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Die
vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zum
Auswählen
von Nukleinsäuren
und Polypeptiden.
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Ligand-Rezeptor
Wechselwirkungen sind aus vielen Gründen, von einem Aufklären grundlegender Mechanismen
eines Erkennens einer biologischen Stelle bis zu Arzneimitteldurchmusterung
und rationalem Arzneimitteldesign, von Interesse. Es ist über viele
Jahre möglich
gewesen eine in vitro Evolution von Nukleinsäuren durch Auswählen von
Molekülen
aus großen
Populationen zu betreiben, welche bevorzugt an ein ausgewähltes Ziel
binden, anschließendes
Amplifizieren und deren Mutieren für ein anschließendes,
erneutes Auswählen
(Tuerk und Gold, Science 249 (1990), 505).
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Die
Befähigung
den Auswahlvorgang mit Proteinen durchzuführen würde von äußerstem Nutzen sein. Dies würde ein
in vitro Design und Erzeugen von Proteinen ermöglichen, die an auserwählte Liganden
spezifisch binden. Die Verwendung von Proteinen ist im Vergleich
zu Nukleinsäuren
besonders vorteilhaft, da die zwanzig verschiedenen Aminosäure Seitenketten
in Proteinen weitaus mehr Bindemöglichkeiten
aufweisen als die vier ähnlichen
Ketten in der Nukleinsäureseite.
Viele biologisch und medizinisch bedeutende Liganden binden ferner
Proteine.
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Verfahren
für sowohl
eine Nukleinsäure-
als auch Proteinevolution erfordern einen Zugang zu einer großen und äußerst vielgestaltigen
Population von Testmolekülen,
einen Weg Mitglieder der Population auszuwählen, die die erwünschten
Eigenschaften aufweisen, und die Befähigung die ausgewählten Moleküle mit mutierten
Variationen erneut zu erzeugen, um eine andere große Population
für eine
anschließende
Auswahl zu erhalten.
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Frühere Versuche
zum Entwickeln eines Verfahrens einer Proteinevolution waren in
erster Linie durch das Unvermögen
der Proteine begrenzt sich selber zu reproduzieren und das Unvermögen eine
kodierende mRNA eines Polypeptids mit dem translatierten Produkt
zu verbinden. Die Erzeugung von großen Peptidbibliotheken und
Durchmusterungsverfahren benötigte
darüber
hinaus bis vor kurzem, dass das Verfahren einen in vitro Expressionsschritt
aufweist. Beispiele umfassen Hefe-Zwei- oder Drei-Hybrid, Hefedisplay-
und Phagendisplayverfahren (Fields und Song, Nature 340 (1989) 245;
Licitra und Liu, PNAS 93 (1996) 12817; Boder und Wittrup, Nat. Biotechnol.
15 (1997) 553; und Scott und Smith, Science 249 (1990) 386). In
vivo Verfahren leiden an mehreren Nachteilen einschließlich einer
begrenzten Bibliotheksgröße und mühsamen Durchmusterungsschritte.
Darüber
hinaus können
unerwünschte
Auswahldrücke
bzw. Selektionsdrücke
auf die Variantengeneration durch zelluläre Beschränkungen des Wirts ausgeübt werden.
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In
jüngster
Zeit wurden in unter Verwendung prokaryotischer und eukaryotischer
in vitro Translationssysteme, wie beispielsweise Ribosomendisplay
(Mattheakis et al., PNAS 91 (1994) 9022; Hanes und Plückthun,
PNAS 94 (1997) 4937; Jermutus et al., Current Opinion in Biotechnology
9 (1998) 534), in vitro Verfahren entwickelt. Diese Verfahren verbinden
das Protein und seine kodierende mRNA mit dem Ribosom und der gesamte
Komplex wird gegen einen Liganden nach Wahl durchmustert. Mögliche Nachteile
dieses Verfahrens umfassen die umfangreiche Größe des Ribosoms, welche Auswirkungen
auf das Durchmustern des angebrachten, und vergleichsweise kleinen,
Protein haben könnte
Zwei Arbeitsgruppen entwickelten 1997 ein in vitro Verfahren für ein Anbringen
eines Proteins an seine kodierende Sequenz während der Translation durch Verwenden
der ribosomalen Peptidyltransferase mit an eine Binder-DNA angebrachtem
Puromycin (Szostak et al., Internationale Patent Veröffentlichung
WO 98/31700 ; Roberts und
Szostak PNAS 94 (1997) 12297; Nemoto et al., FEBS Letters 414 (1997)
405). Die Peptide werden einem ausgewählten Liganden ausgesetzt, wenn
die kodierende Sequenz und die Peptide einmal verbunden sind. Auswahl
oder Binden des Peptids durch den Liganden wählt ebenso die angebrachte
kodierende Sequenz aus, welche anschließend mittels herkömmlicher
Mittel reproduziert werden kann. Sowohl Roberts und Szostak als
auch Nemoto et al. verwendeten die Technik eines Anbringens eines
Puromycin Moleküls
an das 3' Ende einer
kodierenden Sequenz durch einen DNA Linker oder eine andere, nicht
translatierbare Kette. Puromycin ist ein tRNA Akzeptor Stammanalog, welches
die entstehende Peptidkette unter der Wirkung der ribosomalen Peptidyltransferase
annimmt und sie stabil und nicht reversibel bindet, wodurch die
Translation angehalten wird. Diese Verfahren leiden an bestimmten
Nachteilen. Die jedes Peptid kodierende kodierende Sequenz muss
beispielsweise bekannt sein und sowohl anfänglich als auch zwischen jeder
Auswahl modifiziert werden. Die Verfahren nach Roberts und Nemoto
können
daher nicht verwendet werden, um native unbekannte mRNAs auszuwählen. Die
Modifikation der kodierenden Sequenz fügt ferner dem Verfahren mehrere Schritte
hinzu. Das an die Linker Moleküle
angebrachte Puromycin kann schlussendlich bei der Translationsreaktion
mit den nativen tRNAs für
die A Stelle auf dem Ribosom konkurrieren, wobei seine kodierende
Sequenz oder ein nahe gelegenes Ribosom gelesen wird, und könnte daher
das Translationsverfahren "vergiften", wie es nicht angebrachtes
Puromycin in der Translationsreaktionslösung würde. Unbeabsichtigte Wechselwirkungen
zwischen Puromycin und Ribosomen könnten zu zwei Arten einer nicht
spezifischen Reaktion führen:
frühzeitig
gekürzte
Proteine und Proteine, welche an die falsche Botschaft angebracht
sind. Es gibt Berichte im Stand der Technik, die anzeigen, dass
das Verlangen der A Stelle und der Peptidyltransferase nach dem
Puromycin durch Mg
++ Konzentration moduliert
werden kann (Roberts, Curr. Opin. Chem. Biol. 3 (1999) 268). Obgleich
die Mg++ Konzentration zur Steuerung der ersten Art einer nicht-Spezifizität, d.h.
frühzeitiger
Abbruch der Translation, titriert werden kann, wird es die zweite
Art, d.h. fehlerhafte mRNA-Protein Verbindung, nicht beeinflussen.
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Daher
besteht ein Bedarf an einem in vitro Nukleinsäure basierenden Proteinevolutionssystem,
welches nicht notwendigerweise anfängliche Kenntnis der Nukleinsäuresequenz
oder wiederholte chemische Modifikation der Nukleinsäuren erfordert,
und welches eine mRNA an ihr Protein genau verbinden kann.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren bereit,
um erwünschte
Eigenschaften von Proteinen und Nukleinsäuren auszuwählen und zu entwickeln. Die
vorliegende Erfindung stellt in verschiedenen Ausführungsformen
modifizierte tRNAs und tRNA Analoge bereit. Andere Ausführungsformen umfassen
Verfahren zum Erzeugen von Polypeptiden, Assays, die eine Auswahl
von einzelnen Mitgliedern der Population von Polypeptiden mit erwünschten
Eigenschaften ermöglichen,
Verfahren zum Amplifizieren der Nukleinsäuren, die derartige ausgewählte Polypeptide
kodieren, und Verfahren zum Erzeugen neuer Varianten, um auf verbesserte
Eigenschaften zu durchmustern.
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Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
in mehreren Ausführungsformen
das Anbringen eines Proteins an seine Botschaft ohne eine Modifikation
nativer mRNA zu erfordern, obgleich modifizierte mRNA immer noch verwendet
werden kann. Die Spezifizität
der in verschiedenen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ausgeführten Verfahren wird durch
die Spezifizität
der Codon-Anticodon Wechselwirkung bestimmt.
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Die
Erfindung ermöglicht
in einer bevorzugten Ausführungsform
die Auswahl von Nukleinsäuren
durch Auswählen
der Proteine für
welche sie kodieren. Dies kann durch Verbinden des Proteins an seine
verwandte mRNA am Translationsende erreicht werden, was wiederum
durch Verbinden von sowohl dem Protein als auch der mRNA an eine
tRNA oder tRNA Analog durchgeführt
wird.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung umfasst ein tRNA Molekül, dass eine Polypeptid kodierende
Nukleinsäure
und das Polypeptid an die tRNA kovalent binden kann, wobei die Verbindung
der Nukleinsäure
an einem Abschnitt der tRNA auftritt, welcher von der Verbindung
des Polypeptids verschieden ist, und die tRNA ein verbindendes Molekül umfasst,
welches mit dem Anticodon der tRNA zusammenhängt. Eine Aminosäure oder
ein Aminosäure
Analog ist vorzugsweise am 3' Ende
eines tRNA Moleküls
durch eine stabile Bindung angebracht, um ein stabiles Aminoacyl
tRNA Analog (SATA) zu erzeugen.
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Andere
Ausführungsformen
umfassen eine mRNA, welche ein Psoralen umfasst, die vorzugsweise
in dem 3' Bereich
des Leserasters lokalisiert ist, mehr bevorzugt an dem äußersten
3' Codon des Leserasters und
am meisten bevorzugt an dem 3' Stopcodon
des Leserasters. Eine Verbindung zwischen der tRNA und der mRNA
ist in bevorzugten Ausführungsformen
ein vernetztes Psoralenmolekül
und mehr bevorzugt ein Furan-seitiges Psoralen Monoaddukt.
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Mehrere
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung umfassen ein Verfahren für ein stabiles
Verknüpfen
von einer Nukleinsäure,
einer tRNA, und eines durch die mRNA kodierten Polypeptids miteinander, um
einen verbundenen mRNA-Polypeptidkomplex zu bilden. Die Nukleinsäure ist
in einer bevorzugten Ausführungsform
eine mRNA. Das Verfahren kann ferner ein Bereitstellen mehrerer
verschiedener Nukleinsäure-Polypeptid
Komplexe, Bereitstellen eines Liganden mit einer erwünschten
Bindungseigenschaft, in Kontakt bringen der Komplexe mit dem Liganden,
Entfernen von nicht gebundenen Komplexen und erneutes Erhalten von
an den Liganden gebundenen Komplexen umfassen.
