CN111185141A - 一种提取尿蛋白的改性硅胶的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提取尿蛋白的改性硅胶的制备方法及应用。本发明将硅胶改性为氨基聚苯乙烯键合硅胶，利用改性硅胶可以直接吸附尿液中尿激酶和人尿激肽原酶等尿蛋白，再根据不同尿蛋白不同等电点的性质，采用不同洗脱条件将其依次洗脱，最终可实现尿蛋白的有效吸附，不同尿蛋白的分离富集。本发明硅胶利用率高，吸附分离效果好，对环境污染小，无需收集尿液，不用改造小便池，使用方便，成本更低，适用于大规模工业生产。

Description

一种提取尿蛋白的改性硅胶的制备方法及应用
技术领域
本发明属于蛋白质的提取纯化技术领域，具体涉及一种提取尿蛋白的改性硅胶的制备方法及应用。
背景技术
男性尿液中含有尿激酶、和人尿激肽原酶等尿蛋白，这些尿蛋白经回收加工后可制备成相应的原料药及制剂。尿激酶适用于各种血栓病及心肌梗死等疾病的临床治疗，也用于人工心瓣手术后预防血栓形成，保持血管插管和胸腔及心包腔引流管的通畅等；人尿激肽原酶适用于高血压、微循环障碍、外周和脑血管阻塞等疾病的治疗。由此可见，这些尿蛋白具有较高的药用及经济价值，因此，有必要对其进行回收利用。但是传统尿蛋白的回收及分离操作较复杂，传统回收方法为先将尿液收集汇总后进行吸附提取或沉淀操作，且存在环境污染、收集效率低及加工成本高等缺点，使得其无法得到广泛推广。
由此可见，提供一种环境污染小、收集效率高及加工成本低的尿蛋白提取的方法成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
有鉴于现有技术中的问题，本发明提供了一种提取尿蛋白的改性硅胶的制备方法，所述改性硅胶为氨基聚苯乙烯键合硅胶，所述改性硅胶的制备方法具体为：
(1)将硅胶与硝酸反应后，再与浓盐酸反应，将产物经洗涤干燥后得活化硅胶；
(2)将所述活化硅胶、乙烯基三乙氧基硅烷及重熏甲苯加至三口瓶中，通惰性气体保护，再通氨气反应，将产物经提纯干燥后得前驱体I；
(3)将所述前驱体I、苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、纯化水、无水乙醇依次加入至四口烧瓶中，通惰性气体保护，搅拌后升温至65-70℃进行反应，将产物经提纯干燥后得前驱体II；
(4)将所述前驱体II、浓硝酸依次加入至三口瓶中，15℃以下搅拌滴加浓硫酸，滴加完后升温至30-35℃进行反应，将产物经洗涤干燥后得前驱体III；
(5)往三口瓶中加入浓盐酸，升温至55-60℃，加入锡粒反应后，加入所述前驱体III，继续升温至90-100℃进行反应，将产物洗涤干燥后得所述氨基聚苯乙烯键合硅胶。
优选的，所述将产物经洗涤干燥后得活化硅胶，具体为：
将所述产物洗涤至无氯离子后，在120-150℃下干燥，得所述活化硅胶。
优选的，所述将产物经提纯干燥后得前驱体I，具体为：
将所述产物进行抽滤、乙醇洗涤后，用无水乙醇进行抽提，然后进行真空干燥，得所述前驱体I。
优选的，所述将产物经提纯干燥后得前驱体II，具体为：
将所述产物经甲苯反复煮沸、热抽滤后再用甲苯、无水乙醇先后进行抽提，然后进行真空干燥，得所述前驱体II。
优选的，所述将产物经洗涤干燥后得前驱体III，具体为：
将所述产物用纯化水洗至中性，然后进行真空干燥，得所述前驱体III。
优选的，所述将产物洗涤干燥后得所述氨基聚苯乙烯键合硅胶，具体为：
将所述产物依次用纯化水、10％氢氧化钠溶液、纯化水洗涤至中性，再用无水乙醇脱水，进行真空干燥，得所述氨基聚苯乙烯键合硅胶。
相应的，本发明还提出一种利用所述改性硅胶提取尿蛋白的方法，包括：
将所述改性硅胶与尿液接触后，吸附尿蛋白；
将所述尿蛋白从吸附后的改性硅胶上洗脱收集。
优选的，所述将所述尿蛋白从吸附后的改性硅胶上洗脱收集，具体步骤为：
(1)将所述吸附后的改性硅胶装至层析柱后连接至层析系统，用纯化水冲洗；
