SE406913B - Forfarande for rening eller lagning av ett enzym genom kontakt med affinitelsmatrismaterial - Google Patents

Description

'206026-2 i etanol eller aceton, eller dess elektriska egenskaper, såsom an- vänds i elektroforetiska förfarande, isoelektrisk utfällning eller' jonbytarkromatografi. Dessutom har molekylstorleken använts för att rena enzym, såsom genom dialys, gelfiltreringskromatografi, och ult- rafiltrering. Något av dessa förfaringssätt, ensamt eller i kombina- tion, väljes inom facket för att optimera rening och utvinning av enzymet. Trypsin har renats från oxpankreas, med användning av me- toder, som meraspecifikt framgår av en artikel av M. Laskowski i --Methods in Enzymology, Vol. II, sid. 26, 1955. Enligt denna metod extraheras finskuren pankreas med utspädd svavelsyra och behandlas med ammoniumsulfat i åtskilliga, från varandra skilda steg för att davlägsna ribonukleas och alfa-kymotrypsinogen. pH för den erhållna lösningen inställes på 3,0 och behandlas med ammoniumsulfat för att utfälla trypsinogenet. Detta material extraheras därefter med 0,4 mättad ammoniumsulfatlösning och återutfälles med ytterligare ammo- -niumsulfat. Efter tvättning med en surgjord magnesiumsulfatlösning upplöses det råa trypsinogenet i en buffert innehållande CaCl2 och med ett pH av 8, och lagras under 24 h vid 4°C. Det så erhållna tryp- sinet renas därefter genom ytterligare utfällningar med ammoniumsul- fat och extraktioner. Detta förfarande är ett exempel på rening av) trypsin medelst metoder, som bygger på dess egenskaper i lösning.

En annan metod, som använts tidigare, beskrives av Feinstein (FEBS Letters, 7: 353, 1970). Enligt denna metod renas trypsin genom adsorption på en agaroskolonn, som innehåller kovalent bunden ovo- mucoid, ett trypsinhämmande protein, som erhålles från kyck1ingägg.' Det katalytiskt aktiva trypsinet separeras från icke aktivt trypsin såväl som från alfa-kymotrypsin. Denna teknik benämns även enzym- ospecifik kromatografi av Baker (Design of Active-Site-Directed Ir- reversible Enzyme Inhibitors, Wiley, N.Y., 1967), och affinitets- kromatografi av Cuatrecasas m.fl. (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S. 6l:636, 1968). Dessa metoder skiljer sig från förut vedertagna en- zymreningsmetoder genom att den biokatalytiska specificiteten för enzymet är det medel, som används för att uppnå reningen.

Små molekylära inhibitorer jämte makromolekylära inhibitorer av trypsin och trypsinliknande enzym har beskrivits (Vogel m.fl., Natural Proteinase Inhibitors, Academic, N.Y. 1968). Alkyl- och aryl- guanidiner och amidiner är kända inhibitorer av denna typ (Mares- Guia och Shaw, J. Biol. Chem, 240: 1579, 1965).

Fastän de metoder, som grundar sig på enzymets egenskaper i lösning, använts och fortfarande används för att rena trypsin och trypsinliknande enzym bland annat, har de visat sig vara ineffektiva, '7206026-2 ' a ' 3 dyra och tidskrävande. Medan affinitetsmetoden enligt Feinstein re- presenterar en förenkling jämfört med de ovan beskrivna enzymrenings- metoderna, som använder sig av egenskaperna i lösning, har använd- ningen av makromolekylära proteinasinhibitorer följande nackdelar.

De makromolekylära inhibitorerna har en bred enzymspecificitet, och dessutom måste dessa inhibitorer omsorgsfullt renas innan de kan an- vändas i affinitetsmatriserna. Vidare är koncentrationen av dessa inhibitorer i affinitetsmatrisen icke lätt att reglera. Följaktligen har det visat sig existera ett ständigt behov av enklare material och mera effektiva metoder för att erhålla dessa enzym i högre utby- te och högre renhet än vad som hitintills varit möjligt.

Man har nu i enlighet med föreliggande uppfinning funnit, att trypsin eller ett trypsinliknande enzym kan renas eller lagras me- _ delst ett affinitetsmatrismaterial, som har förmåga att biospecifikt binda trypsin eller det trypsinliknande enzymet.

