DE102012022596B4 - Neue zellspezifisch wirksame Nukleotid-Moleküle und Applikationskit zu deren Anwendung - Google Patents

Neue zellspezifisch wirksame Nukleotid-Moleküle und Applikationskit zu deren Anwendung Download PDF

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Abstract

Lange Einzel- oder doppelsträngige Nukleotid-Moleküle zur Einbringung in Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotid-Moleküle zu deren Inaktivierung zumindest an ein Peptid oder Polymer gebunden ist, welches die biologische Wirkung dieser Moleküle inhibiert und welches durch Enzyme abgespalten werden kann und dadurch die biologische Wirkung wieder hervorgerufen wird, wobei zur Inhibierung der Nukleotid-Moleküle das Peptid oder Polymer (i) so an das Rückgrad der Nukleotide gebunden wird, dass beide Enden aneinener gebunden werden oder (ii) zwischen die Enden der Nukleotide gebunden wird.

Description

  • Die Erfindung betrifft neue biologisch wirksame Moleküle auf Grundlage von Nukleotiden, mit denen gezielt in bestimmten Zellen die Expression von Genen indiziert oder vermindert werden kann, sowie einen Applikationskit zur Anwendung.
  • Durch die Einbringung von Nukleinsäuren Zellen kann erreicht werden, dass in diesen Zellen entweder die, auf den eingebrachten DNA-Sequenzen kodierten Gene oder Genabschnitte, Proteine oder Proteinbruchstücke, sowie kürzere oder längere Peptide produziert werden; oder im Fall der Einbringung von interferrierenden RNA-Molekülen die Expression eines spezifisch- der RNA komplimentären Genabschnittes unterdrückt wird. Eine Hemmung der Expression von Genen kann unter Anderem durch die Einbringung von siRNA (engl. short interfering RNA) oder miRNA (microRNA) erreicht werden. SiRNA-Moleküle können klassischer Weise nach ihrer Aktivierung mit der mRNA des Zielgens interagieren und bilden zusammen mit speziellen Endoribonukleasen einen RNA-Proteinkomplex mit der Bezeichnung „RISC” (RNA induced silencing complex). Der RISC Komplex bindet an die Target-mRNA, wobei Endonukleasen die Ziel-mRNA schneiden. Auf diese Weise wird die Genexpression verhindert und somit das Entstehen von Zielproteinen gehemmt.
  • Die Hemmung der Genexpression durch Einbringen von kurzen (19–23 bp), doppelsträngigen RNA-Molekülen (siRNA) in eukaryotische Zellen, die spezifisch für einen Sequenzabschnitt der mRNA eines Zielgens ist, wurde bereits beschrieben (Elbashir SM et al.: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature, 2001 May 24, 411(6836), 494–8; Liu Y et al.: Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids, Biochemistry, 2004 Feb 24, 43(7), 1921–7; US 5,898,031 A ; US 7,056,704 B2 ).
  • Mit Hilfe solcher Moleküle wird nicht das Ablesen eines Gens und die Produktion einer mRNA verhindert, sondern es wird durch die siRNA ein zelleigener Mechanismus initiiert, der die Target-mRNA abbaut. Schließlich wird, wie vorbeschrieben, die Bildung eines spezifischen Proteins unterdrückt, ohne die Expression weiterer Gene zu beeinträchtigen (post-transcriptional gene silencing).
  • Für derzeitige Anwendungen von siRNA wird häufig angestrebt, ausschließlich die Expression eines einzigen Gens in einer Zelle zu unterdrücken. Effekte, bei denen mehrere Gene gleichzeitig oder unspezifisch ausgeschalten werden sind somit nicht erwünscht, weshalb die Sequenzen der siRNA so gestaltet werden, dass diese Effekte unterbunden werden.
  • Ebenfalls wurden Methoden entwickelt, verstärkt Zellen eines Zielgewebes mit siRNA in vivo zu transfizieren (Ikeda et. al.: „Ligand-Targeted Delivery of Therapeutic siRNA”, Pharmaceutical Research, Vol. 23, No. 8, August 2006) oder durch Bindung kurzer Peptide, welche zellspezifisch abgespalten werden eine Zellspezifität zu erreichen ( WO 2008/098569 A2 , WO 2011/150921 A2 ). Durch den Einsatz dieser modifizierten siRNA Moleküle kann erreicht werden, dass selektiv in bestimmten Zellen die Expression von Genen reduziert bzw. unterbunden wird.
  • Diese Methoden für die gezielte Wirkung von Nukleinsäuren ist allerdings oft auf kurze Nukleinsäuresequenzen beschränkt; bei längeren Sequenzen besteht das Problem, dass die Moleküle instabil sind und dadurch nicht über ein gerichtetes Delivery effizient in Zellen eingebracht werden können; die bekannte Bindung von kurzen Peptiden an die Enden längerer Nukleinsäuren und deren zellspezifische Abspaltung führt häufig nicht zu dem gewünschten zellspezifischen Effekt, da die Bindung von Peptiden an das Ende einer langen RNA- oder DNA-Sequenz nicht zu einer ausreichenden Inaktivierung führt.