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Mehrere
erfindungsgemäße Verfahren
beziehen die Evolution von Nukleinsäuremolekülen und/oder Proteinen ein.
Diese Erfindung umfasst in einer Ausführungsform ein Amplifizieren
der Nukleinsäurekomponente
der erneut erhaltenen Komplexe und ein Einfügen von Änderungen in die Sequenz der
Nukleinsäuren. Das
Verfahren umfasst in anderen Ausführungsformen ferner ein Übersetzen
bzw. eine Translation von Polypeptiden der amplifizierten und geänderten
Nukleinsäuren,
deren Verbinden miteinander unter Verwendung von tRNA, und deren
in Kontakt bringen mit dem Liganden, um eine andere neue Population
von gebundenen Komplexen auszuwählen.
In mehreren Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden ausgewählte Protein-mRNA Komplexe
in einem Verfahren einer in vitro Evolution verwendet, insbesondere
das iterative Verfahren, in welchem die ausgewählte mRNA mit einer Änderung
erneut erzeugt, translatiert und wiederum mit einem verwandten Protein
für ein
Auswählen
verbunden wird.
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Die 1 zeigt
schematisch ein Beispiel des Komplexes, der durch die mRNA und deren
Proteinprodukt gebildet wird, falls durch eine modifizierte tRNA
oder ein Analog verbunden. Wie gezeigt paart ein Codon der mRNA
mit dem Anticodon einer modifizierten tRNA und wird durch UV Bestrahlung
an ein Psoralenmonoaddukt kovalent vernetzt. Das translatierte Polypeptid
wird an die modifizierte tRNA mittels der ribosomalen Peptidyltransferase
verbunden. Beide Verbindungen treten auf während die mRNA und das entstehende
Protein durch das Ribosom an Stelle gehalten werden.
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Die 2 zeigt
schematisch ein Beispiel des in vitro Auswahl- und Entwicklungs-
bzw. Evolutionsverfahrens, worin die Anfangs-Nukleinsäuren und
ihre Proteinprodukte verbunden sind (beispielsweise gemäß 1)
und durch eine bestimmte Eigenschaft ausgewählt werden, die das Protein
aufweist. Proteine, welche die bestimmte Eigenschaft nicht aufweisen,
werden verworfen und jene, die die Eigenschaft aufweisen, werden
mit einer Änderung
amplifiziert, vorzugsweise mittels Amplifikation mit einer Änderung
der mRNA, um eine neue Population zu bilden. Nicht bindende Proteine
werden in mehreren Ausführungsformen
ausgewählt.
Die neue Population wird translatiert und mittels einer modifizierten
tRNA oder einem Analog verbunden, und das Auswahlverfahren wird
wiederholt. So viele Auswahl und Amplifikations-/Mutationsrunden
wie erwünscht
können
für eine
Optimierung des Proteinprodukts durchgeführt werden.
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Die 3 zeigt
ein Verfahren zur Konstruktion eines erfindungsgemäßen tRNA
Moleküls.
Das 5' Ende einer
tRNA, eine eine Anticodonschleife kodierende Nukleinsäure und
mit einem Molekül,
das an mRNA stabil verbinden kann (hier Psoralen), und das 3' Ende einer tRNA,
die mit einem terminalen Puromycinmolekül modifiziert ist, werden in
dieser Ausführungsform
ligiert, um eine vollständige
modifizierte tRNA zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen in vitro
Evolutionsverfahren zu bilden.
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Die 4 beschreibt
zwei alternative Ausführungsformen,
durch welche das vernetzende Molekül Psoralen positioniert werden
kann, um die mRNA mit der tRNA in den erfindungsgemäßen Verfahren
verbinden zu können.
Eine erste Ausführungsform
umfasst Verbinden des Psoralen Monoaddukts mit der mRNA, und eine
zweite Ausführungsform
umfasst Verbinden des Psoralen an das Anticodon der tRNA. Psoralen
kann entweder an das Anticodon oder das 3' terminale Codon des Leserasters für bekannte
oder teilweise bekannte Botschaften als Monoaddukt herangezogen
werden (monoadducted). Dies kann in einem von der Translation getrennten
Vorgang bzw. Verfahren durchgeführt
werden, d.h. bevor die Translation auftritt.
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In
verschiedenen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung wird ein tRNA Mechanismus verwendet,
der Boten RNA (mRNA) an sein translatiertes Proteinprodukt verbindet,
wobei ein "verwandtes
Paar" gebildet wird.
MRNAs, deren Sequenz nicht bekannt ist, können in mehreren Ausführungsformen
exprimiert werden, wobei deren Protein durch ein Auswahlverfahren
gegen einen Liganden mit erwünschten
oder ausgewählten
Eigenschaften gekennzeichnet ist, und eine Nukleinsäureevolution – welche
zur Proteinevolution führt – kann in
vitro durchgeführt
werden, um zu Molekülen
mit verbesserten Eigenschaften zu gelangen. Die verwandten Paare
sind vorzugsweise mittels einer verbindenden tRNA, modifizierten
tRNA, oder einem tRNA Analog angebracht. Die tRNA ist in einer bevorzugten
Ausführungsform
an das entstehende Peptid durch die ribosomale Peptidyltransferase
und an die mRNA durch eine Ultraviolett induzierte Vernetzung zwischen
dem Anticodon der tRNA oder des tRNA Analog und dem Codon der RNA
Botschaft verbunden. Dies kann beispielsweise mit Thiouracil durchgeführt werden,
wobei allerdings in einer bevorzugten Ausführungsform, der Linker ein
Psoralen Vernetzer ist, der aus einem Psoralen Monoaddukt hergestellt
ist, welches auf entweder der mRNA oder vorzugsweise auf dem tRNA
Anticodon der Wahl vorab platziert wird. Vorzugsweise wird ein tRNA
Stopp Anticodon ausgewählt.
Ein Stoppcodon/Anticodon Paar wählt
für Volllängen Transkripte
aus. Dem Fachmann wird klar sein, dass eine mRNA ohne Stoppcodon
ebenso verwendet werden kann und dass irgendein Codon oder Nukleinsäuretripplet
verwendet werden kann. Eine tRNA mit einem Anticodon, das nicht natürlich auftritt,
kann gemäß im Stand
der Technik bekannter Verfahren synthetisiert werden (bspw. 3).
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Die
Ausdrücke "Protein", "Peptid" und "Polypeptid" sind hierin festgelegt
ein Polymermolekül
von zwei oder mehr Einheiten zu bedeuten, die Aminosäuren in
irgendeiner Form (bspw. D- oder L-Aminosäuren, synthetische oder modifizierte
Aminosäuren,
die mittels Peptidbindungen, etc. polymerisieren können) beinhalten, und
diese Ausdrücke
können
hierin wechselseitig verwendet werden.
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Der
Ausdruck "Pseudo-Stoppcodon" ist hierin festgelegt
ein Codon zu bedeuten, welches, obwohl es nicht selbstverständlich ein
Nonsenscodon darstellt, eine Botschaft daran hindert weiterer translatiert
zu werden. Ein Pseudo-Stoppcodon kann unter Verwendung eines "stabilen Aminoacyl
tRNA Analog" oder
SATA, wie nachstehend beschrieben, erzeugt werden. Auf diese Art
stellt ein Pseudo-Stoppcodon ein Codon dar, welches von einem SATA
erkannt wird und bindet. Ein anderes Verfahren, durch welches ein
Pseudo-Stoppcodon erzeugt wird, besteht im Erzeugen eines künstlichen
Systems, in welchem die notwendige RNA, die ein Anticodon komplementär zu dem
Pseudocodon aufweist, im Wesentlichen abgereichert ist. Die Translation
wird demgemäß anhalten,
falls die abwesende RNA benötigt
wird, d.h. an dem Pseudo-Stoppcodon. Dem Fachmann wird es klar sein,
dass zahlreiche Wege bestehen, um ein wie hierin festgelegtes Pseudo-Stoppcodon zu
erzeugen.
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Die
Bildung von Verbindungen zwischen mRNA und seinem Proteinprodukt
benötigt
im Allgemeinen eine tRNA oder ein tRNA Analog mit bestimmten Eigenschaften.
Die tRNA oder das tRNA Analog wird in verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen
einen stabilen Peptidakzeptor aufweisen. Diese Modifikation ändert die
tRNA oder das tRNA Analog derart, dass nachdem sie/es die entstehende
Peptidkette durch die Wirkung der ribosomalen Peptidyltransferase
annimmt, es/sie die Kette auf eine stabile Art derart hält, dass die
Peptidyltransferase es/sie nicht ablösen kann. Dies kann durch Verwenden
einer Bindung, wie beispielsweise eines 2' Ester oder 3' Deoxyadenosin oder eines Amino "Acyl tRNAox-red",
durchgeführt
werden, welche an das Ribosom binden kann, Annehmen der Peptidkette,
und anschließend
nicht als ein Donor in der nächsten
Transpeptidierung (Chinali et al., Biochem. 13 (1974) 3001; Krayevsky
and Kukhanova, Prog. Nuc. Acid Res 23 (1979) 1; und Sprinzl und
Cramer Prog. Nuc. Acid Res 22 (1979) 1) zu wirken.
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Eine
Aminosäure
oder ein Aminosäureanalog
wird in einer bevorzugten Ausführungsform
an das 3' Ende der
tRNA oder des tRNA Analog durch eine stabile Bindung angebracht.
Diese stabile Bindung steht der labilen, hoch energetischen Esterbindung
entgegen, welche diese beiden in der nativen Struktur verbindet.
Die stabile Bindung schützt
nicht nur die Bindung von der Wirkung der Peptidyltransferase, sondern
erhält
die Struktur während
der nachfolgenden Schritte. Diese modifizierte tRNA oder dieses
tRNA Analog wird zur Einfachheit als ein "stabiles Aminoacyl tRNA Analog" oder SATA bezeichnet
werden. Wie hierin verwendet ist ein SATA eine Entität, welche
ein ausgewähltes
Codon derart erkennt, dass es eine Peptidkette durch die Wirkung der
ribosomalen Peptidyltransferase annehmen kann, falls sich das verwandte
Codon in der Leseposition des Ribosoms befindet. Die Peptidkette
wird auf eine Art gebunden werden, dass das Peptid stabil gebunden
wird und nicht durch die Peptidyltransferase losgelöst werden
kann. Das ausgewählte
Codon wird vorzugsweise durch Wasserstoffbrücken Bindung erkannt.
