CN115298192A - 4′-o-亚甲基膦酸酯核酸及其类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可用作有效且稳定的RNA干扰剂的核酸及其类似物。

Description

4′-O-亚甲基膦酸酯核酸及其类似物
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2020年1月15日提交的美国临时专利申请号62/961,360；2020年2月12日提交的美国临时专利申请号62/975,352；和2020年3月19日提交的美国临时专利申请号62/991,738的权益，所述专利申请中每一者的内容以引用的方式整体并入本文中。
技术领域
本公开涉及核酸及其类似物、和适用于使用根据本文提供的说明书提供的核酸及其类似物调节靶基因在细胞中的表达的方法。本公开还提供包含本说明书的核酸及其类似物的药学上可接受的组合物和使用所述组合物治疗各种病症的方法。
背景技术
由修饰的核酸调节基因表达作为实验室中的研究工具和临床中的治疗方法均显示巨大潜力。数类基于寡核苷酸或核酸的治疗剂已处于临床研究中，包括反义寡核苷酸(ASO)、短干扰RNA(siRNA)、适体、核酶、外显子跳跃或剪接改变寡核苷酸、mRNA和CRISPR。化学修饰在克服寡核苷酸疗法面临的障碍中发挥关键作用，包括改善核酸酶稳定性、RNA结合亲和力和寡核苷酸的药代动力学性质。在过去三十年间，已针对寡核苷酸研发各种化学修饰策略，包括糖、核碱基和磷酸二酯主链的修饰(Deleavey和Darma,CHEM.BIOL.2012,19(8):937-54；Wan和Seth,J.MED.CHEM.2016,59(21):9645-67；以及Egli和Manoharan,ACC.CHEM.RES.2019,54(4):1036-47)。
ASO和siRNA疗法中最广泛使用的主链修饰中的一者是硫磷酸酯(PS)键联，其用硫原子置换非桥接氧中的一者。尽管此修饰增加核酸酶抗性并改善治疗寡核苷酸的药代动力学而不损害其生物功能，在临床前模型和临床中均已知毒性，诸如发炎、肾毒性、肝毒性和血小板减少症(Frazier,TOXICOL.PATHOL.2015,43(1):78-89)。据信毒性是由ASO经由PS键联结合蛋白质的强烈趋势引起(Shen等人,NAT.BIOTECH.2019,37:640-50)。此外，所述PS键联是手性的，导致2N个非对映体，其中N为主链中PS键联的数量。尽管已努力数十年(Stec等人,NUCLEIC ACID RES.1991,1(21):5883-8和J.AM.CHEM.SOC.1998,120(29):7156-67；Agrawal等人,TETRAHEDRON 1995,6(5):1051-4；Iyer等人,J.AM.CHEM.SOC.2000,112(3),1253-4；和Oka等人,J.AM.CHEM.SOC.2008,130(47):16031-7)，包括具有PS键联经定义的立体化学的寡核苷酸的化学合成中的最新发展(Iwamoto等人,NAT.BIOTECH.2017,35(9):845-51)，但所述方法仍缺乏高立体选择性和高合成效率，且其一般不为稳健和可获得的。期望发展不仅可维持PS键联的所需性质(诸如核酸酶抗性、RNA结合亲和力和适当的药代动力学)，而且可减轻毒性而不损害生物功能的新颖核苷酸间键联。理想地，所述新颖键联应为非手性的。即使无法避免手性，控制立体化学仍应是稳健且容易获得的。
最近，已报导电荷中性烷基膦酸酯键联并用于置换ASO中的PS键联来降低毒性并增加治疗窗(Migawa等人,NUCLEIC ACIDS RES.2019,47(11):5465-79和Shen等人,2019)。然而，此类烷基膦酸酯键联为手性的，在并入位点附近不支持RNA酶H介导的活性，且在固相合成后，在去保护寡核苷酸所需的碱性条件下更易于链裂解。
此领域中针对疾病(尤其癌症)的有效治疗存在持续需求。适用于调节靶基因在细胞中的表达的核酸治疗剂有希望作为治疗剂。因此，仍需找到适用作治疗剂的核酸及其类似物。
发明内容
本申请涉及发挥作用以调节靶基因在细胞中的表达的包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的新颖核酸或其类似物，及其制备方法和用途。本文提供的核酸及其类似物是稳定的并结合RNA靶标以引起与其硫磷酸酯(PS)对应体相当的RNA酶H活性且还适用于剪接转换和RNAi。所提供的核酸及其类似物还可用于其他机制(诸如剪接转换、RNAi等)中。并入4′-O-亚甲基膦酸酯键联向核苷酸间键联赋予核酸酶稳定性，不于磷原子处产生手性中心，且保留蛋白质(例如RNA酶H或Ago2)结合可能需要的磷酸酯主链的负电荷以发挥有效的基因沉默活性，其与电荷中性烷基膦酸酯途径相反(Migawa等人,2019)。
合适的包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物包括核酸抑制剂分子，诸如dsRNAi抑制剂分子、反义寡核苷酸、miRNA、核酶、安塔戈米尔(antagomir)、适体和ssRNAi抑制剂分子。具体地，本公开提供核酸及其类似物，其可用作细胞内RNA水平的调节剂，然后细胞内RNA水平由如本文所述的核酸及其类似物降低。核酸抑制剂分子可通过多种机制(例如通过RNA干扰(RNAi))调节RNA表达。本文提供的核酸及其类似物的优势在于，与细胞内RNA水平的调节一致，广泛范围的药理活性是可能的。另外，本说明书提供使用有效量的如本文所述的核酸及其类似物以治疗或改善疾病病状(诸如癌症、病毒感染或遗传病症)的方法。
现已发现本发明的核酸及其类似物及其药学上可接受的组合物可有效作为细胞内RNA水平的调节剂。此类核酸及其类似物包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示：
Figure BDA0003847035450000031
Figure BDA0003847035450000041
或其药学上可接受的盐，其中每个变量如本文所定义并描述。
本公开的核酸及其类似物及其药学上可接受的组合物适用于治疗与细胞内RNA水平的调节相关联的各种疾病、病症或病状。此类疾病、病症或病状包括本文所述的那些。
由本公开提供的核酸及其类似物还适用于研究生物和病理现象中的基因表达；研究身体组织中的RNA水平；以及体外或体内比较评估新RNA干扰剂。
附图说明
图1包括于基准SGLT2 ASO用核苷酸间磷酸二酯(PO)键联置换核苷酸间硫磷酸酯(PS)键联的结果，所述结果显示与PBS相比剩余的％SGLT2(y轴)以及PBS、基准SGLT2 ASO(ASO)、和分别自5’端至3’端计数、在核苷酸1与2(ASO1)之间、2与3(ASO2)之间、3与4(ASO3)之间、4与5(ASO4)之间、5与6(ASO5)之间、6与7(ASO6)之间、7与8(ASO7)之间、8与9(ASO8)之间、9与10(ASO9)之间、10与11(ASO10)、和11与12(ASO11)之间置换的寡核苷酸(x轴)。
图2包括如通过在0.5和3.0毫克每千克体重(mpk)的单剂量后5天、在小鼠肾脏中的SGLT2 mRNA敲低(KD)测量，PBS、SGLT2基准ASO(ASO)、ASO12和ASO13(x轴)的在体内ASO主链上用核苷酸间4’-O-亚甲基膦酸酯(iMOP)键联置换核苷酸间硫磷酸酯(PS)键联的结果(％表达[Slc5a2/Ppib]+SEM))(y轴)。ASO12是与基准的不同仅在于核苷酸11(自5’端计数)的2’-修饰为2’-OMe而非2’-MOE的实验对照。ASO13是测试制品，其中核苷酸10与11之间的键联为iMOP(显示于核酸I-3中)而非PS。ASO12的剩余部分与ASO13相同。
图3包括如通过在0.5毫克每千克体重(mpk)的单剂量后7天、在小鼠肾脏中的SGLT2 mRNA敲低(KD)测量，在体内ASO主链上用核苷酸间4’-O-亚甲基膦酸酯(iMOP)键联或核苷酸间4’-O-甲基亚甲基膦酸酯(iMeMOP)键联置换PS键联的影响的结果，所述结果显示(相对于PBS剩余的％SGLT2 mRNA)(y轴)与ASO14、SGLT2基准ASO(ASO)、ASO12、ASO13和ASO15(x轴)。ASO14是PO对照，其中核苷酸10与11之间的键联是磷酸二酯键联且核苷酸11是2’-OMe。ASO12是PS对照，其中所有键联均为PS且核苷酸11是2’-OMe。ASO13是iMOP测试制品，其中核苷酸10与11之间的键联是iMOP而非PS。ASO15是iMeMOP测试制品，其中核苷酸10与11之间的键联是iMeMOP(显示于核酸I-6中)而非PS。
图4包括如通过在1.0mpk的单剂量后4天、在小鼠肝脏中的靶基因mRNA敲低测量，于GalXC分子中的反义链的5’端的iMOP键联的结果，所述结果显示(相对于PBS剩余的％Aldh2 mRNA)(y轴)与PBS、GalXC1和GalXC2(x轴)。GalXC1是在所述反义链的5’端的核苷酸1与2之间具有PS键联的对照GalXC分子。GalXC2是用iMOP键联置换所述反义链的5’端PS键联的GalXC分子。所述GalXC分子的剩余部分与所述对照相同。
图5揭示在体内ASO主链的GAP2位置上用iMOP键联或iMeMOP键联置换PS键联的影响。
图6绘示如实例8的表3中所述，基准ASO(A)、ASO12(B)、ASO13(C)、ASO14(D)和ASO15(E)的基于HRMS的体外去污溶酶体(tritosomal)稳定性测定的结果，所述结果显示剩余百分比(％)(y轴)与去污溶酶体孵育时间(小时)(x轴)。
图7包括针对基准ASO:RNA1、ASO12:RNA1、ASO13:RNA1、ASO15:RNA1和ASO14:RNA1，将iMeMOP和iMOP并入ASO:RNA双螺旋的ASO链内的热稳定性结果，所述结果显示标准化吸光度(y轴)与温度(℃)(x轴)。
图8包括针对基准ASO:RNA2、ASO15:RNA2和ASO13:RNA2，将iMeMOP和iMOP并入ASO:RNA杂合体的ASO链内的RNA酶H活性结果，所述结果显示剩余RNA的百分比(％)(y轴)与时间(min)(x轴)。
具体实施方式
1.本发明的某些实施方案的一般描述：
改善RNAi效价和持续时间的5′端磷酸酯模拟物的4′-O-亚甲基膦酸酯化学已描述于WO 2018/045317和U.S.2019/177729中，其整体以引用的方式并入本文中。此类型的化学类似物不仅模拟磷酸酯基团的静电和/或空间性质，而且具有极佳的代谢稳定性，且与标准寡核苷酸固相合成完全相容。
本公开的核酸及其类似物、及其组合物适用作RNA干扰剂。在一些实施方案中，所提供的核酸或其类似物在细胞中抑制基因表达。
在某些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示：
Figure BDA0003847035450000061
或其药学上可接受的盐，其中：
B是核碱基或氢；
R1和R2独立地是氢、卤素、R5、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或：
相同碳上的R1和R2连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和环；
每个R独立地是氢、合适的保护基、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环，或：
相同原子上的两个R基团连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4至7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
R3是氢、合适的保护基、合适的前药、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
每个R4独立地是氢、合适的前药、R5、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-OP(O)R2、-OP(O)(OR)2、-OP(O)(OR)NR2、-OP(O)(NR2)2-、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R、-N(R)P(O)R2、-N(R)P(O)(OR)2、-N(R)P(O)(OR)NR2、-N(R)P(O)(NR2)2、-N(R)S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；
每个R5独立地是任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
X1是O、S或NR；
X2是-O-、-S-、-B(H)2-或共价键；
X3是-O-、-S-、-Se-或-N(R)-；
Y1是附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2′或3′端的连接基团；
Y2是氢、保护基、亚磷酰胺类似物、附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的4′或5′端的核苷酸间连接基团、或附接至固体支持物的连接基团；
Z是-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2-；并且
n是0、1、2、3、4或5。
2.化合物和定义：
本发明的化合物(即，核酸及其类似物)包括本文一般描述的那些，并且由本文公开的类别、子类和种类进一步说明。如本文所用，除非另有说明，否则以下定义应适用。出于本发明的目的，化学元素是根据元素周期表，CAS版，化学和物理手册，第75版识别。另外，有机化学的一般原理描述于“Organic Chemistry”,Thomas Sorrell,University ScienceBooks,Sausalito:1999和“March’s Advanced Organic Chemistry”,第5版,Smith,M.B.和March,J.编，John Wiley和Sons,New York:2001中，其全部内容以引用的方式并入本文中。
如本文所用，术语“脂族”或“脂族基团”意指直链(即，非支链)或支链、经取代或未经取代的烃链，所述烃链完全饱和或含有一个或多个不饱和单元、或完全饱和或含有一个或多个不饱和单元、但不为芳族的单环烃或双环烃(本文中还称为“碳环”、“环脂族”或“环烷基”)，其具有附接至分子的剩余部分的单点。除非另有规定，否则脂族基团含有1至6个脂族碳原子。在一些实施方案中，脂族基团含有1至5个脂族碳原子。在其他实施方案中，脂族基团含有1至4个脂族碳原子。在又其他实施方案中，脂族基团含有1至3个脂族碳原子，且在又其他实施方案中，脂族基团含有1至2个脂族碳原子。在一些实施方案中，“环脂族”(或“碳环”或“环烷基”)是指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元、但不为芳族的单环C3-C6烃，其具有附接至分子的剩余部分的单点。合适的脂族基团包括但不限于直链或支链、经取代或未经取代的烷基、烯基、炔基及其杂合体，诸如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。
如本文所用，术语“桥接双环”是指具有至少一个桥的任何双环环系统，即碳环或杂环、饱和或部分不饱和。如由IUPAC定义，“桥”是连接两个桥头的多个或一个原子或价键的非支链，其中“桥头”是结合至三个或更多个骨架原子(排除氢)的环系统的任何骨架原子。在一些实施方案中，桥接双环基团具有7至12个环成员和0至4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子。此类桥接双环基团为本领域熟知且包括下文列举的那些基团，其中每个基团于任何可取代碳或氮原子处附接至分子的剩余部分。除非另有规定，否则桥接双环基团任选经一个或多个如针对脂族基团列举的取代基取代。另外或替代地，桥接双环基团的任何可取代氮任选经取代。示例性桥接双环包括：
Figure BDA0003847035450000091
Figure BDA0003847035450000101
术语“低级烷基”是指C1-4直链或支链烷基。示例性低级烷基是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。
术语“低级卤代烷基”是指经一个或多个卤素原子取代的C1-4直链或支链烷基。
术语“杂原子”意指氧、硫、氮、磷或硅中的一者或多者(包括氮、硫、磷或硅的任何氧化形式；任何碱性氮的季铵化形式；或杂环的可取代氮，例如N(如于3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如于吡咯烷基中)或NR+(如于N-取代的吡咯烷基中))。
如本文所用，术语“不饱和”意指具有一个或多个不饱和单元的部分。
如本文所用，术语“二价C1-8(或C1-6)饱和或不饱和、直链或支链烃链”是指如本文定义的直链或支链的二价亚烷基、亚烯基和亚炔基链。
术语“亚烷基”是指二价烷基。“亚烷基链”是聚亚甲基，即-(CH2)n-，其中n是正整数，优选1至6、1至4、1至3、1至2、或2至3。经取代的亚烷基链是其中一个或多个亚甲基氢原子经取代基置换的聚亚甲基。合适的取代基包括下文针对经取代的脂族基团所述的那些。
术语“亚烯基”是指二价烯基。经取代的亚烯基链是其中一个或多个氢原子经取代基置换的含有至少一个双键的聚亚甲基。合适的取代基包括下文针对经取代的脂族基团所述的那些。
如本文所用，术语“环丙烯基”是指具有以下结构的二价环丙基：
Figure BDA0003847035450000111
术语“卤素”意指F、Cl、Br或I。
单独或作为较大部分的一部分如于“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”中使用的术语“芳基”是指具有总计五至十四个环成员的单环或双环环系统，其中所述系统中的至少一个环是芳族的且其中所述系统中的每个环含有3至7个环成员。术语“芳基”可与术语“芳基环”互换使用。在本发明的某些实施方案中，“芳基”是指可携带一个或多个取代基的芳族环系统，其包括但不限于苯基、联苯、萘基、蒽基等。如本文所用，术语“芳基”的范围内还包括其中芳族环稠合至一个或多个非芳族环的基团，诸如二氢茚基、苯邻二酰亚胺基、萘二甲酰亚胺基、菲啶基或四氢萘基等。
单独或作为较大部分(例如，“杂芳烷基”或“杂芳烷氧基”)的一部分使用的术语“杂芳基”和“杂芳-”是指具有5至10个环原子，优选5、6或9个环原子；具有环阵列中共用的6、10或14个π电子；且除碳原子外，还具有一至五个杂原子的基团。术语“杂原子”是指氮、氧或硫，且包括氮或硫的任何氧化形式、和碱性氮的任何季铵化形式。杂芳基包括但不限于噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、恶唑基、异恶唑基、恶二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。如本文所用，术语“杂芳基”和“杂芳-”还包括其中杂芳族环稠合至一个或多个芳基、环脂族或杂环基环的基团，其中所述基团或附接点在所述杂芳族环上。非限制性实例包括吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌嗪基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹啉基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩恶嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基和吡啶并[2,3-b]-1,4-恶嗪-3(4H)-酮。杂芳基可为单环或双环的。术语“杂芳基(heteroaryl)”可与术语“杂芳基环”、“杂芳基(heteroaryl group)”或“杂芳族”互换使用，所述术语中的任一者包括任选经取代的环。术语“杂芳烷基”是指经杂芳基取代的烷基，其中所述烷基和杂芳基部分独立地任选经取代。
如本文所用，术语“杂环(heterocycle)”、“杂环基”、“杂环基团”和“杂环(heterocyclic ring)”可互换使用且是指为饱和或部分不饱和的且除碳原子外还具有一个或多个(优选一至四个)杂原子的稳定的5至7元单环或7至10元双环杂环部分，如上文定义。当参考杂环的环原子使用时，术语“氮”包括经取代的氮。作为一实例，在具有0至3个选自氧、硫或氮的杂原子的饱和或部分不饱和环中，所述氮可为N(如于3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如于吡咯烷基中)或+NR(如于N-取代的吡咯烷基中)。
杂环可于任何杂原子或碳原子处附接至其侧基，其导致稳定结构且环原子中的任一者可任选经取代。此类饱和或部分不饱和杂环基团的实例包括但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基吡咯烷基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、恶唑啶基、哌嗪基、二恶烷基、二氧杂环戊烷基、二氮呯基、氧氮呯基、硫氮呯基、吗啉基和奎宁环基。术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基环”、“杂环基团(heterocyclic group)”、“杂环部分”和“杂环基团(heterocyclic radical)”在本文中可互换使用，且还包括其中杂环基环稠合至一个或多个芳基、杂芳基或环脂族环的基团，诸如吲哚啉基、3H-吲哚基、苯并二氢哌喃基、菲啶基或四氢喹啉基。杂环基可为单环或双环的。术语“杂环基烷基”是指经杂环基取代的烷基，其中所述烷基和杂环基部分独立地任选经取代。
如本文所用，术语“部分不饱和”是指包含至少一个双键或三键的环部分。如本文定义，术语“部分不饱和”旨在涵盖具有多个不饱和位点的环，但不旨在包括芳基或杂芳基部分。
如本文所述，本发明的化合物可含有“任选经取代的”部分。一般而言，术语“经取代”，无论是否在术语“任选”之前，均意指指定部分的一个或多个氢经合适的取代基置换。除非另有说明，否则“任选经取代的”基团可于所述基团的每个可取代位置具有合适的取代基，且当任何给定结构中的多于一个位置可经多于一个选自规定基团的取代基取代时，所述取代基在每个位置处可相同或不同。本发明设想的取代基的组合是优选导致形成稳定或化学可行的化合物的那些。如本文所用，术语“稳定”是指出于本文公开的目的中的一者或多者，化合物在经受使得其产生、检测、以及(在某些实施方案中)其回收、纯化和使用的条件时，大体上不改变。
“任选经取代的”基团的可取代碳原子上的合适的单价取代基独立地是卤素；-(CH2)0-4Ro；-(CH2)0-4ORo；-O(CH2)0-4Ro、-O-(CH2)0-4C(O)ORo；-(CH2)0-4CH(ORo)2；-(CH2)0-4SRo；可经Ro取代的-(CH2)0-4Ph；可经Ro取代的-(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph；可经Ro取代的-CH＝CHPh；可经Ro取代的-(CH2)0-4O(CH2)0-1-吡啶基；-NO2；-CN；-N3；-(CH2)0-4N(Ro)2；-(CH2)0-4N(Ro)C(O)Ro；-N(Ro)C(S)Ro；-(CH2)0-4N(Ro)C(O)NRo 2；-N(Ro)C(S)NRo 2；-(CH2)0-4N(Ro)C(O)ORo；-N(Ro)N(Ro)C(O)Ro；-N(Ro)N(Ro)C(O)NRo 2；-N(Ro)N(Ro)C(O)ORo；-(CH2)0-4C(O)Ro；-C(S)Ro；-(CH2)0- 4C(O)ORo；-(CH2)0-4C(O)SRo；-(CH2)0-4C(O)OSiRo 3；-(CH2)0-4OC(O)Ro；-OC(O)(CH2)0-4SR-、SC(S)SRo；-(CH2)0-4SC(O)Ro；-(CH2)0-4C(O)NRo 2；-C(S)NRo 2；-C(S)SRo；-SC(S)SRo、-(CH2)0-4OC(O)NRo 2；-C(O)N(ORo)Ro；-C(O)C(O)Ro；-C(O)CH2C(O)Ro；-C(NORo)Ro；-(CH2)0-4SSRo；-(CH2)0- 4S(O)2Ro；-(CH2)0-4S(O)2ORo；-(CH2)0-4OS(O)2Ro；-S(O)2NRo 2；-(CH2)0-4S(O)Ro；-N(Ro)S(O)2NRo 2；-N(Ro)S(O)2Ro；-N(ORo)Ro；-C(NH)NRo 2；-P(O)2Ro；-P(O)Ro 2；-OP(O)Ro 2；-OP(O)(ORo)2；SiRo 3；-(C1-4直链或支链亚烷基)O-N(Ro)2；或-(C1-4直链或支链亚烷基)C(O)O-N(Ro)2，其中每个Ro可如下文定义经取代且独立地是氢、C1-6脂族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph、-CH2-(5至6元杂芳基环)、或具有0至4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5至6元饱和、部分不饱和或芳基环、或尽管上文定义，但Ro两次单独出现均连同其中间原子一起形成具有0至4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3至12元饱和、部分不饱和或芳基单环或双环，其可如下文定义经取代。
Ro(或Ro两次单独出现均连同其中间原子一起形成的环)上的合适的单价取代基独立地是卤素、-(CH2)0-2R·、-(卤基R·)、-(CH2)0-2OH、-(CH2)0-2OR·、-(CH2)0-2CH(OR·)2；-O(卤基R·)、-CN、-N3、-(CH2)0-2C(O)R·、-(CH2)0-2C(O)OH、-(CH2)0-2C(O)OR·、-(CH2)0-2SR·、-(CH2)0- 2SH、-(CH2)0-2NH2、-(CH2)0-2NHR·、-(CH2)0-2NR· 2、-NO2、-SiR· 3、-OSiR· 3、-C(O)SR·、-(C1-4直链或支链亚烷基)C(O)OR·或-SSR·，其中每个R·未经取代或在前面带有“卤基”的情况下是仅经一个或多个卤素取代，且独立地选自C1-4脂族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph、或具有0至4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5至6元饱和、部分不饱和或芳基环。Ro的饱和碳原子上的合适的二价取代基包括＝O和＝S。
“任选经取代的”基团的饱和碳原子上的合适的二价取代基包括以下：＝O、＝S、＝NNR* 2、＝NNHC(O)R*、＝NNHC(O)OR*、＝NNHS(O)2R*、＝NR*、＝NOR*,-O(C(R* 2))2-3O-或-S(C(R* 2))2-3S-，其中R*每次单独出现均选自氢、可如下文定义经取代的C1-6脂族、或具有0至4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代的5至6元饱和、部分不饱和或芳基环。结合至“任选经取代的”基团的邻位可取代碳的合适的二价取代基包括：-O(CR* 2)2-3O-，其中R*每次单独出现均选自氢、可如下文定义经取代的C1-6脂族、或具有0至4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代的5至6元饱和、部分不饱和或芳基环。
R*的脂族基团上的合适的取代基包括卤素、-R·、-(卤基R·)、-OH、-OR·、-O(卤基R·)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR·、-NH2、-NHR·、-NR· 2或-NO2，其中每个R·未经取代或在前面带有“卤基”的情况下是仅经一个或多个卤素取代，且独立地是C1-4脂族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph、或具有0至4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5至6元饱和、部分不饱和或芳基环。
“任选经取代的”基团的可取代氮上的合适的取代基包括
Figure BDA0003847035450000151
Figure BDA0003847035450000152
Figure BDA0003847035450000153
其中每个
Figure BDA0003847035450000154
独立地是氢、可如下文定义经取代的C1-6脂族、未经取代的-OPh、或具有0至4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代的5至6元饱和、部分不饱和或芳基环、或尽管上文定义，但
Figure BDA0003847035450000155
两次单独出现均连同其中间原子一起形成具有0至4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代的3至12元饱和、部分不饱和或芳基单环或双环。
Figure BDA0003847035450000156
的脂族基团上的合适的取代基独立地是卤素、-R·、-(卤基R·)、-OH、-OR·、-O(卤基R·)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR·、-NH2、-NHR·、-NR· 2或-NO2，其中每个R·未经取代或在前面带有“卤基”的情况下是仅经一个或多个卤素取代，且独立地是C1-4脂族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph、或具有0至4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5至6元饱和、部分不饱和或芳基环。
除非另有说明，否则本文绘示的结构还旨在包括结构的所有异构(例如，对映体、非对映体和几何(或构象))形式；例如，每个非对称中心的R和S构型、Z和E双键异构体、以及Z和E构象异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映体、非对映体、和几何(或构象)混合物在本发明的范围内。除非另有说明，否则本发明的化合物的所有互变异构形式在本发明的范围内。另外，除非另有说明，否则本文绘示的结构还意在包括不同之处仅在于存在一个或多个同位素富集原子的化合物。例如，具有本发明结构的包括由氘或氚置换氢、或由13C或14C富集的碳置换碳的化合物在本发明的范围内。此类化合物适合例如作为分析工具、作为生物测定中的探针或作为根据本发明的治疗剂。
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数个参考物。例如，对“一种方法”的提及包括本文所述的类型的一种或多种方法和/或步骤，并且/或者其对于本领域技术人员而言，在阅读本公开内容等之后将显而易见。
除非另有说明，否则如本文所用，术语“和/或”在本公开中用于意指“和”或“或”。
