CN102614528A - 用于体内递送多核苷酸的多缀合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于向哺乳动物细胞递送多核苷酸或其他细胞不透性分子的化合物、组合物和方法。描述了多缀合物系统，其向小的生物相容的体内递送载体中掺入寻靶、抗调理作用、抗聚集和转染活性。连接组分部分的多个可逆连接的使用提供了生理学应答活性调节。

Description

用于体内递送多核苷酸的多缀合物

本申请是申请日为2007年8月17日、发明名称为“用于体内递送多核苷酸的多缀合物”的中国专利申请200780029802.3(国际申请号PCT/US2007/076202)的分案申请。

相关申请的交叉参考

本申请要求2006年8月18日提交的美国临时申请号60/822,833和2007年5月3日提及的美国临时申请号60/915,868的优先权。

发明背景

多核苷酸和其他膜不透性化合物向活细胞的递送受到细胞的复杂的膜系统的高度限制。用于反义和基因治疗的药物是相对较大的亲水聚合物并且通常也是带大量负电荷的。这两种物理特征阻碍了它们经细胞膜的直接扩散。为此原因，多核苷酸递送的主要障碍是多核苷酸向细胞内部的递送。已经开发了多种转染试剂在体外将多核苷酸递送到细胞。然而，在体外有效的转染试剂的毒性、血清相互作用和弱的寻靶作用使得多核苷酸的体内递送复杂化。在体外良好运行的转染试剂、阳离子聚合物和脂类通常去稳定化细胞膜并形成大的颗粒。转染试剂的阳离子电荷促进了核酸结合以及细胞结合。膜的去稳定化促进了膜不透性多核苷酸经细胞膜的递送。这些性质使得转染试剂在体内无效或有毒性。阳离子电荷导致与血清组分的相互作用，其引起多核苷酸-转染试剂相互作用的去稳定化和弱的生物利用度和寻靶作用。阳离子电荷也可以导致体内毒性。在体外有效的转染试剂的膜活性通常导致体内毒性。

对于体内递送，转染复合体(与待递送的核酸结合的转染试剂)应该是小的，直径小于100nm，并且优选小于50nm。甚至小于20nm或小于10nm的更小的复合体将是更有效的。大于100nm的转染复合体在体内基本上不能接近除了血管细胞之外的细胞。体外复合体也是带正电荷的。该正电荷对于复合体与细胞的附着和膜融合、去稳定化或破坏是必须的。体内转染复合体上的阳离子电荷导致不利的血清相互作用并且因此导致弱的生物利用度。接近中性或负电荷的复合体将具有更好的体内分布和寻靶能力。然而，体外转染复合体通过电荷-电荷(静电)相互作用与核酸结合。带负电荷的聚合物和脂类不与带负电荷的核酸相互作用。此外，这些静电复合体当暴露于生理盐浓度或血清组分时倾向于聚集或瓦解。最后，在体外有效的转染复合体通常在体内是有毒的。用于转染的聚合物和脂类破坏或去稳定化细胞膜。用核酸递送平衡该活性在体外比在体内更容易达到。

尽管一些研究小组已经在改善体内基因向细胞的递送方面取得了不断的进步，但是仍然需要将多核苷酸与递送剂一起有效递送到靶细胞而没有与体内施用转染试剂相关的毒性的制剂。本发明使用生物学不稳定的缀合物递送系统提供了将多核苷酸递送到细胞并释放的组合物和方法。

发明概述

在优选的实施方案中，本发明描述了用于在体内将多核苷酸递送到细胞的组合物，其包含与多核苷酸可逆地缀合的可逆掩蔽的膜活性聚合物。聚合物通过一个或多个第一种可逆共价连接连接到一种或多种掩蔽剂并且通过一个或多个第二种可逆共价连接进一步连接到一种或多种多核苷酸。第一种和第二种可逆共价连接可以包含在相同或相似的条件下被切割的可逆键或者它们可以在不同的条件下被切割，即它们可以包含正交(orthogonal)可逆键。对哺乳动物施用可药用载体或稀释剂中的多核苷酸-聚合物缀合物。

在优选实施方案中，公开了膜活性聚合物，其包含：聚乙烯醚随机共聚物。可以从两种、三种或多种不同的单体合成聚乙烯醚共聚物。单体可以选自：受保护的氨基乙烯醚，如含有苯二甲酰亚氨基的乙烯醚、丁基乙烯醚、十二烷基乙烯醚、十八烷基乙烯醚。优选的聚乙烯醚随机共聚物包含三种单体：含有胺的单体、丁基乙烯醚和十八烷基乙烯醚。

在优选实施方案中，膜活性聚合物的一种或多种生物物理学特征通过掩蔽剂可逆地屏蔽或修饰。掩蔽剂可以选自位阻稳定剂、寻靶基团(targeting groups)和电荷修饰剂。掩蔽剂可以通过抑制聚合物与血清组分或非靶细胞的非特异性相互作用而改善聚合物-多核苷酸的生物分布或寻靶作用。掩蔽剂也可以减少聚合物或聚合物-多核苷酸缀合物的聚集。含有寻靶基团的掩蔽剂可以通过将缀合物系统靶向细胞表面受体而增强细胞特异性寻靶作用或细胞内化。在聚合物缀合到多核苷酸之前或之后，可以将掩蔽剂缀合到膜活性聚合物。

在优选实施方案中，使用所述的缀合物系统可以被递送到细胞的多核苷酸可以选自：DNA、RNA、封闭性多核苷酸、反义寡核苷酸、质粒、表达载体、寡核苷酸、siRNA、微RNA、mRNA、shRNA和核酶。

在优选实施方案中，掩蔽剂和多核苷酸通过可逆连接共价连接到膜活性聚合物。尽管聚合物的掩蔽和多核苷酸与聚合物的连接是重要的，但是这些连接可以干扰聚合物的转染活性或多核苷酸的活性。通过经由可逆连接将掩蔽剂和多核苷酸连接到聚合物，所述可逆连接在合适的时间被切割，聚合物恢复活性并且多核苷酸被释放。可逆的共价连接含有可逆的或不稳定的键，其可以选自：生理学不稳定的键、细胞生理学不稳定的键、pH不稳定键、非常pH不稳定键、极端pH不稳定键、酶可切割的键和二硫键。将聚合物连接到多核苷酸和掩蔽剂的两种可逆连接的存在提供了多核苷酸与递送聚合物的共同递送和掩蔽剂对递送聚合物的选择性寻靶作用和失活。连接的可逆性提供了多核苷酸从膜活性聚合物的释放和膜活性聚合物的选择性活化。

在优选实施方案中，我们描述了一种组合物，其包含：递送聚合物，其：a)通过一种或多种可逆连接共价连接到一种或多种寻靶基团、位阻稳定剂或电荷修饰剂；和b)通过一种或多种可逆连接共价连接到一种或多种多核苷酸。在一个实施方案中，寻靶作用剂、位阻稳定剂或电荷修饰剂的可逆共价连接与多核苷酸可逆共价连接是正交的。

在优选实施方案中，我们描述了聚合物缀合系统，其用于将多核苷酸递送到细胞并将该多核苷酸释放到细胞中，所述聚合物缀合系统包含：可逆地缀合到膜活性聚合物的多核苷酸，所述膜活性聚合物自身可逆地缀合到掩蔽剂。缀合键可以是相同的或者它们可以是不同的。此外，缀合键可以在相同或不同条件下被切割。

在优选实施方案中，我们描述了聚合物缀合系统，其用于将膜不透性分子递送到细胞并在细胞中释放分子。聚合物缀合系统包含可逆地连接到膜活性聚合物的膜不透性分子，其中多种掩蔽剂通过可逆的共价键连接到膜活性聚合物。膜活性聚合物当在体内应用时可以是无毒的或者可以不是被靶定的。掩蔽剂的可逆连接可逆地抑制或改变了聚合物的膜相互作用、血清相互作用、细胞相互作用、毒性或电荷。优选的可逆共价键包含：不稳定键、生理学不稳定键或在哺乳动物细胞内条件下可被切割的键。优选的不稳定键包含pH不稳定键。优选的pH不稳定键包含马来酰胺酸键。另一优选的不稳定键包含二硫键。膜不透性分子包括但不限于：多核苷酸、蛋白质、抗体和膜不透性药物。

在优选实施方案中，在过量聚合物存在下将多核苷酸连接到聚合物。过量聚合物可以有助于多核苷酸-聚合物缀合物的配制。过量聚合物可以在缀合物配制期间减少缀合物的聚集。可以在将缀合物施用于细胞或生物前将多核苷酸-聚合物缀合物与过量聚合物分离。备选地，多核苷酸-聚合物缀合物可以与过量聚合物共同施用于细胞或生物。过量聚合物可以与所述聚合物是相同的或者它可以是不同的。

在优选实施方案中，本发明的聚合物缀合物可以用于体外递送多核苷酸或其他膜不透性分子。对于体外递送，聚合物的可逆掩蔽增强了一些否则无效的多胺如聚赖氨酸的转染活性。可逆掩蔽也可以通过减小其他膜活性聚合物的毒性或将它们的膜破坏性特征限制于内体而增强所述其他膜活性聚合物的效用。

在优选实施方案中，我们描述了用于在体内将多核苷酸递送到细胞的系统，其包含：将寻靶基团共价连接到多核苷酸，将第二种寻靶基团共价连接到膜活性聚合物，并将多核苷酸和膜活性聚合物注射到生物中。

当结合附图考虑时，本发明的其他目的、特征和优点根据下面的详细描述将是显而易见的。

附图简述

图1.聚乙烯醚聚合物聚合的反应方案。

图2.阐明本发明的掩蔽剂的几种实施方案的附图。

图3.简图，图解了多核苷酸-聚合物可逆缀合物和通过马来酰胺

酸对缀合物的可逆掩蔽。

图4.显微照片，显示了用A)CDM-PEG(左)或B)CDM-PEG加CDM-Pip-LBA掩蔽的PBAVE聚合物的肝脏肝细胞的定向递送。

图5.显微照片，显示了在体内掩蔽的多核苷酸-聚合物缀合物向肝细胞的递送。

图6.曲线图，图解了ppara siRNA的多缀合物介导的递送后体内靶基因降低(knockdown)。

图7.显微照片，显示了用(A)DNA-DW1360-CDM-PEG/NAG，(B)DNA+DW1360-CDM-PEG/NAG(未缀合到聚合物的多核苷酸)，(C)DNA-DW1360-CDM-PEG/葡萄糖，和(D)DNA-DW1360-CDM-PEG/

甘露糖在体内将ds DNA向肝脏的递送。Cy3-标记的DNA＝每个小图中的左上象限，

-488鬼笔环肽染色的肌动蛋白＝右上象限，细胞核＝左下象限，复合图＝右下象限。

图8.图和印迹，图解了静脉内注射siRNA多缀合物后小鼠的肝脏中靶基因表达的降低。(A)用apoB siRNA多缀合物处理后肝脏中apoBmRNA水平的降低。(B)apoB siRNA多缀合物处理的小鼠中apoB-100蛋白的血清水平。(C)静脉内注射ppara siRNA多缀合物后肝脏中pparamRNA水平的降低。

图9.图表，图解了apoB-1siRNA多缀合物剂量反应。(A)注射apoB-1siRNA多缀合物的连续稀释液后apoB mRNA的降低。(B)注射不同量的siRNA后apoB mRNA的降低。

图10.图表，图解了apoB-1siRNA多缀合物处理的小鼠中胆固醇水平。

图11.显微照片，显示了(A)ApoB siRNA或(B)GL3阴性对照siRNA，或(C)仅盐水的多缀合物递送后小鼠肝脏中的脂类积累。

图12.图表，图解了在第0天在小鼠中施用apoB-1siRNA缀合物后第2-15天，基因表达的抑制(A)和引起的血清胆固醇的降低(B)。

图13.显微照片，显示了通过施用可逆地缀合到DW1360并用CDM-PEG和CDM-NAG掩蔽的抗体，体内递送抗体到肝细胞。左上象限显示了经标记的抗体，右上象限显示了肌动蛋白，左下象限显示了细胞核，右下象限显示了复合图。

图14.图表，其图解了在用商业体外转染试剂或用不同量的ApoBsiRNA多缀合物递送的ApoB siRNA转染的原代肝细胞中的基因降低。

图15.图表，图解了在体外siRNA-缀合物对Hepa-1c1c7细胞的转染：仅仅缀合物＝掩蔽的siRNA-PLL。

图16.图表，图解了PBAVE存在下DPH的荧光。

图17.图表，图解了A)在Shodex SB-803柱上PEG标准品的洗脱图，B)Shodex SB-803柱的校准图，和C)PBAVE聚合物的分子量计算。

图18.图表，图解了A)Cy3标记的核酸标准品和掩蔽的多核苷酸-聚合物缀合物的洗脱图，B)Sephacryl S-500大小排阻层析的校准图，和C)掩蔽的多核苷酸-聚合物缀合物的分子量计算。

图19.显微照片，显示了使用寡核苷酸-聚合物-CDM/PEG/NAG缀合物(A，C)或寡核苷酸-聚合物-CDM/PEG/葡萄糖缀合物(B，D)，体内多核苷酸递送到小鼠半乳糖受体阳性肿瘤(A-B)或半乳糖受体阴性肿瘤(C-D)。

发明详述

本发明涉及可用于将多核苷酸或其他细胞不透性分子递送到哺乳动物细胞的化合物、组合物和方法。本文描述了用于在体内将多核苷酸或其他膜不透性分子递送到细胞的多缀合物(polyconjugate)系统。多缀合物系统将寻靶、抗调理作用、抗聚集和转染活性掺入到小的50纳米以下的递送载体。该系统的关键组分是连接组分部分的键的可逆性。

所述的体内多核苷酸递送缀合物的第一个组分包含该多核苷酸与膜活性聚合物的生理学上可逆的共价连接。多核苷酸与膜活性聚合物的共价连接确保了在血清存在下体内或离体(ex vivo)施用时，多核苷酸不容易与聚合物解离，从而提供了多核苷酸与膜活性聚合物向靶细胞的共同递送。然而，多核苷酸与聚合物的共价连接可以使得多核苷酸无活性。因此，通过生理学上可逆的连接或者键完成多核苷酸与膜活性聚合物的连接或键。通过使用生理学可逆的连接，多核苷酸可以从聚合物被切除，释放多核苷酸参与和细胞组分的功能性相互作用。通过选择合适的可逆连接，可能形成缀合物，其仅在其被递送到希望的位置，如细胞质后释放所述多核苷酸。

所述的体内多核苷酸递送缀合物的第二种组分包含膜活性聚合物的可逆修饰。膜活性聚合物的可逆修饰减小了非生产性血清和非靶细胞相互作用并且减小了毒性。掩蔽剂也可以为缀合物增加希望的功能，如增强靶细胞相互作用或增强缀合物的胞吞作用。通过掩蔽剂与聚合物经由生理学可逆的共价连接进行共价连接掩蔽聚合物。掩蔽剂可以是无菌的稳定剂、寻靶基团或电荷修饰剂。掩蔽剂可以掩蔽聚合物防止非特异性相互作用，延长循环时间，增强特异性相互作用，抑制毒性，或改变聚合物的电荷。这些修饰的每一种可以改变聚合物的膜活性，使得经修饰的聚合物不能促进多核苷酸的递送。因此，通过生理学可逆的连接完成掩蔽剂与膜活性聚合物的连接。通过使用生理学可逆的连接，掩蔽剂可以从聚合物被切除，从而暴露聚合物并恢复被暴露的聚合物的活性。通过选择合适的可逆连接，可能形成缀合物，其在已经被递送或靶向希望的细胞类型或细胞位置后恢复膜活性聚合物的活性。

本发明包括如下一般结构的缀合物递送系统：

N-L¹-P-(L²-M)_y，

其中N是多核苷酸或其他细胞不透性分子，L¹是可逆连接，P是聚合物，L²是第二种可逆连接，M是掩蔽剂。掩蔽剂M掩蔽或修饰P的性质或相互作用。y是大于0的整数。优选的聚合物是膜活性聚合物。另一优选的聚合物是转染聚合物。许多掩蔽剂可以连接到单个聚合物。所述许多掩蔽剂可以通过多个可逆连接连接到所述聚合物。当可逆连接L²切割时，聚合物P恢复被掩蔽的性质或相互作用。掩蔽剂M可以为聚合物P增加活性，如细胞受体结合。L¹的可逆键可以与L²的可逆键是相同或不同的(正交的)。选择可逆连接L¹或L²的可逆键使得在希望的生理条件下，如存在于希望的组织、器官和亚细胞位置中的生理条件下或应答药学上可接受的外源试剂的加入下发生切割。多核苷酸N和掩蔽剂M可以在沿着聚合物P的长度的任何位置处连接到聚合物P。

聚合物

聚合物是通过称作单体的较小单位重复键合形成的分子。聚合物可以是线性的、分枝网络状的、星形的、鸡冠状或梯形的。聚合物的主链由原子组成，所述原子的键是聚合物长度增长所需的。例如，在聚-L-赖氨酸中，羰基碳、α-碳和α-胺基是聚合物长度所需的并且因此是主链原子。聚合物的侧链由这样的原子组成，所述原子的键不是聚合物长度的增长所需的。