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, lange Nukleinsäuremoleküle so zu modifizieren, dass durch chemische Modifikationen deren biologische Funktion zuverlässig inaktiviert wird und auch zellspezifisch vollständig wiederhergestellt werden kann.
  • Erfindungsgemäß werden mehrere Peptide oder Polymere so an Nukleotidmoleküle gebunden, dass deren räumliche Struktur sich so stark verändert wird, dass deren biologische Funktion nicht mehr gewährleistet wird bzw. sich an die Nukleinsäuren normalerweise anlagernde Moleküle keinen Zugang mehr zu den Nukleinsäuren finden.
  • Im Gegensatz zu beschriebenen Methoden, bei denen kurze Nukleotid-Moleküle durch Bindung von Peptiden oder Polymeren biologisch inaktiviert werden, was auf die Struktur der Peptide zurückzuführen ist, wird in der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen, dass die Peptide oder Polymere so gestaltet werden, dass sich die Struktur der Nukleotide ändert und dadurch deren biologische Aktivität inhibiert wird. Werden die Peptide oder Polymere durch spezifische Enzyme von den Nukleotiden abgespalten, kehren diese in ihre ursprüngliche Struktur zurück und entfalten ihre normale biologische Aktivität.
  • Die Abspaltung durch spezifische Enzyme kann insbesondere dadurch induziert werden, dass diese bei spezifischen Krankheits- oder Entwicklungszuständen von Zellen (insbesondere Zellzyklus oder Ausdifferenzierung bei Stammzellen), spezifisch für bestimmte Zellarten oder krankheitsrelevante Veränderung derer (insbesondere Entartung oder Infektion) oder genotypspezifisch Aktivität zeigen. Des Weiteren kann eine spezifische Abspaltung zur Detektion bestimmter Enzyme oder bei den erwähnten Anwendungen erfolgen.
  • Spezifische Enzyme können hierbei beispielsweise Proteasen oder Peptidasen (Caspasen, Aminopeptidasen oder Serinproteasen; im Speziellen Caspase-1, Caspase-2, Caspase-3, Caspase-4, Caspase-5, Caspase-6, Caspase-7, Caspase-8, KLK4, PLAP, IRAP, uPA, FAPα oder virale PRoteasen, beispielsweise HIV-Protease, Coxsackievirus-Protease, Epstein-Barr-Virus-Protease, Hepatisis-A, -B, -C Virus-Protease), Nukleasen, Glycosidasen, Saccharasen oder Chitinasen sein.
  • Durch die beschriebene Bindung von Peptiden oder Polymeren beispielsweise an micro-(mi-)RNA kann erreicht werden, dass normalerweise auftretende 3d-Strukturen durch Sequenzhomologien verändert werden. Bei der Bindung von Peptiden oder Polymeren an mRNA kann beispielsweise erreicht werden, dass die Initiationsstellen für die Anlagerung von Ribosomen an die mRNA zur Translation verdeckt und so das auf der mRNA codierte Protein nicht exprimiert wird.
  • Die Auswahl der Bindungen von Peptiden oder Polymeren ist dabei nicht auf die Enden der Nukleotid-Moleküle beschränkt, sondern können auch an den Zuckermolekülen der Nukleotide, den Phosphaten oder den organischen Basen erfolgen.
  • Vorteilhaft ist ein Applikationskit zur Anwendung und Verabreichung der biologisch wirksamen Nukleotid-Moleküle, dass es aus wenigstens einer, das Nukleotid-Molekül enthaltenden Ampulle (Ampulle A) besteht, und weiter enthält:
    • – mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle B) mit einem Transfektionssystem (bspw. Zell-penetrierende Peptide, Nanopartikel, Polyethylenimine oder Lipide), und
    • – mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle C) welche weitere Bestandteile zur Bindung an die biologisch wirksamen Moleküle, und
    • – Verdünnungs- und Reaktionspuffer für die Inhalte der Ampullen A, B, und/oder
    • – eine oder mehrere Sonden bzw. Spritzen mit Kanüle und andere benötigte Materialien zur Injektion der Mischung aus den Ampulleninhalten in das die Zielzellen enthaltende Medium und
    • – eine Vorschrift zur Anwendung und Verabreichung.
  • Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
  • Es zeigen:
  • 1: Beispielhafte und schematische Darstellung einer mRNA (1a), an die sich in der bekannten Art und Weise biologische Moleküle oder Molekülkomplexe, beispielsweise Ribosomen (2) anlagern und dadurch einen biologischen Prozess auslösen. Des Weiteren ist die Modifikation der mRNA (1b) durch beispielsweise ein Peptid (3a) dargestellt, wodurch die Anlagerung der biologischen Moleküle oder Molekülkomplexe, beispielsweise Ribosomen (2) und damit die Auslösung eines biologischen Prozesses verhindert wird. Werden das oder die Peptide (3a) wieder von der mRNA abgespalten, können sich die biologischen Moleküle oder Molekülkomplexe (2) wieder in der bekannten Form an die mRNA (1a) anlagern und die bekannten biologischen Prozesse auslösen.