如本文所用，术语“4′-O-亚甲基膦酸酯”是指本文所述的所有经取代的亚甲基类似物(例如，经甲基、二甲基、乙基、氟、环丙基等取代的亚甲基)和所有膦酸酯类似物(例如，硫磷酸酯、二硫磷酸酯、磷酸二酯等)。
如本文所用，术语“5′端核苷酸”是指位于寡核苷酸的5′端的核苷酸。在本申请中，所述5′端核苷酸还可称为“N1核苷酸”。
如本文所用，术语“适体”是指对特定靶标(包括核酸、蛋白质、特定全细胞或特定组织)具有结合亲和力的寡核苷酸。适体可使用本领域已知的方法获得，例如，通过自大核酸随机序列库体外选择获得。Lee等人,NUCLEIC ACID RES.,2004,32:D95-D100。
如本文所用，术语“安塔戈米尔”是指对特定靶标(包括外源性RNAi抑制剂分子或天然miRNA的引导链)具有结合亲和力的寡核苷酸(Krutzfeldt等人,NATURE 2005,438(7068):685-689)。
双链RNAi抑制剂分子包含两个寡核苷酸链：反义链和正义链。反义链或其区域与靶核酸的对应区域部分、大体上或完全互补。另外，双链RNAi抑制剂分子的反义链或其区域与所述双链RNAi抑制剂分子的正义链或其区域部分、大体上或完全互补。在某些实施方案中，所述反义链还可含有与靶核酸序列非互补的核苷酸。所述非互补核苷酸可在互补序列的任一侧上或可在互补序列的两侧上。在某些实施方案中，在反义链或其区域与正义链或其区域部分或大体上互补的情况下，所述非互补核苷酸可位于一个或多个互补区之间(例如，一个或多个错配)。双链RNAi抑制剂分子的反义链还称为引导链。
如本文所用，术语“典型RNA抑制剂分子”是指两链核酸，每条链21个核苷酸长，带有19个碱基对长的中心互补区，以在3′端中的每一者处形成双链核酸和两个核苷酸悬垂物。
如本文所用，术语“互补”是指两个核苷酸(例如，在两个相对的核酸上或在单核酸链的相对区上)之间的结构关系，所述结构关系允许所述两个核苷酸彼此形成碱基对。例如，与相对核酸的嘧啶核苷酸互补的一个核酸的嘌呤核苷酸可通过彼此形成氢键碱基配对在一起。在一些实施方案中，互补核苷酸可以沃森-克里克方式或以使得形成稳定的双螺旋的任何其他方式碱基配对。“完全互补”或100％互补是指其中第一寡核苷酸链或第一寡核苷酸链的区段的每个核苷酸单体可与第二寡核苷酸链或第二寡核苷酸链的区段的每个核苷酸单体形成碱基对的情况。小于100％互补是指其中两个寡核苷酸链(或两个寡核苷酸链的两个区段)的一些(但非所有)核苷酸单体可彼此形成碱基对的情况。“实质性互补”是指两个寡核苷酸链(或两个寡核苷酸链的区段)显示彼此90％或更大的互补性。“足够互补”是指靶mRNA与核酸抑制剂分子之间的互补性，使得由靶mRNA编码的蛋白质的量减少。
如本文所用，术语“互补链”是指与另一链部分、大体上或完全互补的双链核酸抑制剂分子的一链。
如本文所用，术语“常规反义寡核苷酸”是指由以下机制中的一者抑制靶基因的表达的单链寡核苷酸：(1)空间位阻，例如，反义寡核苷酸通过直接干扰例如基因的转录、前mRNA的剪接和mRNA的翻译干扰涉及基因表达和/或编码蛋白的产生的事件顺序中的一些步骤；(2)由RNA酶H诱导靶向的基因的RNA转录本的酶消化；(3)由RNA酶L诱导靶向的基因的RNA转录本的酶消化；(4)由RNA酶P诱导靶向的基因的RNA转录本的酶消化；(5)由双链RNA酶诱导靶向的基因的RNA转录本的酶消化；以及(6)组合空间位阻并在相同的反义寡核苷酸中诱导酶消化活性。常规反义寡核苷酸不具有像RNAi抑制剂分子的RNAi机制。RNAi抑制剂分子可以数种方式与常规反义寡核苷酸区分，包括要求Ago2与RNAi反义链组合，使得所述反义链将所述Ago2蛋白引向预期靶标且Ago2需在此使所述靶标沉默。
簇状规则间隔的短回文重复序列(“CRISPR”)是参与防御入侵噬菌体和质体的微生物核酸酶系统。Wright等人,Cell,2016,164:29-44。此原核系统已适用于编辑真核细胞的基因组中的感兴趣的靶核酸序列。Cong等人,SCIENCE,2013,339:819-23；Mali等人,SCIENCE,2013,339:823-26；Woo Cho等人,NAT.BIOTECHNOLOGY,2013,31(3):230-232。如本文所用，术语“CRISPR RNA”是指包含“CRISPR”RNA(crRNA)部分和/或反式活化的crRNA(tracrRNA)部分的核酸，其中所述CRISPR部分具有与靶核酸部分、大体上或完全互补的第一序列和与tracrRNA部分足够互补的第二序列(还称为示踪剂配偶序列)，使得所述示踪剂配偶序列与tracrRNA部分杂合以形成引导RNA。所述引导RNA与核酸内切酶(诸如Cas核酸内切酶(例如，Cas9))形成复合物并引导所述核酸酶介导所述靶核酸的裂解。在某些实施方案中，所述crRNA部分与所述tracrRNA部分融合以形成嵌合引导RNA。Jinek等人,SCIENCE,2012,337:816-21。在某些实施方案中，所述crRNA部分的第一序列包括约16至约24之间个核苷酸，优选约20个核苷酸，所述核苷酸与所述靶核酸杂合。在某些实施方案中，所述引导RNA是约10至500个核苷酸。在其他实施方案中，所述引导RNA是约20至100个核苷酸。
如本文所用，术语“递送剂”是指与寡核苷酸复合或结合并介导其进入细胞内的转染剂或配体。所述术语涵盖阳离子脂质体，例如，其具有结合至所述寡核苷酸的负电荷的净正电荷。此术语还涵盖如本文所述的缀合物(诸如GalNAc和胆固醇)，所述缀合物可共价附接至寡核苷酸以引导递送至某些组织。本文还描述其他特定的合适的递送剂。
如本文所用，术语“脱氧核糖核苷酸”是指在糖部分的2′-位置具有氢基的核苷酸。
如本文所用，术语“二硫化物”是指含有基团
Figure BDA0003847035450000193
的化学化合物。通常，每个硫原子共价结合至烃基。在某些实施方案中，至少一个硫原子共价结合至除烃外的基团。键联还称为SS键或二硫键。
如本文所用，参考核酸(例如，寡核苷酸)的术语“双螺旋”是指通过核苷酸的两个反平行序列的互补碱基配对形成的双螺旋结构。
如本文所用，术语“赋形剂”是指可包括在组合物中例如以提供或有助于所需一致性或稳定效果的非治疗剂。
如本文所用，术语“呋喃糖”是指具有五元环结构的糖类，其中所述环结构具有由
Figure BDA0003847035450000191
表示的4个碳原子和一个氧原子，其中数字表示所述五元环结构中所述4个碳原子的位置。
如本文所用，术语“谷胱甘肽”(GSH)是指具有结构
Figure BDA0003847035450000192
的三肽。GSH以大约1至10mM的浓度存在于细胞中。GSH减少谷胱甘肽敏感键(包括二硫键)。在所述过程中，将谷胱甘肽转化为其氧化形式，谷胱甘肽二硫化物(GSSG)。一经氧化，则使用NADPH作为电子供体，可由谷胱甘肽还原酶将谷胱甘肽还原。
如本文所用，术语“谷胱甘肽敏感化合物”或“谷胱甘肽敏感部分”可互换使用且是指含有至少一个谷胱甘肽敏感键(诸如二硫键或磺酰基)的任何化学化合物(例如，寡核苷酸、核苷酸或核苷)或部分。如本文所用，“谷胱甘肽敏感寡核苷酸”含有至少一个含有谷胱甘肽敏感键的核苷酸的寡核苷酸。谷胱甘肽敏感部分可位于糖部分的2’-碳或3’-碳且包含磺酰基或二硫桥。在某些实施方案中，谷胱甘肽敏感部分可与亚磷酰胺寡核苷酸合成方法相容，如描述例如于国际专利申请号PCT/US2017/048239中，其以引用的方式整体并入本文中。谷胱甘肽敏感部分还可位于含磷核苷酸间键联处。在某些实施方案中，谷胱甘肽敏感部分选自如PCT/US2013/072536中描述的那些，其以引用的方式整体并入本文中。
如本文所用，术语“核苷酸间连接基团”或“核苷酸间键联”是指可共价连接两个核苷部分的化学基团。通常，所述化学基团是含有磷酸或亚磷酸酯基团的含磷键联基团。磷酸连接基团旨在包括磷酸二酯键联、二硫磷酸酯键联、硫磷酸酯键联、磷酸三酯键联、硫烷基膦酸酯键联、硫烷基磷酸三酯键联、亚磷酰胺键联、膦酸酯键联和/或硼烷磷酸酯键联。许多含磷键联为本领域所熟知，如公开例如于美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050中。在其他实施方案中，所述寡核苷酸含有一个或多个不含磷原子的核苷酸间连接基团，此类短链烷基或环烷基核苷酸间键联、混合杂原子和烷基或环烷基核苷酸间键联、或一个或多个短链杂芳族或杂环核苷酸间键联，包括但不限于具有以下的那些：硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基和硫甲酰基主链；亚甲基甲酰基和硫甲酰基主链；核糖乙酰基主链；含烯烃主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；和酰胺主链。非含磷键联为本领域所熟知，如公开例如于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439中。
如本文所用，术语“环”是指由单链核酸形成的结构，其中位于特定单链核苷酸区侧翼的互补区以所述互补区之间的所述单链核苷酸区自双螺旋形成或沃森-克里克碱基配对排除的方式杂合。环是任何长度的单链核苷酸区。环的实例包括存在于诸如发夹和四环的结构中的未配对核苷酸。
如本文所用，术语“微小RNA”、“成熟微小RNA”、“miRNA”和“miR”可互换使用且是指在植物和动物的基因组中编码的非编码RNA分子。通常，成熟微小RNA长约18至25个核苷酸。在某些情况下，高度保守、内源性表达的微小RNA通过结合至特定mRNA的3′-未翻译区(3′-UTR)调节基因的表达。某些成熟微小RNA似乎源于通常长数百个核苷酸的长内源性初级微小RNA转录本(还称为预微小RNA、初始微小RNA、初始mir、初始miR或初始预微小RNA)(Lee等人,EMBO 1,2002,21(17),4663-4670)。
如本文所用，术语“修饰的核苷”是指含有修饰或通用核碱基或修饰的糖中的一者或多者的核苷。所述修饰或通用核碱基(本文中还称为碱基类似物)一般位于核苷糖部分的1‘-位置且是指除1’-位置处的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶外的核碱基。在某些实施方案中，所述修饰或通用核碱基是含氮碱基。在某些实施方案中，所述修饰的核碱基不含有氮原子。参见例如，美国公开专利申请号20080274462。在某些实施方案中，所述修饰的核苷酸不含有核碱基(脱碱基)。修饰的糖(本文中还称为糖类似物)包括修饰的脱氧核糖或核糖部分，例如，其中所述修饰发生在所述糖的2′、3′、4′或5′-碳位置。所述修饰的糖还可包括非天然替代碳结构，诸如存在于上锁核酸(“LNA”)(参见，例如，Koshkin等人(1998),TETRAHEDRON,54,3607-3630)；桥接核酸(“BNA”)(参见，例如，美国专利号7,427,672和Mitsuoka等人(2009),NUCLEIC ACIDS RES.,37(4):1225-38)；和解锁核酸(“UNA”)(参见，例如，Snead等人(2013),MOLECULAR THERAPY-NUCLEIC ACIDS,2,e103(doi:10.1038/mtna.2013.36))中的那些。本文描述了本公开上下文中的合适的修饰或通用核碱基或修饰的糖。
如本文所用，术语“修饰的核苷酸”是指含有修饰或通用核碱基、修饰的糖或修饰的磷酸酯中的一者或多者的核苷酸。所述修饰或通用核碱基(本文中一般还称为核碱基)通常位于核苷糖部分的1‘-位置且是指除在1’-位置的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶外的核碱基。在某些实施方案中，所述修饰或通用核碱基是含氮碱基。在某些实施方案中，所述修饰的核碱基不含有氮原子。参见例如，美国公开专利申请号20080274462。在某些实施方案中，所述修饰的核苷酸不含有核碱基(脱碱基)。修饰的糖(本文中还称为糖类似物)包括修饰的脱氧核糖或核糖部分，例如，其中所述修饰发生在所述糖的2′-、3′-、4′-或5′-碳位置。所述修饰的糖还可包括非天然替代碳结构，诸如存在于上锁核酸(“LNA”)(参见，例如，Koshkin等人(1998),TETRAHEDRON,54,3607-3630)、桥接核酸(“BNA”)(参见，例如，美国专利号7,427,672和Mitsuoka等人(2009),NUCLEIC ACIDS RES.,37(4):1225-38)；和解锁核酸(“UNA”)(参见，例如，Snead等人(2013),MOLECULAR THERAPY-NUCLEIC ACIDS,2,e103(doi:10.1038/mtna.2013.36))中的那些。修饰的磷酸酯基团是指所述磷酸酯基团的修饰不发生于天然核苷酸中且包括如本文所述的非天然生成的磷酸酯模拟物。如本文所述，修饰的磷酸酯基团还包括非天然生成的核苷酸间连接基团，包括含磷核苷酸间连接基团和非含磷连接基团两者。本文描述了本公开上下文中的合适的修饰或通用核碱基、修饰的糖或修饰的磷酸酯。
如本文所用，术语“裸核酸”是指未配制于保护脂质纳米粒子或其他保护制剂中并因此当体内施用时暴露于血液和内体/溶酶体隔室的核酸。
如本文所用，术语“天然核苷”是指与糖(例如，脱氧核糖或核糖或其类似物)键联的N-糖苷中的杂环含氮碱基。所述天然杂环含氮碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。
如本文所用，术语“天然核苷酸”是指与连接至磷酸酯基团的糖(例如，核糖或脱氧核糖或其类似物)键联的N-糖苷中的杂环含氮碱基。所述天然杂环含氮碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。
如本文所用，术语“核酸或其类似物”是指任何天然或修饰的核苷酸、核苷、寡核苷酸、常规反义寡核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核酶、RNAi抑制剂分子、反义寡核苷酸(ASO)、短干扰RNA(siRNA)、典型RNA抑制剂分子、适体、安塔戈米尔、外显子跳跃或剪接改变寡核苷酸、mRNA、miRNA、或包含本文所述的4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联中的一者或多者的CRISPR核酸酶系统。在某些实施方案中，所提供的核酸或其类似物用于反义寡核苷酸、siRNA和切丁酶基质siRNA中，包括描述于U.S.2010/331389、U.S.8,513,207、U.S.10,131,912、U.S 8,927,705、CA 2,738,625、EP 2,379,083和EP 3,234,132中的那些，所述文献中的每一者以引用的方式整体并入本文中。
如本文所用，术语“核酸抑制剂分子”是指减少或消除靶基因的表达的寡核苷酸分子，其中所述寡核苷酸分子含有特异性靶向靶基因mRNA中的序列的区域。通常，所述核酸抑制剂分子的靶向区包含与靶基因mRNA上的序列足够互补的序列以将所述核酸抑制剂分子的影响引向规定靶基因。所述核酸抑制剂分子可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、和/或修饰的核苷酸。
如本文所用，术语“核碱基”是指天然核碱基、修饰的核碱基或通用核碱基。所述核碱基是位于可并入核酸双螺旋内的修饰的核苷酸中的核苷酸糖部分的1′位置(或可并入核酸双螺旋内的核苷酸糖部分取代中的等效位置)的杂环部分。因此，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸及其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中所述核碱基一般是嘌呤或嘧啶碱基。在一些实施方案中，所述核碱基还可包括共同碱基鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)、或其衍生物，诸如适用于制备寡核苷酸的受保护的衍生物。在一些实施方案中，核碱基G、A和C中的每一者独立地包含选自以下的保护基：异丁酰基、乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基、苯氧基乙酰基、异丙基苯氧基乙酰基、苯甲酰基、9-茀基甲氧基羰基、苯氧基乙酰基、二甲基甲脒、二丁基甲脒和N,N-二苯基胺甲酸酯。核碱基类似物可与dsRNA中的其他碱基或碱基类似物形成双螺旋。核碱基类似物包括适用于本发明的核酸及其类似物和方法的那些，例如，公开于Benner的美国专利号5,432,272和6,001,983以及Manoharan的美国专利公开号20080213891中的那些，所述文献以引用的方式并入本文中。核碱基的非限制性实例包括次黄嘌呤(I)、黄嘌呤(X)、3β-D-呋喃核糖基-(2,6-二氨基嘧啶)(K)、3-O-D-呋喃核糖基-(1-甲基-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7(4H,6H)-二酮)(P)、异胞嘧啶(异C)、异鸟嘌呤(异G)、1-β-D-呋喃核糖基-(5-硝基吲哚)、1-β-D-呋喃核糖基-(3-硝基吡咯)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、4-硫基-dT、7-(2-噻吩基)-咪唑并[4,5-b]吡啶(Ds)和吡咯-2-甲醛(Pa)、2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤(S)、2-氧代吡啶(Y)、二氟甲苯基、4-氟-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑、3-甲基异喹诺酮基、5-甲基异喹诺酮基和3-甲基-7-丙炔基异喹诺酮基、7-氮杂吲哚基、6-甲基-7-氮杂吲哚基、亚咪唑并吡啶基、9-甲基-亚咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、异喹诺酮基、7-丙炔基异喹诺酮基、丙炔基-7-氮杂吲哚基、2,4,5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基、4,6-二甲基吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲蒽基、芘基、芪基(stilbenzyl)、四烯基、稠五苯基及其结构衍生物(Schweitzer等人,J.ORG.CHEM.,59:7238-7242(1994)；Berger等人,NUCLEIC ACIDSRESEARCH,28(15):2911-2914(2000)；Moran等人,J.AM.CHEM.SOC.,119:2056-2057(1997)；Morales等人,J.AM.CHEM.SOC.,121:2323-2324(1999)；Guckian等人,J.AM.CHEM.SOC.,118:8182-8183(1996)；Morales等人,J.AM.CHEM.SOC.,122(6):1001-1007(2000)；McMinn等人,J.AM.CHEM.SOC.,121:11585-11586(1999)；Guckian等人,J.ORG.CHEM.,63:9652-9656(1998)；Moran等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.,94:10506-10511(1997)；Das等人,J.CHEM.SOC.,PERKIN TRANS.,1:197-206(2002)；Shibata等人,J.CHEM.SOC.,PerkinTrans.,1:1605-1611(2001)；Wu等人,J.AM.CHEM.SOC.,122(32):7621-7632(2000)；O′Neill等人,J.ORG.CHEM.,67:5869-5875(2002)；Chaudhuri等人,J.AM.CHEM.SOC.,117:10434-10442(1995)；和美国专利号6,218,108)。碱基类似物还可为通用碱基。
如本文所用，术语“核苷”是指天然核苷或修饰的核苷。
如本文所用，术语“核苷酸”是指天然核苷酸或修饰的核苷酸。
如本文所用，术语“核苷酸位置”是指如自核苷酸在5′端计数，所述核苷酸在寡核苷酸中的位置。例如，核苷酸位置1是指寡核苷酸的5′端核苷酸。
如本文所用，如本文所用的术语“寡核苷酸”是指在2至2500个核苷酸的范围内的核苷酸的聚合形式。寡核苷酸可为单链或双链的。在某些实施方案中，所述寡核苷酸具有500至1500个核苷酸，通常，例如，其中所述寡核苷酸用于基因疗法。在某些实施方案中，所述寡核苷酸是单链或双链的且具有7至100个核苷酸。在某些实施方案中，所述寡核苷酸是单链或双链的且具有15至100个核苷酸。在另一实施方案中，所述寡核苷酸是具有15至50个核苷酸的单链或双链，通常，例如，其中所述寡核苷酸是核酸抑制剂分子。在另一实施方案中，所述寡核苷酸是具有25至40个核苷酸的单链或双链，通常，例如，其中所述寡核苷酸是核酸抑制剂分子。在又另一实施方案中，所述寡核苷酸是单链或双链的且具有19至40或19至25个核苷酸，通常，例如，其中所述寡核苷酸是双链核酸抑制剂分子并形成具有至少18至25个碱基对的双螺旋。在其他实施方案中，所述寡核苷酸是单链的且具有15至25个核苷酸，通常，例如，其中所述寡核苷酸核苷酸是单链RNAi抑制剂分子。通常，如本文所述，所述寡核苷酸含有一个或多个含磷核苷酸间连接基团。在其他实施方案中，如本文所述，所述核苷酸间连接基团是非含磷键联。
如本文所用，术语“悬垂物”是指在双链核酸抑制剂分子的任一链的任一端的末端非碱基配对核苷酸。在某些实施方案中，所述悬垂物由一个链或一个区延伸超过与第一链或第一区形成双螺旋的互补链的末端产生。能够通过碱基对的氢键结合形成双螺旋的两个寡核苷酸区中的一者或两者可具有延伸超过两个聚核苷酸或区共用的互补性的3′和/或5′端的5′和/或3′端。延伸超过所述双螺旋的3’和/或5’端的单链区称为悬垂物。
如本文所用，术语“药物组合物”包含药理有效量的磷酸酯类似物-修饰的寡核苷酸和药学上可接受的赋形剂。如本文所用，“药理有效量”、“治疗有效量”或“有效量”是指本公开的磷酸酯类似物-修饰的寡核苷酸有效产生预期药理、治疗或预防结果的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”意指所述赋形剂适用于与人和/或动物一起使用而无与合理的收益/风险比相称的过度不良副作用(诸如毒性、刺激和过敏反应)。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内、适用于与人和低等动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应等且与合理的收益/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐为本领域所熟知。例如，S.M.Berge等人,于J.PharmaceuticalSciences,1977,66,1-19中详细描述药学上可接受的盐，所述文献以引用的方式并入本文中。本发明的核酸及其类似物的药学上可接受的盐包括来源于合适的无机和有机酸和碱的那些。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是氨基与无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和过氯酸)或与有机酸(诸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)或通过使用本领域中所用的其他方法(诸如离子交换)形成的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬胺酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘化物、2-羟基-乙烷磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟碱酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。
来源于适当碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和N+(C1-4烷基)4盐。代表性碱金属盐或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。其他药学上可接受的盐包括任选无毒铵盐、季铵盐、和使用相对离子(诸如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根和芳基磺酸根)形成的胺阳离子。
如本文所用，术语“合适的前药”旨在指示可在生理条件下或通过溶剂分解转化为本文所述的生物活性核酸或其类似物的化合物。因此，术语“前药”是指药学上可接受的生物活性核酸或其类似物的前体。前药在向受试者施用时可为非活性的，但例如通过水解体内转化为活性化合物。所述前药化合物通常在哺乳动物有机体中提供可溶性、组织相容性或延迟释放的优势(参见，例如，Bundgard,H.,DESIGN OF PRODRUGS(1985),第7至9、21至24页(Elsevier,Amsterdam)。前药的讨论提供于Higuchi,T.等人,“Pro-drugs as NovelDelivery Systems”，A.C.S.Symposium Series,第14卷、和于BIOREVERSIBLE CARRIERS INDRUG DESIGN，Edward B.编,Roche,American Pharmaceutical Association andPergamon Press,1987中，所述文献两者均以引用的方式全文并入本文中。术语“前药”还旨在包括任何共价结合的载剂，当向哺乳动物受试者施用此前药时，所述载剂体内释放活性化合物。如本文所述，活性化合物的前药可通过以使得修饰以例行性操作或体内裂解为亲代活性化合物的方式修饰所述活性化合物中存在的官能团制备。前药包括其中羟基、氨基或巯基结合至当向哺乳动物受试者施用活性化合物的前药时，裂解以分别形成游离羟基、游离氨基或游离巯基的任何基团的化合物。合适的前药的实例包括但不限于谷胱甘肽、酰氧基、硫酰氧基、2-碳烷氧基乙基、二硫化物、硫胺素(thiaminal)、和磷原子-修饰的核酸的烯醇酯衍生物。术语“前寡核苷酸”或“前核苷酸”或“核酸前药”是指已修饰为寡核苷酸的前药的寡核苷酸。膦酸酯和磷酸酯前药可见于例如Wiener等人,“Prodrugs or phosphonatesand phosphates:crossing the membrane”TOP.CURR.CHEM.2015,360:115-160，其全部内容以引用的方式并入本文中。
如本文所用，术语“亚磷酰胺”是指含氮三价磷衍生物。本文描述了合适的亚磷酰胺的实例。
如本文所用，“效价”是指必须体内或体外施用以针对细胞中的预期靶标获得特定水平活性的寡核苷酸或其他药物的量。例如，在1mg/kg的剂量下抑制受试者中的靶标的表达达90％的寡核苷酸具有比在100mg/kg的剂量下抑制受试者中的靶标的表达达90％的寡核苷酸更大的效价。
如本文所用，术语“保护基”在常规化学意义上用作在所需反应的某些条件下可逆地使官能团无反应性的基团。在所需反应后，可移除保护基以将受保护的官能团去保护。所有保护基在不降解较大比例的合成中的分子的条件下应是可移除的。
如本文所用，术语“所提供的核酸”是指本文列举的任何属、亚属和/或物种。
如本文所用，术语“核糖核苷酸”是指在糖部分的2’-位置具有羟基的天然或修饰的核苷酸。
如本文所用，术语“核酶”是指特异性识别并裂解独特靶核酸序列(其可为DNA或RNA)的催化核酸分子。每个核酶具有催化组分(还称为“催化域”)和由两个结合域(一个域在所述催化域的任一侧)组成的靶序列结合组分。
如本文所用，术语“RNAi抑制剂分子”是指(a)具有正义链(客体)和反义链(引导)的双链核酸抑制剂分子(“dsRNAi抑制剂分子”)，其中所述反义链或所述反义链的部分由阿戈纳特(Argonaute 2)(Ago2)核酸内切酶用于裂解靶mRNA、或(b)具有单反义链的单链核酸抑制剂分子(“ssRNAi抑制剂分子”)，其中所述反义链(或所述反义链的部分)由所述Ago2核酸内切酶用于裂解靶mRNA。
双链RNAi抑制剂分子包含两个寡核苷酸链：反义链和正义链。所述正义链或其区域与所述双链RNAi抑制剂分子的反义链或其区域部分、大体上或完全互补。在某些实施方案中，所述正义链还可含有与所述反义链非互补的核苷酸。所述非互补核苷酸可在所述互补序列的任一侧上或可在所述互补序列的两侧上。在某些实施方案中，在所述正义链或其区域与所述反义链或其区域部分或大体上互补的情况下，所述非互补核苷酸可位于一个或多个互补区之间(例如，一个或多个错配)。所述正义链还称为客体链。
如本文所用，术语“全身施用”是指药物于血流中的体内全身吸收或积聚，接着分布在整个体内。
如本文所用，术语“靶位点”、“靶序列”、“靶核酸”、“靶区”、“靶基因”可互换使用且是指“经靶向”以例如用于由RNAi抑制剂分子介导的裂解的RNA或DNA序列，所述RNAi抑制剂分子在其引导/反义区内含有与所述靶序列部分、大体上或完全或足够互补的序列。
如本文所用，术语“四环”是指形成有助于相邻沃森-克里克杂合核苷酸的稳定性的稳定二级结构的环(单链区)。不限于理论，四环可通过堆叠相互作用稳定相邻沃森-克里克碱基对。另外，四环中核苷酸之间的相互作用包括但不限于非沃森-克里克碱基配对、堆叠相互作用、氢键结合和接触相互作用(Cheong等人,NATURE 1990；346(6285):680-2；Heus和Pardi,SCIENCE 1991；253(5016):191-4)。四环使相邻双螺旋的熔化温度(Tm)增加，其熔化温度高于自由随机碱基组成的简单模型环序列预期的熔化温度。例如，四环可在10mMNaHPO4中向包含长度为至少2个碱基对的双螺旋的发夹赋予至少50℃、至少55℃、至少56℃、至少58℃、至少60℃、至少65℃或至少75℃的熔化温度。四环可含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、修饰的核苷酸及其组合。在某些实施方案中，四环由四个核苷酸构成。在某些实施方案中，四环由五个核苷酸组成。
RNA四环的实例包括四环的UNCG家族(例如，UUCG)、四环的GNRA家族(例如，GAAA)、和CUUG四环。(Woese等人,PNAS,1990,87(21):8467-71；Antao等人,NUCLEIC ACIDS RES.,1991,19(21):5901-5)。DNA四环的实例包括四环的d(GNNA)家族(例如，d(GTTA)、四环的d(GNRA))家族、四环的d(GNAB)家族、四环的d(CNNG)家族、和四环的d(TNCG)家族(例如，d(TTCG))。(Nakano等人,BIOCHEMISTRY,2002,41(48):14281-14292。Shinji等人,NIPPONKAGAKKAI KOEN YOKOSHU,2000,78(2):731)。
