CN111760556B - 一种尿激酶吸附剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种尿激酶吸附剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种尿激酶吸附剂及其制备方法和应用，所述制备方法包括S1、将硅胶高温活化，得到活化硅胶；S2、将步骤S1得到的活化硅胶和偶联剂在有机溶剂中反应，过滤、乙醇提取、水洗，得到前驱体1；S3、步骤S2得到的前躯体1与溴素反应，过滤水洗，得到前躯体2；S4、向步骤S3得到的前躯体2中加入水和对氨基苯甲脒盐酸盐，调节pH，反应，降温、过滤、乙醇提取、水洗、甩干，即得；上述方法制备的尿激酶吸附剂以及利用上述尿激酶吸附剂从人尿中直接吸附尿激酶的方法。本发明制备的尿激酶吸附剂的特异性更强，适用范围广，成本低，可直接从人尿中吸附尿激酶，且尿激酶的粗提收率高，比活高，可以实现尿激酶粗品的大规模生产。

Description

一种尿激酶吸附剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医学生物技术领域，具体涉及一种可直接从人尿中吸附尿激酶的吸附剂及其制备方法和应用。
背景技术
尿激酶是由人肾小管上皮细胞产生的一种丝氨酸蛋白酶，是一种碱性蛋白，等电点在pH8.7左右。为白色非结晶状粉末，易溶于水。稀溶液性状不稳定，必须新鲜配用，且不得用酸性溶液稀释。冻干状态可稳定数年。尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶。对合成底物的活性与胰蛋白酶和纤溶酶近似,也有酯酶的活力。无抗原性，不使体内产生抗体。体内半衰期为(14±6)min。
尿激酶是一种溶血栓药物，它能激活纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶，纤溶酶能使不溶性的纤维蛋白转变为可溶性的肽，从而使血栓溶解。因此，临床上多用于治疗血栓形成、血栓栓塞等症。尿激酶与抗癌剂合用时，由于它能溶解癌细胞周围的纤维蛋白，使得抗癌剂能更有效地穿入癌细胞，从而提高抗癌剂杀伤癌细胞的能力。所以，尿激酶也是一种很好的癌症辅助治疗剂，而且，无抗原性问题，可长时间使用。
人尿激酶生产的第一步就是从新鲜男性尿液中吸附人尿激酶，加工成尿激酶粗品。传统的生产方法多采用在卫生间放集尿桶收尿，尿液运输回加工点集中加工的方式。近年来，随着我国人民生活水平不断提高，卫生间的升级改造速度突飞猛进，再加上环保部门对气味、污染排放的控制越来越严格，尿激酶传统的原料收集加工方式越来越难以为继。由此造成的直接后果就是尿激酶粗品原料紧缺，价格飞涨。
为了解决这一突出供需矛盾，改变传统的收集尿液集中处理的生产方式迫在眉睫。CN101863974A公开了一种直接富集尿蛋白的方法，包括如下步骤：(1)将吸附剂再生处理，水冲至中性；(2)将处理好的吸附剂装在滤布袋中，直接放置在卫生间的便斗或者便池中；(3)尿液流经吸附剂，尿蛋白被吸附；(4)收集吸附尿蛋白的吸附剂，运至加工点进行后续处理。该发明通过使用包括离子交换树脂等特定吸附剂，对尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶、尿激酶等尿蛋白直接有效吸附，避免了尿液的收集步骤。
CN105087531A公开了一种制备尿激酶的方法，包括：1)将滤布袋直接放置在卫生间的便斗或者便池中；2)尿液流经滤布袋，尿蛋白被吸附；3)收集吸附尿蛋白的滤布袋，运至加工点进行后续处理，其中，步骤1)所述的滤布袋，包括自外而内依次设置的棉纱布层、改性纤维素层和改性硅胶层，改性硅胶为苯基酰胺化官能团硅胶。该发明通过滤布袋实现了对尿液或稀释尿液中尿激酶、尿胰蛋白酶抑制剂和人尿激肽原酶等尿蛋白的现场吸附，符合城市卫生化要求。