  • 2: Beispielhafte und schematische Darstellung einer mRNA (1a), an die sich in der bekannten Art und Weise biologische Moleküle oder Molekülkomplexe, beispielsweise Ribosomen (2) anlagern und dadurch einen biologischen Prozess auslösen. Des Weiteren ist die Modifikation der mRNA (1b) durch beispielsweise ein Peptid (3b) dargestellt, wodurch sich die räumliche Struktur der mRNA derart ändert, dass die Anlagerung der biologischen Moleküle oder Molekülkomplexe, beispielsweise Ribosomen (2) und damit die Auslösung eines biologischen Prozesses verhindert wird. Dabei kann dieser Prozess durch die Bildung von Doppelsträngen der RNA durch zufällige oder entsprechend geplante Homologien unterstützt werden. Werden das oder die Peptide (3b) wieder teilweise oder vollständig von der mRNA abgespalten, ändert sich die Raumstruktur der mRNA wieder und es können sich die biologischen Moleküle oder Molekülkomplexe (2) wieder in der bekannten Form an die mRNA (1a) anlagern und die bekannten biologischen Prozesse auslösen.
  • In 1 ist der beispielhafte Mechanismus anhand einer mRNA (1a) dargestellt. Dabei lagern sich normalerweise beispielsweise Ribosomen (2) an die mRNA an und lösen dadurch einen biologischen Prozess; im Falle von Ribosomen die Translation aus. Durch die Modifikation der beispielhaften mRNA (1b) durch ein gebundenes beispielhaftes Peptid (3a) wird die Anlagerung beispielsweise der Ribosomen (2) verhindert. Dadurch kann im Falle von Ribosomen (2) keine Translation dieser mRNA (1b) passieren. Bei Abspaltung des Peptides (3a) beispielsweise durch ein Enzym wird die Anlagerung des beispielhaften Ribosomes (2) an die mRNA (1a) nicht mehr verhindert und es findet der normale biologische Prozess, im Falle von Ribosomen die Translation statt. Dabei kann die Bindung des Peptides (3a) an der Initiationsstelle von den beispielhaften Ribosomen oder an einer anderen Stelle der mRNA erfolgen; entsprechend der Bindungsstelle wird entweder die Anlagerung der Ribosomen (2) oder das vollständige Ablesen der beispielhaften mRNA verhindert. In jedem Falle aber kann die normale biologische Funktion der mRNA bei Bindung des beispielhaften Peptides nicht mehr erfolgen.
  • In 2 ist eine weitere Möglichkeit des beispielhaften Mechanismus anhand einer mRNA (1a) dargestellt. Dabei lagern sich normalerweise beispielsweise Ribosomen (2) an die mRNA an und lösen dadurch einen biologischen Prozess; im Falle von Ribosomen die Translation aus. Durch die Modifikation der beispielhaften mRNA (1c) durch ein gebundenes beispielhaftes Peptid (3b) wird die Raumstruktur der beispielhaften mRNA derart verändert, dass die Anlagerung beispielsweise der Ribosomen (2) verhindert wird. Dadurch kann im Falle von Ribosomen (2) keine Translation dieser mRNA (1c) passieren. Bei Abspaltung des Peptides (3b) beispielsweise durch ein Enzym wird die Anlagerung des beispielhaften Ribosomes (2) an die mRNA (1a) nicht mehr verhindert und es findet der normale biologische Prozess, im Falle von Ribosomen die Translation statt.
  • Anwendungsbeispiele:
    • 1) Induktion der Produktion toxischer Proteine in Zielzellen: Die RNA kann so gewählt werden, dass ihre Sequenz für einen oder mehrere Abschnitte eines toxischen Proteins oder Peptids oder für ein gesamtes toxisches Protein oder Peptid kodiert. Beispiele sind bakterielle Toxine wie beispielsweise Diphterie, Anthrax A, Anthrax B, Botulinum toxin oder Toxine höherer Lebewesen (Kegelschnecken, Schlangen, Echsen, Insekten, Spinnen, Skorpione).
    • 2) Induktion der Produktion von Allergenen in Zielzellen, insbesondere in Kombination mit Transportsequenzen, die für ein Display der Allergene an der Zelloberfläche sorgen, so dass sie für das Immunsystem zugänglich werden. Besonders bevorzugt ist es, das Allergen mit einer HLA Sequenz zu kombinieren, insbesondere sequenziell hintereinander oder das Allergen an einer Stelle im Inneren der HLA Sequenz, so dass Allergen und HLA gemeinsam an der Zelloberfläche präsentiert werden. Als Allergen eignen sich insbesondere nichthumane Allergene wie beispielsweise Ambrosia.
    • 3) Spezifische Induktion der Produktion von HLA Proteinen, die an der Zelloberfläche präsentiert werden beispielsweise zur Induktion von Immuntoleranz nach Transplantationen von Geweben oder Organen (Transplantationsmedizin).
  • Bezugszeichenliste
    • 1
    mRNA
    1a, 1b
    inhibierte mRNA
    2
    Ribosom
    3a, 3b
    Peptid