如本文所用，“通用碱基”是指位于修饰的核苷酸中核苷酸糖部分的1′位置、或核苷酸糖部分取代中的等效位置的杂环部分，即当存在于核酸双螺旋中时，可放置于多于一种类型的碱基的对面而不改变双螺旋结构(例如，磷酸酯主链的结构)。另外，所述通用碱基不破坏其所在单链核酸双螺旋至靶核酸的能力。含有通用碱基的单链核酸双螺旋靶核酸的能力可通过对本领域技术人员而言显而易见的方法(例如，UV吸光度、圆二色性、凝胶位移、单链核酸酶敏感性等)测定。另外，可改变观测到形成双螺旋的条件以确定双螺旋稳定性或形成(例如，温度)，因为熔化温度(Tm)与核酸双螺旋的稳定性相关。同与靶核酸恰好互补的参考单链核酸相比，含有通用碱基的单链核酸与所述靶核酸形成Tm低于与所述互补核酸形成的双螺旋的Tm的双螺旋。然而，与其中通用碱基已经碱基置换以产生单一错配的参考单链核酸相比，含有所述通用碱基的单链核酸与所述靶核酸形成Tm高于与具有所述错配碱基的核酸形成的双螺旋的Tm的双螺旋。
一些通用碱基能够通过在所述通用碱基与所有碱基鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)之间在形成碱基对的条件下形成氢键进行碱基配对。通用碱基不为仅与一个单一互补碱基形成碱基对的碱基。在双螺旋中，通用碱基可与双螺旋的相对链上与其相对的G、C、A、T和U中的每一者不形成氢键、形成一个氢键、或形成多于一个氢键。优选地，所述通用碱基不与双螺旋的相对链上与其相对的碱基相互作用。在双螺旋中，通用碱基之间的碱基配对发生但不改变磷酸酯主链的双螺旋结构。通用碱基还可通过堆叠相互作用与相同核酸链上的相邻核苷酸中的碱基相互作用。此类堆叠相互作用稳定所述双螺旋，尤其在所述通用碱基不与所述双螺旋的相对链上与其相对放置的碱基形成任何氢键的情况下。通用结合核苷酸的限制性实例包括肌苷、1-O-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚、和/或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯(Quay等人的美国专利申请公开号20070254362；VanAerschot等人,An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguousnucleoside,NUCLEIC ACIDS RES.1995年11月11日；23(21):4363-70；Loakes等人,3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNAsequencing and PCR,NUCLEIC ACIDS RES.1995年7月11日；23(13):2361-6；Loakes和Brown,5-Nitroindole as a universal base analogue,NUCLEIC ACIDS RES.1994年10月11日；22(20):4039-43)。
3.示例性实施方案的描述：
如上文所述，在某些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示：
Figure BDA0003847035450000321
或其药学上可接受的盐，其中：
B是核碱基或氢；
R1和R2独立地是氢、卤素、R5、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或：
相同碳上的R1和R2连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和环；
每个R独立地是氢、合适的保护基、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环，或：
相同原子上的两个R基团连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4至7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
R3是氢、合适的保护基、合适的前药、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
每个R4独立地是氢、合适的前药、R5、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-OP(O)R2、-OP(O)(OR)2、-OP(O)(OR)NR2、-OP(O)(NR2)2-、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R、-N(R)P(O)R2、-N(R)P(O)(OR)2、-N(R)P(O)(OR)NR2、-N(R)P(O)(NR2)2、-N(R)S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；
每个R5独立地是任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
X1是O、S或NR；
X2是-O-、-S-、-B(H)2-或共价键；
X3是-O-、-S-、-Se-或-N(R)-；
Y1是附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2′或3′端的连接基团；
Y2是氢、保护基、亚磷酰胺类似物、附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的4′或5′端的核苷酸间连接基团、或附接至固体支持物的连接基团；
Z是-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2-；并且
n是0、1、2、3、4或5。
如上文定义和本文描述，B是核碱基或氢。
在一些实施方案中，B是核碱基。在一些实施方案中，B是核碱基类似物。在一些实施方案中，B是修饰的核碱基。在一些实施方案中，B是通用核碱基。在一些实施方案中，B是氢。
在一些实施方案中，B选自
Figure BDA0003847035450000341
Figure BDA0003847035450000342
在一些实施方案中，B选自表1中绘示的那些。
如上文定义和本文描述，R1和R2独立地是氢、卤素、R3、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或相同碳上的R1和R2连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和环。
在一些实施方案中，R1和R2独立地是氢。在一些实施方案中，R1和R2独立地是氘。在一些实施方案中，R1和R2独立地是卤素。在一些实施方案中，R1和R2独立地是R5。在一些实施方案中，R1和R2独立地是-CN。在一些实施方案中，R1和R2独立地是-S(O)R。在一些实施方案中，R1和R2独立地是-S(O)2R。在一些实施方案中，R1和R2独立地是-Si(OR)2R。在一些实施方案中，R1和R2独立地是-Si(OR)R2。在一些实施方案中，R1和R2独立地是-SiR3。在一些实施方案中，相同碳上的R1和R2连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和环。
在一些实施方案中，R1是甲基且R2是氢。
在一些实施方案中，R1和R2选自表1中绘示的那些。
如上文定义和本文描述，每个R独立地是氢、合适的保护基、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环、或相同原子上的两个R基团连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4至7元饱和、部分不饱和或杂芳基环。
在一些实施方案中，R是氢。在一些实施方案中，R是合适的保护基。在一些实施方案中，R是任选经取代的C1-6脂族。在一些实施方案中，R是任选经取代的苯基。在一些实施方案中，R是具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选经取代的4至7元饱和或部分不饱和杂环。在一些实施方案中，R是具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选经取代的5至6元杂芳基环。在一些实施方案中，相同原子上的两个R基团连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4至7元饱和、部分不饱和或杂芳基环。
在一些实施方案中，R选自下表1中绘示的那些。
如上文定义和本文描述，R3是氢、合适的保护基、合适的前药、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环。
在一些实施方案中，R3是氢。在一些实施方案中，R3是合适的保护基。在一些实施方案中，R3是合适的前药。在一些实施方案中，R3是合适的磷酸酯/膦酸酯前药，其是谷胱甘肽敏感部分。在一些实施方案中，R3选自如国际专利申请号PCT/US2017/048239中描述的那些的谷胱甘肽敏感部分，所述申请以引用的方式整体并入本文中。在一些实施方案中，R3是任选经取代的C1-6脂族。在一些实施方案中，R3是任选经取代的苯基。在一些实施方案中，R3是具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选经取代的4至7元饱和或部分不饱和杂环。在一些实施方案中，R3是具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选经取代的5至6元杂芳基环。
在一些实施方案中，R3是甲基。在一些实施方案中，R3是乙基。在一些实施方案中，R3是
Figure BDA0003847035450000361
在一些实施方案中，R3是
Figure BDA0003847035450000362
在一些实施方案中，R3是
Figure BDA0003847035450000363
在一些实施方案中，R3选自下表1中绘示的那些。
如上文定义和本文描述，每个R4独立地是氢、合适的前药、R5、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-OP(O)R2、-OP(O)(OR)2、-OP(O)(OR)NR2、-OP(O)(NR2)2-、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R、-N(R)P(O)R2、-N(R)P(O)(OR)2、-N(R)P(O)(OR)NR2、-N(R)P(O)(NR2)2、-N(R)S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3。
在一些实施方案中，R4是氢。在一些实施方案中，R4是氘。在一些实施方案中，R4是合适的前药。在一些实施方案中，R4是合适的磷酸酯/膦酸酯前药，其是谷胱甘肽敏感部分。在一些实施方案中，R4选自如国际专利申请号PCT/US2013/072536中描述的那些的谷胱甘肽敏感部分，所述申请以引用的方式整体并入本文中。在一些实施方案中，R4是R5。在一些实施方案中，R4是卤素。在一些实施方案中，R4是-CN。在一些实施方案中，R4是-NO2。在一些实施方案中，R4是-OR。在一些实施方案中，R4是-SR。在一些实施方案中，R4是-NR2。在一些实施方案中，R4是-S(O)2R。在一些实施方案中，R4是-S(O)2NR2。在一些实施方案中，R4是-S(O)R。在一些实施方案中，R4是-C(O)R。在一些实施方案中，R4是-C(O)OR。在一些实施方案中，R4是-C(O)NR2。在一些实施方案中，R4是-C(O)N(R)OR。在一些实施方案中，R4是-C(R)2N(R)C(O)R。在一些实施方案中，R4是-C(R)2N(R)C(O)NR2。在一些实施方案中，R4是-OC(O)R。在一些实施方案中，R4是-OC(O)NR2。在一些实施方案中，R4是-OP(O)R2。在一些实施方案中，R4是-OP(O)(OR)2。在一些实施方案中，R4是-OP(O)(OR)NR2。在一些实施方案中，R4是-OP(O)(NR2)2-。在一些实施方案中，R4是-N(R)C(O)OR。在一些实施方案中，R4是-N(R)C(O)R。在一些实施方案中，R4是-N(R)C(O)NR2。在一些实施方案中，R4是-N(R)P(O)R2。在一些实施方案中，R4是-N(R)P(O)(OR)2。在一些实施方案中，R4是-N(R)P(O)(OR)NR2。在一些实施方案中，R4是-N(R)P(O)(NR2)2。在一些实施方案中，R4是-N(R)S(O)2R。在一些实施方案中，R4是-Si(OR)2R。在一些实施方案中，R4是-Si(OR)R2。在一些实施方案中，R4是-SiR3。
在一些实施方案中，R4是羟基。在一些实施方案中，R4是氟。在一些实施方案中，R4是甲氧基。在一些实施方案中，R4是
Figure BDA0003847035450000371
在一些实施方案中，R4选自表1中绘示的那些。
如上文定义和本文描述，每个R5独立地是任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环。
在一些实施方案中，R5是任选经取代的C1-6脂族。在一些实施方案中，R5是任选经取代的苯基。在一些实施方案中，R5是具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选经取代的4至7元饱和或部分不饱和杂环。在一些实施方案中，R5是具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的任选经取代的5至6元杂芳基环。
在一些实施方案中，R5选自下表1中绘示的那些。
如上文定义和本文描述，X1是O、S或NR。
在一些实施方案中，X1是O。在一些实施方案中，X1是S。在一些实施方案中，X1是NR。
在一些实施方案中，X1选自下表1中绘示的那些。
如上文定义和本文描述，X2是-O-、-S-、-B(H)2-或共价键。
在一些实施方案中，X2是-O-。在一些实施方案中，X2是-S-。在一些实施方案中，X2是-B(H)2-。在一些实施方案中，X2和R3形成-BH3。在一些实施方案中，X2是共价键。在一些实施方案中，X2是构成硼烷磷酸酯(boranophosphate)主链的共价键。
在一些实施方案中，X2选自下表1中绘示的那些。
如上文定义和本文描述，X3是-O-、-S-、-Se-或-N(R)-。
在一些实施方案中，X3是-O-。在一些实施方案中，X3是-S-。在一些实施方案中，X3是-Se-。在一些实施方案中，X3是-N(R)-。
在一些实施方案中，X3选自下表1中绘示的那些。
如上文定义和本文描述，Y1是附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2′或3′端的连接基团。
在一些实施方案中，Y1是附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2′端的连接基团。在一些实施方案中，Y1是附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的3′端的连接基团。
在一些实施方案中，Y1的连接基团是键。在一些实施方案中，Y1的连接基团是-C(R)2-。在一些实施方案中，Y1的连接基团是-CH2-。
在一些实施方案中，Y1是
Figure BDA0003847035450000381
在一些实施方案中，Y1是
Figure BDA0003847035450000382
在一些实施方案中，Y1是
Figure BDA0003847035450000383
在一些实施方案中，Y1是
Figure BDA0003847035450000391
在一些实施方案中，Y1是
Figure BDA0003847035450000392
在一些实施方案中，Y1是
Figure BDA0003847035450000393
在一些实施方案中，Y1是
Figure BDA0003847035450000394
在一些实施方案中，Y1是
Figure BDA0003847035450000395
在一些实施方案中，Y1是
Figure BDA0003847035450000396
在一些实施方案中，Y1是
Figure BDA0003847035450000397
在一些实施方案中，Y1是
Figure BDA0003847035450000398
在一些实施方案中，Y1是
Figure BDA0003847035450000399
在一些实施方案中，Y1是
Figure BDA00038470354500003910
在一些实施方案中，Y1是
Figure BDA00038470354500003911
在一些实施方案中，Y1是
Figure BDA00038470354500003912
在一些实施方案中，Y1是
Figure BDA00038470354500003913
在一些实施方案中，Y1选自下表1中绘示的那些。
如上文定义和本文描述，Y2是氢、保护基、亚磷酰胺类似物、附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的4′或5′端的核苷酸间连接基团、或附接至固体支持物的连接基团。
在一些实施方案中，Y2是氢。在一些实施方案中，Y2是保护基。在一些实施方案中，Y2是亚磷酰胺类似物。在一些实施方案中，Y2是下式亚磷酰胺类似物：
Figure BDA0003847035450000401
其中R3、X2和E中的每一者独立地如本文所述。在一些实施方案中，Y2是附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的4′端的核苷酸间连接基团。在一些实施方案中，Y2是附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的5′端的核苷酸间连接基团。在一些实施方案中，Y2是附接至固体支持物的连接基团。
在一些实施方案中，Y2是苯甲酰基。在一些实施方案中，Y2是叔丁基二甲基硅基。在一些实施方案中，Y2是
Figure BDA0003847035450000402
在一些实施方案中，Y2是
Figure BDA0003847035450000403
在一些实施方案中，Y2是
Figure BDA0003847035450000404
在一些实施方案中，Y2是
Figure BDA0003847035450000405
在一些实施方案中，Y2是
Figure BDA0003847035450000406
在一些实施方案中，Y2选自下表1中绘示的那些。
如上文显示，在Y1的一些实施方案中，Y3是附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2′或3′端的连接基团。
在一些实施方案中，Y3是附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2′端的连接基团。在一些实施方案中，Y3是附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的3′端的连接基团。
在一些实施方案中，Y3选自下表1中绘示的那些。
如上文显示，在Y2的一些实施方案中，Y4是氢、保护基、亚磷酰胺类似物、附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的4′或5′端的核苷酸间连接基团、或附接至固体支持物的连接基团。
在一些实施方案中，Y4是氢。在一些实施方案中，Y4是保护基。在一些实施方案中，Y4是亚磷酰胺类似物。在一些实施方案中，Y4是下式亚磷酰胺类似物：
Figure BDA0003847035450000411
其中R3、X2和E中的每一者独立地如本文所述。在一些实施方案中，Y4是附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的4′端的核苷酸间连接基团。在一些实施方案中，Y4是附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的5′端的核苷酸间连接基团。在一些实施方案中，Y4是附接至固体支持物的连接基团。
在一些实施方案中，Y4是苯甲酰基。在一些实施方案中，Y4是叔丁基二甲基硅基。在一些实施方案中，Y4是
Figure BDA0003847035450000412
在一些实施方案中，Y2是
Figure BDA0003847035450000413
在一些实施方案中，Y4是
Figure BDA0003847035450000414
在一些实施方案中，Y4选自下表1中绘示的那些。
如上文定义和本文描述，Z是-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2-。
在一些实施方案中，Z是-O-。在一些实施方案中，Z是-S-。在一些实施方案中，Z是-N(R)-。在一些实施方案中，Z是-C(R)2-。
在一些实施方案中，Z选自下表1中绘示的那些。
如上文定义和本文描述，n是0、1、2、3、4或5。
在一些实施方案中，n是0。在一些实施方案中，n是1。在一些实施方案中，n是2。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是5。在一些实施方案中，n选自下表1中绘示的那些。
在一些实施方案中，包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物在4′-C位置不包含甲基取代。在一些实施方案中，由式I表示的4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联不为
Figure BDA0003847035450000421
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，n是1，且连接性和立体化学如所示，由此形成式I-a-1核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000422
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y1、Y2和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，Y2是合适的羟基保护基(PG)，n是1，且连接性和立体化学如所示，由此形成式I-a-2核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000431
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y1和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，Y2是氢，n是1，且连接性和立体化学如所示，由此形成式I-a-3核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000432
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y1和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，Y2是亚磷酰胺
Figure BDA0003847035450000441
n是1，且连接性和立体化学如所示，由此形成式I-a-4核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000442
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y1和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，Y2是附接至固体支持物
Figure BDA0003847035450000443
的连接基团，n是1，且连接性和立体化学如所示，由此形成式I-a-5核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000444
Figure BDA0003847035450000451
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y1和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′’-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，n是1，连接性和立体化学如所示，且Y1是附接至核苷
Figure BDA0003847035450000452
的3′-羟基的共价键，其中Y1的PG是合适的羟基保护基，由此形成式I-b-1核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000453
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y2和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，Y2是合适的羟基保护基PG1，n是1，连接性和立体化学如所示，且Y1是附接至核苷
Figure BDA0003847035450000454
的3′-羟基的共价键，其中Y1的PG是合适的羟基保护基，由此形成式I-c-1核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000461
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，Y2是氢，n是1，连接性和立体化学如所示，且Y1是附接至核苷
Figure BDA0003847035450000462
的3′-羟基的共价键，其中Y1的PG是合适的羟基保护基，由此形成式I-d-1核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000463
Figure BDA0003847035450000471
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，Y2是亚磷酰胺
Figure BDA0003847035450000472
n是1，连接性和立体化学如所示，且Y1是附接至核苷
Figure BDA0003847035450000473
的3′-羟基的共价键，其中Y1的PG是合适的羟基保护基，由此形成式I-e-1核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000474
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，Y2是附接至固体支持物
Figure BDA0003847035450000481
的连接基团，n是1，连接性和立体化学如所示，且Y1是附接至核苷
Figure BDA0003847035450000482
的3′-羟基的共价键，其中Y1的PG是合适的羟基保护基，由此形成式I-f-1核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000483
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y1和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，n是1，连接性和立体化学如所示，且Y1是附接至核苷
Figure BDA0003847035450000484
的3′-羟基的共价键，由此形成式I-g-1核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000491
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y2和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，n是1，连接性和立体化学如所示，且Y1是附接至寡核苷酸
Figure BDA0003847035450000492
的3′-羟基的共价键，由此形成式I-h-1核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000493
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y2、Y3和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，n是1，连接性和立体化学如所示，且Y1是附接至寡核苷酸
Figure BDA0003847035450000501
的3′-羟基的共价键，由此形成式I-i-1寡核苷酸：
Figure BDA0003847035450000502
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y2、Y3和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，Y2是合适的羟基保护基PG1，n是1，连接性和立体化学如所示，且Y1是附接至寡核苷酸
Figure BDA0003847035450000511
的3′-羟基的共价键，由此形成式I-j-1寡核苷酸：
Figure BDA0003847035450000512
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y3和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，Y2是氢，n是1，连接性和立体化学如所示，且Y1是附接至寡核苷酸
Figure BDA0003847035450000513
的3′-羟基的共价键，由此形成式I-k-1寡核苷酸：
Figure BDA0003847035450000521
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y3和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，Y2是
Figure BDA0003847035450000522
n是1，连接性和立体化学如所示，且Y1是附接至寡核苷酸
Figure BDA0003847035450000523
的3′-羟基的共价键，由此形成式I-l-1寡核苷酸：
Figure BDA0003847035450000524
Figure BDA0003847035450000531
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y3和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，Y2是附接至固体支持物
Figure BDA0003847035450000532
的连接基团，n是1，连接性和立体化学如所示，且Y1是附接至寡核苷酸
Figure BDA0003847035450000533
的3′-羟基的共价键，由此形成式I-m-1寡核苷酸：
Figure BDA0003847035450000534