上述方法虽然解决了传统方法中原尿收集、运输等环节带来的一系列环境问题，但仍存在成本高、尿激酶粗提收率低，比活等问题，不适合大规模生产。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种尿激酶吸附剂及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种尿激酶吸附剂，为硅胶键合对氨基苯甲脒官能团，形成的对氨基苯甲脒键合硅胶。
本发明还提供了上述尿激酶吸附剂的制备方法：包括以下步骤：
S1、将硅胶高温活化，得到活化硅胶；
S2、将步骤S1得到的活化硅胶和偶联剂在有机溶剂中反应，过滤、乙醇提取、水洗，得到前驱体1；
S3、步骤S2得到的前躯体1与溴素反应，过滤水洗，得到前躯体2；
S4、向步骤S3得到的前躯体2中加入水和对氨基苯甲脒盐酸盐，调节pH、反应、降温、过滤、乙醇提取、水洗、甩干，即得。
优选地，步骤S1中所述高温活化为：在120-160℃下烘干3-10h。
优选地，步骤S2中所述偶联剂为乙烯基硅烷偶联剂；进一步优选为乙烯基甲基二乙氧基硅烷，乙烯基甲基二乙甲氧基硅烷，乙烯基三异丙氧基硅烷，乙烯基三乙酰氧硅烷，乙烯基三(2-甲氧基乙氧基)硅烷中的至少一种；最优选为乙烯基甲基二乙氧基硅烷。
优选地，步骤S2中所述有机溶剂为甲苯、甲醇、乙醇和异丙醇中的至少一种。
优选地，步骤S2中活化硅胶、偶联剂和有机溶剂的用量比例为100g：(45-55)ml：(350-450)ml；进一步优选为100g：50ml：400ml。
优选地，步骤S2中所述反应为回流反应6-10h。
优选地，步骤S3中所述前躯体1与溴素反应为：向步骤S2得到的前驱体1中加入350-450ml水形成前躯体1水溶液，向得到的前躯体1水溶液中滴加溴素至水溶液刚刚变红后，停止滴加溴素，25℃下反应30分钟。
优选地，步骤S4中所述对氨基苯甲脒盐酸盐的加入量：为步骤S2中所述活化硅胶用量的1/10-3/10；进一步优选为1/5。
优选地，步骤S4中所述调节pH为：调节pH至9-10。
优选地，步骤S4中所述反应为：在60-90℃下反应4-10h。
本发明还提供了上述尿激酶吸附剂直接从人尿中吸附尿激酶的方法，包括以下步骤：
(1)将尿激酶吸附剂悬液注入带滤网的柱子中，打开柱子的出水口，水流出柱子，尿激酶吸附剂形成吸附柱床；
(2)将步骤(1)得到的吸附柱床放置于小便池/斗中，吸附人尿中的尿激酶，取回吸附柱床；
(3)将步骤(2)取回的吸附床柱用纯化水清洗，取出吸附剂；
(4)向步骤(3)得到的吸附剂加入平衡缓冲液，制成悬混液；
(5)将步骤(4)得到的悬混液装入层析柱，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集到的洗脱液，即为尿激酶粗品溶液；
(6)将步骤(5)洗脱结束后的层析柱用再生缓冲液清洗，用纯化水冲洗至中性，取出尿激酶吸附剂。
优选地，步骤(1)中所述尿激酶吸附剂悬液中尿激酶吸附剂的质量分数为48-55％。
优选地，步骤(2)中所述取回的时间为10-16h。
优选地，步骤(3)中所述纯化水的温度为-10-0℃。
优选地，步骤(4)中所述平衡缓冲液：pH 6.4-7.8，含0.15-0.65M NaCl的0.05-0.15M的
Tris-HCl缓冲液。
优选地，步骤(4)中所述悬混液中尿激酶吸附剂的质量百分数为50-80％。
优选地，步骤(5)中所述洗脱缓冲液：pH2.0-3.0，0.05M-0.15M甘氨酸缓冲液。
优选地，步骤(5)中所述洗脱为：紫外吸收>50mAU开始收集洗脱液，紫外小于50mAU时停止收集。
优选地，步骤(6)中所述再生缓冲液为含0.1-0.2M醋酸的体积百分数为10-30％的乙醇水溶液。
本发明的有益效果为：
本发明中的尿激酶吸附剂为对氨基苯甲脒键合硅胶，和传统的生产工艺比，本发明的制备方法简单，制备的尿激酶吸附剂的特异性更强，适用范围广，环保压力小，成本低，可直接从人尿中吸附尿激酶，解决了传统方法中原尿收集、运输等环节带来的一系列环境问题；同时，尿激酶的粗提收率高，比活高，可以实现尿激酶粗品的大规模生产。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