Föreliggande uppfinning hänför sig till ett affinitetsmatris- material bestående av en olöslig bärare och en ligand, varvid li- ganden har formeln: C)NH2 X - A - R _ . U (amiainium) där X = - C-NHZ Gfflñfl, 'eller = - ï - C-NH (guanidinium) och där R = -(CH2)yZ, -0(CH2)yZ, -S-(CH2)yZ -S-S- (CI-IQY-Z O ß II där Z = -NH2, COOH, I, Br, Cl, CCl, NCS, NCO, SO2Cl och y = 0 - 3 och A betecknar pentyl, hexyl, norvalyl, cyklohexyl, fenyl eller bensoyl och eventuellt en kopplingsmolekyl för kovalent bindning av liganden vid den olösliga bäraren. i Uppfinningen hänför sig även till ett förfarande för rening eller lagring av trypsin eller ett trypsinliknande enzym, vid vil- ket en blandning innehållande trypsinet eller det trypsinliknande enzymet bringas i kontakt med ett affinitetsmatrismaterial enligt uppfinningen så, att trypsinet eller det trypsinliknande enzymet adsorberas medelst matrismaterialet, varpå det hela lagras i kyla 7206026-2 , _4 'och/eller det adsorberade materialet tvättas och därefter desorbe- ras från affinitetsmatrismaterialet. ' Lagring enligt uppfinningen av det adsorberade trypsinet el- ler det adsorberade trypsinliknande enzymet sker vid en sådan tem- peratur, att mikrobiell tillväxt retarderasf t.ex. vid ca 4°C._ _ Liganden i föreliggande affinitetsmatrismaterial utgöres lämp- ligen av m-aminobensamidin, p-aminobensamidin eller p-aminofenylgua- _ nidin. _ Q Med affinitetsmatrismaterial enligt uppfinningen behandlas t.ek. kommersiellt tillgängligt trypsin, oxtrombin eller urokinas från människa. c f Ligandmolekylerna kan vara kovalent bundna till affinitets- matrismaterialet via en molekyl, som benämns en kopplingsmolekyl.

Ligandmolekylen kan ha låg molekylvikt. ' ' Det framställda affinitetsmatrismaterialet används företrä- desvis i en kolonn, i vilken införes ett rått extrakt av material innehållande trypsin eller trypsinliknande enzym från en biologisk källa, som dessförinnan behandlats för att avlägsna olösligt mate- rial och för att erhålla det riktiga pH-värdet och saltkoncentra- tionen. Extraktet får rinna genom kolonnen för att bringa trypsinet eller det trypsinliknande enzymet att biospecifikt adsorberas i af- finitetsmatrisen_och låta alla andra proteiner och biopolymerer i extraktet, som icke har någon specifik affinitet till liganden, att passera direkt genom kolonnen. I vissa fall har det visat sig, att en komponent kan i liten utsträckning retarderas på kolonnen för olika, ospecifika skäl, så att det är önskvärt att omsorgsfullt tvätta kolonnen med buffert för att fullständigt eliminera alla des- sa substanser, som ej uppvisar affinitet. Sedan kolonnen befriats 7 från dessa komponenter kan det specifikt adsorberade trypsinet el- ler det trypsinliknande enzymet desorberas från kolonnen genom att företrädesvis låta en lösning innehållande en löslig, kompetitiv inhibitorförening, som specifikt utövar växelverkan med det adsor- berade enzymet, rinna genom kolonnen. Inhibitorer är material; som har analog funktionalitet med avseende på ligandmaterialen, men skil- jer sig strukturellt bland annat därigenom att de icke har någon-ana- log kopplingsmolekyl och matrismaterial, till vilka de är bundna. ' nu; iämpiigt innibitormaterial utgör benšæuiainvatekioria. via iso- -lering av vissa trypsinliknande enzym har det visat sig användbart att desorbera dessa från kolonnen genom att låta buffertlösningar med surt pH rinna därigenom; Om så är nödvändigt är en gelfiltre- ringskolonn ansluten i serie med affinitetskolonnen sedan de ovid- kommande komponenterna passerat därigenom, varvid således effektivt avlägsnande av den lösliga, kompetitiva inhibitorföreningen från det renade enzymet åstadkommes. ' Med affinitetsmatrismaterial enligt uppfinningen kan även renat trypsin och trypsinliknande enzym lagras utan att deras kata- lytiska aktivitet försämras. Detta genomföras genom att dessa enzym adsorberas på affinitetsmatrismaterialen, varpå det hela lagras i kyla. Då enzymerna är adsorberade på dessa material, kan de icke undergå försämring av sig själva, varigenom en av de väsentliga or- sakerna till enzymförsämring elimineras. ' Affinitetsmatriserna enligt uppfinningen kan användas vid kliniska och/eller veterinärterapeutiska förfarande, exempelvis (1) i ett in vivo bindemedel eller en infångningsanordning för trypsin eller trypsinliknande enzym; (2) i ett in vivo medel eller en an- ordning för administrering av trypsin eller trypsinliknande enzym för terapeutiska ändamål; (3) en extrakorporeal anordning, såsom i ett vaskulärt shuntsystem för.avlägsnande av trvpsin eller trypsin- liknande enzym från blodet och (4) en injektionsanordning eller lik- nande anordning för att i patienten införa trypsin eller wypsinlik- nande enzym för terapeutiska ändamål.