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Ein
Verfahren zum Erzeugen eines SATA wurde 1973 (Fraser und Rich, PNAS
70 (1973) 2671) veröffentlicht.
Dieses Verfahren bezieht die Umwandlung einer tRNA, oder eines tRNA
Analog, zu einer 3'-Amino-3'-deoxy tRNA ein.
Dies wird durch Zufügen
eines 3'-Amino-3'Deoxyadenosin an
das Ende einer nativen tRNA mit tRNA Nukleotidyltransferase nach
Entfernen des nativen Adenosins davon mit einer Schlangengift Phosphodiesterase
erreicht. Diese modifizierte tRNA wird anschließend mit einer Aminosäure durch
die jeweilige Aminoacyl tRNA Synthetase (aaRS) beladen bzw. geladen.
Fraser und Rich verwendeten eine aaRS, in welcher die tRNA an dem
3', eher als an
dem 2', Hydroxyl
geladen ist. Die Aminosäure
wird an die tRNA durch eine stabile Amidbindung eher als die gewöhnliche
labile, hochenergetische Esterbindung gebunden. Sie wird daher,
falls sie ein Peptid von einer ribosomalen Peptidyltransferase annimmt,
das Peptid stabil halten und es nicht einem anderen Akzeptor geben
können.
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Das
SATA wird in einer bevorzugten Ausführungsform an die translatierte
Botschaft durch eine Psoralen Vernetzung zwischen dem Codon und
dem Anticodon angebracht. Psoralen Vernetzungen werden vorzugsweise
zwischen Sequenzen hergestellt, die komplementäre 5' Pyrimidin-Purin 3' Sequenzen, insbesondere UA oder TA
Sequenzen (Cimino et al., Ann. Rev. Biochem. 54 (1985) 1151), enthalten.
Das das SATA codierende Codon, oder das verbindende Codon kann PYR-PUR-X
oder X-PYR-PUR sein, so dass mehrere Codons als das verbindende
Codon verwendet werden können.
In geeigneter Weise weisen die Stopp- oder die Nonsenscodons diese
Konfiguration auf. Die Verwendung eines Codons, dass eine Aminosäure kodiert, kann
geringfügige
Angleichungen an den genetischen Code erfordern, welche einige Anwendungen
erschweren könnten.
Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein Stoppcodon als
das verbindende Codon verwendet und das SATA wirkt als ein Nonsens
Suppressor, so dass es das verbindende Codon erkennt. Dem Fachmann
wird jedoch klar sein, dass irgendein Codon mit geeigneten Angleichungen
an das System verwendet werden kann.
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Fraser
und Rich vollbrachten ihre Arbeit in E. coli, wobei allerdings die
wirksamsten in vitro Translationssystem in Eukaryoten vorliegen.
Die Verwendung von prokaryotischen Suppressoren in eukaryotischen Translationssystemen
scheint brauchbar zu sein (Geller und Rich Nature 283 (1980) 41;
Edwards et al., PNAS 88 (1991) 1153; Hou und Schimmel Biochem. 28
(1989) 6800). Sie sind in erster Linie durch die residenten aaRSs
begrenzt. Diese Begrenzung wird durch verschiedene erfindungsgemäße Ausführungsformen überwunden,
da die tRNA oder das Analog in dem prokaryotischen System geladen
bzw. beladen werden und anschließend gemäß etablierter Verfahren (Lucas-Lenard
und Haenni, PNAS 63 (1969) 93 (1969) gereinigt werden kann.
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In
mehreren Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung können
Akzeptorstammmodifikationen, die für eine Verwendung in den tRNAs
und Analogen geeignet sind, durch mehrere im Stand der Technik bekannte
Verfahren erzeugt werden. Derartige Verfahren werden beispielsweise
in Sprinzl und Cramer, Prog. Nuc. Acid Res. 22 (1979) 1 gefunden.
In einer alternativen Ausführungsform
führt "transkriptionale
tRNA", d.h. die
Sequenz der tRNA wie sie transkribiert würde eher als nach dem post-translationalen
Prozessieren, zu den atypischen und modifizierten Basen, welche
allgemein in tRNAs sind. Diese transkriptionalen tRNAs können als
tRNAs fungieren (Dabrowski et al., EMBO J. 14 (1995) 4872; und Harrington
et al., Biochem. 32 (1993) 7617). Transkriptionale tRNA kann durch
Transkription erzeugt werden oder kann durch aneinander Verbinden kommerzieller
RNA Sequenzen (wie beispielsweise jener, die von Dharmacon Research
Inc., Boulder, CO erhältlich
sind) stückweise
wie in 3 oder durch irgendeine Kombination von etablierten
Verfahren hergestellt werden. Das 5' Phosphat und 3' Puromycin sind beispielsweise an Oligoribonukleotide
angebracht im Handel erhältlich.
Diese Stücke
können
unter Verwendung von T4 DNA Ligase, wie es im Stand der Technik
gut bekannt ist (Moore and Sharp, Science 256 (1992) 9921), aneinander
gebunden werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird alternativ
T4 RNA Ligase verwendet (Romaniuk und Uhlenbeck, Methods in Enzymology
100 (1983) 52).
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In
mehreren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird Psoralen an das SATA durch Konstruktion
einer tRNA aus Stücken,
einschließlich
eines Psoralen verbundenen Oligonukleotids (3) oder
durch Monoadduktion an ein(e) native(s) oder modifizierte(s) tRNA
oder Analog (4), als Monoaddukt herangezogen
(monoadducted).
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Die
Translation wird in mehreren Ausführungsformen anhalten, falls
das entstehende Protein and das SATA durch die Peptidyltransferase
angebracht wird. Falls eine große
Zahl von Ribosomen in dieser Position vorliegt, werden das SATA
und die mRNA mit UV Licht verbunden. Dies wird in einem bevorzugten
Verfahren durch Aufweisen einer gebildeten Psoralen Vernetzung durchgeführt. Psoralene
weisen eine Furanseite und einer Pyronseite auf und sie können zwischen
komplementäre
Basenpaare in doppelsträngiger
DNA, RNA und DNA-RNA Hybriden einfach interkalieren (Cimino et al.,
Ann. Rev. Biochem. 54 (1985) 1151 (1985).
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Vernetzen
wird bei Bestrahlung mit UV, vorzugsweise in dem Bereich von 320
nm bis 400 nm, auftreten und die gestaffelten Pyrimidine kovalent
gebunden belassen. Durch entweder Bilden von Vernetzungen und deren
Photo-Reversierung oder durch Verwendung gewählter Wellenlängen, ist
es möglich
Monoaddukte zu bilden, die nachstehend ausführlicher beschrieben werden.
Diese werden entweder Pyronseitige oder Furanseitige Monoaddukte
sein. Die Furanseitigen Monoaddukte können bei weiterer Bestrahlung
an komplementäre
Basenpaare kovalent vernetzt werden. Die Pyronseitigen Monoaddukte
können
nicht weiter vernetzt werden. Die Bildung des Furanseitigen Psoralen
Monoaddukts (MAf) wird ebenso gemäß etablierten Verfahren durchgeführt. Das
Psoralen wird in einem bevorzugten Verfahren an das Anticodon des
SATA angebracht. Psoralen kann jedoch ebenso an das Ende des Leserasters
der Botschaft, wie in 4 gezeigt, angebracht werden.
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Verfahren
zur Herstellung von gereinigtem MAf auf Oligonukleotiden in großem Maßstab werden
in der Literatur als Verfahren beschrieben (bspw. Speilmann et al.,
PNAS 89 (1992) 4514), welche weniger Ressourcen benötigen jedoch
irgendeine nicht-vernetzbare Pyronseitige Psoralen Monoaddukt Kontaminierung
aufweisen (bspw.
U. S. Patent
4,599,303 ; Gamper et al., J. Mol. Biol. 197 (1987) 349;
Gamper et al., Photochem. Photobiol. 40 (1984) 29). Ein Psoralen
Markieren wird in verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen durch Verwenden
eines von beiden bzw. beider Verfahren durchgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform
werden Furanseitige Monoaddukte durch Verwenden von sichtbarem Licht
von vorzugsweise in dem Bereich von ungefähr 400 nm-420 nm gemäß den Verfahren
erzeugt, welche in
U. S. Patent
5,462,733 and Gasparro et al., Photochem. Photobiol. 57
(1993) 1007 beschrieben werden. In einer Ausführungsform dieser Erfindung
wird ein SATA mit einem Furanseitigen Monoaddukt oder mit als Monoaddukt
herangezogenen (monoadducted) Oligonukleotiden für ein Plazieren an dem 3' Ende von mRNAs,
zusammen mit einem als Monoaddukt herangezogenen (monoadducted)
SATA, als die Grundlage eines Kits bereitgestellt.
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Die
Verwendung des SATA und des Monoaddukts in verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen
ist für
in vitro Translationssysteme besonders vorteilhaft. Dem Fachmann
wird jedoch klar sein, dass ebenso in situ Systeme verwendet werden
können.
Verschiedene erfindungsgemäße Ausührungsformen können auf
irgendein in vitro Translationssystem angewendet werden, einschließlich von
Kaninchen Reticulocyt Lysat (RLL), Weizenkeim, E. coli, Hefelysat
Systeme, etc. aber nicht darauf begrenzt. Viele erfindungsgemäße Ausführungsformen
sind ebenso für
eine Verwendung in Hybridsystemen gut geeignet, worin Bestandteile
verschiedener Systeme kombiniert werden.
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Von
an einer 3' Amidbindung
aminoacylierten tRNAs wird berichtet nicht mit dem Verlängerungsfaktor EF-TU
zu kombinieren, welcher bei einem Binden an die A Seite unterstützt (Sprinzl
und Cramer, Prog. Nuc. Acid Res. 22 (1979) 1). Derartige modifizierte
tRNAs binden jedoch an die A Seite. Dieses Binden von 3' modifizierten tRNAs
kann durch Ändern
der Mg++ Konzentration erhöht werden
(Chinali et al., Biochem. 13 (1974) 3001). Die geeigneten Konzentrationen
und/oder molaren Verhältnisse
von SATA und Mg++ können empirisch bestimmt werden.
Falls die Konzentration oder A Seite Verlangen von SATA zu hoch
ist, könnte
das SATA mit nativen tRNAs für
nicht-verwandte Codons konkurrieren, d.h. könnte viel ähnlicher Puromycin fungieren
und eine Translation zum Stillstand bringen. Falls die Konzentration
oder A Seite Verlangen von SATA zu gering ist, könnte das SATA nicht wirksam
mit den Freisetzungsfaktoren konkurrieren, d.h. es könnte nicht
als eine wirksame Nonsens Suppressor tRNA wirken. Das Gleichgewicht
zwischen diesen kann empirisch bestimmt werden.