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y3和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，n是1，连接性和立体化学如所示，且Y1是附接至寡核苷酸
Figure BDA0003847035450000541
的3′-羟基的亚甲基，由此形成式I-n-1寡核苷酸：
Figure BDA0003847035450000542
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y2、Y3和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，n是1，连接性和立体化学如所示，且Y1是附接至寡核苷酸
Figure BDA0003847035450000543
的3′-碳的亚甲基，由此形成式I-o-1寡核苷酸：
Figure BDA0003847035450000551
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y2、Y3和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，n是1，连接性和立体化学如所示，Y1是附接至核苷
Figure BDA0003847035450000552
的3′-羟基的共价键，且Y2是
Figure BDA0003847035450000553
由此形成式I-p-1寡核苷酸：
Figure BDA0003847035450000561
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y4和Z中的每一者如上文定义。
在一些实施方案中，本发明提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示，其中X3是-O-，n是1，连接性和立体化学如所示，Y1是附接至核苷
Figure BDA0003847035450000562
的3′-羟基的共价键，且Y2是
Figure BDA0003847035450000563
由此形成式I-q-1寡核苷酸：
Figure BDA0003847035450000571
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y4和Z中的每一者如上文定义。
在某些实施方案中，本发明提供寡核苷酸-配体缀合物，其包含具有任何上文公开的核酸类似物中的一者或多者的长度为15至30个核苷酸的反义链、和长度为10至53个核苷酸的正义链，其中所述正义链与所述反义链形成双螺旋区且所述正义链包含一个或多个配体部分。在某些实施方案中，所述配体部分是GalNAc。
在某些实施方案中，反义链在5’端处包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联。
在某些实施方案中，本发明提供寡核苷酸-配体缀合物或其药学上可接受的盐，其包含：
长度为36个核苷酸的正义链，其在位置3、5、8、10、12、13、15和17处包含2′-氟修饰的核苷酸、在位置1、2、4、6、7、9、11、14、16、18至27和31至36处包含2′-O-甲基修饰的核苷酸、以及在位置1与2处的核苷酸之间包含一个硫磷酸酯核苷酸间键联，其中在位置27至30处的核苷酸形成四环，且在位置28至30处的核苷酸中的每一者在2’位置处缀合至单价GalNac部分；和
长度为22个核苷酸的反义链，其在位置3、4、5、7、10、14、16和19处包含2′-氟修饰的核苷酸、在位置1、2、6、8、9、11、12、13、15、17、18和20至22处包含2′-O-甲基修饰的核苷酸、以及在位置2与3的核苷酸之间、在位置20与21的核苷酸之间、和在位置21与22的核苷酸之间包含三个硫磷酸酯核苷酸间键联，其中在位置1和2处的核苷酸形成具有以下结构的4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联：
Figure BDA0003847035450000581
其中每个B独立地是如本文所述的核碱基，例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。
在一些实施方案中，正义链的位置27至30形成GAAA四环。
在一些实施方案中，在2’位置处缀合至单价GalNac部分的核苷酸具有以下结构：
Figure BDA0003847035450000582
其中B是如本文所述的核碱基，例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶；X是O、S或N；且L是键、点击化学柄、或长度为1至20个包含、连续、共价结合的原子的接头，其选自由以下组成的组：经取代和未经取代的亚烷基、经取代和未经取代的亚烯基、经取代和未经取代的亚炔基、经取代和未经取代的亚杂烷基、经取代和未经取代的亚杂烯基、经取代和未经取代的亚杂炔基及其组合。在一些实施方案中，L是缩醛接头。在一些实施方案中，X是O。
在一些实施方案中，在2’位置处缀合至单价GalNac部分的核苷酸具有以下结构：
Figure BDA0003847035450000591
其中B是如本文所述的核碱基，例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。
在一些实施方案中，本发明提供具有如图4中所示的GalXC2结构的寡核苷酸-配体缀合物。
包含本发明的4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的示例性核酸及其类似物阐述于下表1中。
表1.示例性核酸及其类似物
Figure BDA0003847035450000592
Figure BDA0003847035450000601
Figure BDA0003847035450000611
Figure BDA0003847035450000621
在一些实施方案中，本发明提供包含阐述于上表1中的本发明的4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物、或其药学上可接受的盐。
4.提供核酸及其类似物的一般方法
包含本文所述的4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸及其类似物可使用本领域中已知的各种合成方法(包括标准亚磷酰胺方法)制得。可使用任何亚磷酰胺合成方法以合成本发明提供的核酸。在某些实施方案中，亚磷酰胺用于固相合成方法中以产生反应性中间体亚磷酸酯化合物，其接着使用已知方法经氧化以产生膦酸酯修饰的寡核苷酸，所述寡核苷酸通常具有磷酸二酯或硫磷酸酯核苷酸间键联。本公开的寡核苷酸合成可使用领域已知方法以自5′至3′或自3′至5′的方向进行。
在某些实施方案中，合成所提供的核酸的方法包括(a)经由共价键联将核苷或其类似物附接至固体支持物；(b)将核苷亚磷酰胺或其类似物偶联至步骤(a)的核苷或其类似物上的反应性羟基以在其间形成核苷酸间键，其中所述固体支持物上任何未偶联的核苷或其类似物用封端试剂封端；(c)用氧化剂氧化所述核苷酸间键；以及(d)用后续核苷亚磷酰胺或其类似物反复重复步骤(b)至(c)以形成核酸或其类似物，其中至少步骤(a)的核苷或其类似物、步骤(b)的核苷亚磷酰胺或其类似物或步骤(d)的后续核苷亚磷酰胺或其类似物中的至少一者包含如本文所述的含有膦酸酯的部分。通常，重复偶联、封端/氧化步骤和任选去保护步骤，直至所述寡核苷酸达成所需长度和/或序列，然后使其自所述固体支持物裂解。
在绘示特定保护基、离去基或转化条件的下文方案A中，本领域普通技术人员应了解其他保护基、离去基和转化条件也合适且经考虑。需额外保护基策略的方案A类中设想的某些反应性官能团(例如，-N(H)-、-OH等)也经考虑并由本领域普通技术人员了解。此类基团和转化详细描述于March′s Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,andStructure,M.B.Smith和J.March,第5版,John Wiley&Sons,2001、Comprehensive OrganicTransformations,R.C.Larock,第2版,John Wiley&Sons,1999、和Protecting Groups inOrganic Synthesis,T.W.Greene和P.G.M.Wuts,第3版,John Wiley&Sons,1999中，所述文献中的每一者的整体以引用的方式并入本文中。
在某些实施方案中，本发明的核酸及其类似物一般根据下文阐述的方案A和方案B制备：
方案A：以3′至5′方向进行的本发明的核酸及其类似物的合成和本发明的寡核苷酸的合成
Figure BDA0003847035450000641
如上文方案A中绘示，诸如通过使用路易士酸(例如，BF3-OEt2)将式A1核酸或其类似物偶联至式A2 P(V)化合物，以形成包含但不限于4′-O-亚甲基膦酸酯的式A3核酸或其类似物。然后首先将式A3核酸或其类似物去保护(例如，水解)以形成包含但不限于氢4′-O-亚甲基膦酸酯的式A4核酸或其类似物，接着与式A5核苷酸或其类似物缩合以形成包含但不限于本发明的4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的式I-b核酸或其类似物。然后将式I-b核酸或其类似物去保护以形成式I-g核酸或其类似物并与式A6亚磷酰胺类似物反应以形成包含但不限于本发明的4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的式I-h核酸或其类似物。然后氧化式I-h核酸或其类似物提供包含但不限于本发明的4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的式I-i寡核苷酸化合物。B、E、PG、R1、R2、R3、R4、X1、X2、X3、Y2、Y3、Z和n中的每一者如上文定义和本文描述。
方案B：以5′至3′方向进行的本发明的核酸及其类似物和寡核苷酸的合成
Figure BDA0003847035450000651
如上文方案B中绘示，首先选择性将包含但不限于本发明的4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的式I-c核酸或其类似物去保护以形成本发明的式I-d核酸或其类似物，然后与P(III)形成试剂反应以形成本发明的式I-e核酸或其类似物。对选择式I-c核酸或其类似物中的PG1和PG以使得选择性移除PG1的指导提供于本公开内并详细描述于ProtectingGroups in Organic Synthesis,T.W.Greene和P.G.M.Wuts,第3版,John Wiley&Sons,1999中，所述文献中的每一者的整体以引用的方式并入本文中。然后包含但不限于本发明的4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的式I-e核酸或其类似物可与式A8核苷酸或其类似物缩合以形成包含但不限于本发明的4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的式I-p核酸或其类似物。然后氧化式I-p核酸或其类似物提供包含但不限于本发明的4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的式I-q寡核苷酸化合物。B、E、PG、PG1、R1、R2、R3、R4、X1、X2、X3、Y4、Z和n中的每一者如上文定义和本文描述。
本领域技术人员应了解本发明的核酸或其类似物中存在的各种官能团(诸如脂族基团、醇、羧酸、酯、酰胺、醛、卤素和腈)可通过本领域中熟知的技术相互转化，所述技术包括但不限于还原、氧化、酯化、水解、部分氧化、部分还原、卤化、脱水、部分水合和水合。参见例如，“March’s Advanced Organic Chemistry”,第5版,Smith,M.B.和March,J.编,JohnWiley&Sons,New York:2001，所述文献中的每一者的整体以引用的方式并入本文中。此类相互转化可需前述技术中的一者或多者，且合成本发明提供的核酸的某些方法下文描述于范例中。
根据一个方面，本发明提供用于制备包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的寡核苷酸化合物的方法，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-i表示：
Figure BDA0003847035450000661
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-h表示：
Figure BDA0003847035450000671
或其药学上可接受的盐，以及
(b)氧化包含式I-h的核酸或其类似物以形成包含式I-i的寡核苷酸化合物，其中：
每个B是核碱基或氢；
R1和R2独立地是氢、卤素、R5、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或：
相同碳上的R1和R2连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和环；
每个R独立地是氢、合适的保护基、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环，或：
相同原子上的两个R基团连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4至7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
R3是氢、合适的保护基、合适的前药、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
每个R4独立地是氢、合适的前药、R5、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-OP(O)R2、-OP(O)(OR)2、-OP(O)(OR)NR2、-OP(O)(NR2)2-、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R、-N(R)P(O)R2、-N(R)P(O)(OR)2、-N(R)P(O)(OR)NR2、-N(R)P(O)(NR2)2、-N(R)S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；
每个R5独立地是任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
每个X1独立地是O、S或NR；
每个X2独立地是-O-、-S-、-B(H)2-或共价键；
X3是-O-、-S-、-Se-或-N(R)-；
Y2是氢、保护基、亚磷酰胺类似物、附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的4′或5′端的核苷酸间连接基团、或附接至固体支持物的连接基团；
Y3是附接至核苷酸、核苷或寡核苷酸的2′或3′端的连接基团；
每个Z独立地是-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2-；并且
每个n独立地是0、1、2、3、4或5。
根据一个方面，本发明提供制备包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的寡核苷酸化合物的方法，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-q表示：
Figure BDA0003847035450000691
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4’-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-p表示：
Figure BDA0003847035450000692
或其药学上可接受的盐，以及
(b)氧化包含式I-p的核酸或其类似物以形成包含式I-q的寡核苷酸化合物，其中：
每个B是核碱基或氢；
PG是合适的羟基保护基；
R1和R2独立地是氢、卤素、R5、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或：
相同碳上的R1和R2连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和环；
每个R独立地是氢、合适的保护基、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环，或：
相同原子上的两个R基团连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4至7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
R3是氢、合适的保护基、合适的前药、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
每个R4独立地是氢、合适的前药、R5、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-OP(O)R2、-OP(O)(OR)2、-OP(O)(OR)NR2、-OP(O)(NR2)2-、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R、-N(R)P(O)R2、-N(R)P(O)(OR)2、-N(R)P(O)(OR)NR2、-N(R)P(O)(NR2)2、-N(R)S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；
每个R5独立地是任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
每个X1独立地是O、S或NR；
每个X2独立地是-O-、-S-、-B(H)2-或共价键；
每个X3独立地是-O-、-S-、-Se-或-N(R)-；
Y4是氢、保护基、亚磷酰胺类似物、附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的4′或5′端的核苷酸间连接基团、或附接至固体支持物的连接基团；
每个Z独立地是-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2-；并且
每个n独立地是0、1、2、3、4或5。
氧化包含式I-h的核酸或其类似物以形成包含式I-i的寡核苷酸化合物或包含式I-p的核酸或其类似物以形成包含式I-q的寡核苷酸化合物可使用已知氧化条件进行。本领域技术人员应了解P(III)氧化为P(V)可通过各种试剂(诸如过氧化氢、氢过氧化物、过氧化物、过酸、碘及其混合物)进行。过氧化氢可在溶剂(诸如乙腈)的存在下使用。氢过氧化物(即，ROOH)包括其中R是烷基或芳基及其盐的过氧化物，包括但不限于叔丁基过氧化物(tBuOOH)。过氧化物包括烷基、芳基、或混合烷基/芳基过氧化物及其盐。过酸包括但不限于烷基和芳基过酸，包括氯过氧苯甲酸(mCPBA)。使用碱性卤素(诸如溴(Br2)、氯(Cl2)或碘(I2))可在水和其他组分(诸如吡啶、四氢呋喃和水)的存在下进行。替代地，还考虑在TEMPO的存在下的Cl2水溶液。因此，术语“氧化剂”包括“硫化剂”，还认为其具有与“硫杂化试剂”相同的含义。已用于合成含有硫磷酸酯(PS)键的寡核苷酸的硫化试剂的实例包括元素硫、二苯甲酰基四硫化物、3-H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(Beaucage试剂)、二硫化四乙胺甲硫酰基(TETD)和双(O,O-二异丙氧基硫膦基)二硫化物(Stec试剂)。用于制造硫磷酸酯二酯键联的氧化试剂包括苯乙酰基二硫化物(PADS)，如由Cole等人描述于美国专利号6,242,591中。在某些实施方案中，所述氧化是使用于水性吡啶中的碘进行。
在某些方面中，本发明提供用于制备包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的寡核苷酸化合物的方法，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-i-1表示：
Figure BDA0003847035450000721
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-h-1表示：
Figure BDA0003847035450000731
或其药学上可接受的盐，以及
(b)氧化包含式I-h-1的核酸或其类似物以形成包含I-i-1的寡核苷酸化合物，其中：
B、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y2、Y3和Z中的每一者如本文所述和上文定义。
在某些方面中，本发明提供用于制备包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的寡核苷酸化合物的方法，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-q-1表示：
Figure BDA0003847035450000741
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-p-1表示：
Figure BDA0003847035450000742
或其药学上可接受的盐，以及
(b)氧化包含式I-p-1的核酸或其类似物以形成包含式I-q-1的寡核苷酸化合物，其中：
B、PG、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y4和Z中的每一者如本文所述和上文定义。
根据一个方面，本发明提供用于制备包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物的方法，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-h表示：
Figure BDA0003847035450000751
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-g表示：
Figure BDA0003847035450000752
Figure BDA0003847035450000761
(b)使包含式I-g的核酸或其类似物与式A6亚磷酰胺类似物反应：
Figure BDA0003847035450000762
以形成包含式I-h的核酸或其类似物，其中：
每个B是核碱基或氢；
R1和R2独立地是氢、卤素、R5、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或：
相同碳上的R1和R2连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和环；
每个R独立地是氢、合适的保护基、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环，或：
相同原子上的两个R基团连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4至7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
R3是氢、合适的保护基、合适的前药、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
每个R4独立地是氢、合适的前药、R5、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-OP(O)R2、-OP(O)(OR)2、-OP(O)(OR)NR2、-OP(O)(NR2)2-、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R、-N(R)P(O)R2、-N(R)P(O)(OR)2、-N(R)P(O)(OR)NR2、-N(R)P(O)(NR2)2、-N(R)S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；
每个R5独立地是任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
E是卤素或-NR2；
X1是O、S或NR；
每个X2独立地是-O-、-S-、-B(H)2-或共价键；
X3是-O-、-S-、-Se-或-N(R)-；
Y2是氢、保护基、亚磷酰胺类似物、附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的4′或5′端的核苷酸间连接基团、或附接至固体支持物的连接基团；
Y3是附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2′或3′端的连接基团；
每个Z独立地是-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2-；并且
每个n独立地是0、1、2、3、4或5。
根据一个方面，本发明提供用于制备式I-e核酸或其类似物的方法：
Figure BDA0003847035450000781
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式I-d核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000782
(b)使式I-d核酸或其类似物与P(III)形成试剂反应以形成式I-e核酸或其类似物，其中：
每个B是核碱基或氢；
PG是合适的羟基保护基；
R1和R2独立地是氢、卤素、R5、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或：
相同碳上的R1和R2连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和环；
每个R独立地是氢、合适的保护基、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环，或：
相同原子上的两个R基团连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4至7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
R3是氢、合适的保护基、合适的前药、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
每个R4独立地是氢、合适的前药、R5、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-OP(O)R2、-OP(O)(OR)2、-OP(O)(OR)NR2、-OP(O)(NR2)2-、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R、-N(R)P(O)R2、-N(R)P(O)(OR)2、-N(R)P(O)(OR)NR2、-N(R)P(O)(NR2)2、-N(R)S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；
每个R5独立地是任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
E是卤素或-NR2；
X1是O、S或NR；
每个X2独立地是-O-、-S-、-B(H)2-或共价键；
X3是-O-、-S-、-Se-或-N(R)-；
每个Z独立地是-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2-；并且
每个n独立地是0、1、2、3、4或5。
根据一个实施方案，上文步骤(b)中的式A6亚磷酰胺类似物是包含常用于亚磷酰胺寡核苷酸合成中的亚磷酰胺部分的核苷、核苷酸或寡核苷酸。在一些实施方案中，使用P(III)形成试剂制备亚磷酰胺或其类似物。在一些实施方案中，所述P(III)形成试剂是2-氰乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺或2-氰乙基二氯化磷。在某些实施方案中，所述P(III)形成试剂是2-氰乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺。普通技术人员应了解在步骤(b)中分别由包含式I-d或式I-g的核酸或其类似物的羟基或X3部分置换P(III)类似物中的离去基在有或没有合适碱的存在下达成。此类合适碱为本领域所熟知且包括有机和无机碱。在一些实施方案中，所述碱是三级胺，诸如三乙胺或二异丙基乙胺。在某些实施方案中，所述碱是4,5-二氰基咪唑。
在某些方面中，本发明提供用于制备包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物的方法，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-h-1表示：
Figure BDA0003847035450000801
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-g-1表示：
Figure BDA0003847035450000811
或其药学上可接受的盐，以及
(b)使包含式I-g-1的核酸或其类似物与式A6亚磷酰胺类似物反应：
Figure BDA0003847035450000812
以形成包含式I-h-1的核酸或其类似物，其中：
B、E、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y2、Y3和Z中的每一者如本文所述和上文定义。
在某些方面中，本发明提供用于制备式I-e-1核酸或其类似物的方法：
Figure BDA0003847035450000821
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式I-d-1核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000822
或其药学上可接受的盐，以及
(b)使式I-d-1核酸或其类似物与P(III)形成试剂反应以形成式I-e-1核酸或其类似物，其中：
B、PG、R1、R2、R3、R4、X1、X2和Z中的每一者如本文所述和上文定义。
根据一个方面，本发明提供用于制备包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物的方法，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-g表示：
Figure BDA0003847035450000831