Vilken lämplig olöslig bärare som helst kan användas i affi- nitetsmatrismaterialet enligt uppfinningen. Exempel på bärarmaterial innefattar följande: cellulosa och samtliga dess förädlade former; aminoetylcellulosa; fosforcellulosa; dietylaminoetylcellulosa; karb- pximetylcellulosa; ECTEOLA-cellulosa; p-aminobensylcellulosa; poly- etyleniminocellulosa; trietylaminocellulosa; sulfoetylcellulosa; guanidoetylcellulosa; agaroser, såsom exempelvis Sepharose eller Bio-Gel A ; tvärbundna dextraner, såsom exempelvis Sepïadex ; tvärbundna polyakrylamider, såsom exempelvis Bio-Gel P ; agaropek- tin; och tvärbunden eller icke tvärbunden kollagen. Dessa material är karakteristiskt olösliga i vattenlösningar och har företrädesvis låg hydrofobicitet och har nonjonisk karaktär. Ett matrismaterial med jo- nisk karaktär eller ett matrismaterial, som har hög hydrofobicitet, kan visa sig vara ett hinder i affinitetsprocessen._ Kopplingsreaktioner, som är lämpliga för att binda kopplinge- molekyler och/eller ligandmolekyler till bäraren eller matrisen, el- ler ligandmolekyler till kopplingsföreningar, är vanligtvis begrän- sade av det lösningsmedium, i vilket de kan genomföras. Valet av lös- ningsmedelsmedium dikteras av fordringarna på bärarmaterialet. Bära- re av polysackarid- och polyakrylamidtyp används vanligtvis i vat- ten. Då så är nödvändigt kan med vatten blandbara, organiska lösnings- 7206026-2 6 medel i lämpliga proportioner med vatten användas, exempelvis aga- andas med antingen 50% etylenglykol_eller 50% dimetyl- 245 3059 (1970)). om helst kan använ- rosgeler kan bl formamid (Cuatrecasas, J. Biol. Chem.