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Es
wird ebenso angenommen, dass der Verlängerungsfaktor bei einem korrekten
Lesen der Codon-Anticodon Erkennung unterstützt. Die Fehlerrate in der
Abwesenheit des Verlängerungsfaktors
und der zusammenhängenden
GTP Hydrolyse wird geschätzt
1 in 100 für
Codons ein Nukleotid entfernt zu sein (Voet and Voet, Biochemistry
2nd ed. (1995) 1000-1002, John Wiley and Sons). UAA wird in einer
bevorzugten Ausführungsform
als das bindende Codon verwendet. Es gibt für UAA als das bindende Codon
7 nicht-Stoppcodons, welche sich durch eine Aminosäure unterscheiden.
Dies ist 7/61 oder ungefähr
11,5% der nicht-Stoppcodons. Man kann die Wahrscheinlichkeit eines
fehlerhaften Codierens eines gegebenen Codons als (0,01)(0,115)
= 1,15 × 10-3 fehlerhafte Codes pro Codon schätzen. Man
würde daher
einen fehlerhaften Code ungefähr
alle 870 Codons erwarten, eine Häufigkeit,
die die Effizienz von mehreren erfindungsgemäßen Verfahren nicht wesentlich
beeinträchtigen
wird. UAG wird in einer alternativen Ausführungsform als das verbindende
Codon verwendet.
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Geeignete
Konzentrationen von SATA und Mg++ werden
in mehreren Ausführungsformen
in dem in vitro Translationssystem, bspw. RRL, in der Anwesenheit
der mRNA Moleküle
in dem Pool verwendet, was ein Aufhören der Translation bewirkt,
falls das Ribosom das Codon erreicht, welches dem SATA ermöglicht die Peptidkette
(das vorstehend beschriebene verbindende Codon) anzunehmen. Die
meisten der verbindenden Codons werden innerhalb kürzester
Zeit durch SATAs in Ribosomen besetzt sein. Das System wird in einer bevorzugten
Ausführungsform
anschließend
mit UV Licht, vorzugsweise bei ungefähr 320 nm bis 400 nm, bestrahlt.
Nukleinsäuren
sind für
gewöhnlich
für diesen
Wellenlängenbereich
transparent, d.h. absorbieren ihn nicht. Das Psoralen Monoaddukt
wird bei Bestrahlen zu einer Vernetzung umgewandelt, welche das
Anticodon und das Codon durch eine stabile kovalente Bindung bindet.
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Die
Ziel mRNA wird in einer bevorzugten Ausführungsform vorab ausgewählt. In
einer anderen Ausführungsform
wird die Ziel mRNA künstlich
erzeugt. Das Ziel besteht in einer alternativen Ausführungsform
aus Botschaften, die zu dem unter Beobachtung stehenden System nativ
sind, welche unbekannt und/oder nicht identifiziert sein können. Die
Befähigung
unbekannte und/oder nicht identifizierte mRNAs zu verwenden ist
ein besonderer Vorteil von mehreren erfindungsgemäßen Ausführungsformen.
-
Die
Ribosomen werden in mehreren Ausführungsformen freigesetzt oder
denaturiert, wenn einmal alle die entstehenden Proteine mit ihren
verwandten mRNAs verbunden sind. Dies wird vorzugsweise durch Abreicherung
an Mg++ durch Dialyse, einfache Verdünnung oder
Chelatbildung erreicht. Dem Fachmann wird klar sein, dass andere
Verfahren, einschließlich
von, aber nicht darauf begrenzt, Denaturierung durch Ändern der Ionenstärke, des
pHs, oder der Lösungsmittelsystems,
ebenso verwendet werden können.
-
Das
Auswählen
von verwandten Paaren wird in mehreren erfindungsgemäßen Ausführungsformen auf
Affinitätsbinden
von Proteinen gemäß irgendeinem
von mehreren etablierten Verfahren beruhen, welche einschließen, aber
nicht begrenzt sind auf, Affinitätssäulen, Immunopräzipitation,
und viele Hochdurchsatz Durchmusterungsverfahren. Viele Liganden
können
ebenso verwendet werden, einschließlich von, aber nicht begrenzt
auf, Proteine, Nukleinsäuren,
chemische Verbindungen, Polymere und Metalle. Darüber hinaus
können
Zellmembranen oder Rezeptoren oder sogar ganze Zellen verwendet
werden, um die verwandten Paare zu binden. Die Auswahl kann positiv
oder negativ sein. Dass heisst, dass die gewählten verwandten Paare jene sein
können,
welche an einen Liganden gut binden, oder jene, die es nicht tun.
Für ein
Protein beispielsweise, um eine thermodynamisch vorzuziehende Reaktion
zu beschleunigen, d.h. als ein Enzym für jene Reaktion zu wirken,
sollte es sowohl das Substrat als auch ein Übergangszustand Analog binden.
Das Übergangszustand Analog
sollte jedoch weitaus fester als das Substrat gebunden werden. Dies
wird durch die Gleichung kEnzym/kφEnzym =
Ktrans/Ksubst beschrieben,
worin das Verhältnis
der Reaktionsrate mit dem Enzym, kEnzym,
zu der Rate ohne Enzym, kφEnzym, zu dem Verhältnis des Übergangszustands
zu dem Enzym Ktrans über das Binden des Substrats
an das Enzym Ksubst gleich ist (Voet and
Voet, Biochemistry 2nd ed. (1995) 380, John Wiley and Sons).
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden Proteine ausgewählt,
welche für
ein Binden an das Substrat wenig aber für ein Binden an das Übergangszustand
Analog gut konkurrieren. Dies kann betrieblich durch Verwenden der
Proteine durchgeführt
werden, welche von einer Matrix mit Substrat oder Substratanalog daran
gebunden einfach eluiert werden und von der Matrix mit Übergangszustand
Analog daran gebunden am schwierigsten entfernt werden. Durch sequenzielles
Wiederholen dieser Auswahl und erneutes Erzeugen der Proteine durch
Replikation und Translation der Nukleinssäure der verwandten Paare, sollte
sich ein verbessertes Enzym entwickeln. Affinität an eine Entität und Fehlen
an Affinität
an eine andere im gleichen Auswahlverfahren wird in mehreren erfindungsgemäßen Ausführungsformen
verwendet. Eine Auswahl kann durch RNA in vielen Ausführungsformen
durchgeführt
werden.
-
Hat
die Auswahl einmal eine Population verwandter Paare identifiziert,
kann es einfach sein den mRNA Strang von dem SATA für sein erneutes
Erzeugen zu lösen.
Dies ist nicht immer notwendig, kann aber durch Bestrahlen der Paare
mit UV, vorzugsweise bei ungefähr
313 nm oder gerade unterhalb davon, durchgeführt werden. Dies wurde als
eine Wellenlänge
identifiziert, welche die Psoralen Vernetzung zu MAf photo-umkehren
und die Nukleinsäure
minimal schädigen
wird. Das Verhältnis
von Photo-Umkehr zu Nukleinsäureschaden
wird geschätzt
1 Photo-Umkehr für
einen Schaden von 1 in 600 Basen zu sein (Cimino et al., Biochem
25 (1986) 3013).
-
Dem
Fachmann wird klar sein, dass die mRNAs auf viele Arten, einschließlich von,
aber nicht darauf beschränkt,
durch RNA-abhängige
RNA Polymerasen oder durch umgekehrte Transkription und PCR erneut erzeugt
werden können.
Dies kann unter Verwendung von mRNAs stattfinden, die von den verwandten
Paaren getrennt sind, bspw. durch Verwenden von poly T oder poly
U, um an die poly A Schwänze,
von beispielsweise nativen unbekannten Botschaften, zu hybridisieren,
oder durch intaktes Belassen der der verwandten Paare und Verwenden
von Oligonukleotid Primern, welche in das Leseraster für bekannte
Botschaften teilweise hybridisieren. Alternativ können kommerzielle
Kits für
eine schnelle Amplifikation von cDNA Enden verwendet werden. Falls
dies verwendet wird, um Proteine zu entwickeln und nicht um sie
nur auszuwählen,
würde es vorzuziehen
zu sein, mindestens eine Aminosäure
Substitution in jeder Position des Proteins zu prüfen.
-
Der Replikationsschwellenwert
-
Eine
nominale minimale Anzahl von Replikationen für eine wirksame Entwicklung
kann durch Verwenden der nachstehend aufgeführten Formel geschätzt werden.
Die Wahrscheinlichkeit eines Erzeugens der gezielten Verbesserung
bei Replikation kann wie nachstehend aufgeführt bestimmt werden, falls
eine Sequenz vorliegt, welche n Sequenzen in Länge ist, mit einer gezielten
Verbesserung r Mutationen entfernt mit einer Mutationsrate von p:
Für r = 1,
Wahrscheinlichkeit einer Mutation am richtigen Punkt, p, bestimmt
die Wahrscheinlichkeit, dass sie zu dem Richtigen der drei Nukleotide
mutiert, welche von dem Anfangspunkt, 1/3, verschieden sind, bestimmt die
Wahrscheinlichkeit, dass die anderen n-1 Stellen nicht mutiert verbleiben,
(1-p)(n-r), oder
worin, P = die Wahrscheinlichkeit
eines Erzielens einer gegebenen Änderung
R Mutationen entfernt. Allgemeiner, für alle r Werte:
-
Es
ist aufschlussreich die Wahrscheinlichkeiten eines Findens eines
Vorteils einer Mutation entfernt mit den Wahrscheinlichkeiten drei
Mutationen entfernt zu vergleichen. Dies ist, da angesichts des
Triplett genetischen Codes, irgendein gegebenes Codon sich nur in
neun andere Codons bei einer Mutation ändern kann. In der Tat stellt
sich heraus, dass sich kein Codon in neun andere Codes in einer
Mutation überhaupt ändern kann.
Die maximale Anzahl von Aminosäuren,
die in einer Mutation zugänglich
sein kann, beträgt
sieben Aminosäuren
und es gibt ausschließlich
acht Codons der vierundsechzig, die dies bewerkstelligen können. Die
meisten Codons weisen fünf
oder sechs von neunzehn anderen Aminosäuren in einer Mutation auf. Es
erfordert im Allgemeinen drei Mutationen, um alle neunzehn Aminosäuren, welche
von der anfänglichen verschieden
sind, zu erreichen. Diese drei Mutationen können nicht sequenziell sein,
da die beiden dazwischen liegenden im Allgemeinen nicht gezielt
von Vorteil sein werden. Daher benötigt es ein Verwenden von Schritten,
die zumindest drei Mutationen in Größe (r = 3) sind, um all 20
Aminosäuren
zu verwenden.