聚合物可以是均聚物，其中使用一种单体或者聚合物可以是共聚物，其中使用两种或多种不同的单体。共聚物可以是交替的、随机的(统计学的)、嵌段或接枝的(鸡冠状)。

交替聚合物含有确定的重复顺序的单体，如-[A-B]_n-。交替聚合物的单体通常不均聚化，而是一起反应产生交替共聚物。

随机共聚物中的单体沿着任何给定链没有确定顺序或排列，如：-A_nB_m-。此类聚合物的一般组成反映了输入单体的比例。然而，一种单体与另一种单体的精确比例可以在链之间不同。单体的分布可以沿着单一聚合物的长度不同。而且，单体的化学性质可以影响其掺入随机共聚物中的速率和它在聚合物内的分布。从而，尽管随机聚合物中单体的比例取决于单体的输入比例，但是输入比例可以不精确地匹配掺入的单体的比例。

嵌段聚合物具有一种聚合物(聚合物A)的一段或嵌段接着是第二种聚合物(聚合物B)的一段或嵌段：即-聚A-聚B-。结果是不同的聚合物链以从头至尾的构型连接。从而，嵌段聚合物是不同单体成分的嵌段的线性排列。通常(尽管不是必需的)，聚合物嵌段是均聚物，聚合物A由不同于聚合物B的单体组成。二嵌段共聚物是聚A-聚B，三嵌段共聚物是聚A-聚B-聚A。如果A是亲水基团并且B是疏水基团，那么所得的嵌段共聚物可以被认为是聚合的表面活性剂。接枝聚合物是一种类型的嵌段共聚物，其中一个单体的链被接枝到另一单体的侧链上，如(其中n、m、x、y和z是整数)：

单体

多种单体可以用于聚合过程中。单体可以是阳离子的、阴离子的、两性离子的、亲水的、疏水的、亲脂的、两亲的或两性的。单体自身可以是聚合物。单体可以含有化学基团，其可以在聚合之前或之后被修饰。此类单体可以具有选自如下的反应基：胺(伯、仲和叔胺)、酰胺、羧酸、酯、肼、酰肼、羟胺、烷基卤、醛和酮。优选地，可以在多核苷酸缀合后或在水性溶液中修饰反应基。

对于聚合作用领域的技术人员而言，有几类聚合作用方法。例如，聚合可以是链式或逐步聚合。

逐步聚合

在逐步聚合中，聚合以逐步方式发生。通过单体、寡聚体和聚合物之间的反应发生聚合物生长。不需要引发剂，因为自始至终发生相同的反应并且没有终止步骤，从而端基仍然是反应性的。随着官能团被消耗，聚合速率降低。

使用逐步聚合通过使用在相同的单体中具有两个反应基(A和B)的单体(杂双官能)可以产生聚合物，其中A包含反应基并且B包含A反应基(与A形成共价键的反应基)。A-B的聚合产生-[A-B]_n-。反应基A和B可以通过一个共价键或许多共价键连接，从而形成聚合物单体。使用逐步聚合通过使用均双官能单体使得A-A+B-B产生-[A-A-B-B]_n-，也可以产生聚合物。通常，这些反应可以涉及酰化或烷化。单体的两个反应基可以通过单个共价键或多个共价键连接。

如果反应基A是胺，那么B是胺反应基，其可以选自：异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰叠氮、N-羟基-琥珀酰亚胺、磺酰氯、醛(包括甲醛和戊二醛)、酮、环氧化物、碳酸酯、亚氨酸酯、用碳二亚胺活化的羧化物、烷基磷酸酯、芳基卤化物(二氟二硝基苯)、酐、酰基卤、对-硝基苯基酯、邻-硝基苯基酯、五氯代苯基酯、五氟代苯基酯、羰基咪唑、羰基吡啶

和羰基二甲基氨基吡啶

在其他术语中，当反应基A是胺时，那么B可以是酰化或烷化剂或氨基化剂。

如果反应基A是巯基(硫羟)，那么B是硫羟反应基，其可以选自：碘代乙酰基衍生物、马来酰亚胺、氮丙啶衍生物、丙烯酰衍生物、氟苯衍生物和二硫化物衍生物(如二吡啶二硫或5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)衍生物)。

如果反应基A是羧化物，那么反应基B是羧化物反应基，其可以选自：重氮基乙酸酯和胺，其中使用碳二亚胺。可以利用其他添加剂，如羰基二咪唑、二甲基氨基吡啶(DMAP)、N-羟基琥珀酰亚胺或醇，使用碳二亚胺和DMAP。

如果反应基A是羟基，那么反应基B是羟基反应基，其可以选自：环氧化物、环氧乙烷和活化的氨基甲酸酯、活化酯和烷基卤。

如果反应基A是醛或酮，那么反应基B是醛或酮反应基，其可以选自：肼、酰肼衍生物、胺(以形成席夫碱，其可以用或不用还原剂如NaCNBH₃还原)，和羟基化合物。

使用逐步聚合作用通过使用双官能单体和另一试剂可以产生聚合物，使得A-A加另一试剂产生-[A-A]_n-。

如果反应基A是巯基(硫羟基)，那么它可以通过氧化剂如碘(I₂)、高碘酸钠(NaIO₄)或氧(O₂)转化为二硫键。如果反应基A可以是胺，那么它可以通过与2-亚氨基硫醇盐(Traut试剂)反应转化为硫醇，其然后经历氧化和二硫键形成。也可以用二硫化物衍生物(如二吡啶二硫或TNB衍生物)催化二硫键形成。

任一上述实例中的反应基A或B也可以是光反应基，如芳基叠氮化物(包括卤代芳基叠氮化物)、重氮基、二苯甲酮、炔、或重氮甲烷(diazirine)衍生物。

胺、羟基、巯基或羧化物基团的反应产生化学键，其被描述为酰胺、脒、二硫化物、醚、酯、烯胺、亚胺、脲、异硫脲、异脲、磺酰胺、氨基甲酸酯、烷基胺键(仲胺)、和碳-氮单键，其中碳含有羟基、硫醚、二醇、腙、重氮基或砜。

链式聚合

通过向有限数目的增长链中连续加入单体单位发生聚合物的链式反应聚合增长。引发和增长机理是不同的并且通常存在链终止步骤。链式聚合反应可以是原子团的、阴离子或阳离子的。用于链式聚合的单体可以选自：乙烯基、乙烯醚、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺基团。也可以通过环打开聚合作用完成链式聚合。可以使用一些不同类型的自由基引发剂，包括但不限于：过氧化物、羟基过氧化物和偶氮化合物，如2，2’-偶氮二(脒基丙烷)二盐酸盐(AAP)。

转染活性

术语转染指多核苷酸或其他生物活性化合物从细胞外转移到细胞内，使得该多核苷酸或生物活性化合物是功能性的。用于在体外将多核苷酸递送到细胞的转染试剂的实例包括但不限于：脂质体、脂类、多胺、磷酸钙沉淀、组蛋白、聚氮丙啶和两性聚电解质复合物和这些的组合。许多体外转染试剂是阳离子的，其允许所述试剂与带负电荷的核酸通过静电相互作用结合或形成复合体。

膜活性聚合物

膜活性聚合物是两亲性聚合物，其能够对生物膜诱导一种或多种下面的效果：膜的改变或破坏，其允许膜不透性分子进入细胞或者穿过膜；膜中的孔形成；膜的裂开或者膜的破坏或溶解。如本文所用，膜或细胞膜包含脂双层。本发明的膜活性聚合物包括促进多核苷酸或其他膜不透性分子从细胞外向细胞内递送，并优选递送到细胞的细胞质的聚合物。膜的改变或破坏可以通过聚合物或化合物在至少一种下面的测定法中的活性进行功能定义：红细胞裂解(溶血)、脂质体渗漏、脂质体融合、细胞融合、细胞裂解和内体释放。可以引起细胞膜裂解的膜活性聚合物也被称作膜裂解聚合物。可以引起内体或溶酶体破坏的膜活性聚合物被认为是内体裂解性的。膜活性聚合物对细胞膜的效果可以是暂时的。聚合物的膜活性来自其对膜的亲和力，其引起双层结构的变性或变形。膜活性聚合物可以是合成的或非天然的两亲性聚合物。膜活性聚合物可以具有体外转染活性。膜活性聚合物可以是阳离子的、阴离子的、两亲的、两性的、表面活性的或这些的组合。

多核苷酸或其他膜不透性分子向细胞的递送通过膜活性聚合物介导，膜活性聚合物破坏或去稳定化质膜或内部小泡膜(如内体或溶酶体)，包括在膜中形成孔，或者破坏内体或溶酶体功能。

如本文所用，膜活性聚合物与称作细胞渗透性肽的一类聚合物或如下化合物代表的聚合物不同：如来自HIV TAT蛋白的富含精氨酸的肽、触角肽(antennapedia peptide)、VP22肽、transportan、富含精氨酸的人工肽、小的富含胍的人工聚合物，等等。尽管细胞渗透性化合物似乎运输一些分子穿过膜，从脂双层的一侧到达脂双层的另一侧，明显不需要内吞作用并且不需要破坏膜的完整性，但是它们的机理没有被理解并且其自身活性存在争论。

内体裂解性聚合物

内体裂解性聚合物(Endosomolytic polymers)是这样的聚合物，其应答pH的改变能够引起内体的破坏或裂解或者提供正常的膜不透性化合物如多核苷酸或蛋白质从细胞内部膜封闭的小泡如内体或溶酶体逃逸。内体释放对于被内吞但是不能通过细胞膜扩散的多种分子的递送是重要的。内体裂解性聚合物在生理学相关的pH范围内(通常pH 5.5-8)经历它们的理化性质的改变。该改变可以是聚合物溶解性、与其他化合物相互作用的能力的改变，和疏水性或亲水性的改变。示例性内体裂解性聚合物可以具有pH可滴定的基团或pH不稳定的基团或键。如本文所用，pH可滴定的基团在水中作为生理条件(即4-8的pH范围)下pH的函数可逆地接受或供给质子。pH可滴定的基团具有在4-8的范围内的pK_a并且作为该pH范围内的缓冲剂。从而，pH可滴定的基团在内体的较低pH环境中获得或丧失电荷。通过进行酸碱滴定可以通过实验确定生理pH下可滴定的基团并且通过实验确定该基团在4-8的pH范围内是否可以缓冲。在该pH范围内可以显示出缓冲的基团的实例包括但不限于：羧酸、咪唑、N-取代的咪唑、吡啶、酚和多胺。具有pH可滴定的基团的聚合物可以通过所称作的质子海绵效应破坏内部小泡。可逆掩蔽的膜活性聚合物(其中掩蔽剂通过pH不稳定的键连接到聚合物)因此可以被认为是内体裂解性聚合物。

一个亚组的内体裂解性化合物是融合化合物，包括融合肽。融合肽可以促进试剂如寡聚化合物向细胞质的内体释放。认为融合肽在酸性pH下改变构象，有效稳定内体膜，从而增强内体内含物的细胞质递送。示例性融合肽包括来自衍生自多黏菌素B的肽、流感HA2、GALA、KALA、EALA、蜂毒肽和蜂毒肽衍生肽、阿尔茨海默氏β-淀粉状蛋白肽等等。

两性聚电解质

两性聚电解质是含有阴离子和阳离子单体单位的聚合物。更具体地，如本文所用，两性聚电解质含有许多阴离子单体和许多阳离子单位。两性聚电解质聚合物可以任选含有非离子单体单位。在水溶液中，两性聚电解质在接近它们的等电点处沉淀。通过聚合阴离子和阳离子单体，包括聚合物单体，可以形成两性聚电解质。备选地，通过修饰聚合物上的一个但不是所有带电基团，可以形成两性聚电解质。如果带电基团被可逆地修饰，那么形成可逆的两性聚电解质。

两亲性

两亲性或两亲型聚合物是本领域中公知和公认的并且具有亲水(极性，水溶性)和疏水性(非极性，亲脂性，水不溶的)基团或部分。亲水性基团在定性术语中表明化学部分是水优选的。通常，此类化学基团是水可溶的，并且与水是氢键供体或接纳体。亲水基团是带电或不带电的。带电基团可以是带正电荷(阴离子)或负电荷的(阳离子)或两者。两亲性化合物可以是聚阴离子、聚阳离子、两性离子或两性聚电解质。亲水基团的实例包括具有下列化学部分的化合物：糖类、聚氧乙烯、某些肽、寡核苷酸和含有胺、酰胺、烷氧基酰胺、羧酸、硫或者羟基的基团。疏水基团以定性术语表明化学部分是避水的。通常，此类化学基团不是水溶性的，并且不倾向于形成氢键。亲脂基团在脂肪、油、脂类、和非极性溶剂中溶解并且形成氢键的能力很低或无能力。烃(含有2个或更多的碳原子)、某些取代烃、胆固醇、胆固醇衍生物和某些肽是疏水基团的实例。如本文所用，关于两亲性聚合物，将部分定义为当一个共价键断裂并被氢置换时得到的分子。例如，在丁胺中，碳和氮键之间的断裂，以及氢的置换，得到氨(亲水性的)和丁烷(疏水性的)。然而，如果1，4-二氨基丁烷在氮-碳键处被切割，并用氢置换，那么所得的分子再次是氨(2×)和丁烷。然而，因为疏水部分的形成需要两个键的断裂，所以不认为1，4-二氨基丁烷是两亲性的。

天然存在的聚合物是可以在自然中发现的聚合物。实例包括多核苷酸、蛋白质、胶原、和多糖(淀粉、纤维素、糖胺聚糖、壳多糖、琼脂、琼脂糖)。天然聚合物可以从生物来源分离或者它可以是合成的。合成的聚合物通过“人”的化学方法配制或制造，并且不是通过天然存在的生物过程产生的。非天然聚合物是合成的聚合物，其不是从天然存在(动物或植物)的物质或单体(如：氨基酸、核苷酸和糖)制备的。聚合物可以是完全或部分天然的、合成的或者非天然的。

聚合物可以具有一个或多个不稳定的或可切割的键。如果不稳定键在生理条件或者细胞生理调节下是可切割的，那么聚合物是生物可降解的。可切割的键可以在主链中或者在侧链中。如果可切割的键发生在主链中，那么键的切割导致聚合物长度的减小和两个或多个分子的形成。例如，较小的聚乙烯醚聚合物可以通过不稳定键连接而形成大的聚乙烯醚聚合物。如果可切割键发生在侧链中，那么键的切割导致从聚合物失去侧链原子。

本文公开了一类两亲性聚乙烯随机共聚物。聚乙烯共聚物可以从两种、三种或更多种不同的单体合成。优选的单体可以选择如下列表：带电的乙烯醚、含有受保护的离子基团的乙烯醚、邻苯二甲酰亚胺保护的胺乙烯醚、酰基乙烯醚、烷基乙烯醚、低级烷基乙烯醚、高级烷基乙烯醚、丁基乙烯醚、十二烷基乙烯醚、十八烷基乙烯醚、胆固醇乙烯醚、和其他含有烃的疏水乙烯醚。

一类尤其有用的聚合物包含：与三种单体：邻苯二甲酰亚胺单体、小疏水单体和大疏水单体聚合的含有胺的聚乙烯醚随机共聚物。邻苯二甲酰亚胺单体的去保护产生胺单体。小疏水单体包含具有2到6个碳原子的碳-氢链。大疏水单体包含具有约10到约22个碳原子，或约12到约18个碳原子的碳-氢链。中等疏水单体包含具有约6到约10个碳原子的碳-氢链。优选的氨基聚乙烯醚聚合物包含：氨基/丁基/十八烷基聚乙烯醚或氨基/丁基/十二烷基聚乙烯醚。

聚(乙烯醚)随机共聚物的生物物理性质由所选的具体单体、它们掺入聚合物的比率和聚合物的大小决定。通过改变聚合反应中单体的进料比率可以制备不同的聚合物。尽管聚合物中单体的掺入比率可以与单体的进料比率相同，但是比率可以是不同的。不管单体以进料比率或不同的定额掺入，可能改变单体的进料比率以实现所希望的单体掺入比率。优选的氨基聚乙烯醚是水溶性膜活性胺/丁基/十八烷基或胺/丁基/十二烷基随机三元共聚物。通过这些聚合物的侧链的修饰，可能从多胺合成具有相似的胺和疏水单体含量的聚合物，如：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚乙烯胺、和聚烯丙胺或者其他聚合物，如聚乙烯醇。

本发明的优选的膜活性聚合物是以1mg/ml或更大浓度溶于水的。本发明的优选的膜活性聚合物是表面活性的。本发明的膜活性聚合物优选大小为约kDa到约100kDa，更优选约7.5kDa到约50kDa，更优选约10kDa到约30kDa。

掩蔽剂

能够将多核苷酸从细胞外递送到细胞的细胞质的聚合物通常是有毒的或具有差的体内生物分布。因此，必须掩蔽聚合物的引起毒性或者差的生物分布的性质。因为修饰聚合物以掩蔽这些性质也可以失活聚合物的转染活性或膜活性，所以掩蔽剂通过生理学可逆的连接连接到聚合物。连接的切割恢复了聚合物被屏蔽或掩蔽的性质。

