CN101693748B - 一种特异性纯化高分子尿激酶层析介质及制备方法和应用 - Google Patents

一种特异性纯化高分子尿激酶层析介质及制备方法和应用 Download PDF

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一种特异性纯化高分子尿激酶层析介质，其特征是结构为：HOOC-(CH2)4(NH)C-O-R-O-C(NH)NH(CH2)4-CO-X，X＝NHC6H5C(NH)NH2，R代表交联琼脂糖基质。本发明的优点是：制备过程简单，反应条件温和，适用于高效分离高分子尿激酶和低分子尿激酶的介质，能够实施高纯度高分子尿激酶的工业生产。

Description

一种特异性纯化高分子尿激酶层析介质及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种高分子尿激酶层析介质及制备方法，尤其涉及一种特异性纯化高分子尿激酶层析介质及制备方法和应用。
背景技术
根据市场调研机构Datamonitor公司预测，到2015年，全球新颖抗血栓药物创造的市场总价值将达到100亿美元左右。其中血栓溶解剂纤溶酶原激活剂(PAs)类的药物就达15亿美元。而主要的纤溶酶原激活剂包括链激酶(Streptokinase)、尿激酶(Urokinase)、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)等。随着世界人口老龄化的进程，对这类药物的需求必然进一步增加。作为溶栓类药物中的一种，尿激酶是可直接促使无活性的纤溶酶原变为有活性的纤溶酶，使组成血栓的纤维蛋白水解。临床上用于脑血栓形成、脑栓塞、周围动脉或静脉血栓症、肺栓塞、急性心肌梗死等。也可用于眼科溶解眼前房的血纤维、血块。因此在临床上用途广泛。
尿激酶是人体肾细胞产生的一种碱性蛋白酶，会因人体代谢而随尿液排出，因此人尿是生产尿激酶的最主要来源之一。尿激酶在体内合成时为一分子量为55kD的单链多肽酶原，称为单链尿激酶(sc-uPA)。在人体尿液中，尿胃蛋白酶可把尿激酶原切割为双链形式具有高生物活性的天然尿激酶分子，其分子量为54700D。天然尿激酶分子双链通过二硫键连接，称为双链尿激酶(tc-uPA)，也称为高分子尿激酶(HUK)。受到各种酶的切割作用，高分子尿激酶会进一步降解为分子量为31300D的低分子尿激酶(LUK)。在溶栓药物的应用中，虽然LUK具有一定的体外溶栓生物活性，但由于缺少N-端的两个重要模块(生长因子样模块G和Kringle模块K)，在体内的溶栓作用机制不明确，可能会引起溶血等严重副反应，而且高分子尿激酶在体内的半衰期较长，因此药用的尿激酶制剂产品对高分子尿激酶含量有明确规定。其中美国FDA及欧州药典EP明确规定在尿激酶制剂中，高分子尿激酶的含量必须大于90％。我国药典2005版规定，高分子尿激酶含量不低于90％，而实际上国际原料药市场对高分子尿激酶含量的要求更高。因此，从生产工艺的角度来说，高分子尿激酶的收率和纯度是评价工艺优异的重要指标。
我国是一个人口大国，生产尿激酶的原材料丰富，但由于缺乏较有效的分离纯化方法，国内对于尿激酶的生产大多局限于粗品，难以精制到高纯度的高分子尿激酶制剂。因此研究特异性强，纯化效果好，酶活性回收率高的尿激酶纯化方法具有显著的经济价值。国内外有不少学者在亲和配位体和纯化介质方面进行了尝试，如研究单克隆抗体亲和层析(李秀珍等，军事医学科学院院刊，1988，12(3)：195-198)，筛选和开发对尿激酶催化活性域具有高亲和性的系列新颖配位体(李荣秀等，专利号ZL 99124231.9)，开发联苯胺-琼脂糖亲和层析(郑光会等，专利号91100702.4)，开发对氨基苯甲脒-sepharose 6B亲和层析(司世麟等，河北科学院学报，1991，4：41-46；陈祥胜等，湖北中医学院学报，2008，10(4)：30-31)，研究头孢唑啉-Sepharose 4B亲和层析介质(曹学君等，生物化学与生物物理学报，1998，30(6)：635-637)，以及开发基于胍基和氨基苯甲脒的磁性亲和层析介质(董聿生等，高等学校化学学报，2002，23(6)：1013-1017；董聿生等，色谱，2001，19(1)：20-24)等。上述对尿激酶纯化介质及工艺的改进和探索只注重了尿激酶生物活性的最终回收率和纯化倍数，却难以有效分离高分子尿激酶和低分子尿激酶，因此实际效果有限。其主要原因是传统亲和层析都是基于尿激酶分子的β链C-端丝氨酸蛋白酶催化活性域活性位点(His204，Asp255和Ser356)组成的“口袋”高级结构，而高分子尿激酶和低分子尿激酶都具有此天然高级结构，因此单纯用亲和层析往往难以达到分离高分子尿激酶和低分子尿激酶的要求，还需要借助于凝胶过滤层析等步骤进行进一步分离，费时费力并且尿激酶活力损失。而且人尿蛋白中含有许多具有相似“口袋”结构的蛋白或酶类，如胰蛋白酶和尿胰激肽释放酶等，一般亲和层析对这些生化分子也缺少分辨力。因此，本发明的目的是获得一种适用于高效分离高分子尿激酶和低分子尿激酶的介质并用于高纯度高分子尿激酶的大规模生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性纯化高分子尿激酶层析介质及制备方法和应用，该介质能用于从尿激酶溶液中一步纯化获得高纯度高分子尿激酶。