-
Für eine Mutationsrate
von 0,067, welche jene ist welche für "fehleranfällige PCR" berichtet wird, unter Verwendung einer
Botschaft von 300 Nukleotiden, was ein kurzes Protein von 100 Aminosäuren ergibt: P3 = 1,51 × 10-9
-
Daher
würde man
erwarten einen Schwellenwert zu benötigen von: 1/(1,15 × 10-9) = 6,64 × 108
-
Replikationen
mit jener Mutationsrate, um vernünftigerweise
zu erwarten, die nächste
Aminosäure
zu erreichen, welche von Vorteil ist. Dies ist nicht die Replikation
für eine
Verwendung, da die binomiale Ausdehnung zeigt, dass über 1/3
der Versuche (in der Tat ungefähr
1/e) die gegebene Sequenz mit einem gezielten Vorteil nicht enthalten
würde.
-
Eine
Poisson Näherung
für große n und
kleine p für
ein gegebenes μ kann
derart berechnet werden, dass man den allgemeinen Term berechnen
kann, falls n sagen wir in der Größenordnung von 109 liegt
und p in der Größenordnung
von 10-9. Der allgemeine Term der Näherung ist: μr/(r!eμ)
-
Ein
Verstärkungsfaktor
von größer als
ungefähr
6/P stellt sicher, dass ein Entwickeln mit der Verwendung aller
Aminosäuren
voranschreiten wird. Dies ist von Nutzen, falls das Erzeugen neuer
Proteine die Verwendung eines "Shuffelns" von bereits vorliegenden
Proteinen ausschließt.
-
Grenzen bei Aufreinigung
-
Gegeben
eine reversible Bindung, worin B und C für A konkurrieren: AB ↔ A
+ B AC ↔ A
+ C kB = [A][B][AB] kC = [A][C][AC] [B]
= kB [AB][A] (1) [C] = kC [AC][A] (2)
-
Die
Gesamtkonzentrationen können
ausgedrückt
werden: [B]T =
[B] + [AB] (3) [C]T = [C] + [AC] (4)
-
-
Und
Ersetzen von (1) und (2) durch [B] und [C]:
-
-
Streichen
der [A]s in dem Zähler
und Nenner:
-
Schließlich umgruppieren:
-
(Anreicherungsfaktor)
-
Der
vorstehende Faktor wird der "Anreicherungsfaktor" genannt. Das Verhältnis der
Gesamtkomponenten wird mit diesem Faktor multipliziert, um das Verhältnis der
gebundenen Komponenten, oder die Anreicherung von B über C, zu
berechnen. Der naximale Anreicherungsfaktor ist kc/kB, falls das [A] wesentlich kleiner als kc oder kB ist.
-
Die
Anreicherung ist durch das Verhältnis
der Bindekonstanten begrenzt. Um ein seltenes Protein anzureichern,
welches 100-fach so stark wie seine Konkurrenten gebunden wird,
ist das Verhältnis
von jenem Protein zu seinen Konkurrenten mit 3 Anreicherungen um 1
Million erhöht.
Um ein Protein anzureichern, das nur zweifach so stark wie seine
Konkurrenten bindet, würden
10 Anreicherungszyklen nur eine Anreicherung von 1000 erzielen.
-
Die
nachstehend aufgeführten
Beispiele erläutern
verschiedene erfindungsgemäße Ausführungsformen
und sind nicht beabsichtigt die Erfindung auf irgend eine Art zu
begrenzen.
-
Beispiel 1: Erzeugen des SATA
-
Dem
Fachmann wird es klar sein, dass das SATA auf mehrere verschiedene
Arten erzeugt werden kann. Beispielsweise werden in einer bevorzugten
Ausführungsform
drei Fragmente (1) von einer kommerziellen Quelle
(d.h. Dharmacon Research Inc., Boulder, CO) bezogen. Modifizierte
Basen und ein Fragment 3 mit einem vorher angebrachten Puromycin
an seinem 3' Ende
und einem PO4 an seinem 3' Ende sind einbezogen,
wobei alle davon im Handel erhältlich
sind. Drei Fragmente werden verwendet, um eine Beeinflussung des
Fragments 2 beim Bilden des Monoaddukts zu erleichtern.
-
Hefe
tRNAAla oder Hefe tRNAPhe werden verwendet; Sequenzen können allerdings
weitgehend von bekannten tRNAs gewählt werden. Vorzugsweise werden
Sequenzen mit nur einer begrenzten Zahl an Us in dem Abschnitt verwendet,
welcher dem Fragment 2 entspricht. Das Verwenden einer Sequenz mit
nur wenigen Us ist nicht notwendig, da Psoralen vorzugsweise 5'UA3' Sequenzen bindet
(Thompson J.F, et al, Biochemistry 21: 1363). Es ist jedoch weniger
doppelt herangezogenes (adducted) Produkt zum Aufreinigen, falls
eine solche Sequenz verwendet wurde.
-
Das
Fragment 2 wird in einer helixförmigen
Konformation verwendet, um das Psoralen für ein Interkalieren zu induzieren.
Demgemäß wird ein
komplementärer
Strang benötigt.
RNA oder DNA wird verwendet, und eine Sequenz, wie beispielsweise
poly C an einem oder beiden Enden, wird hinzugefügt, um ein Trennen und Entfernen
zu erleichtern, nachdem die Monoadduktbildung vollendet ist.
-
Das
Fragment 2 und die cRNA werden in gepufferter 50 mM NaCl Lösung vereint.
Die Tm wird durch Hyperchromizitätsänderungen
bestimmt. Die beiden Moleküle
werden erneut angelagert und für
1 Stunde mit dem ausgewählten
Psoralen bei einer Temperatur von ~10°C weniger als der Tm inkubiert.
Das Psoralen wird auf der verwendeten Sequenz beruhend ausgewählt. Beispielsweise
weist ein vergleichsweise unlösliches Psoralen,
wie beispielsweise 8 MOP, einer höhere Sequenzstringenz auf,
kann allerdings erfordern wieder aufgefüllt zu werden. Ein löslicheres
Psoralen, wie beispielsweise AMT, weist eine geringere Stringenz
auf, wird allerdings die meisten Seiten auffüllen. Vorzugsweise wird HMT
verwendet. Eine größere Stringenz
ist erwünscht,
falls ein Fragment 2 gewählt
wird, welches mehr nicht-Ziel Us enthält. Erniedrigen der Temperatur oder
Erhöhen
der Innenstärke
durch Hinzugeben von Mg++ wird ebenso für ein Erhöhen der
Stringenz verwendet.
-
Psoralen
wird nach Inkubation mit einer Wellenlänge größer als ungefähr 400 nm
bestrahlt. Die Bestrahlung hängt
von der gewählten
Wellenlänge
ab und dem verwendeten Psoralen. Für HMT wird beispielsweise ungefähr 419 nm
20-150 J/cm2 verwendet. Dieses Verfahren
wird zu einem beinahe vollständigen
Furanseitigen Monoaddukt führen.
-
Reinigung des Monoaddukts
-
Das
Monoaddukt wird anschließend
durch HPLC, wie in Sastry et al, J. Photochem. Photobiol. B Biol. 14:
65-79 beschrieben, gereinigt. Die Tatsache, dass Fragment 2 von
Fragment 3 getrennt vorliegt, erleichtert den Reinigungsschritt,
da eine Reinigung von Monoaddukten ≥ 25 mer im Allgemeinen schwierig
ist (Spielmann et al. PNAS 89: 4514-4518).
-
Ligation von Fragment 2 und 3
-
Das
Fragment 2 wird an das Fragment 3 unter Verwendung von T4 RNA Ligase
ligiert. Das Puromycin am 3' Ende
wirkt als eine Schutzgruppe, dies wird wie nach Romaniuk und Uhlenbeck,
Methods in Enzymology 100 (1983) 52-59 durchgeführt. Verbinden von Fragment
2 + 3 am 3' Ende
von Fragment 1 wird gemäß den Verfahren
durchgeführt,
welche in Uhlenbeck, Biochemistry 24 (1985) 2705-2712 beschrieben
werden. Fragment 2 + 3 ist durch Polynukleotid Kinase 5' phosporyliert und
die beiden halben Moleküle
werden angelagert.
-
In
einem alternativen Verfahren werden wesentliche Mengen von Furanseitigem,
Monoaddukt herangezogenem (monoadducted) U durch Hybridisieren von
poly UA an sich selbst und Bestrahlen, wie vorstehend aufgeführt, gebildet.
Das poly UA wird anschließend
enzymatisch verdaut, um Furanseitiges U zu ergeben, welches geschützt wird
und in ein RNA Analog durch Nukleosid Phosphoramidit Verfahren inkorporiert
wird. Andere Verfahren eines Bildens des Psoralen Monoaddukts umfassen
die Verfahren, welche in Gamper et al., J. Mol. Biol. 197 (1987)
349; Gamper et al., Photochem. Photobiol. 40 (1984) 29; Sastry et
al, J. Photochem. Photobiol. B Biol. 14: 65-79; Spielmann et al.
PNAS 89: 4514-4518;
U. S. Patent
4,599,303 beschrieben werden.
-
Durch
die vorstehend beschriebenen Verfahren erzeugte SATAs werden UAG
(Anti codon CUA) lesen. Darüber
hinaus werden UAA oder UGA ebenso verwendet. Irgendeine Botschaft,
welche das Stoppcodon aufweist, welches als das "verbindende Codon" ausgewählt ist, wird in mehreren Ausführungsformen
verwendet.
-
Beispiel 2: Erzeugen des mit Psoralen
versehenen (psoralenated) Furanseitigen Monoaddukts aus CUAGAΨCUGGAGG
RNA Fragmenten
-
UV-Licht aussetzen von RNA: DNA Hybriden
-
Gleiche
Volumen an 3 ng/ml RNA:cRNA Hybridsegmenten und an 10 μg/ml HMT,
beide in 50 mM NaCl beinhaltet, werden in ein neues 1,5 ml Polypropylen
Mikrozentrifugen Röhrchen
mit Deckel überführt und
bei 37°C
für 30
Minuten im Dunkeln inkubiert. Dies wurde anschließend auf
eine neue, saubere Kulturschale überführt. Dies
wird in einem photochemischen Reaktor (419 nm Spitze (peak) Southern
New England Ultraviolet Co.) bei einem Abstand von ungefähr 12,5
cm derart positioniert, dass eine Bestrahlung ~6,5 mW/cm2 beträgt und
für 60-120
Minuten bestrahlt wird.