Claims (12)

  1. Lange Einzel- oder doppelsträngige Nukleotid-Moleküle zur Einbringung in Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotid-Moleküle zu deren Inaktivierung zumindest an ein Peptid oder Polymer gebunden ist, welches die biologische Wirkung dieser Moleküle inhibiert und welches durch Enzyme abgespalten werden kann und dadurch die biologische Wirkung wieder hervorgerufen wird, wobei zur Inhibierung der Nukleotid-Moleküle das Peptid oder Polymer (i) so an das Rückgrad der Nukleotide gebunden wird, dass beide Enden aneinener gebunden werden oder (ii) zwischen die Enden der Nukleotide gebunden wird.
  2. Nukleotid-Moleküle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Inhibierung der Nukleotid-Moleküle mindestens ein Peptid gebunden wird, welches die Spaltsequenz von Proteasen enthalten.
  3. Nukleotid-Moleküle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Inhibierung der Nukleotid-Moleküle mindestens ein Polymer gebunden wird, welches durch Enzyme abgespalten werden kann.
  4. Nukleotid-Moleküle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Inhibierung der Nukleotid-Moleküle eine Kombination aus mindestens einem Polymer und mindestens einem Peptid gebunden wird, welche durch Enzyme abgespalten werden können.
  5. Nukleotid-Moleküle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleotid-Molekül eine mRNA ist.
  6. Nukleotid-Moleküle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleotid-Molekül eine miRNA ist.
  7. Nukleotid-Moleküle einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleotid-Molekül eine DNA ist.
  8. Nukleotid-Moleküle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleotid-Molekül eine shRNA ist.
  9. Nukleotid-Moleküle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleotid-Molekül eine PNA ist.
  10. Nukleotid-Moleküle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotid-Moleküle weitere Modifikationen, insbesondere LNAs, enthalten.
  11. Applikationskit zur Anwendung und Verabreichung Nukleotid-Moleküle gemäß Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es aus wenigstens einer, das Nukleotid-Molekül enthaltenden Ampulle (Ampulle A) besteht, und weiter enthält: – mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle B) mit einem Transfektionssystem, und – mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle C) welche weitere Bestandteile zur Bindung an die biologisch wirksamen Moleküle, und – Verdünnungs- und Reaktionspuffer für die Inhalte der Ampullen A, B, und/oder – eine oder mehrere Sonden bzw. Spritzen mit Kanüle und andere benötigte Materialien zur Injektion der Mischung aus den Ampulleninhalten in das die Zielzellen enthaltende Medium und – eine Vorschrift zur Anwendung und Verabreichung.
  12. Applikationskit gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass Zellpenetrierende Peptide, Nanopartikel, Polyethylenimine oder Lipide als Transfektionssystem vorgesehen sind.
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