Fastän vilken lämplig reaktionstemperatur s das, används företrädesvis 1 - 30°C i en vattenhaltig buffertlös ning av lämpligt pH, som kan innehålla med vatten blandbara lösnings- medel. Uppfinningen kan genomföras med användning av någon lämplig Exempel på sådana kopplingsreaktioner innefattar koholiska grup- kopplingsreaktion. kopplingen av karboxylgrupper med aminogrupper eller al per, som kan genomföras exempelvis genom tillsats av karbodiimider (vattenlöslig typ föredras), eller via acylazider, acylhalogenider, och acylanhydrider genom tillsats av lämpliga reagenser. En ligand (eller kopplingsmolekyl) innehållande en aminogrupp kan kopplas till en kopplingsmolekyl (eller ligand) innehållande exempelvis isocya- g nat, isotiocyanat, sulfonylklorid, alkylhalogenid, metyl eller etyl- amidat. _ 7 Fastän vilken lämplig kopplingsmolekyl som helst kan användas ligt uppfinningen är det lämpligt att dessa molekyler Exem- i systemet en är lineära och hydrofila såväl som fria från starka jongrupper. pel på kopplingsmolekyler innefattar epsilon-aminokaproinsyra; B- -alanin; 1,6-diaminohexan; bis(3-aminopropyl)-amin; glycin; glycyl- glycin; glycylglycylglycin; succinamidoetylamin; succinamidobutyl- amin; succinamidohexametylamin; aminoetanol; 2,2' och dess högre homologer. Molekyllängden för kopplingsföreningen, som används, bör vara tillräckligt stor för att åstadkomma det rik- -tiga förhållandet mellan ligand och matrismaterial så att effektiv t kan genomföras. I vissa fall har det -diaminodietyleter bindning av det önskade enzyme visat sig, att någon kopplingsförening icke erfordras, ta fall är kopplingsföreningen företrädesvis ungefär 7 Ångström el- men i de fles- ler längre.

Uppfinningen kommer att belysas med följande exempel. Delar och procenthalter är räknade“ på vikt, om icke annat anges. Alla lösningar är vattenlösningar, om icke annat anges. I Exempel I Till en suspension av agarosgel sättes bromcyan i en koncent- ration av 100 mg/ml av gelen. Suspensionen titreras därefter till -ett pH av 11,0 med 4 M natriumhydroxid (Na0H). Sedan alkaliupptag- - ningen upphört, uppsamlas den "aktiverade" gelen på en sintrad glas- tratt och tvättas med kall boratbuffert med en koncentration av 0,1 M och ett pH av 9,5. Därefter återsuspenderas gelen i kall|bo- ratbuffert och blandas i lika volymer med en lösning av l,6 diamino- , g 2 vzosozs-2 hexan i en koncentration av 100 mg/ml av gelen, och pH inställes på 9,5. Den så erhållna blandningen omröres försiktigt över natten vid 4°C. Gelen tvättas därefter genom att hälla denna i en grovsintrad glastratt och genom att långsamt låta destillerat vatten rinna där- igenom. Den erhållna aminohexametylenagarosen suspenderas i en lika volym destillerat vatten, som blandats med 02 g bärnstenssyraanhyd- rid per ml gel. pH inställes på 6,0 och hålles där genom tillsats av 4 M NaOH. Då basupptagningen upphört, omröres blandningen försik- tigt under 3 h vid 4°C och får därefter stå vid denna temperatur över natten. Succinamidohexametylagarosen, som nedan benämns SHA, tvättas på en grovsintrad glastratt, såsom ovan beskrivits.

Liganden p-aminobensamidinmonoväteklorid (benämnd pBz) i en mängd av 37 mg/ml gel kopplas till succinylgrupperna i SHA-gelen ge- nom reaktion i en 0,1 M vattenlöslig karbodiimidlösning med använd- ning av de förfaringssätt, som mera fullständigt beskrives av Hoare och Koshland (J. Biol. Chem. 242: 2447 (l967D. Denna använda vatten- lösliga karbodiimid är l-etyl-3-(3'-dimetylaminopropyl)karbodiimid- monoväteklorid (EDC). Kopplingsreaktionen genomföres i en automatisk pH-stat vid pH 4,75 med användning av 1,0 M klorvätesyra, HCl. Då protonupptagningen upphört, tvättas geluppslamningen på en sintrad glastratt med användning av destillerat vatten, som påföres i en mängd motsvarande fem gånger volymmängden gel, såsom ovan beskrivits.

Det erhållna affinitetsmatrismaterialet benämns nedan pBz-SHA-gel med en ligandkapacitet av 0,021 mekv/ml gel.

Exempel II Det i exempel I beskrivna förfarandet upprepas med undantag av att 45 mg/ml gel av m-aminobensamidindiväteklorid (benämnd mBz) används som ligand. Det så erhållna preparatet benämns nedan mBz- SHA-gel, som har en ligandkapacitet av 0,012 mekv/ml gel.