如本文所用，掩蔽剂包含这样的分子，其当连接到聚合物时，屏蔽、抑制或者失活聚合物的一种或多种性质(生物物理的或生物化学特征)。掩蔽剂也可以为聚合物增加活性或功能，所述活性或功能是不存在掩蔽剂时该聚合物没有的。可以被掩蔽的聚合物的性质包括：膜活性、内体裂解活性、电荷、有效电荷、转染活性、血清相互作用、细胞相互作用、和毒性。掩蔽剂以可以抑制或防止多核苷酸-聚合物缀合物在生理条件中的聚集。本发明的掩蔽剂可以选自：位阻稳定剂、寻靶基团和电荷修饰剂。多种掩蔽剂可以可逆地连接到单个聚合物。为了失活聚合物的性质，必须将一个以上的掩蔽剂连接到聚合物。足够数目的掩蔽剂被连接到聚合物以实现所希望的失活水平。使用合适的聚合物活性测定法，可以容易地确定通过连接掩蔽剂对聚合物的所希望的修饰水平。例如，如果聚合物在给定测定法中具有膜活性，那么将足够水平的掩蔽剂连接到聚合物以实现在该测定法中膜活性的所希望的抑制水平。可以将足够数目的掩蔽剂可逆地连接到聚合物以抑制聚合物在生理条件中的聚集。可以使用一种以上的掩蔽剂。例如，可以将位阻稳定剂和寻靶基团二者连接到聚合物。位阻稳定剂和寻靶基团也可以作为或不作为电荷修饰剂发挥功能。本发明的掩蔽剂可逆地连接到聚合物。如本文所用，如果连接的逆转导致聚合物的被掩蔽的活性恢复，那么掩蔽剂可逆地连接到聚合物。掩蔽剂通过与聚合物上的反应基形成可逆的共价连接而连接到该聚合物。反应基可以选自：胺、醇、硫醇、酰肼、醛、羧基等等。可以可逆地修饰聚合物上一个到所有反应基或者带电荷基团。在一个实施方案中，至少两种掩蔽剂可逆地连接到聚合物。在另一实施方案中，掩蔽剂可逆地连接到聚合物上约20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的反应基。在另一实施方案中，掩蔽剂可逆地连接到聚合物上约20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的带电基团。在另一实施方案中，可逆地连接到聚合物的掩蔽剂与聚合物上带电基团的百分比为约20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。

如本文所用，如果通过连接一种或多种掩蔽剂，聚合物的一种或多种性质被抑制或失活，那么聚合物被掩蔽。如果连接掩蔽剂与聚合物的键的切割导致聚合物的被掩蔽的性质的恢复，那么聚合物被可逆地掩蔽。

本发明的优选的掩蔽剂能够在水溶液中修饰聚合物(与聚合物形成可逆键)。尤其有用的是马来酐衍生物，其中R¹是甲基(-CH₃)并且R²是丙酸基团(-(CH₂)₂CO₂H)或者来自该酸的酯/酰胺。

如本文所用，位阻稳定剂是天然的、合成的、或非天然的非离子亲水聚合物，其相对于不含有位阻稳定剂的聚合物，防止它连接的聚合物的分子内或分子间相互作用。位阻稳定剂阻碍聚合物参与静电相互作用。静电相互作用是由于正电荷和负电荷之间的吸引力导致的两种或多种物质的非共价结合。位阻稳定剂可以抑制与血液组分的相互作用并且因此抑制调理作用、吞噬作用和网状内皮系统的摄入。位阻稳定剂从而可以增加它们连接的分子的循环时间。位阻稳定剂也可以抑制聚合物的聚集。优选的位阻稳定剂是聚乙二醇(PEG)和PEG衍生物。如本文所用，优选的PEG可以具有约1-500个乙二醇单体、2-20个乙二醇单体、5-15个乙二醇单体、或约10个乙二醇单体。如本文所用，优选的PEG也可以具有约85-20,000道尔顿(Da)、约200-1000Da、约200-750Da或约550Da的平均分子量。其他合适的位阻稳定剂可以选自：多糖、葡聚糖、环糊精、聚(乙烯醇)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基丙烯酸2-羟基丙酯(HPMA)和水溶性纤维素醚。

寻靶基团或配体用于将聚合物靶向或递送到靶细胞或组织或特定细胞类型。寻靶基团增强分子与靶细胞的结合。从而，寻靶基团可以增强它们连接的缀合物的药物动力学或生物分布性质以改善缀合物的细胞分布和细胞摄入。一个或多个寻靶基团可以直接地或通过用间隔臂连接而连接到膜活性聚合物。寻靶基团如配体与细胞或细胞受体的结合可以启动内吞作用。寻靶基团可以是单价的、二价的、三价的、四价的或具有更高的价。寻靶基团可以选自：对细胞表面分子具有亲和力的化合物、细胞受体配体、和对细胞表面分子具有亲和力的抗体、抗体片段和抗体模拟物。优选的寻靶基团包含细胞受体配体。多种配体已经被用于将药物和基因靶向细胞和特定细胞受体。细胞受体配体可以选自：糖类、聚糖、糖(包括但不限于：半乳糖、半乳糖衍生物、甘露糖和甘露糖衍生物)、维生素、叶酸、生物素、适配体和肽(包括但不限于：含有RGD的肽、胰岛素、EGF和转铁蛋白)。寻靶基团的实例包括通过使用无唾液酸糖蛋白或半乳糖残基靶定无唾液酸糖蛋白受体的那些。例如，肝脏肝细胞含有ASGP受体。因此，含有半乳糖的寻靶基团可以用于靶定肝细胞。含有半乳糖的寻靶基团包括但不限于：半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、寡糖和糖簇(如：Tyr-Glu-Glu-(氨基己基GalNAc)₃、基于赖氨酸的半乳糖簇，和基于胆烷的半乳糖簇)。其他合适的缀合物可以包括可以结合在无唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)上发现的糖类识别结构域(CRD)的寡糖。含有寡糖和/或糖类复合体的示例性缀合物部分在美国专利号6,525,031中提供。

如本文所用，电荷修饰剂是改变聚合物上的阴离子基团的电荷的基团。电荷修饰剂可以中和聚合物上的带电基团或者将聚合物离子的电荷从正逆转为负或从负逆转为正。聚离子的电荷修饰可以减小聚离子的电荷，形成相反电荷的聚离子或形成两性聚电解质。电荷修饰也可以用于形成具有希望的净电荷或ζ电位的聚合物。具有接近中性净电荷或ζ电位的缀合物优选用于在体内递送多核苷酸。优选的电荷修饰剂可逆地修饰带电基团或离子基团。可逆的电荷修饰剂可以选自：CDM、DM、CDM-硫酯、CDM-掩蔽剂、CDM-位阻稳定剂、CDM-配体、CDM-PEG、和CDM-半乳糖。

ζ电位是悬浮的任何颗粒显示的物理性质并且密切接近表面电荷。在水性介质中，样品的pH是影响ζ电位的最重要的因素之一。当电荷是基于碱/酸的质子化/去质子化时，电荷取决于pH。因此，ζ电位值必须包括将有意义的溶液条件，特别是pH。对于典型颗粒，ζ电位的强度指出胶体系统的潜在稳定性。如果悬浮的所有颗粒都具有大的负或正的ζ电位，那么它们倾向于相互排斥并且将没有颗粒聚集在一起的倾向。然而，如果颗粒具有低的ζ电位值，那么将没有力阻止颗粒聚集在一起和絮凝化。典型颗粒的稳定和不稳定悬浮液之间一般的分界线通常在+30或-30mV。具有比+30mV更正或比-30mV更负的ζ电位的颗粒通常被认为是稳定的。这里我们表明，CDM掩蔽的多核苷酸-聚合物缀合物可以形成小的颗粒，＜20nm或＜10nm(如通过动态光散射、分析型超速离心或原子力显微镜检查测量)，所述颗粒尽管在生理盐和pH9下具有+30到-30mV之间的ζ电位，但是是稳定的。

本发明的多核苷酸-聚合物缀合物的净电荷或ζ电位可以通过连接掩蔽剂或电荷修饰剂进行控制。聚合物电荷，特别是正电荷可以导致与血清组分或非靶细胞的不想要的相互作用。通过用位阻稳定剂或电荷的修饰屏蔽电荷，可以容易地制备具有接近中性的表观表面电荷的缀合物。通过修饰聚合物上的带电基团，可以制备血清稳定的颗粒，其中在pH 9时测量的ζ电位为+30到-30mV、+20到-20mV、+10到-10mV或+5到-5mV。在pH 7下，将预期缀合物的净电荷比pH 9时更正。净电荷或表面电荷是体内多核苷酸复合体递送中的重要因素。

不稳定连接

连接或接头是两个原子之间的连接，其通过一个或多个共价键连接一个目的化学基团或片段与另一目的化学基团或片段。例如，连接可以连接多核苷酸或掩蔽剂与聚合物。连接的形成可以将两个单独的分子连接成一个分子或者它可以连接相同分子中的两个原子。连接可以是电荷中性的，或者可以带有正或负电荷。可逆的或不稳定的连接含有可逆的或不稳定键。连接可以任选包括间隔基，其增加两个连接的原子之间的距离。间隔基可以还增加连接的柔性和/或长度。间隔基可以包括但不限于：烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基，它们每个含有一个或多个杂原子，和杂环。间隔基是本领域公知的并且前面的列举不意在限制本发明的范围。

可逆的或不稳定键是不同于与氢原子的共价键的共价键，其能够在将不会断裂或切割相同分子中其他共价键的条件下被选择性断裂或切割。更特别地，可逆的或不稳定键是这样的共价键，其在合适的条件下比相同分子中其他非不稳定的共价键稳定性更低(热力学地)或更快断裂(动力学地)。分子内不稳定键的切割可以导致形成两个或更多分子。对于本领域技术人员而言，键的切割或不稳定性通常按照键切割的半寿期(t_1/2)，或者一半的键切割所需的时间讨论。正交键是在切割一个键并且不切割另一个键的条件下切割的键。如果在确定的环境中两个键的切割半寿期相互相差10倍或以上，那么认为这两个键是正交的。从而，可逆或不稳定键包括这样的键，其比分子中的其他键更快地被选择性切割。

电子给予或吸取基团的存在可以位于与可切割键足够接近的分子中使得电子给予或吸取基团的电子效应影响键切割的速率。电子吸取基团(EWG)是分子的原子或部分，其从所述分子的另一原子、键或部分吸取电子密度，其中目的键(供体)的电子密度降低。电子给予基团(EDG)是分子的原子或部分，其为该分子的另一原子、键或部分给予电子，其中目的键(接纳体)的电子密度升高。电子吸取/给予基团需要足够接近以实现影响，其通常在被断裂的键的约3个键内。

增加键切割速率的另一策略是在与不稳定键相同的分子中掺入官能团。分子内官能团相互的接近可以使得分子内反应相对于分子间反应是有利的。分子内官能团相互的接近可以实际上导致官能团的局部更高的浓度。通常，分子内反应比分子间反应更快。通过5和6个原子分离的反应基由于形成5和6元环过渡态而可以形成尤其不稳定的键。实例包括将相同分子内的羧酸衍生物(酸、酯、酰胺)和醇、硫醇、羧酸或胺一起反应以制备酯、羧酸酯和碳酸酯、磷酸酯、硫醇酯、酸酐或酰胺。空间相互作用也可以改变键的切割速率。

合适的条件通过不稳定键的类型确定并且是有机化学中公知的。不稳定键可以对pH、氧化或还原条件或试剂、温度、盐浓度、酶的存在或者加入的试剂的存在敏感。例如，某些肽、酯或者糖接头可以在合适酶的存在下被切割。在另一实例中，升高或降低的pH可以是pH不稳定键的合适的条件。在再一个实例中，氧化条件可以是氧化不稳定键的合适条件。在再一个实例中，还原条件可以是还原不稳定键的合适条件。例如，从两个烷基硫醇构建的二硫化物能够通过硫醇存在下还原被断裂，不用切割碳-碳键。在该实例中，碳-碳键对于还原条件是稳定的。

不稳定基团将经历转化的速率可以通过改变含有该不稳定基团的分子的化学成分进行控制。例如，不稳定基团附近的特定化学部分(例如，电子接纳体或供体)的加入可以影响将发生化学转化的具体条件(例如，pH)。

分子可以含有一个或多个可逆的或不稳定键。如果分子中存在一个以上的可逆的或不稳定键，并且所有可逆的或不稳定键是相同类型(在相同条件下以大约相同的速率切割)，那么该分子含有多个可逆的或不稳定键。如果分子中存在一个以上的可逆的或不稳定键，并且可逆的或不稳定键是不同的类型(基于不稳定性的合适条件或者不稳定键的化学官能团)，那么该分子含有正交的可逆的或不稳定键。正交的可逆的或不稳定键提供了切割一种类型的可逆的或不稳定键而留下第二种类型的可逆键不被切割或断裂的能力。换句话说，如果两种不稳定键的一个可以在另一种不稳定键完整的条件下被切割，那么这两种不稳定键是相互正交的。正交的保护基是有机化学中公知的并且包含正交键。

如本文所用，生理学不稳定的键是在这样的条件下被切割的不稳定键，所述条件在哺乳动物身体中通常遇到或与在哺乳动物身体中通常遇到的那些条件相似。可以选择生理学不稳定的连接基团使得它们当存在于某些生理条件中时经历化学转化(例如，切割)。

如本文所用，细胞生理学不稳定键是在哺乳动物细胞内条件下可被切割的不稳定键。哺乳动物细胞内条件包括化学条件如在哺乳动物细胞中遇到的或类似于哺乳动物细胞中遇到的pH、温度、氧化或还原条件或试剂，和盐浓度。哺乳动物细胞内条件也包括存在通常存在于哺乳动物细胞中的酶促活性，如来自蛋白酶解或水解酶的酶促活性。细胞生理学不稳定键也可以应答药学上可接受的外源试剂的施用而被切割。具有小于45分钟的半寿期的被切割的生理学不稳定剂被认为是非常不稳定的。具有小于15分钟的半寿期的被切割的生理学不稳定剂被认为是极端不稳定的。

化学转化(不稳定键的切割)可以通过向细胞加入可药用试剂引发或者可以当含有不稳定键的分子到达合适的细胞内和/或细胞外环境时自发发生。例如，当分子进入酸化的内体时，pH不稳定键可以被切割。从而，可以认为pH不稳定键是内体可切割的键。酶可切割的键当暴露于酶如内体或溶酶体或细胞质中存在的那些酶时可以被切割。当分子进入细胞质的更还原的条件时，二硫键可以被切割。从而，可以认为二硫化物是细胞质可切割的键。

pH不稳定的键：如本文所用，pH不稳定的键是在酸性条件(pH＜7)下被选择性断裂的不稳定键。此类键也可以被称作内体不稳定的键，因为细胞内体和溶酶体具有小于7的pH。术语pH不稳定的包括pH不稳定的、非常pH不稳定的和极端pH不稳定的键。pH不稳定的键可以选自：

a)缩酮，其在酸性环境(小于7大于4的pH)中不稳定而形成二元醇和酮，

b)缩醛，其在酸性环境(小于7大于4的pH)中不稳定而形成二元醇和醛，

c)亚胺或亚胺

(iminiums)，它们在酸性环境(小于7大于4的pH)中不稳定而形成胺和醛或酮，

d)硅-氧-碳连接，其在酸性条件下不稳定，

e)硅-氮(硅氮烷)连接，和

f)硅-碳连接(芳基硅烷、乙烯基硅烷和烯丙基硅烷)，

g)马来酰胺酸-从马来酐衍生物和胺合成的酰胺键，

h)原酸酯，

i)腙，

j)被设计成经历酸催化的水解的被活化的羧酸衍生物(酯、酰胺)，

k)乙烯醚。

有机硅烷已经长期以来被用作有机合成中的氧保护基，这是由于在酸性条件下容易制备(硅-氧-碳连接)和温和除去保护基。例如，甲硅烷基醚和silylenolethers都具有此类连接。硅-氧-碳连接在酸性条件下对水解敏感，形成硅烷醇和醇(或烯醇)。硅原子和醇碳上的取代由于立体和电子效应都可以影响水解速率。这允许通过改变有机硅烷、醇或有机硅烷和醇上的取代可能调节硅-氧-碳连接的水解速率以促进所希望的效果。此外，带电基团或反应基，如胺或羧化物可以连接到硅原子，其赋予不稳定化合物电荷和/或反应性。

硅氮烷的水解导致形成硅烷醇和胺。硅氮烷比硅-氧-碳连接内在地对水解更敏感，然而，水解速率在酸性条件下增加。硅原子和胺上的取代由于立体和电子效应都可以影响水解速率。这允许通过改变硅或胺上的取代可能调节硅氮烷的水解速率以促进所希望的效果。

pH不稳定键的另一实例是使用酸不稳定的烯醇醚键。该不稳定键被切割的速率取决于所形成的羰甚化合物和释放的醇的结构。例如，可以从β-卤代醚合成的乙基异丙烯基醚的类似物具有在pH5下大约2分钟的半寿期。可以从酚醚合成的乙基环己烯基醚的类似物具有在pH5下大约14分钟的半寿期。

酐与胺的反应形成酰胺和酸。通常，逆反应(形成酐和胺)非常慢并且是能量上不利的。然而，如果酐是环酐，那么与胺的反应产生这样的分子，其中酰胺和酸处于同一分子：酰胺酸中。同一分子中两种反应基(酰胺和羧酸)的存在加速了逆反应。具体地，伯胺与马来酐和马来酐衍生物的产物马来酰胺酸比它的非环状类似物复原为胺和酐的速率快1×10⁹到1×10¹³倍(Kirby 1980)。

胺与酐反应形成酰胺和酸。

胺与环酐反应形成酰胺酸。

酰胺酸断裂形成胺和酐是依赖pH的，并且在酸性pH下被极大地加速。可以利用该依赖pH的反应性形成可逆的pH敏感键和接头。顺乌头酸已经被用作这种pH敏感的接头分子。γ-羧化物首先偶联到分子。在第二步中，α或β羧化物偶联到第二个分子形成这两个分子的pH敏感偶联。在pH5下该接头切割的半寿期为8到24小时。