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-b表示：
Figure BDA0003847035450000832
或其药学上可接受的盐，以及
(b)将包含式I-b的核酸或其类似物去保护以形成包含式I-g的核酸或其类似物，其中：
每个B是核碱基或氢；
PG是合适的羟基保护基；
R1和R2独立地是氢、卤素、R5、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或：
相同碳上的R1和R2连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和环；
每个R独立地是氢、合适的保护基、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环，或：
相同原子上的两个R基团连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4至7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
R3是氢、合适的保护基、合适的前药、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
每个R4独立地是氢、合适的前药、R5、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-OP(O)R2、-OP(O)(OR)2、-OP(O)(OR)NR2、-OP(O)(NR2)2-、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R、-N(R)P(O)R2、-N(R)P(O)(OR)2、-N(R)P(O)(OR)NR2、-N(R)P(O)(NR2)2、-N(R)S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；
每个R5独立地是任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
X1是O、S或NR；
每个X2独立地是-O-、-S-、-B(H)2-或共价键；
X3是-O-、-S-、-Se-或-N(R)-；
Y2是氢、保护基、亚磷酰胺类似物、附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的4′或5′端的核苷酸间连接基团、或附接至固体支持物的连接基团；
每个Z独立地是-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2-；并且
每个n独立地是0、1、2、3、4或5。
根据一个方面，本发明提供用于制备式I-d核酸的方法：
Figure BDA0003847035450000851
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含式I-c的核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000852
Figure BDA0003847035450000861
或其药学上可接受的盐，以及
(b)将包含式I-d的核酸或其类似物去保护以形成包含式I-c的核酸或其类似物，其中：
每个B是核碱基或氢；
PG是合适的羟基保护基；
PG1是保护基；
R1和R2独立地是氢、卤素、R5、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或：
相同碳上的R1和R2连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和环；
每个R独立地是氢、合适的保护基、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环，或：
相同原子上的两个R基团连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4至7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
R3是氢、合适的保护基、合适的前药、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
每个R4独立地是氢、合适的前药、R5、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-OP(O)R2、-OP(O)(OR)2、-OP(O)(OR)NR2、-OP(O)(NR2)2-、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R、-N(R)P(O)R2、-N(R)P(O)(OR)2、-N(R)P(O)(OR)NR2、-N(R)P(O)(NR2)2、-N(R)S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；
每个R5独立地是任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
X1是O、S或NR；
每个X2独立地是-O-、-S-、-B(H)2-或共价键；
X3是-O-、-S-、-Se-或-N(R)-；
每个Z独立地是-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2-；并且
每个n独立地是0、1、2、3、4或5。
根据本文描述的实施方案，在上文步骤(b)中去保护保护基(例如，PG或PG1)包括详细描述于Protecting Groups in Organic Synthesis,T.W.Greene和P.G.M.Wuts,第3版,John Wiley&Sons,1999中的那些保护基，所述文献中的每一者的整体以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，所述保护基是合适的羟基保护基、合适的胺基保护基或合适的巯基保护基。
如本文所用，短语“合适的羟基保护基”为本领域所熟知且当连同其结合的氧原子一起时，独立地选自酯、醚、硅基醚、烷基醚、芳基烷基醚和烷氧基烷基醚。此类酯的实例包括甲酸酯、乙酸酯、碳酸酯和磺酸酯。特定实例包括甲酸酯、苯甲酰基甲酸酯、氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯、4,4-(亚乙基二硫)戊酸酯、新戊酸酯(三甲基乙酰基)、巴豆酸酯、4-甲氧基-巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯甲酸苯甲酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯、碳酸酯，诸如甲基、9-茀基甲基、乙基、2,2,2-三氯乙基、2-(三甲基硅基)乙基、2-(苯基磺酰基)乙基、乙烯基、烯丙基和对硝基苯甲基。此类硅基醚的实例包括三甲基硅基、三乙基硅基、叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基、三异丙基硅基和其他三烷基硅基醚。烷基醚包括甲基、苯甲基、对甲氧基苯甲基、3,4-二甲氧基苯甲基、三苯甲基、叔丁基、烯丙基和烯丙氧基羰基醚或衍生物。烷氧基烷基醚包括缩醛，诸如甲氧基甲基、甲硫基甲基、(2-甲氧基乙氧基)甲基、苯甲氧基甲基、β-(三甲基硅基)乙氧基甲基和四氢哌喃醚。芳基烷基醚的实例包括苯甲基、对甲氧基苯甲基、3,4-二甲氧基苯甲基、邻硝基苯甲基、对硝基苯甲基、对卤基苯甲基、2,6-二氯苯甲基、对氰基苯甲基和2-和4-吡啶甲基。在一些实施方案中，合适的羟基保护基是酸不稳定基团，诸如三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)、4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基、9-苯基-呫吨-9-基、9-(对甲苯基)-呫吨-9-基、苯基二苯并哌喃(pixyl)、2,7-二甲基苯基二苯并哌喃等，其适用于在酸敏感寡核苷酸的溶液相和固相合成期间使用例如二氯乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸或乙酸去保护。所述叔丁基二甲基硅基在用于在合成期间移除DMTr基团的酸性条件下稳定但可在用氟化物源(例如，四丁基氟化铵或氢氟吡啶)裂解并去保护RNA寡聚物后移除。
如本文所用，短语“合适的胺基保护基”为本领域所熟知且当连同其附接的氮一起时，包括但不限于芳烷基胺、胺甲酸酯、烯丙胺、酰胺等。胺的单保护基的实例包括叔丁氧基羰基(BOC)、乙氧基羰基、甲氧基羰基、三氯乙氧基羰基、烯丙氧基羰基(Alloc)、苯甲基氧代羰基(CBZ)、烯丙基、苯甲基(Bn)、茀基甲基羰基(Fmoc)、乙酰基、氯乙酰基、二氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、苯乙酰基、苯甲酰基等。胺的双保护基的实例包括经两个独立地选自上文描述为单保护基的取代基取代的胺，且进一步包括环酰亚胺，诸如邻苯二甲酰亚胺、顺丁烯二酰亚胺、琥珀酰亚胺、2,2,5,5-四甲基-1,2,5-氮杂二硅环戊烷、迭氮化物等。应了解胺基保护基一经酸水解，即形成其盐化合物。例如，当通过用酸(诸如盐酸)处理移除胺基保护基时，则所得胺化合物将呈其盐酸盐形成。本领域普通技术人员应了解多种酸适用于移除酸不稳定的胺基保护基并因此考虑多种盐形式。
如本文所用，短语“合适的巯基保护基”还包括但不限于二硫化物、硫醚、硅基硫醚、硫酯、硫碳酸酯和硫胺甲酸酯等。此类基团的实例包括但不限于烷基硫醚、苯甲基和经取代的苯甲基硫醚、三苯基甲硫基醚和三氯乙氧基羰基硫酯等。
在某些方面中，本发明提供用于制备包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物的方法，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-g-1表示：
Figure BDA0003847035450000891
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-b-1表示：
Figure BDA0003847035450000901
或其药学上可接受的盐，以及
(b)将包含式I-b-1的核酸或其类似物去保护以形成包含式I-g-1的核酸或其类似物，其中：
B、PG、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y2和Z中的每一者如本文所述和上文定义。
在某些方面中，本发明提供用于制备式I-d-1核酸或其类似物的方法：
Figure BDA0003847035450000902
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式I-c-1核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000911
或其药学上可接受的盐，以及
(b)将式I-d-1核酸或其类似物去保护以形成式I-c-1核酸或其类似物，其中：
B、PG、PG1、R1、R2、R3、R4、X1、X2和Z中的每一者如本文所述和上文定义。
根据一个方面，本发明提供用于制备包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物的方法，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-b表示：
Figure BDA0003847035450000912
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式A4核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000921
或其药学上可接受的盐，以及
(b)缩合式A4核酸或其类似物与式A5核苷或其类似物：
Figure BDA0003847035450000922
以形成包含式I-b的核酸或其类似物，其中：
每个B是核碱基或氢；
PG是合适的羟基保护基；
R1和R2独立地是氢、卤素、R5、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或：
相同碳上的R1和R2连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和环；
每个R独立地是氢、合适的保护基、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环，或：
相同原子上的两个R基团连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4至7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
R3是氢、合适的保护基、合适的前药、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
每个R4独立地是氢、合适的前药、R5、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-OP(O)R2、-OP(O)(OR)2、-OP(O)(OR)NR2、-OP(O)(NR2)2-、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R、-N(R)P(O)R2、-N(R)P(O)(OR)2、-N(R)P(O)(OR)NR2、-N(R)P(O)(NR2)2、-N(R)S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；
每个R5独立地是任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
X1是O、S或NR；
每个X2独立地是-O-、-S-、-B(H)2-或共价键；
X3是-O-、-S-、-Se-或-N(R)-；
Y2是氢、保护基、亚磷酰胺类似物、附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的4′或5′端的核苷酸间连接基团、或附接至固体支持物的连接基团；
每个Z独立地是-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2-；并且
每个n独立地是0、1、2、3、4或5。
根据一个方面，本发明提供用于制备包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物的方法，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-p表示：
Figure BDA0003847035450000941
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式I-e核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000942
或其药学上可接受的盐，以及
(b)缩合式I-e核酸或其类似物与式A8核苷或其类似物：
Figure BDA0003847035450000951
以形成包含式I-p的核酸或其类似物，其中：
每个B是核碱基或氢；
PG是合适的羟基保护基；
R1和R2独立地是氢、卤素、R5、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或：
相同碳上的R1和R2连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和环；
每个R独立地是氢、合适的保护基、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环，或：
相同原子上的两个R基团连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4至7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
R3是氢、合适的保护基、合适的前药、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
每个R4独立地是氢、合适的前药、R5、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-OP(O)R2、-OP(O)(OR)2、-OP(O)(OR)NR2、-OP(O)(NR2)2-、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R、-N(R)P(O)R2、-N(R)P(O)(OR)2、-N(R)P(O)(OR)NR2、-N(R)P(O)(NR2)2、-N(R)S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；
每个R5独立地是任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
E是卤素或-NR2；
X1是O、S或NR；
每个X2独立地是-O-、-S-、-B(H)2-或共价键；
X3是-O-、-S-、-Se-或-N(R)-；
Y4是氢、保护基、亚磷酰胺类似物、附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的4′或5′端的核苷酸间连接基团、或附接至固体支持物的连接基团；
每个Z独立地是-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2-；并且
每个n独立地是0、1、2、3、4或5。
根据一些实施方案，上文步骤(b)中的缩合包括使用缩合剂。用于缩合式A4核酸或其类似物与式A5核苷或其类似物或包含式I-e的核酸或其类似物与式A8核苷或其类似物的缩合剂可包括磺酰氯，诸如甲烷磺酰氯、甲苯磺酰氯、2,4,6-三异丙基苯磺酰氯或均三甲苯-2-磺酰氯；磺酰基四唑，诸如1-甲苯磺酰基四唑、1-(均三甲苯-2-磺酰基)四唑或1-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)四唑；磺酰基三唑，诸如3-硝基-1-甲苯磺酰基-1,2,4-三唑、3-硝基-1-(均三甲苯-2-磺酰基)-1,2,4-三唑或3-硝基-1-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-1,2,4-三唑；等。在某些实施方案中，所述缩合剂是三异丙基苯磺酰氯。缩合期间，碱可共同存在。因此使用的碱的实例包括三乙胺、乙基二异丙胺、吡啶、二甲基吡啶、咪唑、N-甲基咪唑、N-甲基苯并咪唑、或类似物。在某些实施方案中，所述碱是N-甲基咪唑。
在某些方面中，本发明提供用于制备包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物的方法，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-b-1表示：
Figure BDA0003847035450000971
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式A4-1核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000972
Figure BDA0003847035450000981
或其药学上可接受的盐，以及
(b)缩合包含式A4-1的核酸或其类似物与式A5-1核苷或其类似物：
Figure BDA0003847035450000982
以形成包含式I-b-1的核酸或其类似物，其中：
B、PG、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y2和Z中的每一者如本文所述和上文定义。
在某些方面中，本发明提供用于制备包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物的方法，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-p-1表示：
Figure BDA0003847035450000983
Figure BDA0003847035450000991
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式I-e-1核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450000992
或其药学上可接受的盐，以及
(b)缩合式I-e-1核酸或其类似物与式A8-1核苷或其类似物：
Figure BDA0003847035450000993
以形成包含式I-p-1的核酸或其类似物，其中：
B、PG、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y4和Z中的每一者如本文所述和上文定义。
根据一个方面，本发明提供用于制备包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的寡核苷酸化合物的方法，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式A4表示：
Figure BDA0003847035450001001
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式A3核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450001002
或其药学上可接受的盐，以及
(b)将式A3核酸或其类似物去保护以形成式A4核酸或其类似物，其中：
B是核碱基或氢；
R1和R2独立地是氢、卤素、R5、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或：
相同碳上的R1和R2连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和环；
每个R独立地是氢、合适的保护基、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环，或：
相同原子上的两个R基团连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4至7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
R3是氢、合适的保护基、合适的前药、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
每个R4独立地是氢、合适的前药、R5、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-OP(O)R2、-OP(O)(OR)2、-OP(O)(OR)NR2、-OP(O)(NR2)2-、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R、-N(R)P(O)R2、-N(R)P(O)(OR)2、-N(R)P(O)(OR)NR2、-N(R)P(O)(NR2)2、-N(R)S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；
每个R5独立地是任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
X1是O、S或NR；
每个X2独立地是-O-、-S-、-B(H)2-或共价键；
X3是-O-、-S-、-Se-或-N(R)-；
Y2是氢、保护基、亚磷酰胺类似物、附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的4′或5′端的核苷酸间连接基团、或附接至固体支持物的连接基团；
Z是-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2-；并且
n是0、1、2、3、4或5。
在某些实施方案中，Y2是保护基。
根据本文描述的实施方案，在上文步骤(b)中去保护式A3可包括去保护上文公开或本文定义的任何合适的保护基。在某些实施方案中，式A3核酸或类似物包含4′-O-亚甲基膦酸酯且单去保护是在碱性水性条件下进行。合适的碱金属氢氧化物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂和氢氧化钡)、金属碳酸酯(例如，碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸铯)、碳酸氢钠、有机胺(例如，三乙胺、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、N-甲基吗啉、N-乙基吗啉、三丁胺、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)、N-甲基咪唑(NMI)、吡啶、2,6-二甲基吡啶、2,4,6-三甲吡啶、4-二甲基胺基吡啶(DMAP)、1,8-双(二甲基胺基)萘(“质子海绵”)、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、1,5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、7-甲基-1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(MTBD)、2-叔丁基-1,1,3,3-四甲基胍、2,8,9-三甲基-2,5,8,9-四氮杂-1-磷双环[3.3.3]十一烷或磷腈碱)。
在某些方面中，本发明提供用于制备式A4-1核酸或其类似物的方法：
Figure BDA0003847035450001031
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式A3-1核酸或其类似物：
Figure BDA0003847035450001032
或其药学上可接受的盐，以及
(b)将式A4-1核酸或其类似物去保护以形成式A3-1核酸或其类似物，其中：
B、PG、R1、R2、R3、R4、X1、X2、Y2和Z中的每一者如本文所述和上文定义。
在某些实施方案中，Y2是保护基。
5.用途、制剂和施用
药学上可接受的组合物
根据另一实施方案，本发明提供包含含有本发明的4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物和药学上可接受的载剂、佐剂或媒介物的组合物。本发明的组合物中提供的核酸的量可有效测量地调节靶基因在生物样品或在患者中的表达。在某些实施方案中，本发明的组合物经配制以向需要此组合物的患者施用。在一些实施方案中，本发明的组合物经配制用于向患者非经肠或经口施用。在一些实施方案中，所述组合物包含药学上可接受的载剂、佐剂或媒介物、和核酸抑制剂分子，其中所述核酸抑制剂分子包含至少一种包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核苷酸或其类似物，如本文所述。
如本文所用，术语“患者”意指动物、优选哺乳动物且最优选人。
术语“药学上可接受的载剂、佐剂或媒介物”是指不破坏配制其的所提供的核酸的药理活性的无毒载剂、佐剂或媒介物。可用于本发明的组合物的药学上可接受的载剂、佐剂或媒介物包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(诸如人血清白蛋白)、缓冲物质(诸如磷酸盐)、甘胺酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质(诸如硫酸鱼精蛋白)、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
“药学上可接受的衍生物”意指本发明提供的核酸的任何无毒盐、酯、酯的盐或其他衍生物，一经向接受者施用，其即能够直接或间接提供本发明提供的核酸或抑制活性代谢物或其残余物。
如本文所用，术语“抑制活性代谢物或其残余物”意指代谢物或其残余物还适用于调节靶基因在生物样品或在患者中的表达。
本发明的组合物可经口、非经肠、通过吸入喷雾剂、局部、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或经由植入式贮库施用。如本文所用的术语“非经肠”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝脏内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选地，所述组合物经配制成液体形式以用于非经肠施用，例如，通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射。适用于非经肠施用的剂型通常包含一种或多种适用于非经肠施用的媒介物，包括例如无菌水溶液、盐水、低分子量醇(诸如丙二醇)、聚乙二醇、植物油、明胶、脂肪酸酯(诸如油酸乙酯)等。非经肠制剂可含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使所述制剂与预期接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。适当的流动性可例如通过使用表面活性剂维持。可将液体制剂冻干并储存以用于后续用无菌可注射溶液重溶使用。
本发明的组合物的无菌可注射形式可为水性或油质悬浮液。此类悬浮液可根据本领域中已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。所述无菌可注射制剂还可为于无毒非经肠可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为于1,3-丁二醇中的溶液。在可接受的媒介物和溶剂中，可采用水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌、固定油常规用作溶剂或悬浮介质。
出于此目的，可采用任何温和的固定油(包括合成单或双甘油酯)。脂肪酸(诸如油酸及其甘油酯衍生物)适用于制备可注射剂，天然的药学上可接受的油(诸如橄榄油或蓖麻油)(尤其以其聚氧乙烯化形式)同样也适用于制备可注射剂。此类油溶液或悬浮液还可含有长链醇稀释剂或分散剂(诸如羧甲基纤维素)或常用于配制药学上可接受的剂型(包括乳液和悬浮液)的类似分散剂。其他常用表面活性剂(诸如Tween、Span)和常用于制造药学上可接受的固体、液体或其他剂型的其他乳化剂或生物利用度增强剂还可用于配制的目的。