Exempel III Förfarandet enligt exempel I upprepas med undantag av att 36 mg/ml gel av p-aminofenylguanidinmonoväteklorid (benämnd pAG) används som ligand. Den så erhållna produkten benämns nedan pAG-SHA- gel med en ligandkapaoitet av 0,035 mekv/ml gel.

Exempel IV 7 Förfarandet enligt exempel III upprepas med undantag av att epsilonaminokaproinsyra används i stället för l,6-diaminohexan och succinyleringssteget överhoppas. Detta preparat benämns nedan pAG- CA-gel." Exempel V 4 Förfarandet enligt exempel IV upprepas med undantag av att .g '7206026-2 B-alanin (3-aminopropionsyra i en koncentration av 44 mg/ml gel) lanvänds i stället för epsilonaminokaproinsyra. Detta preparat be- nämns nedan pAG-AA-gel och visar sig binda_trypsin i mindre omfatt- ning än i föregående exempel. I 7 I gxempel VI Förfarandet enligt exempel II upprepas med undantag av att bromcyan används i en koncentration av 200 mg/ml gel och l,6-diami- nohexan används i en koncentration av 180 mg/ml gel. Motsvarande hög- re koncentrationer bärnstenssyraanhydrid används vid kopplingssuc- cinyleringen och kopplingsreaktionen med mBz med användning av 40 mg/ml gel genomföras med användning av 0,1 M EDC. Den så erhållna lmBz-SHA-gelen visar sig ha en högre ligandkoncentration per ml gel (o ,dos mekv/ml gel) . ' i Exempel VII g I Aminoetylcellulosa (AE-cel), innehållande 0,27 mekv amin/g torr cellulosa, svälles i 0,1 M natriumdikarbonat (NaHCO3), tvättas därefter med 0,1 M Na0H, därefter med 0,1 M HC1 och därefter med -destillerat vatten. Suspensionen av 10 g AE-cel i 80 ml vatten be- handlas därefter med 3 g bärnstenssyraanhydrid vid pH 6,0,som bibe- hålles med 4 M NaOH medan pH uppmätes medelst en pH-meter. Då bas- upptagningen upphört, omröres blandningen vid 4°C under 2 h. Efter omsorgsfull tvättning av suspensionen med vatten, blandas denna med 0,93 g mBz och får reagera med 2,3 g EDC, såsom beskrivits i exem- pel I. En något flockig suspension erhålles, vilken nedan benämns pAG-SA-gel.

Exempel VIII , 500 ml vattenfri etylendiamin förupphettas i en tillsluten kolv till 90°C och 25 g torr BIO-GEL P-300 polyakrylamidpärlor tillsättes och uppslamningen omröres kontinuerligt under 8 h. kyles därefter under 1 h i isvatten, varefter geluppslamningen blan- das med 500 ml krossad is. Gelen tvättas därefter med 0,1 M NaCl- lösning på en Büchner-tratt tills tvättvätskorna är fria från ety- lendiamin, såsom visas genom reaktion med 2,4-dinitrofluorbensen.

Gelen överföres därefter till en stor polyetenbehållare och tillräck- ligt med 0,1 M NaCl tillsättes för erhållande av en tunn uppslamning. pH för denna uppslamning inställes på 6,0 och 25_g bärnstenssyraan- hydrid tillsättes portionsvis medan pH hålles på 6,0 genom tillsats av 2eN natriumhydroxidlösning. Då pH för uppslamningen upphör att ändras övertäckes uppslamningen och får sjunka över natten. ningen tvättas därefter med 10 lit. 0,1 M NaCl pâ en Büchner-tgatt. 50 ml av de tvättade pärlorna uppslammas därefter med 50 ml destil- Kolven Uppslam- .iii 1206026-2 lerat vatten, blandas med 10 g mBz och får reagera med 2 g EDC, såsom beskrivits i exempel I. Detta preparat benämns nedan PAE-mBz.