本发明对所采用原料的来源不作限定，如无特殊说明，本发明所采用的原料均为本技术领域普通市售品。如无特殊说明，本发明的悬液、溶液所使用的溶剂均为水，优选为纯化水。
实施例1一种尿激酶吸附剂及其制备方法
将硅胶在125℃烘箱烘4h，将100g活化后的硅胶加入到1L三口反应瓶中，加入400ml甲苯，50ml乙烯基甲基二乙氧基硅烷，回流8h，过滤，乙醇提取，水洗，得到前躯体1，将,前躯体1和400ml水加入到1L三口瓶中，滴加溴素至水溶液刚刚变红，常温(25℃)反应30分钟，过滤水洗，得到前躯体2，将前驱体2和400ml水加入到1L三口瓶中，加入20g对氨基苯甲脒盐酸盐调pH至9，升温80℃反应8h。降温至30℃，过滤，乙醇提取，水洗，甩干即得到尿激酶吸附剂。
实施例2
一种尿激酶吸附剂及其制备方法
将硅胶在120℃烘箱烘10h，将100g活化后的硅胶加入到1L三口反应瓶中，加入350ml甲醇，45ml乙烯基三异丙氧基硅烷，回流6h，过滤，乙醇提取，水洗，得到前躯体1，将,前躯体1和350ml水加入到1L三口瓶中，滴加溴素至水溶液刚刚变红，常温25℃下反应30分钟，过滤水洗，得到前躯体2，将前驱体2和350ml水加入到1L三口瓶中，加入10g对氨基苯甲脒盐酸盐，调pH至9，60℃反应10h后，降温至30℃，过滤，乙醇提取，水洗，甩干，即得到尿激酶吸附剂。
实施例3
一种尿激酶吸附剂及其制备方法
将硅胶在160℃烘箱烘3h，将100g活化后的硅胶加入到1L三口反应瓶中，加入450ml乙醇，55ml乙烯基三乙酰氧硅烷，回流10h，过滤，乙醇提取，水洗，得到前躯体1，将,前躯体1和450ml水加入到1L三口瓶中，滴加溴素至水溶液刚刚变红，常温25℃下反应30分钟，过滤水洗，得到前躯体2，将前驱体2和450ml水加入到1L三口瓶中，加入30g对氨基苯甲脒盐酸盐，调pH至10，90℃反应4h后，降温至30℃，过滤，乙醇提取，水洗，甩干，即得到尿激酶吸附剂。
实施例4
一种尿激酶吸附剂及其制备方法
将硅胶在140℃烘箱烘4h，将100g活化后的硅胶加入到1L三口反应瓶中，加入50ml甲苯，400ml乙烯基甲基二乙氧基硅烷，回流9h，过滤，乙醇提取，水洗，得到前躯体1，将前躯体1和450ml水加入到1L三口瓶中，滴加溴素至水溶液刚刚变红，常温25℃下反应30分钟，过滤水洗，得到前躯体2，将前驱体2和450ml水加入到1L三口瓶中，加入30g对氨基苯甲脒盐酸盐，调pH至9，70℃反应9h后，降温至30℃，过滤，乙醇提取，水洗，甩干，即得到尿激酶吸附剂。
实施例5
一种尿激酶吸附剂及其制备方法
将硅胶在130℃烘箱烘3.5h，将100g活化后的硅胶加入到1L三口反应瓶中，加入48ml异丙醇，420ml乙烯基甲基二乙氧基硅烷，回流7h，过滤，乙醇提取，水洗，得到前躯体1，将前躯体1和380ml水加入到1L三口瓶中，滴加溴素至水溶液刚刚变红，常温25℃下反应30分钟，过滤水洗，得到前躯体2，将前驱体2和400ml水加入到1L三口瓶中，加入20g对氨基苯甲脒盐酸盐，调pH至9，85℃反应8h后，降温至30℃，过滤，乙醇提取，水洗，甩干，即得到尿激酶吸附剂。
对比例1
本对比例与实施例1的不同在于：硅胶的高温活化条件为：180℃下烘干10h。
对比例2
本对比例与实施例1的不同在于：活化硅胶、偶联剂和有机溶剂的用量比例为100g：60ml：500ml,对氨基苯甲脒盐酸盐的加入量活化硅胶用量的2/5。
对比例3
按照CN105087531B中实施例1制备的苯基酰胺化官能团硅胶，作为尿激酶吸附剂。
为了进一步验证本发明制备的尿激酶吸附剂的技术效果，分别利用上述实施例1-5和对比例1-3制备的吸附剂直接从人尿中吸附尿激酶的方法，具体包括以下步骤：
(1)、取尿激酶吸附剂20g，用纯化水，制成质量百分数为50％的尿激酶吸附剂悬液；
(2)、将上述尿激酶吸附剂悬液搅拌均匀，倒入带滤网的吸附柱中，打开吸附柱出口，水从出口排出，尿激酶吸附剂则在吸附柱内形成均匀吸附柱床；
(3)、将上述形成吸附柱床的吸附柱放置于小便池/斗中，12小时后取回；
(4)、将取回的吸附柱用-5℃的纯化水冲洗3次；