顺乌头酸酐和马来酐的结构

顺乌头酐马来酐系统

发生断裂时的pH受到化学成分向不稳定部分的加入的控制。马来酸向胺和马来酐的转化速率强烈依赖于马来酐系统的取代(R²和R³)。当R²是甲基时，转化速率比R²和R³是氢时的转化速率高50倍。当在R²和R³处都有烷基取代(例如，2，3-二甲基马来酐)时，速率增加是显著的，比非取代的马来酐快10,000倍。从胺用2，3-二甲基马来酐的修饰形成的马来酰胺酸键在pH5下以4到10分钟的半寿期切割以回收酐和胺。预期如果R²和R³是大于氢的基团，那么酰胺-酸向胺和酐的转化速率将比R²和/或R³是氢的情况更快。

非常pH不稳定的键：非常pH不稳定键在pH5下具有小于45分钟的切割半寿期。非常pH不稳定键的构建是化学领域公知的。

极端pH不稳定键：极端pH不稳定键在pH5时具有小于15分钟的切割半寿期。极端pH不稳定键的构建是化学领域中公知的。

多核苷酸与聚合物的连接

多核苷酸向细胞递送的多数以前的方法依赖于阴离子核酸与阳离子递送剂如阳离子聚合物或阳离子脂类的复合。与较大的多核苷酸如质粒的静电复合体在生理溶液中倾向于聚集并变大(＞500nm)。较小的多核苷酸——寡核苷酸因为它们的小尺寸，与潜在的递送剂形成不稳定的静电复合体。包装多核苷酸的更有效的方法是共价连接多核苷酸与递送载体。然而，聚合物的附着可以抑制多核苷酸在细胞中的活性。我们已经发现，通过经可逆接头连接多核苷酸与聚合物(所述可逆接头在多核苷酸递送到细胞后断裂)，可能在体内将功能活性多核苷酸递送到细胞。选择可逆接头使得它当存在于某些生理条件(例如，细胞的细胞质的还原条件)中时经历化学转化(例如，切割)。多核苷酸与递送聚合物或膜活性聚合物的附着增强了在体内该多核苷酸向细胞的递送。多核苷酸通过可逆键的切割从聚合物的释放促进了该多核苷酸与合适的细胞组分的相互作用以发挥活性。

除了多核苷酸外，使用所述的多缀合物递送载体，可以在体内向细胞递送具有低膜通透性的一种或多种其他膜不透性分子。适于可逆附着到膜活性聚合物的分子包括：蛋白质、抗体、抗体片段、转录因子、小分子药物、抗癌药物、和其他合成分子，包括影响转录的那些分子。

膜不透性分子与膜活性聚合物的连接使得可以形成合适大小的体内递送载体。所述的分子缀合物是基本上聚合的并且具有与为其他聚合物观察到的相似的大小和寻靶性质。对于血管内(全身)递送，载体需要能够穿越内皮屏障以便到达目的实质细胞。最大的内皮窗孔(内皮屏障中的孔)存在于肝脏并且具有约100nm的平均直径。其他器官中的经内皮孔小得多。例如，肌内皮可以被描述为这样的结构，其具有半径4nm的许多小孔和半径20-30nm的少数大孔。多核苷酸递送载体的大小对于细胞摄入过程也是重要的。认为通过胞吞作用的细胞内化局限于直径约100nm(内吞小泡的大小)的复合体。所述的缀合物小于100nm，更优选小于50nm，更优选小于20nm或小于10nm。

肾脏超滤是从血液清除亲水蛋白质、聚合物和聚合物-蛋白质缀合物的一个主要途径。影响该过程的参数包括化学组成、大小和电荷。大于约70kDa的球状蛋白大部分被排除在肾脏超滤清除之外。因此，位阻稳定剂如PEG的缀合通过增加它们连接的聚合物的有效分子大小而降低肾脏清除。具有小于8kDa的分子量的PEG的超滤不受到限制，而范围为8-30kDa的PEG的超滤受到分子大小的控制。分子量超过30kDa时，PEG清除显著降低。为此原因，总体大小大于约10kDa、大于约20kDa或大于约30kDa的掩蔽的聚合物-多核苷酸缀合物是优选的。除了降低肾脏超滤外，增加聚合物分子量可以促进通过被动增强的渗透和保留机理积累到可通透组织，如肿瘤中。

多核苷酸

术语多核苷酸或核酸或多核酸是本领域术语，指含有至少两个核苷酸的聚合物。核苷酸是多核苷酸聚合物的单体单位。具有小于120个单体单位的多核苷酸通常被称作寡核苷酸。天然核酸具有磷酸脱氧核糖或磷酸核糖主链。非天然的或合成的多核苷酸是这样的多核苷酸，其在体外的或在无细胞系统中聚合并且含有相同或相似的碱基但是可以含有不同于天然磷酸核糖或脱氧核糖主链的类型的主链。可以使用本领域任何公知的技术合成多核苷酸。本领域已知的多核苷酸主链包括：PNA(肽核酸)、硫代磷酸酯、二酰胺磷酸酯、吗啉代和天然核酸的磷酸酯主链的其他变体。碱基包括嘌呤或嘧啶，其还包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、次黄苷和天然类似物。嘌呤和嘧啶的合成衍生物包括，但不限于，在核苷酸上放置新的反应基的修饰，如但不限于，胺、醇、硫醇、羧化物和烷基卤。术语碱基包括DNA和RNA的任何已知的碱基类似物。术语多核苷酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)和DNA、RNA和其他天然和合成核苷酸的组合。

DNA可以为cDNA、体外聚合的DNA、质粒DNA、质粒DNA的部分、来自病毒的遗传物质、线性DNA、载体(P1、PAC、BAC、YAC和人工染色体)、表达载体、表达盒、嵌合序列、重组DNA、染色体DNA、寡核苷酸、反义DNA或这些组的衍生物的形式。RNA可以为信使RNA(mRNA)、体外聚合的RNA、重组RNA、寡核苷酸RNA、转移RNA(tRNA)、小核RNA(snRNA)、核糖体RNA(rRNA)、嵌合序列、反义RNA、干扰RNA、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、外部指导序列、小的非信使RNA(snmRNA)、非翻译的RNA(utRNA)、snoRNAs(24聚体，通过反义机理修饰的snmRNA)、小的非编码RNAs(tncRNAs)、小的发夹RNA(shRNA)或这些组的衍生物的形式。此外，DNA和RNA可以为单链的、双链的、三链的或者四链的。双链、三链和四链多核苷酸可以含有RNA和DNA二者或者天然和/或合成核酸的其他组合。

封闭性多核苷酸是干扰DNA或RNA的功能或表达的多核苷酸。封闭性多核苷酸不翻译成蛋白质但是它们在细胞中的存在或表达改变细胞基因或RNA的表达或功能。封闭性多核苷酸以序列特异性方式引起特定细胞RNA的降解或抑制其功能或翻译。RNA的抑制可以有效抑制基因的表达，其中RNA从所述基因转录。如本文所用，封闭性多核苷酸可以选自：反义寡核苷酸、RNA干扰多核苷酸、dsRNA、siRNA、miRNA、hRNA、核酶、锤头核酶、外部指导序列(US 5,962,426)、snoRNA、形成三螺旋的寡核苷酸、编码封闭性多核苷酸的RNA聚合酶II转录的DNA、编码封闭性多核苷酸的RNA聚合酶III转录的DNA。封闭性多核苷酸可以是DNA、RNA、RNA和DNA的组合，或者可以含有非天然的或合成的核苷酸。

封闭性多核苷酸可以在体外聚合，它们可以是重组的、含有嵌合序列，或者这些组的衍生物。封闭性多核苷酸可以含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、合成的核苷酸，或者任何合适的组合使得靶RNA或基因被抑制。

RNA干扰(RNAi)多核苷酸是通过与哺乳动物细胞的RNA干扰途径机器相互作用诱导RNA干扰从而以序列特异性方式降解或抑制转基因的信使RNA(mRNA)转录物翻译的分子。两种主要的RNAi多核苷酸是小(或短)干扰RNA(siRNAs)和微RNAs(miRNAs)。然而，已经表明其他多核苷酸介导RNA干扰。RNAi多核苷酸可以选自：siRNA、微RNA、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)和能够诱导RNA干扰的编码RNA的表达盒。siRNA包含双链结构，其通常含有15-50个碱基对并且优选21-25个碱基对并且具有与细胞内所表达的靶基因的编码序列或RNA相同(完全互补)或接近相同(部分互补)的核苷酸序列。siRNA可以具有二核苷酸3’突出端。siRNA可以由两个退火的多核苷酸或者形成发夹结构的单个多核苷酸组成。本发明的siRNA分子包含有义区和反义区。在一个实施方案中，缀合物的siRNA从两个寡核苷酸片段装配，其中一个片段包含siRNA分子的反义链的核苷酸序列并且第二个片段包含siRNA分子的有义区的核苷酸序列。在另一实施方案中，有义链通过接头分子如多核苷酸接头或者非核苷酸接头连接到反义链。微RNA(miRNAs)是约22nt长的小的非编码RNA基因产物，其指导它们的mRNA靶标的破坏或者翻译抑制。如果miRNA和靶mRNA之间的互补性是部分的，那么靶mRNA的翻译受到抑制，而如果互补性是广泛的，那么靶mRNA被切割。对于miRNAs而言，复合体结合到通常位于mRNA的3’UTR的靶位点，其通常与miRNA仅有部分同源性。“种子区”-miRNA的5’末端上约7个连续核苷酸的一段序列(与其靶标形成完全碱基配对)-在miRNA特异性中起关键作用。RISC/miRNA复合体与mRNA的结合可以导致蛋白质翻译的抑制或者mRNA的切割和降解。最近的数据表明，如果沿着miRNA和其靶标的全长存在完全同源性而不是仅在种子区中显示出完全碱基配对，那么优先发生mRNA切割(Pillai等人，2007)。

反义寡核苷酸包含含有与靶mRNA中存在的序列互补的序列的多核苷酸。反义寡核苷酸以序列特异性方式结合到mRNA(与mRNA碱基配对)。该结合可以防止其他的细胞酶结合到该mRNA，从而导致所述mRNA翻译的抑制或者所述mRNA的降解。

外部指导序列是短的反义寡核糖核苷酸，其通过形成前体tRNA样复合体诱导靶RNA的RNA酶P介导的切割(US 5,624,824)。

核酶通常是RNA寡核苷酸，其含有与靶信使RNA互补的序列和作为酶来切割信使RNA的RNA序列。mRNA的切割阻止了翻译。

形成封闭性多核苷酸的寡核苷酸可以包括在5’末端、3’末端或同时在5’和3’末端的末端帽部分。帽部分可以是，但不限于，反向脱氧脱碱基部分、反向脱氧胸苷部分、胸苷部分或者3’甘油基修饰。

RNA聚合酶II和III转录的DNA可以在细胞中转录产生作为siRNA发挥功能的小发夹RNA、分离的有义和反义链线性siRNA、核酶或者作为反义RNA发挥功能的线性RNA。RNA聚合酶III转录的DNA含有选自如下的启动子：U6启动子、H1启动子和tRNA启动子。RNA聚合酶II启动子包括U1、U2、U4和U5启动子、snRNA启动子、微RNA启动子和mRNA启动子。

已知的miRNA序列列表可以见研究机构维护的数据库，所述研究机构如Wellcome Trust Sanger Institute、Penn Center for Bioinformatics、Memorial Sloan Kettering Cancer Center和European Molecule BiologyLaboratory等等。已知的有效siRNA序列和同源结合位点也在相关文献中详细记载。通过本领域已知的技术容易设计和产生RNAi分子。此外，可以用计算工具增加发现有效和特异的序列基序的机会(Pei等人2006，Reynolds等人2004，Khvorova等人2003，Schwarz等人2003，Ui-Tei等人2004，Heale等人2005，Chalk等人2004，Amarzguioui等人2004)。

可以化学修饰本发明的多核苷酸。化学修饰的多核苷酸的使用可以改进多核苷酸的多种性质，包括但不限于：对体内核酸酶降解的抗性、细胞摄入、活性和序列特异性杂交。此类化学修饰的非限制性实例包括：硫代磷酸酯核苷酸间连接、2’-O-甲基核糖核苷酸、2’-脱氧-2’-氟代核糖核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、和反向脱氧脱碱基残基掺入。这些化学修饰当用于多种多核苷酸构建体中时，显示出保留在细胞中的多核苷酸活性而同时显著增加这些化合物的血清稳定性。化学修饰的siRNA也可以减小在人体中活化干扰素活性的可能性。

在一个实施方案中，本发明的化学修饰的RNAi多核苷酸包含具有两条链的双链体，其一条或两条可以是化学修饰的，其中每条链为约19到约29(约19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29)个核苷酸。在一个实施方案中，本发明的RNAi多核苷酸包含一个或多个修饰的核苷酸而保持在细胞或重构的体外系统中介导RNAi的能力。可以修饰RNAi多核苷酸，其中化学修饰包含一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)核苷酸。本发明的RNAi多核苷酸可以包含修饰的多核苷酸作为RNAi多核苷酸中存在的核苷酸总数的百分数。同样，本发明的RNAi多核苷酸可以一般在约5到约100％的核苷酸位置(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的核苷酸位置)上包含经修饰的核苷酸。存在于给定RNAi多核苷酸中的经修饰的核苷酸的实际百分数取决于存在于RNAi多核苷酸中的核苷酸总数。如果RNAi多核苷酸是单链的，那么百分数修饰可以基于单链RNAi多核苷酸中存在的核苷酸总数。同样，如果RNAi多核苷酸是双链的，那么百分数修饰可以基于存在于有义链、反义链或有义链和反义链中的核苷酸总数。此外，存在于给定RNAi多核苷酸中的经修饰核苷酸的实际百分数也可以取决于存在于RNAi多核苷酸中嘌呤和嘧啶核苷酸的总数。例如，其中存在于RNAi多核苷酸中的所有嘧啶核苷酸和/或所有嘌呤核苷酸是被修饰的。

RNAi多核苷酸调节基因编码的RNA的表达。因为多个基因可以相互共有一定程度的序列同源性，所以可以设计RNAi多核苷酸以靶定具有足够的序列同源性的一类基因。从而，RNAi多核苷酸可以含有与不同基因靶标共有的或者特定基因靶标独特的序列互补的序列。因此，可以设计RNAi多核苷酸以靶定RNA序列的保守区，所述保守区在几个基因之间具有同源性，从而靶定基因家族中的几个基因(例如，不同的基因同种型、剪接变体、突变基因等等)。在另一实施方案中，可以设计RNAi多核苷酸以靶定单个基因的特定RNA序列独特的序列。

术语互补性指多核苷酸通过常规的沃森-克里克或其他非常规类型与另一多核苷酸序列形成氢键的能力。关于本发明的多核苷酸分子，多核苷酸分子与它的靶标(效应子结合位点)或互补序列的结合自由能足够允许该多核苷酸的相关功能进行，例如酶促mRNA切割或者翻译抑制。核酸分子的结合自由能的测定是本领域公知的(Frier等人1986，Turner等人1987)。百分数互补性表明在第一种多核苷酸分子中的连续链中存在的可以与第二条多核苷酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的碱基百分数(例如，10个中的5、6、7、8、9、10个为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。完全互补指多核苷酸序列的连续链中所有碱基将与第二条多核苷酸序列中相同数目的连续碱基形成氢键。

抑制、下调或降低(knockdown)基因表达指基因的表达(如通过从基因转录的RNA水平或者从RNA翻译的多肽、蛋白质或蛋白质亚基的水平)降低到低于不存在本发明的封闭性多核苷酸-缀合物时观察到的水平。使用通过本发明的组合物递送的多核苷酸，基因表达的抑制、下调或降低优选低于存在对照失活的核酸、具有乱序序列或具有失活错配的核酸或不存在所述多核苷酸与掩蔽聚合物的缀合时观察到的水平。

递送的多核苷酸可以停留于细胞质或细胞核内远离内源遗传物质。备选地，DNA可以与内源遗传物质重组(成为内源遗传物质的一部分)。重组可以引起DNA通过同源或非同源重组插入到染色体DNA中。

可以将多核苷酸递送到细胞中以表达外源核苷酸序列，抑制、消除、增加或改变内源核苷酸序列的表达，或影响不天然与该细胞相关的特定生理学特征。

多核苷酸可以含有表达盒，其被编码为表达完整的或部分蛋白质、或RNA。表达盒指天然或重组产生的多核苷酸，其能够表达序列。如本文所用的术语重组的指由通过分子生物学技术连接在一起的多核苷酸区段组成的多核苷酸分子。所述盒含有目的基因的编码区以及影响目的序列表达的任何其他序列。表达盒通常包括启动子(允许转录起始)和转录的序列。任选地，表达盒可以包括但不限于：转录增强子、非编码序列、剪接信号、转录终止信号和多聚腺苷酸化信号。RNA表达盒通常包括翻译起始密码子(允许翻译起始)，和编码一种或多种蛋白质的序列。任选地，表达盒可以包括但不限于，翻译终止信号、多聚腺苷序列、内部核糖体进入位点(IRES)、和非编码序列。