-
Entfernen von Protoprodukten mit geringem
Molekulargewicht
-
100 μl Chlorofom-Isoamylalkohol
(24:1) wird pipettiert und mittels Vortexen gemischt. Das Gemisch wird
für 5 Minuten
bei 15000 xg in einem Mikrozentrifugen Röhrchen zentrifugiert. Die Chloroform-Isoamylalkohol
Schicht wird mit einer Mikropipette entfernt. Die Chloroform-Isoamylalkohol
Extraktion wird noch einmal wiederholt. Reine RNA präzipitiert
aus der Lösung.
-
Alkohol Präzipitation
-
Zwei
Volumen (~1000 μl)
eiskaltes absolutes Ethanol werden zu dem Gemisch hinzugegeben.
Das Röhrchen
wird für
15 Minuten bei 15.000 xg in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert.
Der Überstand
wird abgegossen und verworfen und die präzipitierte RNA wird in 100 μl DEPC behandeltem
Wasser erneut gelöst
und anschließend
der RNA+8-MOP erneut ausgesetzt.
-
Isolierung
der mit Psoralen versehenen RNA Fragmente unter Verwendung von HPLC
Alle Komponenten, Glassware und Reagenzien, werden derart vorbereitet,
dass sie RNAse frei vorliegen. Die HPLC wird mit einer Dionex DNA
PA-100 gepackten Säule
angeordnet. Das mit Psoralen versehene RNA:DNA Hybrid wird auf 4°C erwärmt. Die
mit Psoralen versehene RNA wird auf die HPLC gegeben, gefolgt von
einer Oligonukleotid Analyse, wie in dem nachstehenden Abschnitt
beschrieben, welcher "Oligonukleotid
Analyse durch HPLC" genannt
wird. Die gesammelten Fraktionen werden repräsentieren:
- a)
5'CUAGAΨCUGGAGG3', worin Ψ Pseuduridin
ist (SEQ ID NO: 1)
- b) Furanseitiges 5'CUPsoralenAGAΨCUGGAGG3' Monoaddukte (SEQ
ID NO: 2)
- c) 5'XXXXXCCUCCAGAUCUAGXXXXX3' (SEQ ID NO: 3)
- d) 5'XXXXXCCUCCAGAUCUPsoralenAGXXXXX3' (SEQ ID NO: 4)
-
Die
Fraktionen werden bei 4°C
in neuen, RNAse freien, eingerasteten (snapped) Mikrozentrifugen Röhrchen gelagert
und bei -20°C
gelagert, falls mehr als vier Wochen Lagerung benötigt werden.
-
Identifizierung
der RNA Fragmente, die durch jede Spitzen Fraktion repräsentiert
werden, welche durch HPLC unter Verwenden von Polyacrylamid Gelelektrophorese
(PAGE) gesammelt werden
-
Die
Elektrophoreseeinheit wird in einem Kühlschrank bei 4°C angeordnet.
Ein Gel mit einem 2 mm Abstandshalter wird ausgewählt. Jede
5 μl an
HPLC Fraktion wird mit Ladepuffer auf 10 μl verdünnt. 10 μl jeder verdünnten Fraktion wird in geeignet
markierte Probenvertiefungen geladen. Der Laufweite Farbstoff wird
in eine getrennte Spur geladen und die Elektrophorese wird, wie
in dem nachstehend aufgeführten
Abschnitt, laufen gelassen, der "Polyacrylamid
Gelelektrophorese (PAGE) von mit Psoralen versehenen RNA Fragmenten" genannt wird.
-
Nachdem
der Elektrophorese Lauf vollständig
ist, wird die Elektrophorese angehalten, falls der Laufweite Farbstoff
die Kante des Gels erreicht hat. Die Vorrichtung wird auseinandergebaut.
Die Gel-Glas Paneeleinheit wird auf der UV Lichtbox platziert. UV
Lichter werden angeschaltet. Die RNA Banden werden identifiziert.
Die Banden werden als dichtere Schatten unter UV Lichtbedingungen
erscheinen.
-
Extraktion der RNA aus dem Gel
-
Jede
Bande wird mit einer neuen, sterilen und RNAse freien Skalpellklinge
ausgeschnitten und in ein neues 1,5 ml eingerastetes Mikrozentrifugen
Röhrchen überführt. Jedes
Gel wird mit der Seite der Skalpellklinge gegen die Wandungen der
Mikrozentrifugen Röhrchen
gedrückt.
Eine neue Klinge wird für
jede Probe verwendet. 1,0 ml 0,3 M Natriumacetat wird zu jedem Röhrchen hinzugegeben
und für
mindestens 24 Stunden bei 4°C
eluiert. Das Eluat wird mit einer Mikropipette in ein neues 0,5
ml eingerastetes Polypropylen Mikrozentrifugenröhrchen mit Deckel überführt. Eine
neue RNAse freie Pipettenspitze wird für jedes Röhrchen verwendet und die RNA
wird mit Ethanol aus präzipitiert.
-
Ethanolpräzipitation
-
Zwei
Volumen eiskaltes Ethanol werden zu jedem Eluat hinzugegeben und
anschließend
bei 15.000 xg für
15 Minuten in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Die Überstände werden
verworfen und die präzipitierte RNA
wird in 100 μl
DEPC behandeltem DI Wasser erneut gelöst. Die RNA wird bis zum Bedarf
in den Mikrozentrifugen Röhrchen
bei 4°C
gelagert. Die Röhrchen
werden bei -20°C
gelagert, falls eine Lagerung für
mehr als zwei Wochen erfolgt. Das nachstehend aufgeführte ist
die angenommene Ordnung einer Wanderungsrate für jedes Fragment, in Reihenfolge
vom schnellsten zu langsamten:
- a) 5'CUAGAΨCUGGAGG3'
- b) Furanseitige 5'CUPsoralenAGAΨCUGGAGG3' Monoaddukte
- c) 5'XXXXXCCUCCAGAUCUAGXXXXX3'
- d) 5'XXXXXCCUCCAGAUCUPsoralenAGXXXXX3'
-
Die
Röhrchen,
welche den Rest jeder Fraktion mit der mutmaßlichen chemischen Sequenz
beinhalten, werden markiert und bei -20°C gelagert.
-
Ethanolpräzipitation von RNA
-
RNA
Oligonukleotid Fragmente werden präzipitiert und die gesamte Glassware
wird zum Entfernen von irgendwelchen RNAse Spuren gereinigt, wie
in dem nachfolgen Abschnitt beschrieben wird, welcher "Inaktivierung von
RNAsen auf Arbeitsgerät,
Hilfsstoffen und in Lösungen" genannt wird. Alle
Lösungen
werden in RNAse freier Glassware gelagert und ein Einbringen von
Nukleasen wird verhindert. Absolutes Ethanol wird bis zur Verwendung
bei 0°C
gelagert. Mikropipettoren werden verwendet, um zwei Volumen eiskaltem
Ethanol zu Nukleinsäuren
zu geben, welche in den Mikrozentrifugen Röhrchen präzipitiert werden sollen. Mikrozentrifugen
Röhrchen
mit Deckel werden in die Mikrozentrifuge platziert und bei 15.000
xg für
15 Minuten zentrifugiert. Der Überstand
wird verworfen und präzipitierte
RNA wird in DEPC behandeltem DI Wasser erneut gelöst. RNA
wird bei 4°C
in Mikrozentrifugen Röhrchen
bis zur Verwendungsbereitschaft gelagert.
-
Ligation der RNA Fragmente 2 und 3
-
Die
gesamte Glassware wird gereinigt, um irgendwelche RNAse Spuren zu
entfernen, wie in dem nachfolgen Abschnitt beschrieben wird, welcher "Inaktivierung von
RNAsen auf Arbeitsgerät,
Hilfsstoffen und in Lösungen" genannt wird. Das
nachstehend aufgeführte
wird in ein neues 1,5 ml Polypropylen Mikrozentrifugen Röhrchen mit
Schnappdeckel unter Verwendung einer 100-1000 μl Pipette überführt und eine neue sterile Pipettenspitze
wird für
jede Lösung
verwendet:
| Fragment
2 (3.0 nM) | 125,0 μl |
| Fragment
3 (3.0 nM) | 125,0 μl |
| Reaktionspuffer | 250.0 μl |
| RNA
T4 Ligase (9-12 U/ml) | 42 μl |
| Reaktionspuffer | |
| RNAse
freies DI Wasser | 90,00
ml |
| Tris-HCl
(50 mM) | 0,79
g |
| MgCl2 (10 mM) | 0,20
g |
| DTT
(5 mM) | 0,078
g |
| ATP
(1 mM) | 0,55
g |
| pH
auf 7,8 mit HCl | |
| RNase
freies DI Wasser | QS
auf 100,00 ml |
-
Das
Gemisch wird vorsichtig gemischt und die RNA wird durch Inkubieren
des Gemischs bei 16°C
für eine
Stunde in einer Kühlkammer
mit Temperatursteuerung geschmolzen. RNA wird unmittelbar nach Vervollständigung
der Inkubation aus der Lösung
präzipitiert.
-
Alkoholpräzipitation
-
Zwei
Volumen (~1000 μl)
eiskaltem absoluten Ethanol werden zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben.
Das Mikrozentrifugen Röhrchen
wird für
15 Minuten bei 15.000 xg in einer Mikrozentrifuge platziert. Der Überstand
wird abgegossen und verworfen und die präzipitierte RNA wird in 100 μl DEPC behandeltem
Wasser erneut gelöst.
Das Gemisch wird, wie in dem nachstehend aufgeführten Abschnitt beschrieben,
einer Elektrophorese unterzogen, welcher "Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE)
von mit Psoralen versehenen RNA Fragmenten" genannt wird. Das nachstehend aufgeführte ist
die angenommene Reihen folge einer Wanderungsrate für jedes
Fragment, in der Reihenfolge vom schnellsten zum langsamsten:
- a) Frag. 2
5'CUAGAΨCUGGAGG3'-OH
Psoralen
- b) Frag. 3
5'UCCUGUGTΨCGAUCCACAGAAUUCGCACC-Puromycin
(SEQ ID NO: 5)
- c) Frag 2 + 3
5'CUAGAYCUGGAGGUCCUGUGTΨCGAUCCACAGAAUUCGCACCPuromycin
(SEQ ID NO: 6)
Psoralen
-
Jede
Fraktion wird mittels UV Abschatten isoliert, die Banden werden
ausgeschnitten, die RNAs werden aus dem Gels eluiert und das RNA
Eluat wird wie in dem folgenden Abschnitt beschrieben aus präzipitiert, welcher "Polyacrylamid Gelelektrophorese
(PAGE) von mit Psoralen versehenen RNA Fragmenten" genannt wird.
