、カルボキシル
基がアルキルエステル化されたアミノ酸である特許請求
の範囲第１項記載の精製方法。 （６）アルキルエステルが、メチルエステル、エチルエ
ステルまたはプロピルエステルである特許請求の範囲第
５項記載の精製方法。 （７）芳香環を有するアミノ酸が、Ｌ−トリプトファン
、Ｄ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｄ−チロシン、
Ｌ−フェニルアラニンまたはＤ−フェニルアラニンであ
る特許請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項ま
たは第５項に記載の精製方法。 （８）芳香環を有するアミノ酸誘導体が、Ｌ−トリプト
ファン、Ｄ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｄ−チロ
シン、Ｌ−フェニルアラニンまたはＤ−フェニルアラニ
ンの誘導体である特許請求の範囲第１項ないし第３項の
いずれか１項または第５項に記載の精製方法。 （９）インターフェロンがヒトのインターフェロンであ
る特許請求の範囲第１項記載の精製方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60036110A JPH06800B2 (ja) | 1985-02-25 | 1985-02-25 | ヒトインターフェロン―βの精製方法 |
| DE19863605908 DE3605908A1 (de) | 1985-02-25 | 1986-02-24 | Verfahren zum reinigen von interferon |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60036110A JPH06800B2 (ja) | 1985-02-25 | 1985-02-25 | ヒトインターフェロン―βの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61197600A true JPS61197600A (ja) | 1986-09-01 |
| JPH06800B2 JPH06800B2 (ja) | 1994-01-05 |
Family
ID=12460627
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60036110A Expired - Lifetime JPH06800B2 (ja) | 1985-02-25 | 1985-02-25 | ヒトインターフェロン―βの精製方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06800B2 (ja) |
| DE (1) | DE3605908A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63304000A (ja) * | 1987-06-05 | 1988-12-12 | Ube Ind Ltd | 生体由来物質の固定化方法 |
| JP2010210497A (ja) * | 2009-03-11 | 2010-09-24 | Tosoh Corp | 液体クロマトグラフィー用充填剤、及び生体高分子の分離精製方法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2732252B2 (ja) * | 1987-12-07 | 1998-03-25 | 株式会社ジェイ・エム・エス | ヘモグロビン選択吸着剤 |
| US5652348A (en) * | 1994-09-23 | 1997-07-29 | Massey University | Chromatographic resins and methods for using same |
| DE19521995A1 (de) * | 1995-06-20 | 1997-01-02 | Ralf Bauer | Verfahren zur Trennung in ihren Eigenschaften ähnlichen Substanzen von mindestens einer die weitere Verwendung störenden, in ihren Eigenschaften ähnlichen Matrix und die Verwendung eines Trennungsmaterials |
| KR20100070994A (ko) * | 2008-12-18 | 2010-06-28 | 토소가부시키가이샤 | 액체 크로마토그래피용 충전 재료 및 해당 충전 재료에 의한 생체고분자의 분리·정제 방법 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5668689A (en) * | 1979-11-07 | 1981-06-09 | Toray Ind Inc | Method for concentration and purification of interferon |
-
1985
- 1985-02-25 JP JP60036110A patent/JPH06800B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-02-24 DE DE19863605908 patent/DE3605908A1/de active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5668689A (en) * | 1979-11-07 | 1981-06-09 | Toray Ind Inc | Method for concentration and purification of interferon |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63304000A (ja) * | 1987-06-05 | 1988-12-12 | Ube Ind Ltd | 生体由来物質の固定化方法 |
| JP2010210497A (ja) * | 2009-03-11 | 2010-09-24 | Tosoh Corp | 液体クロマトグラフィー用充填剤、及び生体高分子の分離精製方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06800B2 (ja) | 1994-01-05 |
| DE3605908C2 (ja) | 1992-08-27 |
| DE3605908A1 (de) | 1986-10-02 |
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