多核苷酸可以含有不在靶细胞中发挥特定功能而是用于产生该多核苷酸的序列。此类序列包括，但不限于，多核苷酸在宿主生物中复制或选择所需的序列。

术语基因一般指多核苷酸序列，其包含产生治疗性多核苷酸(例如，核酶)或多肽或前体必需的编码序列。多肽可以由全长编码序列或者由编码序列的任何部分编码，只要保持全长多肽或片段的所希望的活性或功能性质(例如，酶促活性、配体结合、信号转导)。该术语也包括基因的编码区并且包括位于5’和3’末端上与编码区相邻的任一边上的约1kb或以上距离的序列，使得该基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区的5’并且存在于mRNA上的序列被称作5’非翻译序列。位于编码区的3’或下游并且存在于mRNA上的序列被称作3’非翻译序列。术语基因包括基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有用非编码序列中断的编码区，所述非编码序列被称作内含子、间插区或间插序列。内含子是被转录为核RNA的基因。内含子可以含有调节元件，如增强子。内含子从核的或初级转录物去除或剪接；因此，内含子不存在于成熟RNA转录物中。信使RNA(mRNA)在翻译期间发挥功能以规定新生多肽中氨基酸的序列或顺序。基因也可以包括其他区域或序列，包括但不限于，启动子、增强子、转录因子结合位点、多聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点、沉默子、绝缘序列、基质附着区。这些序列可以接近基因的编码区存在(在10,000个核苷酸内)或者存在于远距离的位点(大于10,000个核苷酸)。这些非编码序列影响基因转录和/或翻译的水平或速率。基因的共价修饰可以影响转录(例如，基因组DNA的甲基化)速率、mRNA的稳定性(例如，3’多聚腺苷酸尾的3’长度)、翻译速率(例如，5’帽)、核酸修复、细胞核转运，和免疫原性。核酸的共价修饰的一个实例涉及

试剂(Mirus Corporation，Madison，WI)的作用。

如本文所用，术语基因表达指通过脱氧核糖核酸基因(例如，通过RNA聚合酶的酶促作用)将基因中编码的遗传信息转化为RNA(例如，小RNA、siRNA、mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)，并且对于编码蛋白质的基因，通过mRNA的翻译转化为蛋白质的过程。基因表达可以在该过程中的许多阶段受到调节。上调或活化指增加基因表达产物(即RNA或蛋白质)的产量的调节，而下调或抑制指减少产量的调节。涉及上调或下调的分子(例如，转录因子)通常被分别称作激活子和抑制子。

多核苷酸可以用于研究目的或用于在细胞中产生治疗性改变。用于治疗目的的多核苷酸的递送通常被称作基因治疗。多核苷酸的递送可以导致存在于靶细胞中的遗传物质的修饰。术语稳定转染或稳定转染的通常指外源多核苷酸向被转染细胞的基因组中的导入和整合。术语稳定转染子指已经将多核苷酸稳定整合到基因组DNA中的细胞。稳定转染也可以通过使用附加型载体得到，所述附加型载体在真核细胞分裂期间复制(例如，含有乳头瘤病毒复制原点的质粒DNA载体、人工染色体)。术语瞬时转染或瞬时转染的指向细胞中引入多核苷酸，其中所述多核苷酸不整合到被转染细胞的基因组中。如果多核苷酸含有可表达的基因，那么表达盒受到调节控制，其控制染色体中内源基因的表达。术语瞬时转染子指已经摄入多核苷酸但是没有将该多核苷酸整合到它的基因组DNA中的细胞。

配制

通过共价连接多核苷酸与聚合物形成多核苷酸-聚合物缀合物。将聚合物聚合或修饰使得它含有反应基A。也将该多核苷酸聚合或修饰使得它含有反应基B。选择反应基A和B使得它们可以使用本领域已知的方法通过可逆共价连接连接。

可以在过量聚合物存在下进行多核苷酸与聚合物的缀合。因为多核苷酸和聚合物在缀合期间可以为相反电荷，所以过量聚合物的存在可以减小或者消除缀合物的聚集。备选地，可以使用过量载体聚合物，如聚阳离子。可以在将缀合物施用于动物或者细胞培养物之前从缀合的聚合物除去过量聚合物。备选地，可以将过量聚合物与缀合物共同施用于动物或细胞培养物。

类似地，可以在过量聚合物或掩蔽剂存在下将聚合物缀合到掩蔽剂。因为多核苷酸和聚合物在缀合期间可以为相反电荷，所以过量聚合物的存在可以减小或者消除缀合物的聚集。备选地，可以使用过量载体聚合物。可以在将缀合物施用于动物或者细胞培养物之前从缀合的聚合物除去过量聚合物。备选地，可以将过量聚合物与缀合物共同施用于动物或细胞培养物。可以在多核苷酸缀合到聚合物之前或随后修饰聚合物。

转染试剂

向细胞递送多核苷酸的方法已经通常被称作转染或转染方法。如本文使用的术语转染指从细胞外向细胞内引入多核苷酸或其他生物活性化合物使得该多核苷酸具有生物活性。多核苷酸可以用于研究目的或者在细胞中产生治疗性改变。多核苷酸的递送可以导致靶细胞中存在的遗传物质的修饰。转染试剂或递送载体是与寡核苷酸或多核苷酸结合或复合并介导它们进入细胞的一种或多种化合物。

体外转染试剂，或者递送载体是与寡核苷酸和多核苷酸结合或复合并介导它们进入细胞的化合物或化合物的组合物。转染试剂的实例包括但不限于，蛋白质和聚合物复合体(polyplexes)、脂类和脂质体(lipoplexes)、聚合物和脂类的组合(lipopolyplexes)、磷酸钙沉淀、和树状聚体。通常，转染试剂具有带净正电荷的组分，其结合寡核苷酸的或多核苷酸的负电荷。阳离子转染试剂也可以浓集大的核酸。转染试剂也可以用于结合官能团与多核苷酸。官能团包括细胞寻靶信号、核定位信号、增强内含物从内体或其他细胞内小泡(如膜活性化合物)释放的化合物，和改变它们连接的化合物或复合体的行为或相互作用的其他化合物(相互作用修饰剂)。

本发明的缀合的多核苷酸为多种治疗性、诊断性、靶标确认、基因组发现、遗传工程和药物基因组应用提供了有用的试剂和方法。缀合的多核苷酸与相同的未缀合的多核苷酸相比具有改进的细胞摄入性质。

肠胃外施用途径包括血管内(静脉内、动脉内)、肌内、实质内、皮内、皮下、皮肤、肿瘤内、腹膜内、硬膜内、硬膜下、硬膜外和淋巴管内注射，其使用注射器和针头或导管。本文的血管内指在称作血管的管状结构内，所述血管连接身体内的组织或器官。在该管状结构腔内，体液流到身体部分或从身体部分流出。体液的实例包括血液、脑脊液(CSF)、淋巴液或者胆汁。血管的实例包括动脉、小动脉、毛细血管、小静脉、血窦、静脉、淋巴管、胆汁管、和唾液腺或其他外分泌腺的管。血管内途径包括通过血管如动脉或静脉递送。血液循环系统提供了药物的全身扩散。涉及粘膜的施用途径意在包括经鼻、支气管吸入到肺，或经眼睛施用。实质内包括直接注射到组织如肝脏、肺、心脏、肌肉(骨骼肌或隔)、脾脏、胰腺、脑(包括心室内)、脊髓、神经节、淋巴结、脂肪组织、甲状腺组织、肾上腺、肾、前列腺和肿瘤。经皮施用途径已经通过贴剂和离子电渗疗法实现。其他上皮途径包括经口、鼻、呼吸系统、直肠、和阴道施用途径。

缀合物可以在可药用载体溶液中注射。可药用指从药理学/毒理学观点看，哺乳动物可接受的那些性质和/或物质。短语可药用指当施用于哺乳动物时生理学上可耐受的并且通常不产生变应性或其他麻烦的或毒性反应的分子实体、组合物和性质。优选地，如本文所用，术语可药用指得到联邦或者州政府的管理机构批准或者在美国药典或者其他公认的药典中列出用于动物、尤其人类中。

治疗效果

我们已经公开了多核苷酸递送，导致特定组织中的基因表达或者报道基因或内源基因的基因表达的抑制。多核苷酸递送后测量的报道(标记)基因表达的水平表明递送其他多核苷酸后相似的基因表达水平的合理期望。本领域普通技术人员认为有益的治疗水平在疾病与疾病之间不同，例如：血友病A和B分别由X连锁的凝血因子VIII和IX的缺陷引起。它们的临床过程受到因子VIII或IX的正常血清水平百分比的极大影响：＜2％，严重；2-5％，中等；5-30％轻微。从而，严重患者中循环因子的正常水平从1％增加到2％可以被认为是有益的。大于6％的水平防止了自发出血但是不能防止手术或损伤后继发性出血。基因的类似抑制不必是100％的以提供治疗效果。基因治疗领域技术人员将基于标记基因结果的足够水平合理地预期疾病特异的基因表达的有益水平。在血友病实例中，如果标记基因表达产生在体积上与因子VIII的正常水平的2％相当水平的蛋白质，那么可以合理地预期编码因子VIII的基因也可以以相似水平表达。从而，报道基因或标记基因如萤光素酶和β-半乳糖苷酶的基因一般作为细胞内蛋白质表达的有用的范例。类似地，分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的报道基因或标记基因一般作为分泌型蛋白质的有用的范例。

从递送的多核苷酸表达的蛋白质在减弱或预防疾病、状况或症状中的治疗效果可以通过所述蛋白质完成，所述蛋白质停留在细胞内、保持附着到细胞膜或者从细胞分泌和解离，其中它可以进入全身循环和血液。可以为治疗性的分泌性蛋白质包括激素、细胞因子、生长因子、凝血因子、抗蛋白酶蛋白质(例如，α-抗胰蛋白酶)和存在于血液中的其他蛋白质。膜上的蛋白质通过为细胞提供受体以摄入蛋白质或脂蛋白而具有治疗效果。例如，低密度脂蛋白(LDL)受体可以在肝细胞中表达并降低血液胆固醇水平从而防止动脉粥样硬化病变，该病变可以引起中风或心肌梗塞。停留在细胞内的治疗性蛋白质可以是酶，其清除循环的毒性代谢物，如苯丙酮尿症中的代谢物。它们也可以引起癌细胞增殖性或癌性降低(例如，转移性降低)。细胞内的蛋白质也可以干扰病毒的复制。

考虑到肝脏在代谢中的中心作用(例如，多种高胆固醇血症中的脂蛋白代谢)和循环蛋白质(血友病中的凝血因子)的分泌，肝脏是基因治疗中最重要的靶组织。至少一百种不同的遗传疾病可以潜在地通过肝脏定向基因疗法校正。此外，获得性病症如慢性肝炎和肝硬化是常见的并且也可以通过基于多核苷酸的肝脏疗法治疗。涉及异向基因表达的基因治疗将通过肝脏定向基因转移进一步增加可被治疗的病症数目。例如，通过在肝细胞中表达胰岛素基因可以治疗糖尿病，所述肝细胞的生理学将使得能够进行葡萄糖调节的胰岛素分泌。

除了增加或减少涉及代谢或疾病的基因外，多核苷酸向细胞的体内递送也可以用于刺激免疫系统、刺激免疫系统破坏癌细胞、失活癌基因或者活化或递送肿瘤抑制基因。也可以递送多核苷酸以诱导对病原体的免疫性或者阻断病原性基因的表达。

杂项定义

如本文所用，体内(in vivo)指发生在生物内并且更特别地指在完整的活的多细胞生物(动物)，如哺乳动物(与部分或死亡的生物相反)的活组织中或上进行的过程。

如本文所用，体外(in vitro)指在用于实验研究中研究疾病或过程的活的多细胞生物外产生的人工环境(如试管或培养板)中进行的过程。如本文所用，体外包括在培养生长的完整细胞中进行的过程。

如本文所用，原位(in situ)指在完整组织中进行的过程。然而，组织可以在活的生物中或者从该生物除去。

如本文所用，离体(ex vivo)指在生物外的人工环境中对活细胞或组织进行的过程，所述活细胞或组织从生物取出并且随后返回到生物中。

交联剂是用于将两个分子连接在一起，即在两个分子之间形成连接的双功能分子。双功能分子可以含有同或异双功能性。

如本文所用，表面活性聚合物降低水的表面张力和/或与其他相的界面张力，并且因此在液/汽界面被正吸附。

抗体是结合特定表位的任何免疫球蛋白，包括抗体和其片段。该术语包括多克隆抗体、单克隆抗体，和嵌合抗体。抗体结合部位是抗体分子的结构部分，其由特异结合抗原的重链和轻链可变和高变区组成。如本文所用的多种语法形式的短语抗体分子预期为完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。示例性抗体分子是完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的含有互补位的那些部分，包括本领域已知的那些部分，如Fab、Fab′、F(ab′)₂和F(v)，所述部分优选用于本文所述的治疗方法中。通过本领域公知的方法，分别用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶蛋白酶解基本上完整的抗体分子制备抗体分子的Fab和F(ab′)₂部分。短语单克隆抗体在其多种语法形式中指具有仅仅一种抗体结合部位的抗体，所述抗体结合部位能够与特定抗原免疫反应。单克隆抗体从而通常显示出它与之免疫反应的任何抗原的单一结合亲和力。单克隆抗体因此可以含有具有多个抗体结合部位的抗体分子，每个抗体结合部位对于不同的抗原是免疫特异性的，例如，双特异性(嵌合的)单克隆抗体。

实施例

实施例1.多核苷酸合成和装配.使用下面合成的RNA寡核苷酸(Dharmacon，Lafayette CO)。有义链RNA含有伯胺，其在5’具有六个碳间隔基以允许缀合到递送载体。2′ACE保护的RNA寡核苷酸在退火步骤前根据生产商的说明书进行去保护。siRNAs具有下面的序列：

apoB(Ensembl#ENSMUST00000037520)；

apoB-1siRNA

有义

5′-NH₄-GAAmUGmUGGGmUGGmCAAmCmUmUmUmA^＊G，SEQ ID 1，

反义5′-P-AmAAGUUGCCACCCACAUUCmA^＊G，SEQ ID 2；

apoB-2siRNA

有义5′-NH₄-GGAmCAmUGGGmUmUCCAAAmUmUAmC^＊G，SEQ ID 3，

反义5′-P-UmAAUUUGGAACCCAUGUCCmC^＊G，SEQ ID 4；

ppara(GenBank#NM_011144)；

ppara-1siRNA，

有义

5′-NH₄-mUmCAmCGGAGmCmUmCAmCAGAAmUmUmC^＊U-3′，SEQ ID 5，

反义5′-P-AmAUUCUGUGAGCUCCGUGAmC^＊U-3′，SEQ ID6；

ppara-2siRNA

有义5′-NH₄-mUmCCCAAAGCmUCCmUmUmCAAAAmU^＊U-3′，SEQ ID 7，

反义5′-P-mUmUUUGAAGGAGCUUUGGGAmA^＊G-3′，SEQ ID8；

对照siRNA(GL-3萤光素酶报道基因)，

有义

5′-NH₄-mCmUmUAmCGmCmUGAGmUAmCmUmUmCGAmU^＊U-3′；SEQ ID 9，

反义5′-P-UmCGAAGUACUCAGCGUAAGmU^＊U；SEQ ID 10；

m＝2′-O-CH₃取代，

^＊＝硫代磷酸酯连接，和

P＝PO₄。

每种靶序列的有义和反义寡核苷酸如下进行退火：混合等摩尔量的每一种并在94℃加热5分钟，冷却到90℃3分钟，然后以0.3℃的梯度降温250次，在每个梯度保持3秒。

实施例2.聚乙烯醚随机共聚物

A.乙烯醚单体的合成.使用四正丁基溴化铵(0.5g)作为相转移催化剂通过在100℃DMF(75ml)中将2-氯代乙基乙烯醚(25g，0.24mol)和邻苯二甲酰亚胺(25g，0.135mol)反应制备2-乙烯氧基乙基邻苯二甲酰亚胺。将该溶液加热6小时然后在水中冷却(crash out)并过滤。然后将该固体从甲醇重结晶两次得到白色晶体。

B.胺+低级烷基聚乙烯醚聚合物.从具有不同的烷基与胺比例并具有一到四个碳的烷基的乙烯醚单体合成一系列共聚物(图1，R和R’可以是相同或不同的)。膜活性取决于疏水单体的大小(烷基链长度)和比例(Wakefield 2005)。使用模式脂质体，发现丙基和丁基来源的聚合物是膜裂解性的，而含有甲基和乙基的聚合物不是。我们将这些聚合物称作甲基、乙基、丙基或丁基-氨基乙烯醚(或分别为PMAVE、PEAVE、PPAVE，或PBAVE)。这些聚合物具有足够的电荷以与DNA在生理学浓度的盐溶液中复合。相比，小膜裂解性阳离子肽如蜂毒肽太弱并且不能在等渗盐溶液中浓缩DNA。合成的两亲性聚合物的较大尺寸不仅增强了它们的DNA结合能力，而且使得它们在摩尔基础上比蜂毒肽更具裂解性。用较少数目的聚合物分子裂解膜的能力将促进体内核酸递送。使用荧光团标记的DNA，我们测定了合成的聚合物的电荷密度并证实了它们在盐水中的稳定性。

C.合成水溶性、两亲性膜活性聚乙烯醚多胺三元共聚物.将X mol％胺保护的乙烯醚(例如，2-乙烯氧基乙基邻苯二甲酰亚胺)在氮气层下加入烘干的圆底烧瓶的无水二氯甲烷中。向该溶液加入Y mol％烷基(例如，乙基、丙基或丁基)乙烯醚，接着加入Z mol％烷基(十二烷基、十八烷基)乙烯醚(图1)。尽管所详述的聚合物来自2-3种不同的单体，但是本发明不限于乙烯醚单体的具体组成。容易设想包含更多单体或不同单体的聚合物。将溶液用干冰丙酮浴降温到-78℃。向该溶液加入10mol％BF₃EtOEt并让反应在-78℃下进行2-3小时，然后用甲醇氢氧化铵溶液淬灭。将聚合物减压干燥，然后置于30ml 1，4-二