本发明的药学上可接受的组合物可以任何经口可接受的剂型经口施用，所述剂型包括但不限于胶囊剂、片剂、水性悬浮液或溶液。在经口使用的片剂的情况下，常用载剂包括乳糖和玉米淀粉。通常，还添加润滑剂(诸如硬脂酸镁)。关于以胶囊形式经口施用，有用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当经口使用需要水性悬浮液时，活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，还可添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。经配制用于经口施用的本发明的组合物可与或不与食物一起施用。在一些实施方案中，本发明的药学上可接受的组合物不与食物一起施用。在其他实施方案中，本发明的药学上可接受的组合物与食物一起施用。
替代地，本发明的药学上可接受的组合物可以用于直肠施用的栓剂的形式施用。此类组合物可通过混合剂与合适的非刺激性赋形剂制备，所述组合物在室温下是固体但在直肠温度下是液体并因此将在直肠中融化以释放药物。此类材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
本发明的药学上可接受的组合物还可局部施用，尤其当治疗靶标包括通过局部应用易接近的区域或器官(包括眼、皮肤或下肠道的疾病)时。针对此类区域或器官中的每一者易于制备合适的局部制剂。
下肠道的局部应用可受直肠栓剂制剂(参见上文)或受合适的灌肠剂制剂影响。还可使用局部透皮贴剂。
关于局部应用，可将所提供的药学上可接受的组合物配制成含有悬浮或溶解于一种或多种载剂中的活性组分的合适的软膏。用于局部施用本发明的核酸或其类似物的载剂包括但不限于矿物油、液体石蜡脂、白石蜡脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。替代地，可将所提供的药学上可接受的组合物配制成含有悬浮或溶解于一种或多种药学上可接受的载剂中的活性组分的合适的洗剂或乳膏。合适的载剂包括但不限于矿物油、去水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
关于眼科用途，可将所提供的药学上可接受的组合物配制成在等渗、pH经调整的无菌盐水中的微粉化悬浮液、或优选地，配制成在等渗、pH经调整的无菌盐水中的溶液，所述组合物具有或不具有防腐剂(诸如苯扎氯铵)。替代地，关于眼科用途，可将药学上可接受的组合物配制成软膏(诸如石蜡脂)。
本发明的药学上可接受的组合物还可由鼻喷雾剂或吸入剂施用。此类组合物根据医药制剂领域中熟知的技术经制备且可制备成盐水中的溶液，采用苯甲醇或其他合适的防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物、和/或其他常规增溶剂或分散剂。
在某些实施方案中，所提供的核酸(例如，核酸抑制剂分子)可与化合物的其他分子、分子结构或混合物混合、封装、缀合或以其他方式缔合，所述化合物包括例如脂质体和脂质，诸如公开于美国专利号6,815,432、6,586,410、6,858,225、7,811,602、7,244,448和8,158,601中的那些；聚合材料，诸如公开于美国专利号6,835,393、7,374,778、7,737,108、7,718,193、8,137,695和美国公开专利申请号2011/0143434、2011/0129921、2011/0123636、2011/0143435、2011/0142951、2012/0021514、2011/0281934、2011/0286957和2008/0152661中的那些；有助于摄取、分布或吸收的壳体(capsid)、类壳体(capsoid)或受体靶向的分子，所述文献中的每一者的整体以引用的方式并入本文中。
在某些实施方案中，将所提供的核酸(例如，核酸抑制剂分子)配制成脂质纳米粒子(LNP)。一经混合脂质与核酸以形成复合物，通常即自发形成脂质-核酸纳米粒子。取决于所需的粒度分布，所得纳米粒子混合物可任选使用例如热桶挤压机(诸如
Figure BDA0003847035450001071
挤压机(Northern Lipids,Inc))挤压通过聚碳酸酯膜(例如，100nm截断)。为制备用于治疗用途的脂质纳米粒子，可期望移除使用的溶剂(例如，乙醇)以形成纳米粒子和/或交换缓冲剂，所述移除可通过例如透析或切向流过滤进行。制造含有核酸抑制剂分子的脂质纳米粒子的方法为本领域已知，如公开例如于美国公开专利申请号2015/0374842和2014/0107178中，所述文献中的每一者的整体以引用的方式并入本文中。
在某些实施方案中，LNP包含有包含阳离子脂质体和聚乙二醇化脂质的脂质核心。所述LNP还可包含一种或多种包膜脂质，诸如阳离子脂质、结构性或中性脂质、固醇、聚乙二醇化脂质、或其混合物。
在某些实施方案中，所提供的核酸共价缀合至配体，所述配体将所述核酸引导递送至感兴趣的组织。已探索许多此类配体。参见，例如，Winkler,THER.DELIV.,2013,4(7):791-809。例如，所提供的核酸可缀合至多个糖配体部分(例如，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc))以将所述核酸引导摄取至肝脏内。参见，例如，WO 2016/100401。可使用的其他配体包括但不限于甘露糖-6-磷酸、胆固醇、叶酸盐、转铁蛋白和半乳糖(关于其他特定示例性配体，参见，例如，WO 2012/089352)。通常，当所提供的核酸缀合至配体时，所述核酸作为裸核酸施用，其中还未将寡核苷酸配制于LNP或其他保护包衣中。在某些实施方案中，所述裸核酸内的每个核苷酸在糖部分的2’-位置通常经2’-F或2’-OMe修饰。
此类药物组合物可通过常规灭菌技术灭菌或可经无菌过滤。所得水溶液可经包装以原样使用、或冻干，所述冻干制剂在施用前与无菌水性赋形剂组合。所述制剂的pH通常将在3与11之间、更优选在5与9之间或在6与8之间、且最优选在7与8之间，诸如7至7.5。固体形式的药物组合物可包装在多个单剂量单位中，所述单剂量单位每个含有固定量的上文提及的一种或多种剂，诸如包装在片剂或胶囊剂的密封包装中。固体形式的药物组合物还可以灵活量包装在容器中，诸如包装在针对局部可应用的乳膏或软膏设计的可压挤管中。
可与载剂材料组合以产生单一剂型的组合物的本发明的核酸或其类似物的量将根据治疗的宿主、特定的施用模式而变化。优选地，应配制所提供的组合物使得可向接受此类组合物的患者施用剂量在0.01与100mg/kg体重/天之间的核酸或其类似物。
还应了解用于任何特定患者的特定剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括采用的特定核酸或其类似物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合、以及主治医师的判断和治疗的特定疾病的严重程度。本发明的核酸或其类似物在所述组合物中的量还将取决于所述组合物中的特定核酸或其类似物。
核酸及其类似物和药学上可接受的组合物的用途
本文描述的核酸及其类似物和组合物一般适用于调节细胞内RNA水平。所提供的包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物可用于调节靶基因在细胞中的表达的方法。通常，此类方法包括以足以调节靶基因的表达的量将所提供的核酸抑制剂分子引入细胞内。在某些实施方案中，所述方法体内进行。所述方法还可体外或离体进行。在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于人细胞。
在某些实施方案中，所提供的包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物(例如，核酸抑制剂分子)可用于治疗有需要的患者的方法。通常，此类方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的包含如本文所述的所提供的核酸抑制剂分子的药物组合物。
如本文所用，如本文所述，术语“治疗(treatment、treat和treating)”是指逆转、缓解疾病或病症、或其一种或多种症状、延迟其发作、或抑制其进展。在一些实施方案中，治疗可在已发展一种或多种症状后施用。在其他实施方案中，治疗可在缺乏症状的情况下施用。例如，治疗可在症状发作前向易感个体施用(例如，鉴于症状史和/或鉴于遗传或其他易感因素)。治疗还可在症状已解决后继续，例如来防止或延迟其复发。
在某些实施方案中，本文公开的药物组合物可适用于治疗或预防有需要的患者的与病毒感染相关的症状。一个实施方案涉及治疗病毒感染的方法，其包括向受试者施用包含治疗有效量的所提供的包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物(例如，核酸抑制剂分子)的药物组合物，如本文所述。此类病毒感染的非限制性实例包括HCV、HBV、HPV、HSV或HIV感染。
在某些实施方案中，本文公开的药物组合物可适用于治疗或预防有需要的患者的与癌症相关的症状。一个实施方案涉及治疗癌症的方法，其包括向受试者施用包含治疗有效量的所提供的核酸抑制剂分子的药物组合物，如本文所述。此类癌症的非限制性实例包括胆道癌、膀胱癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、脑癌、胶质瘤、星形细胞瘤、乳癌、化生癌、宫颈癌、宫颈鳞状细胞癌、直肠癌、结直肠癌、结肠癌、遗传性非息肉性结直肠癌、结直肠腺癌、胃肠道间质瘤(GIST)、子宫内膜癌、子宫内膜间质肉瘤、食道癌、食道鳞状细胞癌、食管腺癌、眼黑素瘤、葡萄膜黑色素瘤、胆囊癌、胆囊腺癌、肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、肾母细胞瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、肝癌、肝恶性瘤、肝肿瘤、肝细胞癌、胆管癌、肝母细胞瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、间皮瘤、B细胞淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、被套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、前体T淋巴细胞淋巴瘤/白血病、外周T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌(NPC)、成神经细胞瘤、口咽癌、口腔鳞状细胞癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臓癌、胰导管腺癌、假乳头状肿瘤、腺泡细胞癌。前列腺癌、前列腺腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、小肠癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastriccarcinoma)、胃肠道间质瘤(GIST)、子宫癌或子宫肉瘤。通常，本公开的特征为通过施用治疗有效量的如本文所述的药物组合物治疗肝癌、肝恶性瘤、肝肿瘤、肝细胞癌、胆管癌和肝母细胞瘤的方法。
在某些实施方案中，本文公开的药物组合物可适用于治疗或预防与增生性、发炎性、自体免疫性、神经、眼、呼吸、代谢、皮肤病学、听觉、肝脏、肾脏、或感染性疾病相关的症状。一个实施方案涉及治疗增生性、发炎性、自体免疫性、神经、眼、呼吸、代谢、皮肤病学、听觉、肝脏、肾脏、或感染性疾病的方法，其包括向受试者施用包含治疗有效量的所提供的核酸抑制剂分子的药物组合物，如本文所述。通常，所述疾病或病状是肝脏疾病。
在一些实施方案中，本公开提供用于减少靶基因在受试者中的表达的方法，其包括以足以减少所述靶基因的表达的量向有需要的受试者施用药物组合物，其中所述药物组合物包含如本文所述的所提供的包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸抑制剂分子或其类似物和如本文还描述的药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所提供的核酸抑制剂分子是如本文所述的RNAi抑制剂分子，包括dsRNAi抑制剂分子或ssRNAi抑制剂分子。
靶基因可为来自任何哺乳动物的靶基因，诸如人靶基因。任何基因可根据本发明方法沉默。示例性靶基因包括但不限于VII因子、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、HBV、HCV、RSV、PDGFβ基因、Erb-B基因、Src基因、CRK基因、GRB2基因、RAS基因、MEKK基因、JNK基因、RAF基因、Erk1/2基因、PCNA(p21)基因、MYB基因、JUN基因、FOS基因、BCL-2基因、周期蛋白D基因、VEGF基因、EGFR基因、周期蛋白A基因、周期蛋白E基因、WNT-1基因、β-连环蛋白基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、存活素基因、Her2/Neu基因、拓扑异构酶I基因、拓扑异构酶IIα基因、p73基因、p21(WAF1/CIP1)基因、p27(KIP1)基因、PPM1D基因、RAS基因、窖蛋白I基因、MIB I基因、MTAI基因、M68基因、肿瘤抑制基因中的突变、p53肿瘤抑制基因、LDHA及其组合。
在一些实施方案中，所提供的包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸抑制剂分子或其类似物使靶基因沉默且因此可用于治疗患有特征在于靶基因的非所需表达的病症或处于其风险下的受试者。例如，在一些实施方案中，所述所提供的核酸抑制剂分子使β-连环蛋白基因沉默，且因此可用于治疗患有特征在于非所需的β-连环蛋白表达的病症(例如，腺癌或肝细胞癌)或处于其风险下的受试者。
通常，本发明提供的核酸(例如，核酸抑制剂分子)经静脉内或皮下施用。然而，本文公开的药物组合物还可通过本领域中已知的任何方法施用，所述方法包括例如经口、颊、舌下、直肠、阴道、尿道内、局部、眼内、鼻内和/或耳内，所述施用可包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、水性悬浮剂、凝胶剂、喷雾剂、栓剂、药膏剂、软膏剂等。
在某些实施方案中，药物组合物经由全身施用(诸如经由静脉内或皮下施用)递送至受试者或有机体中的相关组织或细胞(诸如肝脏)。在其他实施方案中，所述药物组合物经由局部施用或全身施用递送。在某些实施方案中，所述药物组合物经由局部施用(诸如经由肺部递送)递送至相关组织或细胞(诸如肺细胞和组织)。
本文公开的核酸或其类似物的治疗有效量可取决于施用途径和患者的身体特性，诸如受试者的大小和重量、疾病进展或渗透的程度、受试者的年龄、健康状况和性别。
在某些实施方案中，如本文所述的所提供的核酸在20微克至10毫克每千克体重接受者每天、100微克至5毫克每千克体重接受者每天、或0.5至2.0毫克每千克体重接受者每天的剂量下经施用。
本公开的药物组合物可每天或间歇施用。例如，本公开的核酸或其类似物的间歇性施用可每周一至六天、每月一至六天、每周一次、每隔一周一次、每月一次、每隔一月一次、或每年一次或两次或分为每年、每月、每周或每日多个剂量施用。在一些实施方案中，间歇性给药可意指周期性施用(例如每日施用一天、一周或连续二至八周，然后停药，不施用长达一周、长达一个月、长达两个月、长达三个月或长达六个月或更长时间)或其可意指间隔数天、数周、数月或数年施用。
在本发明的治疗方法中的任一者中，核酸或其类似物可作为单一疗法单独或与本领域中已知的额外疗法组合向受试者施用。
范例
缩写
Ac：乙酰基
AcOH：乙酸
ACN：乙腈
Ad：金刚烷基
AIBN：2,2′-偶氮二异丁腈
Anhyd：无水
Aq：水性
B2Pin2：双(频哪醇合)二硼-4,4,4′,4′,5,5,5′,5′-八甲基-2,2′-二(1,3,2-二氧杂硼烷)
BINAP：2,2′-双(二苯基膦基)-1,1′-联萘
BH3：硼烷
Bn：苯甲基
Boc：叔丁氧基羰基
Boc2O：二碳酸二叔丁基酯
BPO：过氧化苯甲酰
nBuOH：正丁醇
CDI：羰基二咪唑
COD：环辛二烯
d：天
DABCO：1,4-重氮基双环[2.2.2]辛烷
DAST：二乙基氨基三氟化硫
dba：二亚苯甲基丙酮
DBU：1,8-重氮基双环[5.4.0]十一碳-7-烯
DCE：1,2-二氯乙烷
DCM：二氯甲烷
DEA：二乙胺
DHP：二氢哌喃
DIBAL-H：氢化二异丁基铝
DIPA：二异丙胺
DIPEA或DIEA：N,N-二异丙基乙胺
DMA：N,N-二甲基乙酰胺
DME：1,2-二甲氧基乙烷
DMAP：4-二甲基氨基吡啶
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DMP：戴斯-马丁过碘烷
DMSO：二甲基亚砜
DMTr：4,4’-二甲氧基三苯甲基
DPPA：二苯基磷酰基迭氮化物
dppf：1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁
EDC或EDCI：1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
ee：对映体过量
ESI：电喷雾电离
EA：乙酸乙酯
EtOAc：乙酸乙酯
EtOH：乙醇
FA：甲酸
h或hr：小时
HATU：六氟磷酸N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲鎓
HCl：盐酸
HPLC：高效液相色谱法
HOAc：乙酸
IBX：2-二氧碘基苯甲酸
IPA：异丙醇
KHMDS：六甲基二硅氮化钾
K2CO3：碳酸钾
LAH：氢化铝锂
LDA：二异丙基氨基锂
L-DBTA：二苯甲酰基-L-酒石酸
m-CPBA：间氯过氧苯甲酸
M：莫耳
MeCN：乙腈
MeOH：甲醇
Me2S：二甲硫
MeONa：甲醇钠
MeI：碘甲烷
min：分钟
mL：毫升
mM：毫莫耳
mmol：毫莫耳
MPa：兆帕斯卡
MOMCl：甲基氯甲基醚
MsCl：甲烷磺酰氯
MTBE：甲基叔丁基醚
nBuLi：正丁基锂
NaNO2：亚硝酸钠
NaOH：氢氧化钠
Na2SO4：硫酸钠
NBS：N-溴琥珀酰亚胺
NCS：N-氯琥珀酰亚胺
NFSI：N-氟苯磺酰亚胺
NMO：N-甲基吗啉N-氧化物
NMP：N-甲基吡咯烷
NMR：核磁共振
℃：摄氏度
Pd/C：碳载钯
Pd(OAc)2：乙酸钯
PBS：磷酸盐缓冲盐水
PE：石油醚
POCl3：氧氯化磷
PPh3：三苯膦
PyBOP：六氟磷酸(苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷基鏻
Rel：相对
R.T.或rt：室温
sat：饱和
SEMCl：氯甲基-2-三甲基硅基乙基醚
SFC：超临界流体色谱法
SOCl2：二氯化硫
tBuOK：叔丁醇钾
TBAB：四丁基溴化铵
TBAF：四丁基氟化铵
TBAI：四丁基碘化铵
TEA：三乙胺
Tf：三氟甲磺酸酯
TfAA、TFMSA或Tf2O：三氟甲磺酸酐
TFA：三氟乙酸
TIBSCl：2,4,6-三异丙基苯磺酰氯
TIPS：三异丙基硅基
THF：四氢呋喃
THP：四氢哌喃
TLC：薄层色谱法
TMEDA：四甲基乙二胺
pTSA：对甲苯磺酸
UPLC：超高效液相色谱法
wt：重量
Xantphos：4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨
一般合成方法
以下实施例旨在阐述本发明且不应解释为限制本发明。温度以摄氏度给定。若未另外提及，则所有蒸发均在减压下、优选在约15mm Hg与100mm Hg(＝20至133mbar)之间进行。最终产物、中间体和起始材料的结构通过标准分析方法例如微量分析和光谱特性(例如，MS、IR、NMR)证实。使用的缩写为本领域中常规的那些。
用于合成本发明的核酸或其类似物的所有起始材料、建构组元、试剂、酸、碱、脱水剂、溶剂和催化剂可商购获得或可通过本领域普通技术人员已知的有机合成方法产生(Houben-Weyl第4版1952,Methods of Organic Synthesis,Thieme,第21卷)。另外，本发明的核酸或其类似物可通过本领域普通技术人员已知的如以下实施例中所示的有机合成方法产生。
除非另有说明，否则所有反应均在氮或氩下进行。
质子NMR(1H NMR)在氘化溶剂中进行。在本文公开的某些核酸或其类似物中，一个或多个1H位移与残余的蛋白溶剂信号重迭；此类信号已报导于下文提供的实验中。
如下文实施例中绘示，在某些示例性实施方案中，核酸或其类似物根据以下一般程序制备。应了解，尽管所述一般方法绘示本发明的某些核酸或其类似物的合成，但以下一般方法和本领域普通技术人员已知的其他方法可应用于如本文所述的所有核酸或其类似物和此类核酸或其类似物中的每一者的子类和种类。
实施例1.(2R,3S,4R,5R)-2-(((((2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基)氧基)(甲氧基)磷酰基)甲氧基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺(I-3)的合成
Figure BDA0003847035450001201
步骤1：((((2R,3S,4R,5R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-5-(2,4-二氧代-3,4- 二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基四氢呋喃-2-基)氧基)甲基)膦酸二甲酯。(1.2)
将1.10g 1.1溶解于10mL无水DMF中。然后将1.22g咪唑添加至所述溶液。添加1.36g TBSCl后，在室温下将所述反应混合物保持搅拌10小时。如通过UPLC证实反应完成后，在减压下移除DMF。然后将淡黄色残余物重新溶解于200mL EA中并用75mL水洗两次且用盐水洗一次。所得溶液经无水硫酸钠干燥并通过旋转蒸发移除挥发物。然后将粗产物通过骤沸塔(0至10％MeOH于DCM中)纯化以提供呈白色泡沫的1.2(1.21g，83％产率)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):8.42(s,1H),7.59(d,J＝8Hz,1H),7.58(d,J＝4Hz,1H),6.33(dd,J1＝8Hz,J2＝1.6Hz,1H),4.89(s,1H),4.25(d,J＝4Hz,1H),4.03(m,1H),3.76-3.91(m,2H),3.85(d,J＝4Hz,3H),3.82(d,J＝4Hz,3H),3.37(s,3H),0.91(s,9H),0.13(s,3H),0.11(s,3H)。针对C18H33N2NaO9PSi-计算的MS(ESI)m/z：503.5150，实测值：503.55。
步骤2：氢((((2R,3S,4R,5R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-5-(2,4-二氧代-3, 4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基四氢呋喃-2-基)氧基)甲基)膦酸甲酯。(1.3)
将3.30g 1.2溶解于120mL水性吡啶(吡啶:水3:2)中。将所述反应混合物加热至50℃并保持搅拌16小时。如通过UPLC证实反应完成后，在减压下移除挥发物。粗产物1.3(3.74g，定量)无需进一步纯化即用于下一步骤中。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.16(br,1H),7.75(d,J＝1Hz,1H),6.09(d,J＝8Hz,1H),5.67(d,J1＝8Hz,1H),4.94(s,1H),4.24(d,J＝4Hz,1H),3.95(m,1H),3.45-3.61(m,2H),3.43(d,J＝4Hz,3H),3.26(s,3H),0.87(s,9H),0.11(s,3H),0.10(s,3H)。31P-NMR(200MHz,DMSO-d6):19.96。针对C17H30N2O9PSi-计算的MS(ESI)m/z：465.4913，实测值：465.23。
步骤3：((((2R,3S,4R,5R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-5-(2,4-二氧代-3,4- 二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基四氢呋喃-2-基)氧基)甲基)膦酸(2R,3S,5R)-2-((双(4-甲 氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋 喃-3-基酯甲酯(I-1)。
将4.65g 1.3溶解于100mL无水吡啶中。将所述混合物冷却至0℃并添加7.72gTIBSCl(3当量)，搅拌5min，接着升温至室温并再搅拌15min。然后将4.63g 1-((2R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮添加至所得溶液，接着添加4.1mL 1-甲基咪唑。在室温下将所述反应混合物搅拌2小时。UPLC证实反应完成并添加25mL饱和碳酸氢钠以淬灭所述反应。在减压下移除挥发物且将所得黄色/棕色油通过快速色谱法(0至10％MeOH于DCM中，具有0.1％TEA)纯化以提供呈白色粉末的I-1(3.67g，44％产率)。针对C48H61N4NaO15PSi+计算的MS(ESI)m/z：1016.0770，实测值：1016.01。
步骤4：((((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-3-羟基-4- 甲氧基四氢呋喃-2-基)氧基)甲基)膦酸(2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧 基)甲基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基酯甲酯(I-2)。
将2.50g I-1溶解于50mL无水THF中。然后在室温下在搅拌下在3min内向所述溶液逐滴添加7.5mL TBAF(1M)。在室温下将所得溶液保持搅拌30min。当UPLC指示消耗>85％起始材料时，停止所述反应。在减压下移除挥发物以产生黄色油，将其通过快速色谱法(0至10％MeOH于DCM中，具有0.1％TEA)纯化以提供呈白色粉末的I-2(1.07g，49％产率)。31P-NMR(200MHz,CDCl3):21.93,21.91。针对C42H46N4O15P-计算的MS(ESI)m/z：877.8173，实测值：877.91。
步骤5：(2R,3S,4R,5R)-2-(((((2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧 基)甲基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基)氧基)(甲氧 基)磷酰基)甲氧基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基四氢呋喃-3-基 (2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺(I-3)。
将440mg化合物I-2溶解于6mL无水DCM中。在室温下搅拌10min后，将262μL 2-氰乙基N’,N’,N’,N’-四异丙基亚磷二酰胺酸酯添加至所述反应混合物，接着添加100mg 4,5-二氰基咪唑。在室温下将所得澄清溶液保持搅拌4小时。UPLC监测证实起始材料的完全转化。然后所述反应混合物用5mL饱和碳酸氢钠和5mL盐水洗涤。在经无水硫酸钠干燥后，在减压下移除挥发物。然后将白色油残余物通过快速色谱法(0至8％MeOH于DCM中，具有0.1％TEA)纯化以提供呈白色粉末的I-3(346mg，64％产率)。31P-NMR(200MHz,CDCl3):152.80,152.75,151.53,151.38,22.65,22.47,22.19,22.16。针对C51H64N6NaO16P2 +计算的MS(ESI)m/z：1102.0357，实测值：1102.08。
实施例2.(2R,3S,4R,5R)-2-(1-((((2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基)氧基)(甲氧基)磷酰基)乙氧基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺(I-6)的合成
Figure BDA0003847035450001231
步骤1：苯甲酸(2R,3S,4R,5R)-5-(3-((苯甲氧基)甲基)-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧 啶-1(2H)-基)-2-((二甲氧基磷酰基)甲氧基)-4-甲氧基四氢呋喃-3-基酯(2.2)。
将3.06g 2.1溶解于20mL无水DCM中。将所述溶液冷却至0℃并添加3.77mL BF3·Et2O，接着添加3mL(1-羟基乙基)膦酸二甲酯。在室温下将所述反应混合物搅拌24小时，之后将另外的1.9mL BF3·Et2O和1.5mL(1-羟基乙基)膦酸二甲酯添加至所述反应物。将所得溶液再保持搅拌84小时。如通过UPLC证实反应完成后，将所述反应用15mL水淬灭并用40mLDCM稀释。将各层分离，且有机层用30mL饱和碳酸氢钠和30mL盐水洗涤。在经无水硫酸钠干燥后，将所述混合物浓缩并通过快速色谱法(30至100％EA于己烷中，接着0至5％MeOH于DCM中)纯化以提供呈白色粉末的2.2(2.04g，56％产率)。针对C28H32N2NaO11P+计算的MS(ESI)m/z：627.5380，实测值：627.21。
步骤2：苯甲酸(2R,3S,4R,5R)-2-(1-(二甲氧基磷酰基)乙氧基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基四氢呋喃-3-基酯(2.3)。
将1.80g 2.2溶解于0.9mL无水甲苯中并将7.2mL TFA添加至所述溶液。然后将反应混合物加热至45℃并搅拌3小时。如通过UPLC证实反应完成后，所述混合物用70mL甲苯稀释并在减压下移除挥发物。然后将紫色/棕色残余物溶解于100mL EA中并用50mL碳酸氢钠和50mL盐水洗涤。在经无水硫酸钠干燥后，在减压下移除挥发物。然后将所得棕色油通过快速色谱法纯化以提供呈白色粉末的2.3(1.11g，77％产率)。针对C20H25N2NaO10P+计算的MS(ESI)m/z：507.3870，实测值：507.43。
步骤3：苯甲酸(2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-(1-(羟基(甲氧基)磷酰基)乙氧基)-4-甲氧基四氢呋喃-3-基酯(2.4)。