(2)用含有0.1M氯化钠的0.1M磷酸缓冲液洗脱，收集洗脱流出液，得第一收集液；所述第一收集液为含有尿激肽原酶的溶液；
(3)用含有0.2M氯化钠的0.1M TRIS-HCL缓冲液洗脱，收集洗脱流出液，得第二收集液；所述第二收集液为含有尿激酶的溶液。
优选的，所述收集洗脱流出液，还包括：检测所述洗脱流出液在280nm处吸光值A280，当所述吸光值不再下降，停止收集。
优选的，所述第一收集液和第二收集液分别加入乙醇进行沉淀，收集沉淀后进行真空干燥，分别得到尿激肽原酶和尿激酶的粗制品。
本发明自制的改性硅胶为氨基聚苯乙烯键合硅胶，与现有技术相比，硅胶利用率更高，吸附效果更好，对环境污染更小，成本更低。可以将所述改性硅胶装至滤布袋中后放置在卫生间的便斗或者便池中，直接吸附尿液中的尿蛋白，不需要收集大体积尿液，也不用改造小便池，使用方便，成本低。收集吸附后的改性硅胶，运至加工点后，根据不同尿蛋白不同等电点的性质，采用不同洗脱条件将不同尿蛋白产品洗脱分离，将尿蛋白从改性硅胶上洗脱收集，最终实现了不同尿蛋白的分离富集，简化了尿蛋白的提取工序和工作量，分离效果好，适用于大规模工业生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的氨基聚苯乙烯键合硅胶制备方法流程示意图；
图2为本发明实施例提供的利用氨基聚苯乙烯键合硅胶提取尿蛋白流程示意图；
图3为本发明实施例提供的对吸附尿蛋白后的氨基聚苯乙烯键合硅胶进行洗脱处理的流程示意图。
具体实施方式
为了解决背景技术中的问题，本发明提供了一种提取尿蛋白的改性硅胶的制备方法，所述改性硅胶为氨基聚苯乙烯键合硅胶。通过制得的改性硅胶，直接吸附尿液中的尿蛋白，硅胶利用率更高，吸附效果更好，使用方便，便于尿蛋白的收集与提取。下面将结合本发明实施例与实施例中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1所示，本发明提供了一种提取尿蛋白的改性硅胶的制备方法，所述改性硅胶为氨基聚苯乙烯键合硅胶，所述改性硅胶的制备方法具体为：
步骤101：将硅胶与硝酸反应后，再与浓盐酸反应，将产物经洗涤干燥后得活化硅胶。
其中，结合具体实施场景，所述产物的洗涤干燥可以为：产物洗涤至无氯离子后，在120-150℃下干燥。
步骤102：将所述活化硅胶、乙烯基三乙氧基硅烷及重熏甲苯加至三口瓶中，通惰性气体保护，再通氨气反应，将产物经提纯干燥后得前驱体I(乙烯基乙氧基硅键合联硅胶)。
步骤103：将所述前驱体I、苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、纯化水、无水乙醇依次加入至四口烧瓶中，通惰性气体保护，搅拌后升温至65-70℃进行反应，将产物经提纯干燥后得前驱体II(聚苯乙烯键合硅胶)。
步骤104：将所述前驱体II、浓硝酸依次加入至三口瓶中，15℃以下搅拌滴加浓硫酸，滴加完后升温至30-35℃进行反应，将产物经洗涤干燥后得前驱体III(硝基聚苯乙烯键合硅胶)。
步骤105：往三口瓶中加入浓盐酸，升温至55-60℃，加入锡粒反应后，加入所述前驱体III，继续升温至90-100℃进行反应，将产物洗涤干燥后得所述氨基聚苯乙烯键合硅胶。
其中，结合具体实施场景，所述惰性气体可以为氩气等惰性气体；干燥方式可以为真空干燥。
实施例2
在具体实施场景中，提取尿蛋白的氨基聚苯乙烯键合硅胶，可以通过以下方法制得：
步骤201：硅胶加1:1(V/V)的硝酸回流6-8h，待硅胶沉降后，弃去上层硝酸废液，加入浓盐酸，回流6-8小时，洗涤至无氯离子，120-150℃干燥，得活化硅胶。
步骤202：将步骤201的活化硅胶50g、50ml乙烯基三乙氧基硅烷及20ml重熏甲苯加至三口瓶中，通氩气30min后，再通氨气，并同时搅拌，室温反应12-14小时。产物经抽滤，乙醇洗涤若干次后，转入索氏提取器中用无水乙醇抽提10小时，然后在40-50℃真空干燥，得前驱体I(乙烯基乙氧基硅键合联硅胶)。