Exempel IX _ g En standardbuffert av tris(hydroximetyl)aminometan/kalium- klorid (0,05 M TRIS/0,5 M KCl med ett pH av 8,0), som nedan benämns TRIS/KCl-buffert, används för att bringa affinitetskolonnen i jäm- vikt, att upplösa enzymprov, och att tvätta den med enzym satsade affinitetskolonnen. En liten kromatografikolonn (0,7 cm x 20 cm) fylles med 7-8 ml pBz-SHA-gel. Sedan kolonnen kommit i jämvikt till- sättes 40 mg av den renaste, kommersiellt tillgängliga trypsinkva- liteten, som är upplöst i ungefär 2 ml TRIS/KCl-buffert. Då 0,01 M bensamidinväteklorid, som benämns Bz, i TRIS/KCl-bufferten får rin- _na genom den trypsinbundna kolonnen, desorberas trypsinet av den lösliga inhibitorn och uttvättas specifikt i ett i hög grad renat tillstånd och utan närvaro av något.degraderat eller försämrat tryp- sin. Kolonnen elueras därefter med glycin/KCl-buffert (0,05 M gly- cin och 0,5 M KCl, pH 3,0), vilket resulterar i utträde av föga el- ler inget protein. Det aktiva trypsinet, som sålunda erhållits, har en större renhet än 95%, såsom bestämmes medelst türeringsmetoden med aktiva ställningar, enligt Chase och Shaw, Bioohem. Biophys.

Res. Comm. 29:508 (1967). Det erhållna 65%-iga utbytet visar, att den renaste, kommersiellt tillgängliga trypsinkvaliteten endast har en renhet av 65%. Affinitetsmaterialets specificitet verifieras ge- nom att satsa 40 mg alfa-kymotrypsin på en i förväg, till jämvikt bragt kolonn, varefter kolonnen tvättas med TRIS/KCl-bufferten in- nehållande Bz. Alfa-kymotrypsin visar sig passera omedelbart genom affinitetsgelen. Dessutom göres verifikation av affinitetsspecifici- teten genom att eluera kolonnen med glycin/kaliumklorid-buffert (0,05 M/0,5 M, pH 3,0). Kolonnen visade sig eluera protein, vilket visar en riktigt fungerande kolonn. Éxempel X Förfarandet enligt exempel IX upprepas med undantag av att man i desorptionssteget använder 0,001 M HCl/0,5 M KCl i stället för Bz i TRIS/KCl för att eluera trypsinet från affinitetskolonnen. Re- sultat, som liknar de'i exempel IX erhållna, observeras.

Exempel XI Oxtrombin, som erhållits från Parke-Davis Co. renas på mBz- SHA-gelen av hög kapacitet, som framställts i exempel VI i enlighet med förfarandet i exempel IX med undantag av att en G-25 Sephadex kolonn med dimensionen 1,5 cm x 30 cm anslutes i serie med affini- tetskolonnens utlopp. Det så erhållna, renade trombinet är även fritt

Claims (22)

lllïmííóšozs-z m från Ez. Räknat på vikt visar sig trombinutgângsmaterialet ha en koncentration av l-2% aktivt enzym. Exempel XII ' _ pAG-SHA-gelen packas igen 0,7 x 20 cm kolonn (bäddvolym unge- fär 8 ml) och tvättas med TRIS/KCl-buffert. l ml av en trypsinlös- I ning (40 mg/ml) införes i kolonnen och tvättas därefter med buffer- ten för att avlägsna ovidkommande material. Den trypsinabsorberade gelen lagras därefter vid ca 4°C för att retardera mikrobiell till- växt på kolonnen. e c e Urokinas från människa (5000 Plougenheter) som erhållits från Nutritional Biochemicals Corporation, renas på mBz-SHA-gelen av hög kapacitet, som framställts i exempel VI i enlighet med förfarandet l i exempel IX med undantag av att 0,01 M HCl i 0,5 M KCl används för att desorbera enzymet från affinitetskolonnen. Resultat, som liknar de i exempel X erhållna, observeras. Fastän föreliggande exempel var specifika vad beträffar betin- ~ gelser och material kan vilket som helst av de ovan angivna, typis- ka materialen om så är lämpligt ersätta varandra i ovanstående exem- pel med liknande resultat. Förutom de steg, som används för att ge- nomföra förfarandet enligt uppfinningen, kan ytterligare steg eller modifikationer göras, om så är önskvärt, exempelvis ultrafiltrering, dialys eller lyofilisering. Dessutom kan andra material användas en- ligt uppfinningen som förbättrar eller på annat sätt i önskvärd riktning påverkar egenskaperna hos systemen för deras användning, varvid exempelvis med vatten blandbara, organiska lösningsmedel kan användas för att förbättra effektiviteten för systemet. Således är modifikationer och variationer inkluderade inom föreliggande ansökans ram, under förutsättning att de faller inom de bifogade kravens ram. -Patentkrav