将1.11g化合物2.3溶解于40mL 3:2吡啶和水混合物中。将所述反应混合物加热至50℃并搅拌16小时。如通过UPLC证实反应完成后，在减压下移除挥发物且粗品2.4(1.26g，定量)无需进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤4：苯甲酸(2R,3S,4R,5R)-2-(1-((((2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基)氧基)(甲氧基)磷酰基)乙氧基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基四氢呋喃-3-基酯(I-4)。
将1.04g 2.4溶解于24mL无水吡啶中并冷却至0℃。添加1.81gTIBSCl并将所述混合物升温至室温且在室温下搅拌10min。将2.16g1-((2R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮添加至所得溶液，接着添加1.0mL 1-甲基咪唑。然后在室温下将所述反应混合物搅拌3小时。如通过UPLC证实反应完成后，添加10mL饱和碳酸氢钠以淬灭所述反应。在减压下移除挥发物且将所得黄色油通过快速色谱法(0至10％MeOH于DCM中，具有0.1％TEA)纯化以提供呈白色粉末的I-4(0.89g，47％产率)。针对C50H53N4NaO16P+计算的MS(ESI)m/z：1019.9490，实测值：1019.78。
步骤5：(1-(((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-3-羟基-4-甲氧基四氢呋喃-2-基)氧基)乙基)膦酸(2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基酯甲酯(I-5)。
将1.38g碳酸钾添加至20mL MeOH并将所得浆液搅拌12小时。将0.89g I-4溶解于5mL无水MeOH中并添加5mL预先制得的碳酸钾浆液。在室温下将所述反应混合物搅拌2.5小时。如通过UPLC证实反应完成后，将所述反应混合物过滤，且滤液用2mL 1M乙酸淬灭。在减压下移除挥发物。然后将粗品通过快速色谱法(30至100％EA于己烷中，接着0至5％MeOH于DCM中，具有0.1％TEA)纯化以提供呈白色泡沫的I-5(0.42g，53％产率)。针对C43H49N4NaO15P+计算的MS(ESI)m/z：915.8410，实测值：915.48。
步骤6：(2R,3S,4R,5R)-2-(1-((((2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基)氧基)(甲氧基)磷酰基)乙氧基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺(I-6)。
将550mg I-5溶解于7.5mL无水DCM中。在室温下搅拌10min后，将320μL 2-氰乙基N’,N’,N’,N’-四异丙基亚磷二酰胺酸酯添加至所述反应混合物，接着添加90mg 4,5-二氰基咪唑。在室温下将所得澄清溶液搅拌3小时。如通过UPLC证实反应完成后，所述反应混合物用5mL饱和碳酸氢钠和5mL盐水洗涤。在经无水硫酸钠干燥后，在减压下移除挥发物。然后将白色油残余物通过快速色谱法(0至10％MeOH于DCM中，具有0.1％TEA)纯化以提供呈白色粉末的I-6(451mg，67％产率)。31P-NMR(200MHz,CDCl3):152.48,152.46,151.32,151.29,24.74,24.50,24.13,23.96。针对C52H66N6NaO16P2 +计算的MS(ESI)m/z：1116.0627，实测值：1116.12。
实施例3.(2R,3R,4S,5R)-2-(((((2R,4S,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-甲氧基四氢呋喃-3-基)氧基)(甲氧基)磷酰基)甲氧基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺(I-9)的合成
Figure BDA0003847035450001261
步骤3：((((2R,3S,4R,5R)-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)-5-(2,4-二氧代-3,4- 二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基四氢呋喃-2-基)氧基)甲基)膦酸(2R,3S,5R)-2-((双(4-甲 氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋 喃-3-基酯甲酯(I-7)。
将2.60g 1.3溶解于55mL无水吡啶中并冷却至0℃。添加TIBSCl(3当量)并在0℃下维持搅拌15min。升温至室温后，添加2.48gN-(9-((2R,3S,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基-3-甲氧基四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺，接着添加2.3mL 1-甲基咪唑。然后在室温下将所述反应混合物搅拌3小时。通过UPLC证实反应完成后，添加10mL饱和碳酸氢钠以淬灭所述反应。在减压下移除挥发物且将所得黄色油通过快速色谱法(0至10％MeOH于DCM中，具有0.1％TEA)纯化以提供呈白色粉末的I-7(2.26g，55％产率)。针对C56H67N7O15PSi+计算的MS(ESI)m/z：1137.2442，实测值：1137.45。
步骤4：((((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-3-羟基-4- 甲氧基四氢呋喃-2-基)氧基)甲基)膦酸(2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧 基)甲基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基酯甲酯(I-8)。
将1.30g I-7溶解于40mL无水THF中并在搅拌下在室温下在3min内逐滴添加3.0mLTBAF(1M)，且在室温下将所得溶液搅拌1小时。当通过UPLC证实消耗>90％起始材料时，在减压下移除挥发物以产生黄色油，将其通过快速色谱法(0至10％MeOH于DCM中，具有0.1％TEA)纯化以提供呈灰白色粉末的I-8(0.53g，45％产率)。针对C50H51N7O15P-计算的MS(ESI)m/z：1021.9663，实测值：1020.84。
步骤5：(2R,3S,4R,5R)-2-(((((2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧 基)甲基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基)氧基)(甲氧 基)磷酰基)甲氧基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基四氢呋喃-3-基 (2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺(I-9)。
将416mg I-8溶解于5mL无水DCM中。在室温下搅拌10min后，将224μL 2-氰乙基N’,N’,N’,N’-四异丙基亚磷二酰胺酸酯添加至所述反应混合物，接着添加63mg 4,5-二氰基咪唑。在室温下将所得澄清溶液搅拌3小时。如通过UPLC证实反应完成后，所述反应混合物用5mL饱和碳酸氢钠、5mL盐水洗涤、经无水硫酸钠干燥、并在减压下浓缩。然后将所得白色油残余物通过快速色谱法(0至10％MeOH于DCM中，具有0.1％TEA)纯化以提供呈白色泡沫的I-9(305mg，61％产率)。31P-NMR(200MHz,CDCl3):152.89,152.71,151.60,151.51,23.19,22.81,22.16,21.75。针对C59H70N9O16P2 +计算的MS(ESI)m/z：1223.2023，实测值：1222.91。
实施例4.(2R,3R,5R)-2-(((((2R,3R,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)氧基)(甲氧基)磷酰基)甲氧基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺(I-12)的合成
Figure BDA0003847035450001281
步骤1：苯甲酸(2R,3S,5R)-5-(3-((苯甲氧基)甲基)-5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二 氢嘧啶-1(2H)-基)-2-(1-(二甲氧基磷酰基)乙氧基)四氢呋喃-3-基酯(3.2)
将4.10g 3.1溶解于24mL无水DCM中。然后将所述溶液冷却至0℃并添加5.40mLBF3·Et2O，接着添加3.60mL(羟基甲基)膦酸二甲酯。在0℃下将所述反应混合物搅拌15min并使得逐渐升温至室温。在室温下将所得溶液搅拌18小时。如通过UPLC证实反应完成后，所述反应用20mL水淬灭并用60mL DCM稀释。将各层分离，且有机层用30mL饱和碳酸氢钠和30mL盐水洗涤。在经无水硫酸钠干燥后，将所述混合物浓缩并通过快速色谱法(30至100％EA于己烷中，接着0至10％MeOH于DCM中)纯化以提供呈白色粉末的3.2(2.15g，45％产率)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):8.04(dd,J1＝12Hz,J2＝4Hz,2H),7.24-7.64(m,9H),6.86(t,J＝8Hz,1H),5.53(s,1H),5.52(s,2H),5.21(s,1H),4.72(s,2H),4.06(dd,J1＝14Hz,J2＝8Hz,1H),3.82-3.90(m,7H),2.58-2.63(m,1H),2.32-2.39(m,1H),2.02(s,3H)。针对C27H31N2NaO10P+计算的MS(ESI)m/z：597.1614，实测值：597.1783。
步骤2：苯甲酸(2R,3S,5R)-2-((二甲氧基磷酰基)甲氧基)-5-(5-甲基-2,4-二氧 代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基酯。(3.3)
将2.12g化合物3.2溶解于2.0mL无水甲苯中并将16.0mL TFA添加至所述溶液。然后将反应混合物加热至45℃并搅拌5小时。如通过UPLC证实反应完成后，所述混合物用70mL甲苯稀释并在减压下移除挥发物。然后将紫色/棕色残余物溶解于100mL EA中并用100mL碳酸氢钠和100mL盐水洗涤。在经无水硫酸钠干燥后，在减压下移除挥发物。然后将所得棕色油通过快速色谱法纯化以提供呈白色粉末的3.3(1.21g，75％产率)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):8.46(s,1H),7.40-8.05(m,6H),6.82(t,J＝8Hz,1H),5.53(s,1H),5.22(s,1H),4.07(dd,J1＝14Hz,J2＝8Hz,1H),3.83-3.91(m,7H),2.59-2.64(m,1H),2.38-2.44(m,1H),1.98(s,3H)。针对C19H23N2NaO9P+计算的MS(ESI)m/z：477.3615，实测值：477.4387。
步骤3：苯甲酸(2R,3S,5R)-2-((羟基(甲氧基)磷酰基)甲氧基)-5-(5-甲基-2,4- 二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基酯(3.4)
将1.2g化合物3.4溶解于40mL 3:2吡啶和水混合物中。将所述反应混合物加热至50℃并搅拌16小时。如通过UPLC证实反应完成后，在减压下移除挥发物且粗品3.4(1.37g，定量)无需进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤4：苯甲酸(2R,3R,5R)-2-(((((2R,3R,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9- 基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)氧基)(甲氧基)磷酰基) 甲氧基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基酯(I-10)。
将2.56g 3.4和2.98g 1-((2R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮溶解于64mL无水吡啶中并冷却至0℃。添加3.44g TIBSCl。然后在0℃下将所述混合物搅拌15min。升温至室温后，向反应混合物添加2.5mL 1-甲基咪唑。然后在室温下将所述反应混合物搅拌3.5小时。如通过UPLC证实反应完成后，添加30mL饱和碳酸氢钠以淬灭所述反应。在减压下移除挥发物且将所得黄色油通过快速色谱法(0至10％MeOH于EA中，具有0.1％TEA)纯化以提供呈白色粉末的I-10(2.42g，46％产率)。针对C56H55N7O14P+计算的MS(ESI)m/z：1080.3545，实测值：1080.3895。
步骤5：((((2R,3R,5R)-3-羟基-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)- 基)四氢呋喃-2-基)氧基)甲基)膦酸(2R,3R,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-2- ((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯甲酯(I-11)。
将1.38g碳酸钾添加至20mL MeOH并将所得浆液搅拌12小时。然后过滤所述浆液以产生作为碳酸钾溶液的澄清滤液。将1.0g I-10溶解于45mL无水MeOH中并添加5mL预先制得的碳酸钾溶液。在室温下将所述反应混合物搅拌1小时。如通过UPLC证实反应完成后，将所述反应混合物过滤，且滤液用1.5mL 1M乙酸淬灭。在减压下移除挥发物。然后将粗品通过快速色谱法(30至100％EA于己烷中，具有0.1％TEA，接着0至10％MeOH于DCM中)纯化以提供呈白色泡沫的I-11(0.52g，58％产率)。针对C49H51N7O13P+计算的MS(ESI)m/z：976.3283，实测值：976.6138。
步骤6：(2R,3R,5R)-2-(((((2R,3R,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-2- ((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)氧基)(甲氧基)磷酰基)甲氧 基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙 基亚磷酰胺(I-12)。
将291mg I-11溶解于4.0mL无水DCM中。在室温下搅拌10min后，将143μL 2-氰乙基N’,N’,N’,N’-四异丙基亚磷二酰胺酸酯添加至所述反应混合物，接着添加39mg 4,5-二氰基咪唑。在室温下将所得澄清溶液搅拌3小时。如通过UPLC证实反应完成后，所述反应混合物用5mL饱和碳酸氢钠和5mL盐水洗涤。在经无水硫酸钠干燥后，在减压下移除挥发物。然后将白色油残余物通过快速色谱法(0至10％MeOH于DCM中，具有0.1％TEA)纯化以提供呈白色粉末的I-12(220mg，62％产率)。31P-NMR(200MHz,DMSO-d6):149.64,149.51,149.49,149.37,23.67,23.65,23.38,23.33。针对C58H68N9O14P2 +计算的MS(ESI)m/z：1176.4361，实测值：1176.7185。
实施例5.(2R,3R,5R)-2-(1-((((2R,3R,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)氧基)(甲氧基)磷酰基)乙氧基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺(I-15)的合成
Figure BDA0003847035450001321
步骤1：苯甲酸(2R,3S,5R)-5-(3-((苯甲氧基)甲基)-5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二 氢嘧啶-1(2H)-基)-2-(1-(二甲氧基磷酰基)乙氧基)四氢呋喃-3-基酯(4.1)
将4.50g 3.1溶解于27mL无水DCM中。然后将所述溶液冷却至0℃并添加5.90mLBF3·Et2O，接着添加4.50mL(1-羟基乙基)膦酸二甲酯。在0℃下将所述反应混合物搅拌15min并使得逐渐升温至室温。在室温下将所得溶液搅拌24小时。如通过UPLC证实反应完成后，所述反应用40mL水淬灭并用100mL DCM稀释。将各层分离，且有机层用30mL饱和碳酸氢钠和30mL盐水洗涤。在经无水硫酸钠干燥后，将所述混合物浓缩并通过快速色谱法(30至100％EA于己烷中，接着0至10％MeOH于DCM中)纯化以提供呈白色粉末的4.1(2.15g，45％产率)。针对C28H33N2NaO10P+计算的MS(ESI)m/z：611.1771，实测值：611.3412。
步骤2：苯甲酸(2R,3S,5R)-2-(1-(二甲氧基磷酰基)乙氧基)-5-(5-甲基-2,4-二 氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基酯。(4.2)
将1.90g化合物4.1溶解于2.0mL无水甲苯中并将16.0mL TFA添加至所述溶液。然后将反应混合物加热至45℃并搅拌5小时。如通过UPLC证实反应完成后，所述混合物用70mL甲苯稀释并在减压下移除挥发物。然后将紫色/棕色残余物溶解于100mL EA中并用100mL碳酸氢钠和100mL盐水洗涤。在经无水硫酸钠干燥后，在减压下移除挥发物。然后所得棕色油通过快速色谱法纯化以提供呈白色粉末的4.2(1.15g，76％产率)。针对C20H25N2NaO9P+计算的MS(ESI)m/z：491.1195，实测值：491.2625。
步骤3：苯甲酸(2R,3S,5R)-2-(1-(羟基(甲氧基)磷酰基)乙氧基)-5-(5-甲基-2, 4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基酯(4.3)
将1.0g化合物4.2溶解于40mL 3:2吡啶和水混合物中。将所述反应混合物加热至50℃并搅拌16小时。如通过UPLC证实反应完成后，在减压下移除挥发物且粗品4.3(1.14g，定量)无需进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤4：苯甲酸(2R,3R,5R)-2-(1-((((2R,3R,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9- 基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)氧基)(甲氧基)磷酰基) 乙氧基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基酯(I-13)。
将1.35g 4.3和1.50g 1-((2R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮溶解于27mL无水吡啶中并冷却至0℃。添加2.35g均三甲苯-2-磺酰氯。然后在0℃下将混合物搅拌15min。升温至室温后，向反应混合物添加1.20mL 1-甲基咪唑。然后在室温下将所述反应混合物搅拌4小时。如通过UPLC证实反应完成后，添加30mL饱和碳酸氢钠以淬灭所述反应。在减压下移除挥发物且将所得黄色油通过快速色谱法(0至10％MeOH于EA中，具有0.1％TEA)纯化以提供呈白色粉末的I-13(1.03g，46％产率)。针对C57H57N7O14P+计算的MS(ESI)m/z：1094.3701，实测值：1094.3352。
步骤5：(1-(((2R,3R,5R)-3-羟基-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)- 基)四氢呋喃-2-基)氧基)乙基)膦酸(2R,3R,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-2- ((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯甲酯(I-14)。
将1.38g碳酸钾添加至20mL MeOH并将所得浆液搅拌12小时。然后过滤所述浆液以产生作为碳酸钾溶液的澄清滤液。将680mg I-13溶解于45mL无水MeOH中并添加5mL预先制得的碳酸钾溶液。在室温下将所述反应混合物搅拌1.5小时。如通过UPLC证实反应完成后，将所述反应混合物过滤，且滤液用1.5mL 1M乙酸淬灭。在减压下移除挥发物。然后将粗品通过快速色谱法(30至100％EA于己烷中，具有0.1％TEA，接着0至10％MeOH于DCM中)纯化以提供呈白色泡沫的I-14(310mg，51％产率)。针对C50H53N7O13P+计算的MS(ESI)m/z：990.3439，实测值：990.5858。
步骤6：(2R,3R,5R)-2-(1-((((2R,3R,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-2- ((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)氧基)(甲氧基)磷酰基)乙氧 基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙 基亚磷酰胺(I-15)。
将300mg I-14溶解于4.0mL无水DCM中。在室温下搅拌10min后，将150μL 2-氰乙基N’,N’,N’,N’-四异丙基亚磷二酰胺酸酯添加至所述反应混合物，接着添加42mg 4,5-二氰基咪唑。在室温下将所得澄清溶液搅拌3小时。如通过UPLC证实反应完成后，所述反应混合物用5mL饱和碳酸氢钠和5mL盐水洗涤。在经无水硫酸钠干燥后，在减压下移除挥发物。然后将白色油残余物通过快速色谱法(0至10％MeOH于DCM中，具有0.1％TEA)纯化以提供呈白色粉末的I-15(225mg，74％产率)。31P-NMR(200MHz,DMSO-d6):149.41,148.96,148.84,148.74,148.73,148.66,148.61,148.53,24.61,24.58,24.55,24.52,24.48,24.46,24.42,24.37。针对C59H70N9O14P2 +计算的MS(ESI)m/z：1190.4518，实测值：1190.4528。
实施例6.(2R,3S,5R)-2-(((((2R,3R,5R)-5-(4-苯甲酰胺基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)氧基)(甲氧基)磷酰基)甲氧基)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺(I-18)的合成
Figure BDA0003847035450001351
步骤1：乙酸(2R,3S,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((羟基(甲氧基)磷 酰基)甲氧基)四氢呋喃-3-基酯(5.2)
将2.0g化合物5.1(乙酸(2R,3S,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((二甲氧基磷酰基)甲氧基)四氢呋喃-3-基酯)溶解于72mL 5:4吡啶和水混合物中。将所述反应混合物加热至50℃并搅拌16小时。如通过UPLC证实反应完成后，在减压下移除挥发物且粗品5.2(2.26g，定量)无需进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤2：苯甲酸(2R,3R,5R)-2-(((((2R,3R,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9- 基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)氧基)(甲氧基)磷酰基) 甲氧基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基酯(I-16)。
将1.87g 5.2和2.02g N-(1-((2R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)苯甲酰胺溶解于47.5mL无水吡啶中并冷却至0℃。添加3.44g均三甲苯-2-磺酰氯。然后在0℃下将所述混合物搅拌15min。升温至室温后，向反应混合物添加1.6mL 1-甲基咪唑。在室温下将所述反应混合物搅拌3小时。如通过UPLC证实反应完成后，添加30mL饱和碳酸氢钠以淬灭所述反应。在减压下移除挥发物且将所得黄色油通过快速色谱法(0至10％MeOH于EA中，具有0.1％TEA)纯化以提供呈白色粉末的I-16(1.72g，46％产率)。针对C58H58N8O14P+计算的MS(ESI)m/z：1121.3810，实测值：1121.4519。
步骤5：((((2R,3S,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2- 基)氧基)甲基)膦酸(2R,3R,5R)-5-(4-苯甲酰胺基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-2- ((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯甲酯(I-17)。
将1.38g碳酸钾添加至20mL MeOH并将所得浆液搅拌12小时。然后过滤所述浆液以产生作为碳酸钾溶液的澄清滤液。将1.4g I-16溶解于100mL无水MeOH中并添加4mL预先制得的碳酸钾溶液。在室温下将所述反应混合物搅拌20分钟。如通过UPLC证实反应完成后，将所述反应混合物过滤，且滤液用1.5mL 1M乙酸猝灭。在减压下移除挥发物。然后将粗品通过快速色谱法(30至100％EA于己烷中，具有0.1％TEA，接着0至10％MeOH于DCM中)纯化以提供呈白色泡沫的I-17(0.85g，63％产率)。针对C56H56N8O13P+计算的MS(ESI)m/z：1079.3705，实测值：1079.6301。
步骤6：(2R,3S,5R)-2-(((((2R,3R,5R)-5-(4-苯甲酰胺基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1 (2H)-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)氧基)(甲氧基)磷 酰基)甲氧基)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷 酰胺(I-18)。
将640mg I-17溶解于10.0mL无水DCM中。在室温下搅拌10min后，将285μL 2-氰乙基N’,N’,N’,N’-四异丙基亚磷二酰胺酸酯添加至所述反应混合物，接着添加99mg 4,5-二氰基咪唑。在室温下将所得澄清溶液搅拌3小时。如通过UPLC证实反应完成后，所述反应混合物用5mL饱和碳酸氢钠和5mL盐水洗涤。在经无水硫酸钠干燥后，在减压下移除挥发物。然后将白色油残余物通过快速色谱法(0至10％MeOH于DCM中，具有0.1％TEA)纯化以提供呈白色粉末的I-18(420mg，55％产率)。31P-NMR(200MHz,DMSO-d6):149.59,149.56,149.47,149.46,23.83,23.82,23.38,23.36。针对C65H73N10O15P2 +计算的MS(ESI)m/z：1279.4783，实测值：1279.7819。
实施例7.在SGLT2 ASO主链中用磷酸二酯键联置换硫磷酸酯键联的影响。
在图1中，ASO是SGLT2基准ASO。ASO1、ASO2、ASO3、ASO4、ASO5、ASO6、ASO7、ASO8、ASO9、ASO10和ASO11表示基于基准ASO分别在核苷酸1与2、2与3、3与4、4与5、5与6、6与7、7与8、8与9、9与10、10与11、11与12(自5’端至3’端计数)之间用核苷酸间磷酸二酯(PO)键联置换核苷酸间硫磷酸酯(PS)键联。
使用上文寡核苷酸使用0.2ml剂量体积皮下治疗雌性CD-1IGS小鼠(6至8周龄)。施用的剂量基于RNA重量为1.3mg/kg且配制于磷酸盐缓冲盐水中。5天后，通过CO2将动物安乐死，并通过心脏穿刺放血。使用4mm直径一次性穿刺活检收集肾脏样品并使用RNAlaterTM溶液固定24h。使用5mm钢珠将组织样品均质于TrizolTM试剂中，并使用MagMAXTM系统使用制造商的推荐分离总RNA。利用标准工业方法自总RNA产生cDNA(单链合成)，且所述cDNA用作TaqManTM定量实时PCR(qRT-PCR)的基质以定量检测SGLT2mRNA。使用标准ddCt方法计算相对SGLT2 mRNA，并将其标准化为Ppib mRNA作为参考基因。
图1中的SGLT2 mRNA减弱结果证实，除核苷酸2与3(ASO2)之间的位置外，在SGLT2ASO分子中用PO键联置换单一PS核苷酸间键联在主链上的所有位置处均显著减小效价。当在核苷酸1与2(ASO1)、3与4(ASO3)、和11与12(ASO11)之间用PO置换PS时，活性降低是局部的。在任何其他位置，用PO置换PS消除活性。
实施例8.在SGLT2 ASO主链中用iMOP置换硫磷酸酯键联的影响。
在图2中，ASO是SGLT2基准ASO。ASO12是实验对照，其与所述基准的唯一差异在于核苷酸11(自5’端计数)的2’-修饰是2’-OMe而非2’-MOE。ASO13是测试制品，其中核苷酸10与11之间的键联是iMOP(显示于核酸I-3中)而非PS。ASO13的剩余部分与ASO12相同。
使用上文寡核苷酸使用0.2ml剂量体积皮下治疗雌性CD-1IGS小鼠(6至8周龄)。施用的剂量基于RNA重量为0.5或3mg/kg且配制于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。5天后，通过CO2将动物安乐死，并通过心脏穿刺放血。使用4mm直径一次性穿刺活检收集肾脏样品并使用RNAlaterTM溶液固定24h。使用5mm钢珠将组织样品均质于TrizolTM试剂中，并使用MagMAXTM系统使用制造商的推荐分离总RNA。利用标准工业方法自总RNA产生cDNA(单链合成)，且所述cDNA用作TaqManTM定量实时PCR(qRT-PCR)的基质以定量检测SGLT2 mRNA。使用标准ddCt方法计算相对SGLT2 mRNA，并将其标准化为Ppib mRNA作为为参考基因。