本发明是这样来实现的，其特征是一种特异性纯化高分子尿激酶层析介质其结构为：HOOC-(CH2)4(NH)C-O-R-O-C(NH)NH(CH2)4-CO-X，
X＝NHC6H5C(NH)NH2，R代表交联琼脂糖基质。
本发明所述的一种特异性纯化高分子尿激酶层析介质其制备方法为：
(1)交联琼脂糖基质的活化：取琼脂糖作为基质，将基质与0.5g/mL溴化氰在pH≥11碱性条件下冰水浴中活化，得到活化的琼脂糖基质；
(2)5-氨基戊酸-琼脂糖复合物的制备：活化的琼脂糖基质与5-氨基戊酸摩尔比大于1∶2偶联，得到5-氨基戊酸-琼脂糖胶复合物；
(3)5-氨基戊酸-琼脂糖胶-对氨基苯甲脒复合物的的制备：5-氨基戊酸-琼脂糖胶复合物与对氨基苯甲脒缩合，其中控制5-氨基戊酸与对氨基苯甲脒的摩尔分子比控制为10∶1-10∶5，缩合反应得到目的层析介质。
本发明的应用为：尿激酶特异性纯化介质装层析柱，用预处理后尿激酶粗提液进行上样，然后经过洗涤和两阶段洗脱步骤，获得目的高分子尿激酶产品，其中上样和洗涤步骤中缓冲液为pH6.0-8.0的0.2-0.5mol/L醋酸盐缓冲液，第一阶段洗脱缓冲液为pH4.0-6.0的1.0-1.5mol/L磷酸盐缓冲液；第二阶段洗脱缓冲液为pH4.0-6.0的0.2-0.5mol/L磷酸盐缓冲液。
本发明的优点是：制备过程简单，反应条件温和，适用于高效分离高分子尿激酶和低分子尿激酶的介质，能够实施高纯度高分子尿激酶的工业生产。
具体实施方式
(1)1L高分子尿激酶特异性层析介质的合成：
将购买的Separose-CL4B湿胶(裸胶)1L抽去保护剂，用水洗涤一次，再抽干，加水至2000mL，预先用冰水浴(0℃)保温，磁力搅拌重悬。用100mL的0.5g/mL溴化氰溶液活化，边滴加溴化氰溶液边用NaOH溶液调pH值至10.0-11.0。加完溴化氰溶液后用NaOH溶液维持pH11.0至15min左右。反应完后用预冷沙滤漏斗抽滤至干，抽滤瓶中放置过量的固体硫酸亚铁粉末以去除未反应的溴化氰。用预冷的稀HCl溶液(3mmol/L HCl)进行洗涤10L体积。将抽干的活化琼脂糖胶Separose-CL4B约1000ml加入到pH9.3，1mol/L的5-氨基戊酸溶液2000ml中，25℃搅拌遮光反应12小时，砂芯漏斗滤干，然后用0.5mol/L NaCl洗涤10L后再用纯水洗涤10L后，将1000ml 5-氨基戊酸-琼脂糖胶悬浮于适量水中、搅拌。将1000mL对氨基苯甲脒溶液(pH4.5，0.5mol/L)和50mL 0.5mol/L缩合剂(EDC.HCl)同时加入到悬浮的胶中，将pH调至5.0，25℃室温下反应5小时，砂芯漏斗滤干，0.5mol/L NaCl洗涤10L，纯水洗涤10L，然后抽干并常温保存于0.1mol/L NaAC-20％乙醇(pH7.0)溶液中备用。
(2)高分子尿激酶特异性纯化介质用于尿激酶的纯化：
取成年男性尿1000L，过滤，调节pH至8.0后用0.8mol/L硫酸氨沉淀，沉淀用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解，然后用离子交换层析对尿激酶活性组分进行纯化分离。洗脱液上(1)中合成纯化介质填装的层析柱(预先用pH6.0-8.0的0.2-0.5mol/L醋酸盐缓冲液平衡)，然后依次用含1.0-1.5mol/L磷酸盐缓冲液(pH4.0-6.0)和含0.2-0.5mol/L磷酸盐缓冲液(pH4.0-6.0)洗脱，收集第二次洗脱液，进行超滤脱盐，并且冷冻干燥获得高分子尿激酶产品。整个工艺中高分子尿激酶回收率达98％以上，产品用SDS-PAGE法检测为单一条带，HPLC检测高分子尿激酶含量为99.5％以上，生物活性达到20万单位/mg.p。

Claims (1)

1.一种特异性纯化高分子尿激酶层析介质的应用，该特异性纯化高分子尿激酶层析介质的结构为：HOOC-(CH2)4(NH)C-O-R-O-C(NH)NH(CH2)4-CO-X，X＝NHC6H5C(NH)NH2，R代表交联琼脂糖基质；其特征是用特异性纯化高分子尿激酶层析介质装层析柱，用预处理后尿激酶粗提液进行上样，然后经过洗涤和两阶段洗脱步骤，获得目的高分子尿激酶产品，其中上样和洗涤步骤中缓冲液为pH6.0-8.0的0.2-0.5mol/L醋酸盐缓冲液，第一阶段洗脱缓冲液为pH4.0-6.0的1.0-1.5mol/L磷酸盐缓冲液；第二阶段洗脱缓冲液为pH4.0-6.0的0.2-0.5mol/L磷酸盐缓冲液。
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