(5)、取出尿激酶吸附剂，加入平衡缓冲液制成质量百分数为60％的混悬液，装入层析柱，柱高20cm；连接层析柱到层析系统，用洗脱缓冲液进行洗脱，层析系统紫外吸收>50mAU开始收集洗脱液，紫外小于50mAU时停止收集，收集到的洗脱液，即为尿激酶粗品溶液；
其中，所述平衡缓冲液为：pH 6.4-7.8，含0.4M NaCl的0.1M的Tris-HCl缓冲液；所述洗脱缓冲液为：pH2.0-3.0，0.1M甘氨酸缓冲液。
上述尿激酶吸附剂的再生为：将洗脱结束后的层析柱用再生缓冲液清洗5-6次后，用纯化水冲洗至中性，取出尿激酶吸附剂，备用即可；其中，再生缓冲液为含0.15M醋酸的体积百分数为20％的乙醇水溶液。
对与实施例1-5和对比例1-3的尿激酶吸附剂相应的尿激酶粗品溶液进行检测，按照中国药典(2015年版)测定尿激酶活性浓度。结果如表1所示。
表1
粗提收率％ 比活IU(mg pro)-1
实施例1 88.2 1688
实施例2 76.8 1351
实施例3 77.6 1367
实施例4 79.4 1426
实施例5 80.6 1435
对比例1 70.5 1245
对比例2 65.4 1208
对比例3 52.6 1120
综上所述，本发明中的尿激酶吸附剂为对氨基苯甲脒键合硅胶，和传统的生产工艺比，本发明的制备方法简单，制备的尿激酶吸附剂的特异性更强，适用范围广，环保压力小，成本低，可直接从人尿中吸附尿激酶，解决了传统方法中原尿收集、运输等环节带来的一系列环境问题；同时，尿激酶的粗提收率高，比活高，可以实现尿激酶粗品的大规模生产。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (5)

1.一种尿激酶吸附剂的制备方法：其特征在于，包括以下步骤：
S1、将硅胶高温活化，得到活化硅胶；
步骤S1中所述高温活化为：在125℃下烘干4h；
S2、将步骤S1得到的活化硅胶和偶联剂在有机溶剂中，回流反应8h，过滤、乙醇提取、水洗，得到前驱体1；
步骤S2中活化硅胶、偶联剂和有机溶剂的用量比例为100g：50mL：400mL；所述偶联剂为乙烯基甲基二乙氧硅烷，所述有机溶剂为甲苯；
S3、步骤S2得到的前驱体1与溴素反应至水溶液刚刚变红，过滤水洗，得到前躯体2；
S4、向步骤S3得到的前驱体2中加入400mL水和20g对氨基苯甲脒盐酸盐，调节pH至9，升温80℃反应8h，降温至30℃、过滤、乙醇提取、水洗、甩干，即得。
2.一种根据权利要求1所述的制备方法制备的尿激酶吸附剂。
3.一种从人尿中直接吸附尿激酶的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的制备方法制备的尿激酶吸附剂进行吸附。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将尿激酶吸附剂悬液注入带滤网的吸附柱，打开吸附柱的出水口，水流出吸附柱，尿激酶吸附剂形成吸附柱床；
(2)将步骤(1)得到的吸附柱放置于小便池/斗中，吸附人尿中的尿激酶，取回吸附柱床；
(3)将步骤(2)取回的吸附床柱用纯化水清洗，取出吸附剂；
(4)向步骤(3)得到的吸附剂加入平衡缓冲液，制成悬混液；
(5)将步骤(4)得到的悬混液装入层析柱，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集到的洗脱液，即为尿激酶粗品溶液；
(6)将步骤(5)洗脱结束后的层析柱用再生缓冲液清洗，用纯化水冲洗至中性，取出尿激酶吸附剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述尿激酶吸附剂悬液中尿激酶吸附剂的质量分数为48-55％；
步骤(4)中所述平衡缓冲液：pH 6.4-7.8，含0.15-0.65M NaCl的0.05-0.15M的Tris-HCl缓冲液；
步骤(5)中所述洗脱缓冲液：pH2.0-3.0，0.05M-0.15M甘氨酸缓冲液；
步骤(6)中所述再生缓冲液为含0.1-0.2M醋酸的体积百分数为10-30％的乙醇水溶液。
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