-
Das
Ligationsverfahren wird mit irgend welchen verbliebenen, nicht ligierten
Fragment 2 und 3 Fraktionen wiederholt.
-
Die
ligierten Fraktionen 2 und 3 werden zusammengeführt und in einem kleinen Volumen
RNAse freiem DI Wasser bei 4°C
gelagert.
-
Ligation von RNA Fragment 1 mit Fragment
2 + 3
-
Die
gesamte Glassware wird gereinigt, um irgendwelche RNAse Spuren zu
entfernen, wie in dem nachfolgen Abschnitt beschrieben wird, welcher "Inaktivierung von
RNAsen auf Arbeitsgerät,
Hilfsstoffen und in Lösungen" genannt wird. Das
nachstehend aufgeführte
wird in ein neues 1,5 ml Polypropylen Mikrozentrifugen Röhrchen mit
Schnappdeckel überführt. Eine
100-1000 μl
Pipette und eine neue Spitze werden für jede Lösung verwendet:
| Fragment
2 + 3 (3.0 nM) | 125,0 μl |
| Reaktionspuffer | 250.0 μl |
| T4
Polynukleotid Kinase (5-10 U/ml) | 1,7 μl |
| Reaktionspuffer | |
| RNAse
freies DI Wasser | 90,00
ml |
| Tris-HCl
(40 mM) | 0,63
g |
| MgCl2 (10 mM) | 0,20
g |
| DTT
(5 mM) | 0,08
g |
| ATP
(1 mM) | 0,006
g |
| pH
auf 7,8 mit HCl | |
| RNase
freies DI Wasser | QS
auf 100,00 ml |
-
Die
RNA wird vorsichtig gemischt und anschließend durch Erhitzen des Gemischs
auf 70°C
für 5 Minuten
in einem Heizblock geschmolzen. Das Gemisch wird über einen
zwei Stunden Zeitraum auf Raumtemperatur gekühlt und den RNAs wird ermöglicht sich
in eine tRNA Konfiguration anzulagern. Die RNA wird aus der Lösung aus
präzipitiert.
-
Alkoholpräzipitation
-
Zwei
Volumen (~1000 μl)
eiskaltem absoluten Ethanol werden zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben.
Das Mikrozentrifugen Röhrchen
wird für
15 Minuten bei 15.000 xg in einer Mikrozentrifuge platziert. Der Überstand
wird abgegossen und verworfen und die präzipitierte RNA wird in 100 μl DEPC behandeltem
Wasser erneut gelöst.
Das Gemisch wird, wie in dem nachstehend aufgeführten Abschnitt beschrieben,
einer Elektrophorese unterzogen, welcher "Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE)
von mit Psoralen versehenen RNA Fragmenten" genannt wird. Das nachstehend aufgeführte ist
die angenommene Reihenfolge einer Wanderungsrate für jedes
Fragment, in der Reihenfolge vom schnellsten zum langsamsten:
- a) Frag. 1
5'GCGGAUUUAGCUCAGDDGGGAGAGCGCCAGACU3'
- b) Frag 2 + 3
5'CUAGAYCUGGAGGUCCUGUGTΨCGAUCCACAGAAUUCGCACCPuromycin
Psoralen
- c) Frag. 1 + 2 + 3
5'GCGGAUUUAGCUCAGDDGGGAGAGCGCCAGACUCUAGAΨCUGGAGG
UC...CUGUGTΨCGAUCCACAGAAUUCGCACCPuromycin
(SEQ ID NO: 7)
Psoralen
-
Jede
Fraktion wird mittels UV Abschatten isoliert, die Banden werden
ausgeschnitten, die RNAs werden aus dem Gels eluiert und das RNA
Eluat wird, wie in dem folgenden Abschnitt beschrieben, aus präzipitiert,
welcher "Polyacrylamid
Gelelektrophorese (PAGE) von mit Psoralen versehenen RNA Fragmenten" genannt wird. Das
Ligationsverfahren wird mit nicht ligiertem Fragment 1 und der 2
+ 3 Fraktion wiederholt. Die ligierten Fraktionen 2 + 3 werden zusammengeführt und
in einem kleinen Volumen RNAse freiem DI Wasser bei 4°C gelagert.
-
Schlussendliche RNA Ligation
-
Das
nachstehend aufgeführte
wird in ein neues 1,5 ml Polypropylen Mikrozentrifugen Röhrchen mit Schnappdeckel überführt. Eine
100-1000 μl
Pipette und eine neue Spitze werden für jede Lösung verwendet:
| Fragment
1 + 2 + 3 (3.0 nM) | 250 μl |
| Reaktionspuffer | 250 μl |
| RNA
T4 Ligase (44 μg/ml) | 22 μg |
-
Das
Gemisch wird bei 17°C
in einem Kühlschrank
mit Temperatursteuerung für
4,7 Stunden inkubiert. Unmittelbar nach der Inkubation wird die
RNA, wie in vorstehend aufgeführtem
Schritt 6.2, aus präzipitiert
und die tRNA wird durch Elektrophorese, wie in dem folgenden Abschnitt
beschrieben, isoliert, welcher "Polyacrylamid
Gelelektrophorese (PAGE) von mit Psoralen versehenen RNA Fragmenten" genannt wird. Die
tRNA wird in einem kleinen Volumen RNAse freiem Wasser zusammengeführt und
bei 4°C
bis zu zwei Wochen gelagert oder bei -20°C für Zeiträume von mehr als zwei Wochen
gelagert.
-
Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE)
von mit Psoralen versehenen RNA Fragmenten
-
Acrylamid Gel Zubreitung
-
Die
gesamte Glassware muss RNAse frei sein, wie in dem nachfolgen Abschnitt
beschrieben wird, welcher "Inaktivierung
von RNAsen auf Arbeitsgerät,
Hilfsstoffen und in Lösungen" genannt wird. Die
Gel Vorrichtung wird zusammengebaut, um ein 4 mm Dickes quadratisches
Gel von 20 cm × 42
cm zu erzeugen. 29 Teile Acrylamid mit 1 Teil Ammonium Vernetzer
werden bei Raumtemperatur mit der geeigneten Menge Acrylamid Lösung in
einem RNAse freien Erlenmeyer Kolben mit dicker Wandung gemischt. Acrylamid
Lösung
| Harnstoff
(7 M) | 20.42
g |
| TBE
(1X) | QS
auf 11 |
| 5X
TBE | |
| 0.455
M Tris-HCl | 53.9
g |
| 10
mM EDTA | 20
ml von 0.5 M |
| RNAse
freies DI Wasser | 900
ml |
| pH
mit Borsäure
auf | pH
9 |
| QS
mit RNAse freiem DI Wasser auf | 11 |
-
Das
Gemisch wird mit Vakuumdruck für
eine Minute entgast. Die geeignete Menge TEMED wird hinzugegeben,
vorsichtig gemischt, und anschließend wird das Gelgemisch zwischen
die Glasplatten auf innerhalb 0,5 cm von der Oberseite gegossen.
Der Kamm wird unmittelbar zwischen die Glasscheiben und in die Gelmatrix
eingefügt.
Ein RNAse freier Gelkamm wird verwendet. Der Kamm sollte Vertiefungen
für eine
5 mm breite Farbstoffspur und 135 mm Probenspuren erzeugen. Dem
Gel wird ermöglicht
für ungefähr 30-40
Minuten zu polymerisieren und anschließend wird der Kamm sorgfältig entfernt.
Die Probenvertiefungen werden mit einem Laufpuffer unter Verwendung
einer Mikropipette mit einer neuen Pipettenspitze ausgespült. Die
Vertiefungen werden anschließend
mit Laufpuffer befüllt.
-
Probenbereitung
-
Ein
Aliquot der Probe wird in Ladepuffer in einem Mikrozentrifugen Röhrchen mit
Schnappdeckel suspendiert und mittels Vortexen gemischt. Indikatorfarbstoff
wird nicht zu der Probe hinzugegeben. Ladepuffer
| Harnstoff
(7 M) | 420.42
g |
| Tris-HCl
(50 mM) | 7,85
g |
| QS
mit RNAse freiem D-H2O | auf
11 |
-
Elektrophoreselauf
-
Das
maximale Volumen an RNA/Ladepuffer Lösung wird in die 135 mm Probenvertiefungen
geladen und das geeignete Volumen an Laufweite Farbstoff in die
5 mm Laufweitespur. Die Proben werden in einem Kühlschrank bei 5°C einer Elektrophorese
unterzogen. Die Elektrophorese wird angehalten, falls der Laufweite Farbstoff
die Kante des Gels erreicht hat. Die Vorrichtung wird auseinandergebaut.
Glasspaneele werden nicht von dem Gel entfernt. Die Gel-Glas Paneeleinheit
wird auf einer UV Lichtbox platziert. Das UV Licht wird mit aufgesetzter
UV Filterschutzbrille angeschaltet. Die RNA Banden werden identifiziert.
Sie erscheinen als dichtere Schatten unter UV Lichtbedingungen.
Die RNA wird aus dem Gel extrahiert. Jede Bande wird mit einer neuen,
sterilen und RNAse freien Skalpellklinge ausgeschnitten und in ein
neues 1,5 ml Mikrozentrifugen Röhrchen
mit Schnappdeckel überführt. Jedes
Gel wird mit der Seite der Skalpellklinge gegen die Wandungen der Mikrozentrifugen
Röhrchen
gedrückt.
Eine neue Klinge wird für
jede Probe verwendet. 1,0 ml 0,3 M Natriumacetat wird zu jedem Röhrchen hinzugegeben
und für
mindestens 24 Stunden bei 4°C
eluiert. Das Eluat wird mit einer Mikropipette mit einer neuen RNAse
freien Pipettenspitze für
jedes Röhrchen
in ein neues 0,5 ml Polypropylen Mikrozentrifugenröhrchen mit
Schnappdeckel überführt. Zwei
Volumen eiskaltes Ethanol werden zu jedem Eluat hinzugegeben und
anschließend
bei 15.000 xg für
15 Minuten in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Die Überstände werden
verworfen und die präzipitierte
RNA wird in 100 μl
DEPC behandeltem DI Wasser erneut gelöst. Die RNA wird bis zum Bedarf
in den Mikrozentrifugen Röhrchen
bei 4°C
gelagert.
-
Oligonukleotid Analyse mittels HPCL
-
HPLC
Reinigung der RNA Oligonukleotide wird unter Verwendung von Anionen
Austauschchromatographie am besten bewirkt. Entweder die 2'-geschützten oder
die 2'-entschützten Formen
können
chromatographiert werden. Die 2'-geschützte Form
bietet den Vorteil eines Minimierens von Sekundärstruktur Wirkungen und stellt
einen Widerstand gegenüber
Nukleasen bereit. Sterile Bedingungen werden während der Reinigung benötigt, falls
die RNA vollständig
entschützt
ist.