步骤203：将50g前驱体I、50ml苯乙烯、0.9g聚乙烯吡咯烷酮、50ml纯化水、200ml无水乙醇依次加入至四口烧瓶中，通氩气保护，搅拌3h后，升温至65-70℃，反应6-8小时。产物经甲苯反复煮沸、热抽滤后再用甲苯、无水乙醇先后抽提2h，然后在40-50℃真空干燥。得前驱体II(聚苯乙烯键合硅胶)。
步骤204：将10g前驱体II、80ml浓硝酸依次加入至三口瓶中，15℃以下搅拌滴加浓硫酸50ml。滴加完后升温至30-35℃，反应10-12h。产物用纯化水洗至中性，然后在70-80℃真空干燥，得前驱体III(硝基聚苯乙烯键合硅胶)。
步骤205：往三口瓶中加入100ml浓盐酸，升温至55-60℃，加入20g锡粒，反应5-10min后加入5g前驱体III，继续升温至90-100℃，反应20-24h。将产物依次用纯化水、10％氢氧化钠溶液、纯化水洗涤至中性，再用无水乙醇脱水，30-35℃真空干燥，得氨基聚苯乙烯键合硅胶。
实施例3
如图2所示,本发明提供了一种利用氨基聚苯乙烯键合硅胶提取尿蛋白的方法，包括：
步骤301：将氨基聚苯乙烯键合硅胶与尿液接触后，吸附尿蛋白。
步骤302：将所述尿蛋白从吸附后的改性硅胶上洗脱收集。
其中，结合具体实施场景,可以将氨基聚苯乙烯键合硅胶装至棉纱布缝制的布袋中，布袋封口后放置在小便池或小便斗中，与尿液接触后，吸附尿蛋白；可以早上放置，晚上收回，对吸附后的改性硅胶进行洗脱处理。
实施例4
如图3所示，本发明提供了一种利用氨基聚苯乙烯键合硅胶提取尿蛋白的方法，在具体实施场景中，对吸附尿蛋白后的改性硅胶(氨基聚苯乙烯键合硅胶)进行洗脱处理，处理操作可以包括以下步骤：
步骤401：将吸附尿蛋白后的改性硅胶装至层析柱后连接至层析系统，用纯化水冲洗3-5柱体积。
步骤402：再用含有0.1M氯化钠的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0-7.5)洗脱3-5柱体积，收集洗脱流出液，检测流出液在280nm处吸光值A280，至吸光值A280不再下降，停止收集，此第一收集液为含有尿激肽原酶的溶液。
步骤403：再用含有0.2M氯化钠的0.1M TRIS-HCL缓冲液(pH10.0-10.5)洗脱3-5柱体积，收集洗脱流出液，检测流出液在280nm处吸光值A280，至吸光值A280不再下降，停止收集，此第二收集液为含有尿激酶的溶液。
步骤404：第一收集液与第二收集液分别加入乙醇进行沉淀，收集沉淀后进行真空干燥，分别得到尿激肽原酶、尿激酶的粗制品。
本发明自制的改性硅胶为氨基聚苯乙烯键合硅胶，与现有技术相比，硅胶利用率更高，吸附效果更好，对环境污染更小，成本更低。可以将所述改性硅胶装至滤布袋中后放置在卫生间的便斗或者便池中，直接吸附尿液中的尿蛋白，不需要收集大体积尿液，也不用改造小便池，使用方便。收集吸附后的改性硅胶，运至加工点后，根据不同尿蛋白不同等电点的性质，采用不同洗脱条件将不同尿蛋白产品洗脱分离，将尿蛋白从改性硅胶上洗脱收集，最终实现了不同尿蛋白的分离富集，简化了尿蛋白的提取工序和工作量，分离效果好，适用于大规模工业生产。
上述实施例的具体实施场景仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。上述序号仅仅为了描述，不代表实施场景的优劣。任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中，文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范作用。如非另行定义，文中所用的所有专业和科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。