烷/甲醇(2/1)中。加入20摩尔当量肼/邻苯二甲酰亚胺以从胺除去保护基。溶液回流3小时，然后减压干燥。将固体置于20ml 0.5M HCl中，回流15分钟，用20ml蒸馏水稀释，并回流额外的一小时。然后将溶液用NaOH中和，冷却到室温，转移到3,500分子纤维素管中，对蒸馏水透析24小时(2×20L)，并冻干。使用分析型大小排阻柱根据标准方法估计聚合物的分子量。尽管在这些实施例中描述了含有所指出的乙烯醚单体的聚合物，但是本发明不限于这些具体的单体。

通过用肼和HCl顺序处理除去邻苯二甲酰亚胺基团后，将聚合物转移到3,500分子纤维素管中并对蒸馏水透析24小时(2×20L)，并冻干。然后将聚合物溶于水中并置于琼脂糖(sephadex)G-15柱上。分离从sephadexG-15排阻的聚合物并通过冻干浓缩。然后使用Eprogen Inc.CATSEC100、CATSEC300和CATSEC1000串联柱通过GPC测定聚合物的分子量。运行缓冲液为50mM NaCl，0.1％TFA，和10％MeOH。聚乙烯吡啶标准用作校准曲线。聚合物的分子量在10,000-100,000Da范围内，多数聚合物制剂大于20,000Da。

D.合成DW1360.从2-乙烯氧基乙基邻苯二甲酰亚胺(3.27g，15mmol)，丁基乙烯醚(0.40g，4mmol)，和十八烷基乙烯醚(0.29g，1mmol)单体合成胺/丁基/十八烷基聚乙烯醚三元共聚物。将单体溶解在30ml无水二氯甲烷中。然后将这些溶液加入-78℃干冰/丙酮浴。2分钟后，加入BF₃·OEt₂(0.042g，0.3mmol)并让反应在-78℃进行3小时。然后通过加入氢氧化铵在甲醇中的50/50混合物或硼氢化锂溶液终止聚合作用。然后通过旋转蒸发除去溶剂。然后将聚合物溶解在30ml 1，4-二烷/甲醇(2/1)中。向该溶液加入肼(0.44g，138mmol)并将混合物加热回流3小时。然后通过旋转蒸发除去溶剂，并将所得的固体置于20ml 0.5M HCl中并回流15分钟，用20ml蒸馏水稀释，再回流1小时。然后用NaOH中和该溶液，冷却到室温，转移到3,500分子纤维素管中并对蒸馏水透析24小时(2×20L)，并冻干。

类似地，可以合成含有不同比例的胺、丁基和十八烷基的其他聚合物。也可以掺入其他单体。具体地，叔丁基乙烯醚、十二烷基乙烯醚和油酸乙烯醚(oleic vinyl ether)已经被掺入到聚合物中。

在一个实施方案中，使用单体以15个胺单体∶4个低级烷基单体∶1个高级烷基单体的进料比例可以合成胺/低级烷基/高级烷基聚乙烯醚三元共聚物。在上述条件下，确定所掺入的比例为约5.4-7.5个胺单体∶3-3.5个低级烷基单体∶1个高级烷基单体。在另一实施方案中，使用单体以4-8个胺单体∶3-5个低级烷基单体∶1个高级烷基单体合成胺/低级烷基/高级烷基聚乙烯醚三元共聚物。在优选实施方案中，聚合物是水溶性的(在25℃下约1mg/ml或更大)和表面活性的。

在一个实施方案中，将聚合物分级分离以产生分子量约5kDa到约50kDa，更优选约10kDa到约30kDa的聚合物。

E.其他三元共聚物.类似的聚合物可以由不同碱基聚合物的修饰合成，包括，但不限于：聚-L-赖氨酸(PLL)、聚乙烯胺(PVA)和聚烯丙基胺(PAA)。通过将不同的烷基连接到这些聚合物的主链，可以制备胺∶低级烷基∶高级烷基的比例为约6∶3∶1的三元共聚物。

F.脂质体裂解.用含有100mM羧基萤光素(CF)和10mM HEPES的1ml缓冲液(pH 7.5)水化10mg卵磷脂酰胆碱。然后通过100-nm孔的聚碳酸酯滤器(Nucleopore，Pleasanton，CA)挤出脂质体。使用琼脂糖(Sepharose)4B-200通过大小排阻层析除去未被捕获的CF，用10mMHEPES pH 8.0.1M NaCl洗脱。将200μL等分试样的CF装载的脂质体加入1.8ml等渗缓冲液。向小泡悬浮液加入0.25μg聚合物或蜂毒肽后30分钟测量荧光(λ_ex＝488，λ_em＝540)。每次实验结束时，通过加入40μl 1％TritonX-100溶液破坏小泡以测定最大裂解。

实施例3.掩蔽剂

A.合成2-丙酸-3-甲基马来酐(羧基二甲基马来酐或CDM).向氢化钠(0.58g，25mmol)在50ml无水四氢呋喃中的悬浮液中加入2-膦酰基丙酸三乙酯(7.1g，30mmol)。氢气的释放停止后，加入溶于10ml无水四氢呋喃中的2-酮戊二酸二甲酯(3.5g，20mmol)并搅拌30分钟。然后加入10ml水并通过旋转蒸发除去四氢呋喃。用3x50ml乙醚萃取所得的固体和水混合物。合并乙醚萃取物，用硫酸镁干燥，并浓缩得到浅黄色油。通过硅胶层析用2∶1乙醚∶己烷洗脱纯化油，产生4g(82％产率)纯的三酯。然后将该三酯溶解到50ml含有4.5g(5当量)氢氧化钾的水和乙醇的50/50混合物中形成2-丙酸-3-甲基马来酐。加热该溶液以回流1小时。然后通过旋转蒸发除去乙醇并用盐酸酸化该溶液至pH2。然后用200ml乙酸乙酯萃取该水溶液，将其分离，用硫酸镁干燥并浓缩得到白色固体。然后将该固体从二氯甲烷和己烷重结晶产生2g(80％产率)2-丙酸-3-甲基马来酐。

通过用草酰氯转化CDM成它的酰基氯接着加入硫醇、酯或者胺和吡啶可以从CDM合成硫酯、酯和酰胺。CDM和它的衍生物通过本领域的标准方法容易地修饰，以加入寻靶配体、位阻稳定剂、带电基团和其他反应基。所得的分子可以用于可逆地修饰胺。

B.含有半乳糖的寻靶基团.最广泛研究的肝细胞寻靶配体是基于半乳糖，其被肝细胞上的脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)结合。已经表明半乳糖的附着促进一些高度水溶性的不带电聚合物的肝细胞寻靶，所述聚合物包括：寡糖壳聚糖、聚苯乙烯衍生物和聚丙烯酰胺HPMA。使用乳糖、半乳糖-葡萄糖二糖，通过葡萄糖残基的修饰容易地产生半乳糖寻靶基团。使用标准酰胺偶联技术，容易将乳糖酸(LBA，乳糖衍生物，其中葡萄糖已经被氧化成葡糖酸)掺入到马来酐衍生物中。图2显示了将半乳糖偶联到马来酐CDM的两种LBA衍生物的结构。

马来酰胺酸修饰将带正电荷的胺基转化为带负电荷的胺基。该电荷修饰可以减小聚合物与带负电荷的细胞和血清组分的非特异性相互作用。然而，太多的负电荷可以增强与清除受体的相互作用。通过在掩蔽剂中插入带正电荷的叔胺基产生两性离子，可以产生净中性的含有半乳糖的马来酐衍生物。从组分：CDM、丙基氨基哌嗪和乳糖酸产生了这种化合物：CDM-Pip-LBA(图2)。

C.位阻稳定剂CDM-PEG和寻靶基团CDM-NAG(N-乙酰半乳糖胺)合成(图2).向50ml二氯甲烷中的CDM(Rozema 2003)(300mg，0.16mmol)溶液加入草酰氯(2g，10wt.eq.)和二甲基甲酰胺(5μl)。允许反应过夜进行，此时通过旋转蒸发除去过量的草酰氯和二氯甲烷，产生CDM酰基氯。将酰基氯溶解在1ml二氯甲烷中。向该溶液加入10ml二氯甲烷中的1.1摩尔当量的聚乙二醇一甲基醚(平均分子量450)(对于CDM-PEG)或(氨基乙氧基)乙氧基-2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷(即，氨基二乙氧基乙基NAG)(对于CDM-NAG)和吡啶(200μl，1.5当量)。然后搅拌该溶液1.5小时。然后除去溶剂并将所得的固体溶解到5ml水中并使用0.1％TFA水/乙腈梯度用反相HPLC纯化(图2)。

实施例4.多核苷酸与聚合物的可逆连接.用S-乙酰基修饰氨基siRNA寡核苷酸导致稳定的受保护的硫羟基，其可以在含有胺的聚阳离子存在下在碱性溶液(pH≥9)中释放。用于除去硫酯基的标准去保护条件需要与羟胺温育。然而，这些去保护条件导致严重的siRNA二硫化物二聚体形成。通常，烷基胺和硫酯之间的反应相对较低，但是在聚阴离子siRNA和聚阳离子胺之间的复合体中，官能团之间的反应变得基本上为分子内的并且被极大地加速(见图3中的步骤2a)。除了加速去保护作用外，所释放的硫羟基与聚阳离子上活化的二硫基的反应也被极大地增强(步骤2b)。活化的二硫化物吡啶基二硫醇(PD)确保了选择性二硫化物形成，并且容易地用可商购的试剂连接到聚阳离子。这些颗粒内反应的结果为二硫化物与聚阳离子的＞90％的缀合。

实施例5.多核苷酸与聚合物的可逆缀合

A.SATA修饰的多核苷酸.通过5’胺修饰的siRNA与1重量当量(wt.eq.)的SATA试剂(Pierce)和0.36wt.eq.NaHCO₃在水中4℃下反应16小时合成N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)修饰的多核苷酸。通过加入9体积的乙醇并在-78℃温育2小时沉淀受保护的硫羟基修饰的siRNAs。分离沉淀物，将其溶解在1×siRNA缓冲液(Dharmacon)中，并通过测量260nm波长下的吸光度定量。

通过加入1.5wt％4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-[2-吡啶基二硫代]-甲苯(SMPT，Pierce)修饰聚合物(在该实施例中为PBAVE或DW1360(5mM TAPS pH 9中30mg/ml)。加入SMPT后1小时，向含有5mM TAPSpH 9的400μl等渗葡萄糖溶液加入0.8mg SMPT-聚合物。向该溶液加入50μg SATA修饰的siRNA。对于其中PBAVE浓度恒定的剂量反应实验，加入不同量的siRNA。然后温育混合物16小时。这样，多核苷酸通过可逆的二硫键缀合到聚合物。用于聚合物和siRNA之间缀合的二硫键在细胞质的还原环境中提供了可逆性。通过向溶液中加入5.6mg HEPES游离碱接着加入3.7mg CDM-NAG和1.9mg CDM-PEG的混合物掩蔽siRNA-聚合物缀合物。注射前在室温(RT)下温育该溶液1小时。

B.缀合的多核苷酸的定量.为了定量缀合的siRNA的量，将含有1μgsiRNA的10μl等分试样的siRNA-聚合物缀合物用2μl 1M DTT或不用添加剂在室温下处理16小时。向样品中加入100μg聚丙烯酸和300μgNaCl以中和静电相互作用。2小时温育后，样品在2％琼脂糖凝胶上电泳并通过用溴化乙锭染色显示siRNA。用Kodak分子成像软件(MolecularImaging Software)4.0版定量siRNA带。将未缀合的siRNA的量对DTT处理时释放的量归一化以确定缀合百分数。缀合的siRNA的量通常为70-90％。

可以使用其他二硫化物缀合化学，其中硫羟基作为二硫化物被保护或者根本不被保护。此外，可以用其他活化的二硫化物基团、硫羟基或者保护的硫羟基修饰聚合物。

实施例6.CDM-掩蔽剂与多核苷酸-聚合物缀合物的可逆连接.可以如用马来酸衍生物修饰多核苷酸-聚合物缀合物以可逆地修饰该聚合物(图3，步骤4)。通过向溶液中加入5.6mg HEPES游离碱接着加入3.7mgCDM-NAG和1.9mg CDM-PEG的混合物掩蔽siRNA-聚合物缀合物。在体内注射前，在室温(RT)温育溶液1小时。

实施例7.被掩蔽的缀合物的寻靶活性.为了阐明CDM-PIP-LBA(含有半乳糖)剂能够使得两亲性聚乙烯醚25/75(25∶75丁基∶胺)PBAVE进行肝脏寻靶，将该聚合物用荧光团Cy3标记，接着用CDM-PEG与或不与CDM-Pip-LBA进行修饰。将400μl等渗葡萄糖中的100μg掩蔽的聚合物注射到小鼠的尾静脉。注射后1小时取出肝脏样品并制备和处理冷冻的肝脏切片用于免疫组织化学(图4)。如图4中所示，CDM-Pip-LBA寻靶的聚合物广泛地位于肝细胞内(B)，而非寻靶的聚合物主要位于肝脏的巨噬细胞(A)。

CDM-LBA修饰的PBAVE是高度阴离子的并且主要发现于巨噬细胞(未显示)。CDM-Pip-LBA(两性离子掩蔽剂)修饰的聚合物接近中性并且总体上显示靶向肝脏并且更重要的是，靶向肝细胞的聚合物的量增加(图4B)。还可能用位阻稳定剂，包括CDM-PEG掩蔽剂屏蔽电荷，如负电荷。

实施例8.多核苷酸对肝细胞的寻靶.如上述制备寡核苷酸-聚合物缀合物并用CDM-Pip-LBA掩蔽。将20μg SATA/Cy3修饰的siRNA缀合到1.8mg PD-修饰的PLL并用CDM-Pip-LBA修饰。将400μL盐水中经掩蔽的缀合物注射到小鼠的尾静脉。在相同的注射液中为用俄勒冈绿(Oregon Green)标记的100μg CDM-Pip-LBA-修饰的25/75-PBAVE。缀合物在生理条件下是可溶的并且不聚集。注射后1小时，收集肝脏并制备并处理冷冻肝脏切片用于免疫组织化学。用

染色细胞核。注射到小鼠的尾静脉中后，在肝细胞中观察到经标记的寡核苷酸和PBAVE(图5的左上小图)。

实施例9.缀合物的体内活性.评估了经掩蔽的多核苷酸-聚合物缀合物递送siRNA用于抑制小鼠肝脏中的内源基因：过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARa)的能力。经尾静脉用400μL等渗葡萄糖中的CDM-Pip-LBA修饰的PPARa siRNA-PLL缀合物(20μg siRNA，1.8mgPD-PLL)和25/75-PBAVE(100μg)注射C57B小鼠(n＝4)。注射后48小时从肝脏制备RNA。用定量实时PCR(qRT-PCR)测定PPARa mRNA水平。将mRNA水平对用抗萤光素酶siRNA注射的动物归一化。mRNA水平的改变对内源GAPDH归一化。进行三次独立的实验。如图6所示，得到PPARa mRNA水平的20％抑制。

实施例10.缀合物的体内递送/活性.从Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN)得到6到8周龄雄性小鼠(品种C57BL/6，20-25g)。注射前将小鼠圈养至少10天。用Harlan Teklad啮齿动物饮食(RodentDiet)(Harlan，Madison WI)随意进行喂养。用总体积0.4ml注射HEPES-缓冲的(5mM pH 7.5)等渗葡萄糖灌注到小鼠的尾静脉中。用DNA或siRNA缀合物注射小鼠。

将小鼠禁食4小时，然后通过眼窝后取血收集血清并收集肝脏。收集用于Western测定法中的血清并加入到等体积的含有EDTA的完全蛋白酶抑制剂混合物(Complete Protease Inhibitor Cocktail)(Roche，IndianapolisIN)并在-20℃保存。收集后立即用

根据生产商的方案(Molecular Research Center，Cincinnati OH)从肝脏分离总RNA。

为了分析肝细胞寻靶，如上述配制总体积0.2ml的含有10μg Cy3-标记的，21-聚体dsDNA的多缀合物并通过静脉内注射递送到雄性ICR小鼠(20-25g，Harlan Sprague Dawley)中。注射后1小时，处死小时并切除肝脏样品。在一些实验中，也切除来自肺、肾、脾、脑和胰腺的组织样品。将组织样品在4％低聚甲醛/PBS中固定6小时，然后在4℃下置于30％蔗糖/PBS溶液中过夜。然后将固定的组织样品置于含有OCT冷冻培养基(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)的块规夹持器(block holder)中并在液氮中快速冷冻。用Microm HM 505N恒冷切片机(Carl Zeiss，Thornwood，NY)制备冷冻的组织切片(8-10μm)并置于Superfrost-Plus显微镜载玻片(Fisher Scientific)上。用PBS中的

鬼笔环肽(13nM，Invitrogen，Carlsbad CA)和

(40nM，Invitrogen)复染组织切片20分钟。将切片在Vectashield(Vector Laboratories，Burlingame CA)中封片并通过LSM510共焦显微镜(Carl Zeiss)分析。