1. Förfarande för rening eller lagring av ett enzym, som utgöres av trypsin eller ett trypsinliknande enzvm, k ä n n e - t e c k n a t av att en blandning innehållande enzymet bringas i kontakt med ett affinitetsmatrismaterial bestående av en olöslig bärare och en ligand med formeln x-Af-R 72060 6-2' 11 C) ÉH (amidinium) dar x = - c - :m2 i C) NH2 eller = _ N _ å _ NH2 (guanidinium) I H och där R = -(cH2)yZ, -0(cH2)YZ, -S-(CHZYYZ "S"S- där Z = -NH2, COOH, I, Br, Cl, o Écl, Ncs, Nco, sozcl ll och y 0 - 3, och A betecknar pentyl, hexyl, norvalyl, cyklohexyl, fenyl eller bensoyl, och eventuellt en kopplingsmolekyl för kovalent bindning av liganden vid den olösliga bäraren, så att enzymet adsorberas av matrismaterialet, varpå det hela lagras i kyla och/eller det adsor- berade materialet tvättas och därefter desorberas från affinitets- matrismaterialet.

2. Förfarande enligt krav.l, k ä n n e t e c k n a t av att den olösliga bäraren utgöres av cellulosa eller en förädlad form därav; aminoetylcellulosa; fosforcellulosa; dietylaminoetyl- cellulosa; karboximetylcellulosa; ECTEOLA-cellulosa; p-aminobensyl- cellulosa; polyetyleniminocellulosa; trietylaminocellulosa; sulfo- etylcellulosa; guanidoetylcellulosa; en ágaros; en tvärbunden dexfl tran; en tvärbunden polyakrylamid; en agaronektin; en tvärbunden eller icke tvärbunden kollagen. '

3. Förfarande enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att liganden utgöres av m-aminobensamidin; p-aminobensamidin; eller p-aminofenylguanidin.

4. Förfarande enligt krav l, k ä n,n e t e c k n a t av att kopplingsmolekylen är linjär, hydrofil och fri från starka jongrupper. i

5. Förfarande enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t av att längden på kopplingsmolekylen är minst ca 7 Å.

6. Förfarande enligt något av kraven l - 5, k ä n n e ~ t e c k n a t av att kopplingsmolekylen består av epsilon-amino- kaproinsyra; B-alanin; 1,6-diaminohexan; bis(3-aminopropyl)amin; glycin; glycylglycin; glycylglycylglycin; succinamidoetylamin; succinamidobutylamin; succinamidohexametylamin; aminoetanol; l!2'- -diaminodietyleter eller en högre homolog därav. w -7206026-2 e” " i 12

7. Förfarande enligt nagot av kraven l - 6, k ä n n e - t e c k n a t av att kontakten åstadkommes genom att blandningen får rinna genom matrismaterialet.

8. Z 8. Förfarande enligt krav 1, ck ä n n e t e c k n a t av att desorberingen genomföres genom att en vätska får rinna genom matrismaterialet, vilken vätska innehåller ett kompetitivt inhibi- tormaterial för specifik växelverkan med det adsornerade enzymet.

9. Förfarande enligt krav 8, k ä n n e t e c k n a t av att inhibitormaterialet utgöres av bensamidinväteklorid.

10. l0. Förfarande enligt krav 8 eller 9, k ä n n e t efic k - n a t av att inhibitormaterialet avlägsnas från lösningen genom gelfiltrering. ' ' g

11. ll. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e_t e c k n a t av att desorberingen genomföras genom att en buffert med surt pH-vär-. de får rinna genom matrismaterialet.