以上公开的仅为本发明实施例的具体实施场景，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种提取尿蛋白的改性硅胶的制备方法，其特征在于，所述改性硅胶为氨基聚苯乙烯键合硅胶，所述改性硅胶的制备方法具体为：
(1)将硅胶与硝酸反应后，再与浓盐酸反应，将产物经洗涤干燥后得活化硅胶；
(2)将所述活化硅胶、乙烯基三乙氧基硅烷及重熏甲苯加至三口瓶中，通惰性气体保护，再通氨气反应，将产物经提纯干燥后得前驱体I；
(3)将所述前驱体I、苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、纯化水、无水乙醇依次加入至四口烧瓶中，通惰性气体保护，搅拌后升温至65-70℃进行反应，将产物经提纯干燥后得前驱体II；
(4)将所述前驱体II、浓硝酸依次加入至三口瓶中，15℃以下搅拌滴加浓硫酸，滴加完后升温至30-35℃进行反应，将产物经洗涤干燥后得前驱体III；
(5)往三口瓶中加入浓盐酸，升温至55-60℃，加入锡粒反应后，加入所述前驱体III，继续升温至90-100℃进行反应，将产物洗涤干燥后得所述氨基聚苯乙烯键合硅胶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将产物经洗涤干燥后得活化硅胶，具体为：
将所述产物洗涤至无氯离子后，在120-150℃下干燥，得所述活化硅胶。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将产物经提纯干燥后得前驱体I，具体为：
将所述产物进行抽滤、乙醇洗涤后，用无水乙醇进行抽提，然后进行真空干燥，得所述前驱体I。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将产物经提纯干燥后得前驱体II，具体为：
将所述产物经甲苯反复煮沸、热抽滤后再用甲苯、无水乙醇先后进行抽提，然后进行真空干燥，得所述前驱体II。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将产物经洗涤干燥后得前驱体III，具体为：
将所述产物用纯化水洗至中性，然后进行真空干燥，得所述前驱体III。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将产物洗涤干燥后得所述氨基聚苯乙烯键合硅胶，具体为：
将所述产物依次用纯化水、10％氢氧化钠溶液、纯化水洗涤至中性，再用无水乙醇脱水，进行真空干燥，得所述氨基聚苯乙烯键合硅胶。
7.一种利用权利要求1-6制备的改性硅胶提取尿蛋白的方法，其特征在于，
将所述改性硅胶与尿液接触后，吸附尿蛋白；
将所述尿蛋白从吸附后的改性硅胶上洗脱收集。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述将所述尿蛋白从吸附后的改性硅胶上洗脱收集，具体步骤为：
(1)将所述吸附后的改性硅胶装至层析柱后连接至层析系统，用纯化水冲洗；
(2)用含有0.1M氯化钠的0.1M磷酸缓冲液洗脱，收集洗脱流出液，得第一收集液；所述第一收集液为含有尿激肽原酶的溶液；
(3)用含有0.2M氯化钠的0.1M TRIS-HCL缓冲液洗脱，收集洗脱流出液，得第二收集液；所述第二收集液为含有尿激酶的溶液。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述收集洗脱流出液，还包括：检测所述洗脱流出液在280nm处吸光值A280，当所述吸光值不再下降，停止收集。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一收集液和第二收集液分别加入乙醇进行沉淀，收集沉淀后进行真空干燥，分别得到尿激肽原酶和尿激酶的粗制品。
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