图7中(每个小图的左上象限)中显示了用含有Cy3-标记的，21-聚体双链DNA的多核苷酸-聚合物缀合物注射后1小时取自小鼠的肝脏切片的共焦显微照片。肌动蛋白在右上象限中显示以指示细胞轮廓。细胞核在左上象限中显示。合并的图在右下象限中显示。当聚合物含有NAG寻靶部分时，观察到Cy3-标记的dsDNA在肝细胞中的积累，被肝巨噬细胞摄入或在肝窦状隙中的积累最小(图7A)。分布在肝脏的不同叶片各处接近均匀。其他器官的检查揭示了在脾和肾中微小的Cy3-荧光，其水平估计比肝脏中低20倍。注射未缀合的多核苷酸+聚合物或者用CDM-葡萄糖代替递送载体上的CDM-NAG导致显著降低的肝细胞摄入和被脾和肾的摄入增加(分别图7B和7C)，其与葡萄糖对脱唾液酸糖蛋白受体的低亲和力相一致。用CDM-甘露糖代替递送载体上的CDM-NAG导致增加的巨噬细胞和肝脏内皮细胞寻靶(图7D)。

定量PCR和Invader测定法(Invader Assays).在准备定量PCR中，用SUPERSCRIPT

(Invitrogen)和寡聚-dT引物根据生产商的方案反转录总RNA(500ng)。通过使用7500型快速实时PCR系统(Model 7500Fast Real-Time PCR system)(Applied Biosystems，Foster City CA)进行定量PCR。针对apoB和ppara的

基因表达测定法(GeneExpression Assays)以一式三份用于二路(biplex)反应，使用GAPDHmRNA引物和探针，使用

Universal PCR Master Mix(AppliedBiosystems)。GAPDH引物和探针(IDT，Coralville IA)的序列为：

GAPDH-正向5′-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′，SEQ ID 11；

GAPDH-反向5′-CATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG-3′，SEQID 12；

GAPDH-探针

5′-Hex/CGTGCCGCCTGGAGAAACCTGCC/BHQ-3′，SEQ ID 13。

用定制的

mRNA测定法根据生产商说明书(Third WaveTechnologies，Madison WI)进行ppara mRNA水平的直接测量。使用泛蛋白的探针组，根据生产商的说明书以一式三份进行二路反应。

ApoB western，细胞因子测定法和肝脏毒性和代谢组(panels).通过在3-8％聚丙烯酰胺/SDS凝胶上电泳完成血清蛋白(0.1μl)的分离。将分离的蛋白质电泳转移到PVDF膜接着用兔多克隆抗ApoB抗体(BiodesignInternational，Saco ME)的1∶5000稀释液温育。然后将印迹与缀合到辣根过氧化物酶的山羊抗兔抗体(Sigma)的1∶80,000稀释液温育，用增强的化学发光检测试剂盒(Amersham Biosciences，Piscataway NJ)检测抗体结合。通过夹层ELISA使用试剂根据生产商的说明书(R&D Systems，MinneapolisMN)测量小鼠细胞因子TNF-α和IL-6的血清水平。用夹层ELISA试剂盒根据生产商的说明书(PBL Biomedical，Piscataway NJ)测量小鼠IFN-α的血清水平。用Marshfield临床实验室兽医诊断部(Marshfield ClinicLaboratories Veterinary Diagnostic Division)(Marshfield WI)的自动化系统测量ALT、AST、胆固醇和甘油三酯的血清水平。

siRNA缀合物处理的小鼠中细胞因子和肝脏酶的血清水平

n＝5，数据以平均值±标准差显示

实施例11.小鼠肝脏中靶基因的降低(knockdown).为了阐明该系统在体内递送siRNA和降低靶基因表达的能力，将含有apoB-1siRNA(800μg聚合物，50μg siRNA)的缀合物注射到C57Bl/6小鼠中。如在体内寻靶研究中，通过尾静脉灌注施用siRNA缀合物。注射后两天从经注射的小鼠收集肝脏并用反转录酶定量PCR(RT-qPCR)测定apoB mRNA水平。相对于GAPDH mRNA的水平和μg总输入RNA测量apoB mRNA水平以便减小如下的可能性：相对apoB mRNA水平的差异是由于对持家基因表达的非特异性影响。如图8A所示，用apoB-1siRNA缀合物处理的小鼠与接受非apoB对照siRNA的小鼠或者仅用盐水注射的小鼠相比具有显著降低的apoB mRNA水平(n＝5，p＜0.00001)，如注射后两天测量。特别地，接受apoB-1siRNA缀合物的小鼠中平均apoB mRNA水平与盐水处理组相比相对于GAPDH mRNA水平降低76±14％，而用对照siRNA注射的小鼠中apoB mRNA水平未受影响。如果相对于总RNA测量apoB mRNA水平，那么得到相似的结果。血清中apoB-100蛋白质水平的蛋白质印迹分析反映了肝脏apoB mRNA水平的降低(图8B)。

为了证实apoB降低的特异性，将单独的一组小鼠用靶定apoB mRNA的不同区的siRNA处理。接受apoB-2siRNA缀合物的小鼠也显示出apoBmRNA水平的显著降低(60±6％降低，n＝5，p＜0.00001，图8A)。血清中apoB-100蛋白质水平的蛋白质印迹分析反映了肝脏apoB mRNA水平的降低(图8B)。在空肠(表达apoB基因的另一组织)中的ApoB mRNA表达没有降低，提示该缀合物不靶向该组织。该组织特异活性与肝细胞寻靶相一致。

我们也制备了含有靶定过氧化物酶体增殖物激活受体α(ppara)的siRNA的缀合物，过氧化物酶体增殖物激活受体α是在控制肝脏中脂肪酸代谢中一种重要的基因(Kersten 1999，Schoonjans 1996)。靶定ppara的两种不同的siRNAs的递送导致ppara mRNA水平显著降低，如通过用于定量mRNA水平的两种独立的方法测定(图8C)。相对于接受对照siRNA的小鼠，接受ppara-1siRNA的小鼠中ppara mRNA水平降低40±9％到64±9％，如分别通过

或RT-qPCR测定。在用含有ppara-2siRNA的递送载体注射的小鼠中观察到ppara mRNA水平的相似的降低，所述siRNA靶定ppara mRNA序列的单独区域。

通过测量肝脏酶和细胞因子的血清水平评估递送系统的潜在毒性。注射后48小时，与盐水处理的小鼠相比，在接受对照siRNA或apoB-1siRNA缀合物的小鼠中检测到ALT和AST水平的轻微升高。然而，升高的水平不是显著的(p＜0.05)并且肝脏切片的组织学检查也没有揭示肝脏毒性病征。类似地，用ELISA对血清中TNF-α和IL-6水平的分析揭示两种水平在siRNA-聚合物缀合物注射后6小时轻微升高，但是到48小时时返回到基线水平。将预期在6小时时观察到的升高不会引起显著的免疫刺激并且比脂多糖刺激时观察到的水平低至少四个数量级(Matsumoto 1998，Matsuzaki 2001)并且比腺病毒注射后观察到的水平低1到3个数量级(Lieber 1997，Benihoud 2007)。除了注射apoB-1siRNA缀合物后6小时的轻微升高，在任何时间点都没有检测到INF-α血清水平的显著差异。这些结果表明该靶向递送系统是良好耐受的。

实施例12.剂量反应和表型分析.我们以两种方式进行了剂量反应研究：通过减少递送到小鼠的siRNA缀合物的量或者通过保持聚合物的量恒定但是降低缀合的siRNA的量。通过比较这些实验的结果，我们希望确定递送载体的哪两种组分对于递送是限制性的：内体裂解性聚合物或siRNA自身。

向小鼠注射apoB-1siRNA缀合物的简单的连续稀释液导致肝脏apoBmRNA的降低量的逐渐减少(图9A)。在最高注射剂量(800μg聚合物，50μgsiRNA，即，2.5mg/kg)下，与仅仅注射盐水的小鼠相比，注射后第2天肝脏中apoB mRNA水平相对于GAPDH mRNA降低84±5％。当相对于总RNA测量apoB mRNA水平时，得到类似的结果。注射低两倍的siRNA缀合物(400μg聚合物，25μg siRNA)导致相对于apoB mRNA水平降低50±8％。低四倍的注射导致与盐水对照组相比没有apoB降低。保持聚合物的量恒定但是降低缀合到递送载体的apoB-1siRNA的量导致与从连续稀释液得到的那些结果在数量上相似的结果(图9B)。该发现提示存在于递送载体中的内体裂解性聚合物的量不是所观察到的降低的限制性因素，相反，限制性因素是缀合到聚合物的siRNA的量或功效。

apoB缺乏的标志是由于VLDL装配和胆固醇从肝脏转运的受损引起的降低的血清胆固醇水平(Burnett Zimmermann 200602)。为了确定图10中所示的apoB的降低水平足够在这些小鼠中引起生理应答，我们测量了它们的总的血清胆固醇水平。在最高递送的siRNA剂量(50μg)下，我们观察到相对于接受对照siRNA或仅接受盐水的小鼠，平均血清胆固醇水平的显著降低(30±7％，n＝5，p＜0.001)(图10)。在用apoB-2siRNA缀合物处理的动物中得到相似的结果。降低递送的siRNA的量导致所观察到的胆固醇降低量的逐渐减少，这与在这些动物中测量到的减少的apoB mRNA降低相一致。

肝脏中VLDL装配的受损和导致的VLDL输出的减少也可以预期改变肝脏甘油三酯水平，因为甘油三酯也被掺入到VLDL颗粒中(Gibbons2004)。实际上，表达截短形式的apoB(类似于在家族性β-脂蛋白过少血症患者中观察到的形式)的转基因小鼠也显示出转运肝脏甘油三酯的能力降低(Chen 2000)。为了评估apoB降低对甘油三酯转运的影响，我们对从用apoB-1siRNA缀合物注射的小鼠得到的肝脏切片进行了油红染色。肝脏切片的检查揭示了与对照小鼠相比显著增加的甘油脂类含量(图11)。小图A显示了用ApoB siRNA处理的小鼠。小图B显示了用阴性对照GL3siRNA处理的小鼠。小图C显示了仅用盐水注射的小鼠。在这些小鼠中也检测到降低的血清甘油三酯水平，为降低的肝脏甘油三酯输出能力提供了进一步的证据。这些结果一起表明简单的静脉内注射apoB-1siRNA缀合物导致多核苷酸向肝细胞的功能递送并且因此导致肝脏中apoB表达的降低与预期的表型效应。

为了分析肝脏脂肪积累，将来自siRNA-缀合物处理的和对照小鼠的肝脏样品在OCT冷冻介质中冷冻并如上述制备冷冻组织切片(8-10μm)。将风干的组织切片在4％甲醛/PBS中固定20分钟，用蒸馏水冲洗几次，然后用60％异丙醇快速冲洗。通过在100ml异丙醇中混合物0.5g油红O过夜并用Whatman#1滤纸过滤制备油红O贮存液。通过混合20ml水与30ml油红O贮存液并用0.2μm Nalgene过滤单位(Fisher Scientific)过滤制备油红O工作液。固定的切片用现制备的油红O工作液染色15分钟，用60％异丙醇快速冲洗。通过将载玻片浸入Harris改良的苏木精溶液(Sigma，St.Louis MO)7次并用蒸馏水冲洗进行细胞核的复染。然后将冲洗后的载玻片用Gel Mount(Biomedia Corp.，Foster City CA)封片。用装备数码相机的Zeiss Axioplan 2显微镜(Axiocam，Carl Zeiss)分析染色的载玻片。用AxioVision软件(Carl Zeiss)捕获数字图像。

实施例13.通过经CDM或二硫化物不稳定连接缀合到膜活性聚合物递送siRNA.二硫化物缀合物：在HEPES碱pH 7.5存在下，将靶定萤光素酶的在有义链上具有5’氨基的50ng siRNA与1μgN-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯反应。单独在HEPES pH 7.5存在下将从胺保护的和丁基乙烯醚单体的50/50混合物合成的50μg聚乙烯醚与5μg3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应。然后合并经修饰的siRNA和经修饰的聚合物以允许siRNA共价连接到聚合物。6-24小时后，在HEPES碱存在下，将聚合物-siRNA缀合物与200μg2-丙酸-3-甲基马来酐反应。将颗粒加入稳定表达萤光素酶基因的小鼠肝细胞HEPA细胞系。作为对照，向细胞加入含有CMD修饰的聚合物(无siRNA)的样品。在暴露于聚合物-多核苷酸缀合物的细胞中，萤光素酶表达相对于仅暴露于聚合物的细胞被抑制75％，表明功能性siRNA向细胞的递送。

CDM缀合物：在HEPES pH 7.9存在下，将靶定萤光素酶的在有义链上具有5’氨基的50ng siRNA与2μgCDM硫酯反应。向siRNA加入从胺保护的和丁基乙烯醚单体的50/50混合物合成的50μg聚乙烯醚。6-24小时后，在HEPES碱存在下，将聚合物-siRNA缀合物与200μg2-丙酸-3-甲基马来酐反应。将颗粒加入稳定表达萤光素酶基因的小鼠肝细胞HEPA细胞系。作为对照，向细胞加入含有CMD修饰的聚合物(无siRNA)的样品。在暴露于聚合物-多核苷酸缀合物的细胞中，萤光素酶表达相对于仅暴露于聚合物的细胞被抑制86％，表明功能性siRNA向细胞的递送。

用膜活性聚合物-siRNA缀合物转染HEPA-Luc细胞后萤光素酶活性的抑制百分数

二硫化物缀合	CDM缀合
		75％	86％

实施例14.apoB降低的寿命和它的表型效应.我们进行了时间过程实验来测定注射单次剂量的apoB-1siRNA缀合物后小鼠中apoB降低和胆固醇降低的持续时间。与我们在前面部分中所述的结果一致的是，注射apoB-1siRNA缀合物(800μg聚合物，50μg siRNA)导致在第2天相对于对照小鼠平均apoB mRNA水平降低87±8％(图12A)。apoB表达的降低伴随着总血清胆固醇水平降低42±5％(图12B)。apoB mRNA表达的降低直到第10天都保持显著，并且到第15天返回到接近对照水平。血清胆固醇的降低保持显著到第4天(n＝5，p＜0.01)，并且直到第10天才完全恢复到对照水平。这些结果表明单次注射siRNA缀合物后可以实现持续的apoB降低和表型的产生，并且随着apoB的表达随时间返回到正常水平，表型可以被逆转。

实施例15.使用聚合物-PMO缀合物将二氨基磷酸吗啉代寡核苷酸(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide(PMO))递送到细胞.

使用用于连接siRNA和聚合物的基于CDM-硫酯的交联，也可能将其他类型的寡核苷酸可逆地缀合物到聚合物。具体地，我们研究了PMO向细胞的递送。在HEPES pH 7.9存在下，将裸的或者与DNA互补链杂交的5nmol氨基-PMO(其阻断突变的萤光素酶转录物中的突变剪接位点)不与任何物质反应或者与2μgCDM硫酯反应。向其中加入从50％氨基乙烯醚、45％丁基乙烯醚和5％十二烷基乙烯醚(DW550)合成的200μg聚乙烯醚。三个或以上的小时后，将聚合物+PMO或聚合物-PMO缀合物与500μgCDM在HEPES存在下反应以保持pH＞7.5。除了CDM外，将缀合物与CDM的PEG酯反应，所述酯衍生自CDM的酰基氯和不同分子量的PEG一甲基醚。然后将缀合物加入到在用于HeLa细胞的条件下生长的HeLaLuc/705细胞(Gene Tools，Philomath OR)。细胞以3×10⁶个细胞/孔的密度接种在24孔培养皿中并培养24小时。将培养基用含有2.5nmol氨基-PMO复合体的1.0ml DMEM替换。细胞在增湿的5％CO₂培养箱中37℃下培养4小时。然后将培养基用含有10％胎牛血清的DMEM替换。然后额外培养细胞48小时。然后收获细胞并测定裂解物的萤光素酶表达。当转染试剂是DW550聚乙烯醚聚合物-PMO缀合物时，结果表明为不带电多核苷酸的增强的递送。

不带电多核苷酸向细胞的递送

实施例16.siRNA向肌肉的缀合物递送.如上述将40μg PPARasiRNA或对照(GL3)siRNA缀合到PBAVE聚合物并掩蔽。将250μl缀合物注射到小鼠中的腓肠肌(n＝3)。注射速率为约25μl/秒。如上述测定PPARa表达水平。

直接注射掩蔽的缀合物后肌肉中的PPARa抑制

实施例17.siRNA表达盒的体内递送.将20μg PCR产生的线性SEAPsiRNA表达盒(其表达处于U6启动子控制下的SEAP siRNA)与400μg膜活性聚合物DW1453(由75mol％氨基、21mol％低级烷基(丁基)和4mol％高级烷基(C18，十八烷基的聚合组成并且用半乳糖与乳糖酸(LBA)修饰)复合。通过加入43mg LBA到60mg聚合物接着加入34mg EDC和24mg NHS进行乳糖酸化(lactobionylation)。作为对照，也配制表达萤光素酶siRNA(GL3)的盒。通过加入0.65重量当量的戊二醛将DNA缀合到聚合物。过夜缀合后，将复合体用40摩尔％的NHS-乙酸酯修饰以减少聚合物上的电荷。

在14重量当量的HEPES碱存在下将500μg乳糖酸化的DW1453用7重量当量的掩蔽剂CDM-PEG(平均10单位)修饰并注射到表达分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的小鼠的尾静脉中。掩蔽的聚合物注射后10分钟，注射共同靶定的DNA-DW1453聚合物缀合物。在第1和14天，抽血并测定SEAP水平。