图2证实相比于图1中所示的磷酸二酯置换，在SGLT2 ASO中用iMOP键联置换PS键联大体上维持体内mRNA KD活性，ED50为约0.5mpk。2’-OMe实验对照(ASO12)显示与基准(ASO)相等的效价。所有三种寡核苷酸ASO、ASO12和ASO13均显示剂量依赖性活性。
实施例9.在SGLT2 ASO主链中用iMOP和iMeMOP置换硫磷酸酯键联的影响。
在图3中，ASO是SGLT2基准ASO。ASO14是PO对照，其中核苷酸10与11之间的键联是磷酸二酯键联且核苷酸11是2’-OMe。ASO12是PS对照，其中所有键联均为PS且核苷酸11是2’-OMe。ASO13是iMOP测试制品，其中核苷酸10与11之间的键联是iMOP(显示于核酸I-3中)而非PS。ASO15是iMeMOP测试制品，其中核苷酸10与11之间的键联是iMeMOP(显示于核酸I-6中)而非PS。
将上文描述的测试制品溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并以0.5mg/kg皮下注射至雌性CD-1小鼠内。在注射PBS或测试制品后7天收获组织样品。然后使用TissueLyser II(Qiagen,Valencia,CA)将组织样品均质于QIAzol Lysis试剂中。然后使用MagMAXTechnology根据制造商说明书(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)纯化RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)制备cDNA。使用小鼠特异性SGLT2引物(Integrated DNA Technology,Coralville,IA)在CFX384实时PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)上进行PCR。
图3中的结果证实与完全PS基准ASO的活性相比，在SGLT2ASO中用iMeMOP置换PS核苷酸间键联完全维持mRNA KD活性。所述基准ASO(ASO)和PS对照(ASO12)显示类似敲低活性，ED50为<0.5mpk。PO对照(ASO14)失去大部分敲低活性(ED50>0.5mpk)。iMOP(ASO13)维持一些敲低活性(ED50约0.5mpk)，其类似于图2中所示的结果。
实施例10.在GalXC分子中的反义链的5’端的iMOP键联的影响。
在图4中，GalXC1是在反义链的5’端的核苷酸1与2之间具有PS键联中的一者的对照GalXC分子。GalXC2是用iMOP键联置换反义链的5’端PS键联的GalXC分子。所述分子的剩余部分与对照相同。
将测试核酸溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并以0.5mg/kg皮下注射至雌性CD-1小鼠内。在注射PBS或测试核酸后7天收获组织样品。然后使用TissueLyser II(Qiagen,Valencia,CA)将组织样品均质在QIAzol Lysis试剂中。然后使用MagMAX Technology根据制造商说明书(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)纯化RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)以制备cDNA。使用小鼠特异性ALDH2引物(Integrated DNA Technology,Coralville,IA)在CFX384实时PCR检测系统(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA)上进行PCR。
图4中的结果证实用衍生自于GalXC分子中的反义链的5’端的核酸I-9的GalXC2中的4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联置换GalXC1中的PS核苷酸间键联维持体内mRNA KD活性。
实施例11.在SGLT2 ASO主链的GAP 2位置上用iMOP置换硫磷酸酯键联。
在图5中，ASO是SGLT2基准ASO。ASO4是实验PO对照，其与所述基准的唯一差异在于核苷酸4与5(自5’端计数)之间的键联是核苷酸间磷酸二酯(PO)而非硫磷酸酯(PS)键联。ASO18是测试制品，其中核苷酸4与5之间的键联是iMOP(显示于核酸I-12中)而非PS。ASO19是iMeMOP测试制品，其中核苷酸4与5之间的键联是iMeMOP(显示于核酸I-15中)而非PS。
将上文描述的测试制品溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并以0.5mg/kg皮下注射至雌性CD-1小鼠内。在注射PBS或测试制品后5天收获组织样品。(除测试制品ASO*组外，其样品在另一实验中在注射后7天收获)。然后使用TissueLyser II(Qiagen,Valencia,CA)将组织样品均质于QIAzol Lysis试剂中。然后使用MagMAX Technology根据制造商说明书(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)纯化RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)以制备cDNA。使用小鼠特异性SGLT2引物(Integrated DNA Technology,Coralville,IA)在CFX384实时PCR检测系统(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA)上进行PCR。
图5中的结果证实与完全PS基准ASO的活性相比，在SGLT2ASO中用iMOP(ASO18)或iMeMOP(ASO19)置换PS核苷酸间键联大体上维持体内mRNA KD活性。两种ASO的ED50均为约0.5mpk。所述基准ASO(ASO)显示敲低活性，ED50为<0.5mpk。PO对照(ASO4)失去大部分敲低活性(ED50>0.5mpk)。
实施例12.去污溶酶体稳定性
为评估具有体外核苷酸间修饰的化合物的代谢稳定性，在大鼠肝脏去污溶酶体(酸性磷酸酶活性)(Sekisui Xenotech,Kansas City,KS)中在38℃下孵育约4μM测试化合物及其对应的对照化合物。所述大鼠肝脏去污溶酶体是来自已用Triton WR 1339(还称为泰洛沙泊(Tyloxapol))处理的大鼠肝脏细胞的溶酶体。孵育的测试化合物及其相应对照化合物是在不同预定时间点下自孵育去污溶酶体收集并接着使用96孔/100mg
Figure BDA0003847035450001411
OTXTM匣SPE板(Phenomenex,Torrance,CA)和96孔板真空歧管根据制造商的说明书自溶酶体基质提取。洗脱液使用
Figure BDA0003847035450001412
(Biotage,Charlotte,NC)溶剂蒸发装置蒸发并重溶于水中且经由LC-MS分析。
使用ACQUITY
Figure BDA0003847035450001413
仪器(Waters公司，Milford,MA)以0.4mL/min递送含有缓冲添加剂的流动相，色谱分离使用ACQUITY
Figure BDA0003847035450001421
寡核苷酸BEH C18柱1.7μm粒度逆相超高效液相色谱法(2.1x 50mm)柱(Waters公司，Milford,MA)完成。将柱温度维持在70℃且样品注射体积为8μL。使用在负离子模式和电喷雾电离(ESI)条件下操作的
Figure BDA0003847035450001422
G2S高分辨率飞行时间质谱仪(HRMS,Waters公司，Milford,MA)以检测对照、测试化合物及其代谢物。零电荷状态分子离子质量经由电荷状态反卷积使用PROMASS DECONVOLUTIONTM软件(Novatia,Newtown,PA)获得。通过比较实验测定的质量和预期的理论分子量识别对照、测试化合物及其代谢物。
为评估iMOP键联在GalXC分子情况下的代谢稳定性，在上文描述的去污溶酶体测定中测试图4中所示的两种化合物。GalXC1是在反义链的5’端的核苷酸1与2之间具有PS键联的GalXC分子。GalXC2是用iMOP键联置换所述反义链的5’端PS键联的GalXC分子。
在24小时孵育周期内，在测试核酸的iMOP键联上未观测到裂解产物。表2中的数据表明与具有PS键联的对照反义链相比，含有iMOP核苷酸间键联的反义链显示经改善的整体代谢稳定性。自所述反义链的3’端观测到主要代谢物(数据未显示)。
表2.用大鼠去污溶酶体孵育后残余的全长反义链百分比
测试制品 0h 1h 2h 4h 8h 24h
GalXC1 100 102 104 85 56 25
GalXC2 100 88 86 82 73 49
为评估iMOP和iMeMOP键联在ASO平台情况下的代谢稳定性，在上文描述的去污溶酶体测定中测试图3中所示的测试制品。如表3中所示，与亲代对照和2’OMe PS对照相比，具有iMOP或iMeMOP键联的测试制品显示类似的代谢稳定性。核苷酸10与11之间的键联是磷酸二酯键联(ASO14)的PO对照显示最低稳定性。图6以图表形式显示表3的结果。
表3.用大鼠去污溶酶体孵育后残余的全长反义链百分比
Figure BDA0003847035450001431
实施例13.iMOP和iMeMOP修饰对双螺旋稳定性的影响
SGLT2 ASO和RNA1(经设计以完全沃森-克里克互补性结合至SGLT2 ASO的12merRNA)的双螺旋形成和融化通过紫外线(UV)光谱以及在配备帕耳帖温度控制器的AgilentCary 3500UV-VIS分光光度计上监测。双螺旋浓度为2μM(4μM总浓度的链)于PBS(磷酸盐缓冲盐水)(1X,pH 7.4)中。加热至90℃后，将样品缓慢冷却至室温并冷藏过夜。然后将样品转移至分光光度计的冷光析管内且一经以0.5℃/min的速率自5℃加热至90℃，即监测260nm下的吸光度的变化。当低于20℃时，将样品保持在流动氮下，且每隔30秒记录吸光度值。使用基线法计算Tm值并显示于图7中。
ASO是完全硫磷酸化SGLT2基准ASO。ASO14是所述基准的PO对照且在核苷酸10与11之间具有磷酸二酯键联。ASO13是iMOP测试制品，其中核苷酸10与11之间的键联是iMOP而非PS。ASO15是iMeMOP测试制品，其中核苷酸10与11之间的键联是iMeMOP而非PS。结果指示当结合至互补RNA1时，ASO14显示最高热稳定性。结果还指示用新颖iMeMOP或iMOP修饰置换PS核苷酸间键联维持ASO:RNA双螺旋热稳定性，而并入iMeMOP在-1℃下轻微失稳(参见图6中的ASO15:RNA1)，并入iMOP在+1.5℃下稳定(参见图7中的ASO13:RNA1)。
实施例14.iMOP和iMeMOP修饰对RNA酶H活性的影响
已知RNA酶H酶消化ASO:RNA杂合体的RNA部分，而ASO链仍未受影响。当并入ASO时，为监测核苷酸间键联修饰在诱发RNA酶H活性中的功效，使经iMOP和iMeMOP修饰的ASO与互补RNA杂合并测试其对由人RNA酶H裂解的敏感性。裂解反应是使用高分辨率LC-MS方法而非经典电泳方法监测。分析产生的RNA片段的质量峰可确定RNA上的精确裂解位点，而在LC光谱上定量对应于RNA片段和/或残余的全长RNA的峰面积允许比较由不同ASO诱导的裂解反应动力学(图8)。
设计长32个核苷酸的RNA链(RNA2)，其含有与SGLT2 12mer ASO完全互补的12个核苷酸段。将每个ASO退火至互补体RNA提供双螺旋基质(ASO15:RNA2、ASO13:RNA2和ASO:RNA2)。ASO是SGLT2基准ASO，其中所有键联均为PS。ASO13是iMOP测试制品，其中核苷酸10与11之间的键联是iMOP而非PS。ASO15是iMeMOP测试制品，其中核苷酸10与11之间的键联是iMeMOP而非PS。
一般而言，将2nmol每个反义寡核苷酸与1nmol RNA混合于1X RNA酶H反应缓冲剂(50mM Tris-HCl、75mM KCl、3mM MgCl2和10mM DTT，在pH 8.3下)中。在90℃下将样品加热5分钟并缓慢冷却至室温以使得形成双螺旋基质。每个退火溶液均由相对于RNA 2倍过量的AON制成，以确保所有RNA与ASO杂合且游离RNA不存在于溶液中。接着，将100μL等分试样转移至玻璃总回收MS小瓶内并在LC-MS样品保持器中在20℃(测定温度)下保持1分钟。选择的测定温度远低于ASO:RNA杂合体的热熔化温度以进一步确保所有RNA均与ASO杂合。孵育1分钟后，在Waters Synapt高分辨率LC-MS上分析ASO:RNA双螺旋基质，针对0时间点产生光谱。
然后通过在1X RNA酶H缓冲剂中添加2μL 0.25U新鲜稀释的大肠杆菌RNA酶H酶引发RNA裂解反应。在冰上处理酶以避免任何活性损失。通过移液轻轻混合所述混合物并在LC-MS上在添加酶后30sec、15min、30min和45min时间点下监测RNA裂解。用于此类测定的0.25U最佳RNA酶H浓度选自一是列初步酶稀释物(10U、5U、1U、0.5U和0.25U)。在0.25U下，RNA的消化是缓慢的，如图8中所示，允许计算和比较裂解速率。在每个时间点下，通过在所述时间点下定量对应于残余的全长RNA的LC峰面积，计算转化为裂解产物的RNA的分数。如图8中所示，结果指示在SGLT2 ASO序列中用iMeMOP或iMOP置换PS核苷酸间键联以与SGLT2基准的裂解速率相当的裂解速率完全维持RNA酶H活性。
尽管本文已描述本发明的许多实施方案，但显而易见可改变本文提供的基本实例以提供利用本发明的核酸或其类似物和方法的其他实施方案。因此，应了解本发明的范围由本说明书和随附权利要求书定义，而非由已借助于实例表示的特定实施方案定义。

Claims (34)

1.一种核酸或其类似物，其包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I表示：
Figure FDA0003847035440000011
或其药学上可接受的盐，其中：
B是核碱基或氢；
R1和R2独立地是氢、卤素、R5、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或：
相同碳上的R1和R2连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和环；
每个R独立地是氢、合适的保护基、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环，或：
相同原子上的两个R基团连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4至7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
R3是氢、合适的保护基、合适的前药、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
每个R4独立地是氢、合适的前药、R5、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-OP(O)R2、-OP(O)(OR)2、-OP(O)(OR)NR2、-OP(O)(NR2)2-、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R、-N(R)P(O)R2、-N(R)P(O)(OR)2、-N(R)P(O)(OR)NR2、-N(R)P(O)(NR2)2、-N(R)S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；
每个R5独立地是任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
X1是O、S或NR；
X2是-O-、-S-、-B(H)2-或共价键；
X3是-O-、-S-、-Se-或-N(R)-；
Y1是附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2′或3′端的连接基团；
Y2是氢、保护基、亚磷酰胺类似物、附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的4′或5′端的核苷酸间连接基团、或附接至固体支持物的连接基团；
Z是-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2-；并且
n是0、1、2、3、4或5。
2.根据权利要求1所述的核酸或其类似物，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联选自代表式中的任一者：
Figure FDA0003847035440000031
Figure FDA0003847035440000041
或其药学上可接受的盐，其中：
Y3是附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2′或3′端的连接基团；并且
Y4是氢、保护基、亚磷酰胺类似物、附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的4′-或5′端的核苷酸间连接基团、或附接至固体支持物的连接基团。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的核酸或其类似物，其中所述核酸或其类似物选自下式中的任一者：
Figure FDA0003847035440000042
Figure FDA0003847035440000051
或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸或其类似物，其中R1是氢且R2是氢或甲基。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸或其类似物，其中每个R4独立地是氢、羟基、氟、甲氧基或
Figure FDA0003847035440000061
6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸或其类似物，其中每个B选自
Figure FDA0003847035440000062
Figure FDA0003847035440000063
7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸或其类似物，其中所述核酸或其类似物选自表1中所绘示的那些中的任一者、或其药学上可接受的盐。
8.根据权利要求1所述的核酸或其类似物，其中所述核酸或其类似物是包含第一链和第二链的双链RNAi抑制剂分子，其中所述第一链是正义链且所述第二链是反义链。
9.根据权利要求8所述的核酸或其类似物，其中所述双链RNAi抑制剂分子包含在所述正义链与所述反义链之间具有15至45个核苷酸的互补区。
10.根据权利要求9所述的核酸或其类似物，其中在所述正义链与所述反义链之间的所述互补区是20至30个核苷酸。
11.根据权利要求10所述的核酸或其类似物，其中在所述正义链与所述反义链之间的所述互补区是21至26个核苷酸。
12.根据权利要求9所述的核酸或其类似物，其中在所述正义链与所述反义链之间的所述互补区是19至24个核苷酸。
13.根据权利要求12所述的核酸或其类似物，其中在所述正义链与所述反义链之间的所述互补区是19至21个核苷酸。
14.根据权利要求8所述的核酸或其类似物，其中所述双链RNAi抑制剂分子含有四环。
15.根据权利要求1所述的核酸或其类似物，其中所述核酸或其类似物是单链核酸。
16.根据权利要求15所述的核酸或其类似物，其中所述单链核酸是单链RNAi抑制剂分子。
17.根据权利要求15所述的核酸或其类似物，其中所述单链核酸是常规反义核酸、核酶或适体。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的核酸或其类似物，其中所述单链RNAi抑制剂分子的长度是14至50个核苷酸。
19.根据权利要求18所述的核酸或其类似物，其中所述单链RNAi抑制剂分子的长度是约16至30、18至22、或20至22个核苷酸。
20.根据权利要求1所述的核酸或其类似物，其中所述核酸或其类似物是裸核酸。
21.根据权利要求1所述的核酸或其类似物，其还包含至少一种递送剂，其中所述至少一种递送剂缀合至所述核酸或其类似物以促进运输所述核酸或其类似物跨越细胞的外膜。
22.根据权利要求1所述的核酸或其类似物，其中所述递送剂选自由糖类、肽、脂质、维生素和抗体组成的组。
23.根据权利要求1所述的核酸或其类似物，其中所述递送剂选自N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、甘露糖-6-磷酸、半乳糖、寡糖类、多糖类、胆固醇、聚乙二醇、叶酸盐、维生素A、维生素E、石胆酸和阳离子脂质。
24.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的核酸或其类似物、和药学上可接受的载剂、佐剂或媒介物。
25.一种用于减少靶基因在有需要的受试者中的表达的方法，其包括向所述受试者施用足以减少所述靶基因表达的量的如权利要求24所述的药物组合物。
26.一种用于治疗有需要的受试者的癌症、病毒感染或遗传病症的方法，其包括向所述受试者施用足以治疗所述癌症、病毒感染或遗传病症的量的如权利要求24所述的药物组合物。
27.根据权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述施用包括全身施用。
28.一种用于制备包含4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联的核酸或其类似物的方法，其中所述4′-O-亚甲基膦酸酯核苷酸间键联由式I-c表示：
Figure FDA0003847035440000081
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式A4核酸或其类似物：
Figure FDA0003847035440000091
或其药学上可接受的盐，和
(b)缩合式A4核酸或其类似物与式A5核苷或其类似物：
Figure FDA0003847035440000092
以形成包含式I-b的核酸或其类似物，其中：
每个B是核碱基或氢；
PG是合适的羟基保护基；
R1和R2独立地是氢、卤素、R5、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或：
相同碳上的R1和R2连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和环；
每个R独立地是氢、合适的保护基、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环，或：
相同原子上的两个R基团连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4至7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
R3是氢、合适的保护基、合适的前药、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
每个R4独立地是氢、合适的前药、R5、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-OP(O)R2、-OP(O)(OR)2、-OP(O)(OR)NR2、-OP(O)(NR2)2-、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R、-N(R)P(O)R2、-N(R)P(O)(OR)2、-N(R)P(O)(OR)NR2、-N(R)P(O)(NR2)2、-N(R)S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；
每个R5独立地是任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
X1是O、S或NR；
每个X2独立地是-O-、-S-、-B(H)2-或共价键；
X3是-O-、-S-、-Se-或-N(R)-；
Y2是氢、保护基、亚磷酰胺类似物、附接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的4′或5′端的核苷酸间连接基团、或附接至固体支持物的连接基团；
每个Z独立地是-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2-；并且
每个n独立地是0、1、2、3、4或5。
29.如权利要求27所述的方法，其中Y2是保护基。
30.如权利要求29所述的方法，其还包括制备式I-d核酸的步骤：
Figure FDA0003847035440000111
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含式I-c核酸或其类似物：
Figure FDA0003847035440000112
或其药学上可接受的盐，并且
(b)将所述包含式I-c的核酸或其类似物去保护以形成包含式I-d的核酸或其类似物，其中：
每个B是核碱基或氢；
PG是合适的羟基保护基；
PG1是保护基；
R1和R2独立地是氢、卤素、R5、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或：
相同碳上的R1和R2连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和环；
每个R独立地是氢、合适的保护基、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环，或：
相同原子上的两个R基团连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4至7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
R3是氢、合适的保护基、合适的前药、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
每个R4独立地是氢、合适的前药、R5、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-OP(O)R2、-OP(O)(OR)2、-OP(O)(OR)NR2、-OP(O)(NR2)2-、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R、-N(R)P(O)R2、-N(R)P(O)(OR)2、-N(R)P(O)(OR)NR2、-N(R)P(O)(NR2)2、-N(R)S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；
每个R5独立地是任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
X1是O、S或NR；
每个X2独立地是-O-、-S-、-B(H)2-或共价键；
X3是-O-、-S-、-Se-或-N(R)-；
每个Z独立地是-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2-；并且
每个n独立地是0、1、2、3、4或5。
31.如权利要求30所述的方法，其还包括制备式I-e核酸或其类似物的步骤：
Figure FDA0003847035440000131
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式I-d核酸或其类似物：
Figure FDA0003847035440000132
(b)使所述式I-d核酸或其类似物与P(III)形成试剂反应以形成式I-e核酸或其类似物，其中：
每个B是核碱基或氢；
PG是合适的羟基保护基；
R1和R2独立地是氢、卤素、R5、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或：
相同碳上的R1和R2连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和环；
每个R独立地是氢、合适的保护基、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环，或：
相同原子上的两个R基团连同其中间原子一起形成具有0至3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4至7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
R3是氢、合适的保护基、合适的前药、或任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
每个R4独立地是氢、合适的前药、R5、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-OP(O)R2、-OP(O)(OR)2、-OP(O)(OR)NR2、-OP(O)(NR2)2-、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R、-N(R)P(O)R2、-N(R)P(O)(OR)2、-N(R)P(O)(OR)NR2、-N(R)P(O)(NR2)2、-N(R)S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；
每个R5独立地是任选经取代的选自以下的基团：C1-6脂族、苯基、具有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4至7元饱和或部分不饱和杂环、和具有1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5至6元杂芳基环；
E是卤素或-NR2；
X1是O、S或NR；
每个X2独立地是-O-、-S-、-B(H)2-或共价键；
X3是-O-、-S-、-Se-或-N(R)-；
每个Z独立地是-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2-；并且
每个n独立地是0、1、2、3、4或5。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其中每个R1是氢且R2是氢或甲基。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的方法，其中每个R4独立地是氢、羟基、氟、甲氧基或
Figure FDA0003847035440000151
34.根据权利要求28至33中任一项所述的方法，其中每个B选自
Figure FDA0003847035440000152
Figure FDA0003847035440000153
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