12. Förfarande enligt något av kraven 1 - 11, t e c k n_a t av att blandningen utgöres av kommersiellt tillgäng- ligt trypsin, oxtrombin eller urokinas från människa. k ä n n e -

13. Förfarande enligt något av kraven l - 12, k ä n n e - t e c k n a t av att produkten från reningen utgöres av trypsin, karboxipeptidas B, napain, ficin, trombin, plasmin, subtilopepti- das, aspergillopeptidas, streptococcuspeptidas, klostridiopeptidas, bromelain eller urokinas. '

14. Förfarande enligt något av kraven l - 6, k'ä n n e - t e c k n a t av att det adsorberade enzymet lagras vid en tempe- ratur som retarderaf mikrobiell tillväxt. i

15. Förfarande enligt krav 14, k ä n n e t e c k n a t av att det adsorberade enzymet lagras vid en temperatur av ca 4°C el- ler lägre.

16. Förfarandë enligt krav 15, k ä n n e t e c k n a t av att trypsin, karboxipeptidas B, papain, ficin, trombin, plasmin, subtilopeptidas, aspergillopeptidasf streptococcuspeptidas, klost- ridiopeptidas, bromelain eller urokinas lagras. J

17. Medel för utförande av förfarandet enligt krav l, k ä n - n e t e c k n a t av att det utgöres av ett affinitetsmatrismate- rial, bestående av en olöslig bärare och en ligand med formeln x-A-RI " ' (amidinium) 2 I c 7206026-2 13 Q NH II eller = - N - C - NH å (guanidinium) och aär R = -(cn2>yz. -oyz, -s-(cnyyz -S~S-(CH2)Y-Z där Z = -Nl-lz, COOH, I, Br, Cl, O CCI, NCS, NCO, SO2Cl och y = 0-3; V och A betecknar pentyl, hexyl, norvalyl, cyklohexyl, fenyl eller bensoyl och eventuellt en kopplingsmolekyl för kovalent bindning av liganden vid den olösliga bäraren.

18. ' 18. Medel enligt krav 17, k ä n n e t e c k n a t av att den olösliga bäraren består av cellulosa eller en förädlad form därav; aminoetylcellulosa; fosforcellulosa; dietylaminoetylcellur losa; karboximetylcellulosa; ECTEOLA-cellulosa; p-aminobensylcel- lulosa; polyetyleniminocellulosa; trietylaminocellulosa; sulfo- etylcellulosa; guanidoetylcellulosa; en agaros; en tvärbunden dex- tran; en tvärbunden polyakrylamid; agaropektin; tvärbunden eller icke tvärbunden kollagen.

19. Medel enligt krav 17 eller 18, k ä n n e t e c k n a t av att liganden utgöres av m-aminobensamidin; p-aminobensamidin; eller p-aminofenylguanidin.

20. Medel enligt krav 17, k ä n n e t e c k n a t av att kopplingsmolekylen är linjär, hydrofil, och fri från starka jon- grupper.

21. Medel enligt krav 17 eller 20, k ä n n e t e c k n a t av att längden av kopplingsmolekylen är minst huvudsakligen 7 Å.

22. Medel enligt något av kraven 17, 20 eller 21, k ä n - n e t e c k n a t av att kopplingsmolekylen består av epsilonami- nokaproinsyra; ß-alanin; 1,6-diaminohexan; bis(3-aminopropyßamin; glycin; glycylglycin; glycylglycylglycin; succinamidoetylamin; succinamidobutylamin; succinamidohexametylamin; aminoetanol; 2,2'- -diaminodietyleter eller en högre homolog därav. ' 7206026-2 14 ÅNFÖRDA PUBLIKATIONER: Sverige 337 223 (12 q:6/01), 343 210 (A61k 23/00), 354 868 (C079 7/02), 361 320 (C07g 7/02) f ' _ Storbritannien 1 226 052 Tyskland 1 905 813, 2 050 484, 2 102 514 Andra pubtikatipnerz Immunochemístry. 2(1965), p. 293-322. Nahrung. 10(1966):7, p. 541-549. Biochemístry. 7(1968):11, p. 4045-4052. Journal of bioLogicaL chemistry. 242(19671:24, p. S782-S788. JournaL of medicinen chemist-ny. 1o<1967>=6, p. 1123-1128. Chemical abstracts. 66(1967), ref. 102044 x (Mot. bioL. Kiev 1965, p. 221-226 (Publ, 1966) Russ.). Chemical abstracts. 73(1970), ref. 105684.)