-
Entschützen
von 2'-Orthoester
geschützter
RNA
-
Die
Röhrchen
werden bei 15,000 xg für
30 Sekunden zentrifugiert oder bis sich das RNA Pellet am Boden
befindet. 400 μl
Entschützungspuffer
von pH 3,8 werden zu jedem RNA Röhrchen
hinzugegeben.
-
Entschützungspuffer
-
Essigsäure (100
mM) wird mit Tetramethylethylendiamin (TEMED) auf pH 3,8 eingestellt.
Das Pellet wird in dem Puffer durch Auf- und Abziehen in der Pipette
vollständig
gelöst.
Die Röhrchen
werden für
10 Sekunden gevortext und bei 15.000 xg zentrifugiert. Die Röhrchen werden
in einem Wasserbad von 60°C
für 30 Minuten
inkubiert. Die Proben werden vor einer Verwendung lyophilisiert.
-
HPLC Säulenbedingungen
-
Eine
4 × 250
mm Säule
(DNAPAC PA, No. 043010), die mit Dionex(800)-DIONEX-0 (346-6390)
bepackt ist, mit einer Kapazität
von 40 optischen Dichteeinheiten (ODU) bei 260 nm wird installiert.
Die Säulentemperatur
wird auf 54°C
eingestellt. Das Injektionsvolumen wird derart eingestellt, dass
5 μl ungefähr 0,20 ODU
erzeugen. Elutionspuffer
| Bedingung | Puffer
A | Puffer
B |
| Natriumperchlorat | (5
mM) 2,8 g | (300
mM) 168,0 g |
| Tris-HCl | 2,4
g | 2,4
g |
| Acetonitril
(2%) | 80,0
ml | 80,0
ml |
| DI
Wasser | 3900
ml | 900
ml |
| eingestellter
pH | 8,0
mit HCl | 8,0
mit HCl |
| q.s. | 4000
ml | 4000
ml |
-
HPLC Gradient
-
Ein
30% bis 60% Gradient an Puffer B für Oligos mit einer Basenpaarlänge von
17-32 wird bereitgestellt:
| Zeit
(Minuten) | Fluss
(ml/min) | %A | %B | Kurve
bzw. Krümmung |
| 0 | 1.5 | 100 | 0 | * |
| 1 | 1.5 | 100 | 0 | 6 |
| 3 | 1.5 | 70* | 30* | 6 |
| 15 | 1.5 | 40* | 60* | 6 |
| 15.5 | 2.5 | 0 | 100 | 6 |
| 17 | 2.5 | 0 | 100 | 6 |
| 17.25 | 2.5 | 100 | 0 | 6 |
| 23 | 2.5 | 100 | 0 | 6 |
| 23.1 | 1.5 | 100 | 0 | 6 |
| 24 | 1.5 | 100 | 0 | 6 |
| 25 | 0.1 | 100 | 0 | 6 |
- * % Werte, welche zum Modifizieren des
Gradienten geändert
werden können.
Gewöhnliche
Gradienten sind 0-30%, 20-50%, 30-60% und 40-70% an Puffer B.
-
Gradientauswahl
-
Der
Gradient wird beruhend auf der Anzahl an Basen, wie nachstehend
aufgeführt,
ausgewählt:
| Zahl
an Basen | Gradient |
| 0-5 | 0-30 |
| 6-10 | 10-40 |
| 11-16 | 20-50 |
| 17-32 | 30-60 |
| 33-50 | 40-70 |
| > 50 | 50-80 |
-
Die
Zielproben werden nach der HPLC gesammelt und die RNA Konzentration
wird mit einem Spektrophotometer bei 260 nm bestimmt. Die Proben
werden bei -70°C
gelagert.
-
Inaktivierung
von RNAsen auf Arbeitsgerät,
Hilfsstoffen und in Lösungen
Glassware wird durch Backen bei 180°C für mindestens 8 Stunden behandelt.
Kunststoffware durch Spülen
mit Chloroform behandelt. Alle Artikel werden alternativ in 0,1%
DEPC eingeweicht.
-
Behandlung mit 0,1% DEPC
-
0,1%
DEPC wird vorbereitet. DI Wasser wird durch einen 0,2 μM Membranfilter
filtriert. Das Wasser wird bei 1,034 bar (15 Psi) in einem Flüssigkeitszyklus
autoklaviert. 1,0 g (wt/v) DEPC/Liter steriles Wasser werden hinzugegeben.
-
Glass- und Kunststoffware
-
Die
gesamte Glass- und Kunststoffware wird in 0,1% DEPC für zwei Stunden
bei 37°C
eingetaucht. Die Glassware wird mindestens 5x mit sterilem DI Wasser
gespült.
Die Glassware wird auf 100°C
für 15
Minuten erhitzt oder für
15 Minuten bei 1,034 bar (15 Psi) in einem Flüssigkeitszyklus autoklaviert.
-
Elektrophoresebehälter, die
für eine
Elektrophorese von RNA verwendet werden Behälter werden mit Detergens gewaschen,
mit Wasser und anschließend
Ethanol gespült
und Luft getrocknet. Der Behälter
wird mit 3% (v/v) Wasserstoffperoxid (30 ml/L) befüllt und
für 10
Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der Behälter wird
mindesten 5-mal mit DEPC behandeltem Wasser gespült.
-
Lösungen
-
Alle
Lösungen
wurden unter Verwendung RNAse freier Glassware, Kunststoffware,
autoklaviertem Wasser und Chemikalien hergestellt, die für eine Arbeit
mit RNA und RNAse freien Spateln zurückgehalten wurden. Einweghandschuhe
werden verwendet. Die Lösungen
werden falls möglich
mit 0,1% DEPC für
mindestens 12 Stunden bei 37°C
behandelt und anschließend
auf 100°C
für 15
Minuten erhitzt oder für
15 Minuten bei 1,034 bar (15 Psi) in einem Flüssigkeitszyklus autoklaviert.
-
RNA Translation
-
2 μl gastroinhibitorische
Peptid (GIP) mRNA mit einer Konzentration von 20 μl/ml wird
in einem 250 μl Polypropylen
Mikrozentrifugen Röhrchen
mit Schnappdeckel platziert. 35 μl
Kaninchen Reticulocyt Lysat (im Handel von Promega erhältlich)
wird hinzugegeben. 1 μl
Aminosäure
Gemisch, welches kein Methionin enthält (im Handel von Promega erhältlich),
wird hinzugegeben. 1 μl
35S Methionin oder nicht markiertes Methionin werden hinzugegeben.
2 μl bzw.
ml Luciferase können
wahlweise zu einigen Röhrchen
gegeben werden, um als eine Kontrolle zu dienen.
-
SATA
wird zu den Versuchsröhrchen
hinzugegeben. Kontrollröhrchen,
die kein SATA enthalten, werden ebenso bereitet. Die Menge an verwendetem
SATA liegt ungefähr
zwischen 0,1 μg
bis 500 μg,
vorzugsweise zwischen 0,5 μg
bis 50 μg.
1 μl Rnasin
von 40 Einheiten/ml wird hinzugegeben. Nuklease freies Wasser wird
hinzugegeben, um ein Gesamtvolumen von 50 μl zu erhalten.
-
Es
kann für
Proteine größer als
ungefähr
150 Aminosäuren
notwendig sein, die tRNA Menge zu supplementieren. Beispielsweise
können
ungefähr
10-200 μg
tRNA hinzugegeben werden. Die Menge des SATA sollte im Allgemeinen
hoch genug sein, um Stopp- oder Pseudostoppcodons wirksam zu unterdrücken. Die Menge
der nativen tRNA muss hoch genug sein, um das SATA aus zu konkurrieren,
welches keinem dynamischen Korrekturlesen unter der Wirkung der
Verlängerungsfaktoren
unterzogen wird.
-
Jedes
Röhrchen
wird unmittelbar geschlossen, mit Parafilm versehen und für die Translationsreaktionen
bei 30°C
für 90
Minuten inkubiert. Der Inhalt von jedem Reaktionsröhrchen wird
durch Kapillarwirkung in ein 50 μl
Kapillarröhrchen
aus Quarz überführt. Das
SATA wird mit mRNA durch Bestrahlen des Inhalts von jedem Röhrchen mit
2-10 J/cm2 Licht einer Wellenlänge von
~350 nm vernetzt, wie nach Gasparro et al. (Photochem. Photobiol.
57 (1993) 1007). Der Inhalt jedes Röhrchens wird nach dem Photo-Vernetzen
in ein neues Mikrozentrifugen Röhrchen
mit Schnappdeckel überführt. Die
Ribosomen werden durch Chelatieren der Calciumionen durch Zugeben
von 2 μl
10 mM EDTA zu jedem Röhrchen
dissoziiert. Jedes Röhrchen
wird zwischen jedem Schritt durch Rühren jeder Komponent mit einer
Pipettenspitze bei Zugabe vorsichtig gemischt.
-
Die
beste RNA für
eine Translation wird vor einem Durchführen maßgeblicher Versuche bestimmt.
Reihenverdünnungen
können
erforderlich sein, um die beste Konzentration von mRNA zwischen
5-20 μg/ml
zu finden.
| Reagenz | 1 | 2 | 3 | 4 |
| Kaninchen
Reticulocyt Lysat (35 μl) | + | + | + | + |
| Aminosäuregemisch
minus Methionin (1 μl
von 1 mM) | + | + | + | + |
| 35S Methionin (1 μl von 44.000 GBq/mmol (1.200 Ci/mmol)) | + | - | - | + |
| Methionin
(nicht markiert | - | + | + | - |
| GIP
mRNA (2 μl von
20 μg/ml) | + | - | - | - |
| 32P GIP mRNA (2 μl von 20 μg/ml) | - | + | + | - |
| Rnasin
(1 μl von
40 E/μl) | + | + | + | + |
| SATA | - | - | - | |
| Wasser,
Nuklease frei (q.s. auf 50 μl) | + | + | + | + |
-
SDS-Page
Elektrophorese wird mit jeder Probe, wie vorstehend beschrieben,
durchgeführt.
Autoradiographie von dem Gel wird, wie von Sambrook et. al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Coldspring
Harbor Press (1989) beschrieben, durchgeführt.
-
Während eine
Anzahl bevorzugter Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung und Variationen davon detailliert beschrieben
wurden, werden nutzbare andere Modifikationen und Verfahren dem
Fachmann offenkundig sein. Sequenzliste