活性为4只动物的平均值±标准差。

实施例18.抗体的递送.将35μg兔IGG(Sigma)抗体用2wt％SPDP(Pierce)修饰。通过加入2wt％亚氨基硫烷(iminothiolane)修饰DW1360(5mM TAPS pH 9中30mg/ml)。向含有5mM TAPS pH 9的400μl等渗葡萄糖溶液中加入530μg亚氨基硫烷-PBAVE。向该溶液加入35μgSPDP-修饰的抗体。16小时后，用7重量当量的CDM-NAG和CDM-PEG的2∶1混合物修饰抗体-聚合物缀合物。将缀合物注射到小鼠的尾静脉中。注射后20分钟，处死小鼠并收获肝脏并处理用于显微镜分析。肝脏组织的检查表明肝细胞中抗体的显著积累(图13)。左上象限显示了经标记的抗体。右上象限显示肌动蛋白，左下象限显示细胞核，右下象限显示复合图。

实施例19.作为体外转染试剂的经掩蔽的多核苷酸-聚合物缀合物.使用如以前描述的两步胶原酶灌注方法(Klaunig 1981)从成年小鼠(品种C57BL/6)收获原代肝细胞。如通过锥虫蓝排阻测定的，肝细胞存活力为85-90％。将肝细胞以每孔1.5×10⁵个细胞的密度接种在胶原包被的12孔板中的含有10％胎牛血清的1ml培养基中。接种后24小时，不更换培养基，使用

(Mirus Bio，Madison WI)根据生产商的方案用siRNA或者用不同量的siRNA缀合物转染一式三份的孔中的细胞。转染后24小时收获肝细胞，并用试剂(Molecular ResearchCenter，Cincinnati OH)分离总RNA。

为了阐明所述的经掩蔽的多核苷酸-聚合物缀合物的体外转染性质，用可商购的siRNA转染试剂或者所述的多核苷酸缀合物将载脂蛋白B(apoB)-特异性siRNA递送到原代肝细胞。用缀合物对原代肝细胞的转染是高度有效的，导致apoB mRNA接近80％的降低(图14)。如通过靶基因降低测量的，siRNA递送水平与用商业试剂

实现的水平相当。如预测的，减少加入细胞的缀合物的量导致逐渐减少的apoB降低。

实施例20.作为体外转染试剂的经掩蔽的多核苷酸-聚合物缀合物.使用

(Mirus Bio)，用编码萤火虫和海肾(renilla)萤光素酶的质粒转染Hepa-1c1c7细胞。质粒转染后4小时，向细胞加入用9μgPD-PLL缀合接着用CDM-Pip-LBA(45g)修饰的100ng萤光素酶siRNA。对于某个样品，也向细胞加入CDM-Pip-LBA修饰的25/75-PBAVE(5μg)。加入siRNA后48小时，收获细胞并测定萤火虫和海肾萤光素酶。对于每个样品，将萤火虫表达的量对海肾归一化，并且对于每个组，对没有暴露于siRNA的细胞归一化。PLL-siRNA缀合物单独不能在体外将siRNA递送到细胞(白色条形，图15)。加入马来酰胺酸-掩蔽的膜裂解性聚合物PBAVE导致等于商业转染试剂的活性(黑色条形)。通常，siRNA和DNA转染似乎需要过量试剂。高于与siRNA相互作用所需的过量释放聚合物可以增强体外和体内功能递送(从内体释放)。由于siRNA-聚合物缀合物和聚合物之间相似的大小和电荷，它们可以在体内同时靶定肝细胞。支持该预期的是，我们观察到共同注射缀合到PLL的Cy3-标记的siRNA与俄勒冈绿(Oregon Green)-标记的25/75-PBAVE实际上共同定位到肝细胞(见上文)。

具有递送聚合物的siRNA缀合物的体外活性等同于用商业试剂TRANSIT转染的未缀合的siRNA(图15)。基于碘乙酰胺烷基化化学，用siRNA和聚合物的可逆连接进行的平行实验(图15中的IA-缀合物带斑点条形)表明如果缀合不是可逆的，那么siRNA-聚合物缀合物是无活性的，提示为了siRNA的功能性递送，二硫键必须被还原(所观察到的20％降低是由于没有被缀合的约10％的寡核苷酸，如通过凝胶分析测定)。为马来酰胺酸化的(maleamylated)缀合物观察到的活性提示，即使聚合物不再带正电荷和通过静电力与寡核苷酸相互作用，siRNA-缀合物也抗血清中核酸酶的降解。也可以使用核酸酶抗性的经修饰的siRNA类似物。

实施例21.用于将掩蔽剂和多核苷酸附着到膜活性聚合物的不稳定连接

A.具有PEG间隔基的pH不稳定键。ASGP-R配体寻靶基团的一个实施方案可以如下制备：

化合物I

2-乙酰氨基-3，4，6-三-O-乙酰基-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖苷的(氨基乙氧基)乙基衍生物

化合物II

N-乙酰基-半乳糖胺-PEG-甲基马来酐

化合物I用作产生化合物II的前体，化合物II是能够可逆地修饰含有胺的膜活性聚合物如PBAVE聚合物的半乳糖寻靶基团掩蔽剂。马来酐与聚合物上的胺基的反应导致在半乳糖和聚合物之间形成pH不稳定的连接。用化合物II修饰PBAVE聚合物得到：

化合物III

用化合物III(0.75∶1化合物III与聚合物胺摩尔比)和CDM-PEG₅₀₀(0.25CDM-PEG与聚合物胺摩尔比)修饰PBAVE氨基得到缀合物，其在体内显示出靶向肝细胞。亚乙基的不同的间隔基长度(n＝1，2，3或7)在体内递送siRNA至肝细胞中都是有效的，如通过靶基因表达的降低所证实。

B.具有烷基间隔基的pH不稳定键.如化合物V中阐明，也可以烷基间隔基。然而，烷基间隔基可以增加掩蔽剂的疏水性，导致掩蔽剂和缀合物的较低的溶解度。

化合物V

N-乙酰基-半乳糖胺-C₆-甲基马来酐掩蔽剂

C.多价寻靶基团.也可以利用具有更高价的寻靶基团。在下面阐明了多价半乳糖寻靶基团的示例性实施方案。二价(VI)和三价(VII)半乳糖配体可以对ASGP-R具有更高的亲和力。

化合物VII

D.阴性对照寻靶配体.对靶细胞具有明显较低亲和力的相关寻靶基团可以用作阴性对照来确定优选的寻靶基团的功效。作为实例，肝细胞的ASGP-R结合半乳糖，但是不结合葡萄糖。因此，葡萄糖寻靶基团(VIII)可以用作寻靶寻靶测定法中的阴性对照。

Glc β-异构体

VIII

E.甘露糖寻靶基团.已知巨噬细胞和肝巨噬细胞具有结合甘露糖糖类的受体。因此，具有甘露糖残基的寻靶基团(IX)可以用于靶定这些细胞。

Man α-异构体

IX

F.具有不同的不稳定性的连接.具有不同的不稳定性(切割动力学)的连接可以用于将掩蔽剂或者多核苷酸连接到膜活性聚合物。

为了递送反义多核苷酸，可能通过降低从缀合物释放多核苷酸的速率来延长降低(knockdown)的持续时间。可以产生在典型的哺乳动物细胞中的还原环境中具有不同的切割动力学的二硫键。掩蔽剂从聚合物的较慢释放可以增加缀合物在体内的循环时间。例如，5-甲基-2-亚氨基硫烷(M2IT，连接X)显示出比SMTP连接(化合物XI)慢4倍的切割速率。

预期化合物XII的切割速率比二取代的马来酐连接慢约30倍。

实施例22.PBAVE和多核苷酸-PBAVE缀合物的表征

A.两亲性分析.1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(DPH，Invitrogen)荧光(λ_ex＝350nm；λ_em＝452nm)在疏水环境中增强。该荧光团用于分析PBAVE(DW1360)聚合物。在40μg质粒DNA存在或不存在下，向0.5ml 50mMHEPES缓冲液，pH 8.0中的10μg PBAVE加入0.5μM(终浓度)DPH。然后通过测量DPH的荧光，用该溶液测试疏水环境中DPH的积累。缀合物存在下DPH荧光的增加表明通过聚合物形成疏水环境。加入过量DNA没有显著改变DPH荧光(图16)。

B.分子量.使用HPLC大小排阻层析和一组聚乙二醇作为标准品(American Polymer Standard Corp.)测定DW1360的分子量。聚合物在GPC HPLC上使用Shodec SB-803HQ柱与甲醇中的0.2M LiClO₄，5％AcOH进行分离。PBAVE聚合物从柱子的洗脱表明约12.8kDa的平均大小(图17)。

C.多核苷酸-聚合物缀合物的分子量.用FPLC大小排阻层析和Cy3-标记的核酸作为标准品测定经掩蔽的多核苷酸-聚合物缀合物的分子量。使用1×22cm Sephacryl S-500柱并用50mM HEPES，pH 8.0以1ml/分钟进行洗脱，在Shimadzu FPLC上分离缀合物和标准品。缀合物从柱子的洗脱表明约77kDa的平均大小(图18)。

D.缀合物化学计量.通过实验测定PBAVE聚合物的平均分子量为约13kDa。通过实验测定经掩蔽的多核苷酸-聚合物缀合物的平均分子量为约77kDa。通过实验测定每个PBAVE聚合物的电荷(胺)的平均分子量为约200Da。CDM掩蔽剂的平均分子量经计算为约550Da。通过实验测定PBAVE聚合物修饰的平均程度为可利用胺的约75％。缀合的siRNA的平均分子量经计算为约14kDa。使用这些值，CDM-掩蔽的PBAVE聚合物掩蔽剂的平均分子量经计算为约30kDa。从而，siRNA与掩蔽的聚合物的可能的化学计量为约1∶2。

E.颗粒大小测定和ζ电位.使用Brookhaven InstrumentsCorporation，ZetaPlus Particle Sizer，I90，通过532nm下的光散射测量体内注射的缀合物的大小。峰的单峰性分析在100到30nm之间变动。使用多峰分析，具有最大数目(＞95％)颗粒的峰小于50nm，并且更典型地小于20nm。也可以使用分析型超速离心或者原子力显微镜测量多缀合物大小。以相同的方式，用Brookhaven Instruments Corporation ZetaPALS测量缀合物的ζ电位。CDM掩蔽的缀合物的ζ电位在0到-30mV之间并且更主要在0到-20mV之间变动。在具有5mM TAPS的缓冲于pH9的等渗葡萄糖中测量ζ电位。在相同的条件下也形成了具有0到-10mV和0到-5mV的ζ电位的稳定的非聚集的缀合物。在pH 7时，将预期缀合物由于一些胺的质子化而获得一定的正电荷。

实施例23.体内递送缀合物到裸鼠中人类肝细胞瘤异种移植物.为了阐明所述的缀合物可以用于靶定肿瘤细胞，将CDM-NAG修饰的寡核苷酸-DW1360缀合物注射到小鼠中，该小鼠已经在侧腹上皮下(SC)植入人肝癌HepG2细胞。从Harlan Spraque Dawley(Indianapolis，IN)得到六周龄雌性无胸腺的裸鼠。将小鼠用300μl PBS中的2百万个HepG2细胞皮下接种在左侧腹上。2周后，对照结肠癌HT-29细胞(300μl PBS中的2百万个)皮下接种在右侧腹上。以后的注射是补偿较快的生长速率。当皮下肿瘤生长到接近8mm宽度和长度时，通过尾静脉注射200μl递送缓冲液中的含有10μg Cy3-标记的21-聚体dsDNA的CDM-NAG和CDM-PEG修饰的缀合物。

在高百分比的皮下肝细胞瘤肿块中观察到NAG靶定的缀合物的积累(30-60％，n＝4，图19A)。在图19A中显示了显示摄入的肿瘤细胞的代表性区域。在接受葡萄糖靶定的缀合物的小鼠中观察到极低水平的肿瘤靶定(图19B，＜5％的肿瘤块，n＝3)。在没有半乳糖受体的对照结肠癌肿瘤中，用NAG或葡萄糖修饰的缀合物没有观察到肿瘤细胞信号(图19C-D，n＝2)。使用HuH-7肝癌细胞建立异种移植物也观察到类似的结果。

实施例24.在缀合前用可逆的PEG修饰修饰聚合物.用1.5wt％SMPT修饰400μg聚合物DW1360(从75∶20∶5胺∶丁基∶十八烷基乙烯醚的进料比形成)。1小时后，在5.6mg HEPES碱存在下向聚合物加入2重量当量的CDM-NAG(N-乙酰基半乳糖胺)和CDM-PEG(平均11单位)的2∶1wt∶wt混合物。向该溶液加入20μgSATA/Cy3-修饰的22-聚体DNA寡核苷酸。过夜温育后，向缀合物加入5重量当量的CDM-NAG和CDM-PEG的2∶1 wt∶wt混合物。将掩蔽的缀合物在400μl盐水中注射到小鼠的尾静脉。确定缀合前用CDM-NAG和CDM-PEG对聚合物的修饰不降低缀合效率。注射后1小时，收集肝脏并制备和处理冷冻的肝脏切片用于免疫组织化学。用

染色细胞核。注射到小鼠的尾静脉后，在肝细胞中观察到标记的寡核苷酸。

实施例25.CMD试剂修饰后定量缀合物中的胺基.如前述合成寡核苷酸-DW 1360缀合物聚合物，接着用14重量当量的HEPES碱和7重量当量的CDM-NAG和CDM-PEG(平均11单位)的2∶1wt∶wt混合物处理。一小时后，通过用100mM NaHCO₃中的三硝基苯磺酸(TNBS)处理测量马来酐衍生物处理的缀合物的胺含量。当对没有被马来酰胺酸修饰的缀合物归一化时，确定经修饰的胺的量为总量的约75％。该修饰程度可以通过改变所加入的马来酐的量而改变。

实施例26.寡核苷酸-聚合物缀合物和其马来酐衍生物的电泳.如前述制备寡核苷酸-聚合物DW1360缀合物。然后用不同量的CDM-PEG(11个单位平均值)和CDM-NAG修饰含有1μg多核苷酸的缀合物。然后将缀合物置于琼脂糖凝胶(2wt％)中并电泳。注意到当用溴化乙锭染色时，缀合物的电荷取决于马来酐衍生物的当量从正改变为中性到负。

认为前文仅仅阐明本发明的原理。此外，因为本领域技术人员容易想到无数修改和改变，所以不希望将本发明限制于所示和所述的精确的构建和操作。因此，所有合适的修改和等同方案都落入本发明的范围内。

Claims (19)

1.用于将RNA干扰多核苷酸体内递送到肝细胞的缀合物递送系统，其包含

其中，

P是膜活性多胺，

L²是二取代的马来酰胺酸生理学不稳定的键，

M¹是含有靶向基团的掩蔽剂，

M²是含有位阻稳定剂的掩蔽剂，

N是RNA干扰多核苷酸，

L¹是与L²正交的生理学不稳定的共价键，

y和z是大于或等于0的整数，其中y和z的值一起大于P的胺数目的50％，

P的膜活性通过经生理学不稳定的键L²连接M¹和M²修饰大于50％的P胺而被可逆抑制，并且L²的切割恢复P的膜活性。

2.权利要求1的缀合物，其中所述多核苷酸包含siRNA或者微RNA。

3.权利要求1的缀合物，其中所述多胺大于5kDa。

4.权利要求1的缀合物，其中所述缀合物直径小于20nM。

5.权利要求1的缀合物，其中所述缀合物在pH9下具有0到-20mV的ζ电位。

6.权利要求1的缀合物，其中L²是马来酰胺酸。

7.权利要求6的缀合物，其中靶向基团是半乳糖衍生物。

8.权利要求7的缀合物，其中P-L²-M¹具有结构：

其中n是1到500的整数。

9.权利要求6的缀合物，其中所述位阻稳定剂是聚乙二醇。

10.权利要求9的缀合物，其中P-L²-M¹具有结构：

其中n是1到500的整数。

11.权利要求1的缀合物，其中所述膜活性聚合物含有两种或更多种不同的单体。

12.权利要求11的缀合物，其中所述膜活性聚合物含有三种或更多种不同的单体。

13.权利要求12的缀合物，其中所述单体选自含有胺的单体、低级烷基单体、丁基单体、高级烷基单体、十二烷基单体和十八烷基单体。

14.权利要求1的缀合物，其中y+z的值大于或等于所述多胺上胺数目的70％。

15.权利要求1的缀合物递送系统，其中所述缀合物递送系统还包含通过生理学不稳定键可逆地共价连接到多种掩蔽剂的过量膜活性多胺，其中所述过量聚合物不共价连接到所述RNA干扰多核苷酸。

16.权利要求1的缀合物递送系统，其中所述缀合物在可药用载体或稀释剂中提供。

17.用于将RNA干扰多核苷酸体内递送到肝细胞的缀合物递送系统，其通过包含如下步骤的方法形成：

a)形成膜活性多胺；

b)形成第一种掩蔽剂，其包含含有寻靶基团的二取代的马来酐；

c)形成第二种掩蔽剂，其包含含有位阻稳定剂的二取代的马来酐；

d)通过与马来酰胺酸键正交的生理学不稳定的共价键将所述RNA干扰多核苷酸连接到所述多胺；

e)可逆地抑制膜活性多胺的膜活性，其中抑制由通过将所述多胺与所述第一种和第二种掩蔽剂反应修饰所述多胺上50％或以上的胺组成。

18.权利要求17的缀合物递送系统，其中所述寻靶基团是半乳糖衍生物并且所述位阻稳定剂是聚乙二醇。

19.权利要求18的缀合物递送系统，其中所述半乳糖衍生物是N-乙酰半乳糖胺。

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