CN116615542A - 寡核苷酸的全身递送 - Google Patents

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CN116615542A
CN116615542A CN202180068029.1A CN202180068029A CN116615542A CN 116615542 A CN116615542 A CN 116615542A CN 202180068029 A CN202180068029 A CN 202180068029A CN 116615542 A CN116615542 A CN 116615542A
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Abstract

本公开提供了用以促进寡核苷酸的全身递送的寡核苷酸‑配体缀合物，所述寡核苷酸经设计以防止、限制或调节mRNA分子的表达。所述缀合物包含与脂质缀合物部分或金刚烷基连接的核苷酸。

Description

寡核苷酸的全身递送
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月4日提交的美国临时专利申请第63/060,715号和2021年2月2日提交的美国临时专利申请第63/144,603号的优先权，所述临时专利申请的全部内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及核酸-疏水性配体缀合物和寡核苷酸-疏水性配体缀合物。特定而言，本公开涉及核酸-脂质缀合物和寡核苷酸-脂质缀合物，其制备方法，其化学构型，和适用于根据本文所提供的说明书使用缀合的核酸和寡核苷酸调节细胞中靶基因的表达的方法。本公开还提供了包含本说明书的缀合物的药学上可接受的组合物，和使用所述组合物治疗各种病症的方法。
发明背景
经修饰的核酸对基因表达的调控显示出作为实验室中的研究工具和临床中的治疗方法的极大潜力。若干种类的基于寡核苷酸或核酸的治疗剂已在临床研究中，包括反义寡核苷酸(ASO)、短干扰RNA(siRNA)、双链核酸(dsNA)、适体、核酶、外显子跳跃或剪接改变寡核苷酸、mRNA和CRISPR。化学修饰在克服寡核苷酸治疗剂所面临的障碍中起关键作用，包括改进核酸酶稳定性、RNA结合亲和力和寡核苷酸的药物动力学特性。在过去三十年中已开发用于寡核苷酸的各种化学修饰策略，包括糖、核碱基和磷酸二酯主链的修饰(Deleavey和Darma,CHEM.BIOL.2012,19(8):937-54；Wan和Seth,J.MED.CHEM.2016,59(21):9645-67；以及Egli和Manoharan,ACC.CHEM.RES.2019,54(4):1036-47)。
基于siRNA或双链核酸(dsNA)的治疗剂已成功地用作减少肝脏中特异性靶基因的表达的有效方式。因此，这些RNAi剂独特地适用于调节靶基因表达的若干治疗、诊断和研究应用。
阻止广泛临床使用的障碍之一是将完整siRNA有效递送至肝脏以外的能力。因此，在本领域中持续需要在肝脏外部成功递送新型和有效的RNAi剂以调节各种组织中靶基因的表达。
本公开旨在通过设计用于全身递送的包含疏水性配体的新颖寡核苷酸缀合物来克服这种障碍。
发明内容
本申请涉及包含疏水性配体的新颖核酸、寡核苷酸或其类似物，包括但不限于金刚烷基和脂质缀合物。本公开涉及用以调节细胞中靶基因的表达的核酸-脂质缀合物和寡核苷酸-脂质缀合物，以及其制备方法和用途。亲脂性/疏水性部分，例如脂肪酸和金刚烷基，当连接至这些高度亲水性核酸/寡核苷酸时，可基本上增强血浆蛋白结合并因此提高循环半衰期。本文所提供的缀合的核酸、寡核苷酸和其类似物是稳定的并结合至RNA靶标以引起广泛肝外RNase H活性并且还适用于剪接转换和RNAi。例如脂质的疏水性部分的并入促进将新颖核酸、寡核苷酸或其类似物全身递送至若干组织中，所述组织包括但不限于CNS、肌肉、脂肪和肾上腺。
合适的核酸-疏水性配体缀合物和寡核苷酸-疏水性配体缀合物包括核酸抑制剂分子，例如dsRNA抑制剂分子、dsRNAi抑制剂分子、反义寡核苷酸、miRNA、核酶、安塔够妙(antagomir)、适体和单链RNAi抑制剂分子。特别是，本公开提供了可用作细胞内RNA水平的调节剂的核酸-脂质缀合物、寡核苷酸-脂质缀合物和其类似物。核酸抑制剂分子可经由一组不同机制，例如通过RNA干扰(RNAi)来调节RNA表达。本文所提供的核酸-疏水性配体缀合物、寡核苷酸-疏水性配体缀合物和其类似物的优点在于可能存在大范围的药理活性，与细胞内RNA水平的调节一致。另外，本说明书提供了使用有效量的本文所述的缀合物通过调节细胞内RNA水平来治疗或改善疾病状况的方法。
现已发现，本公开的核酸-疏水性配体缀合物和其药学上可接受的组合物可有效作为细胞内RNA水平的调节剂。包含一个或多个脂质缀合物的此类核酸-脂质缀合物由式I或Ia表示：
或其药学上可接受的盐，其中每个变量如本文定义和描述。
在一些实施方案中，所述核酸-脂质缀合物由式I-b、I-c、I-Ib、I-Ic、I-d或I-e、I-Id或I-Ie表示：
或其药学上可接受的盐，其中每个变量如本文定义和描述。
在另一方面，本公开提出了由式II或II-a表示的寡核苷酸-配体缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中每个变量如本文定义和描述。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸-脂质缀合物由式II-b、II-c、II-Ib、II-Ic、II-d、II-e、II-Id或II-Ie表示：
或其药学上可接受的盐，其中每个变量如本文定义和描述。
本公开的寡核苷酸-配体缀合物包含一个或多个由以下任一者表示的核酸-配体缀合物单元：式I、I-a、I-b、I-c、I-Ib、II-Ic、I-d、I-e、I-Id、I-Ie、II、II-a、II-b、II-c、II-Ib、II-Ic、II-d、II-e、II-Id或II-Ie。
本公开的核酸-配体缀合物和寡核苷酸-配体缀合物和其药学上可接受的组合物可用于治疗与调控细胞内RNA水平相关的多种疾病、病症或疾患。此类疾病、病症或疾患包括本文所述的那些。本文公开了这些核酸-配体缀合物和寡核苷酸-脂质缀合物的制造方法和递送方法。
本公开所提供的核酸-配体缀合物和寡核苷酸-配体缀合物还可用于生物和病理现象中基因表达的研究；身体组织中RNA水平的研究；以及体外或体内新RNA干扰剂的比较性评价。本文所公开的核酸-配体缀合物和寡核苷酸-配体缀合物可用于降低靶基因的表达。
附图说明
图1显示在单次15mg/kg静脉内注射GalXC脂质缀合物之后第5天不同组织中ALDH2mRNA的基因沉默。
图2显示通过单次静脉内注射双链体1c(C22)，在给药之后第6天和第14天，肝外组织中ALDH2 mRNA的基因沉默的剂量反应效应。
图3显示在15mg/kg单次皮下给药之后，不同组织中双链体1c(C22)的持久ALDH2沉默活性。
图4显示在15mg/kg单次皮下给药之后，肝外组织中GalXC二酰基脂质缀合物双链体1h(二酰基C16)、1i(二酰基C18:1)、1j(PEG2K-二酰基C18)和单脂质缀合物双链体1b(C18)的基因沉默活性。
图5显示在15mg/kg单次皮下给药之后第7天和第14天，不同组织中GalXC长脂质缀合物双链体1d(C24)、1e(C26)、1g(C24:1)和金刚烷缀合物双链体5b(3X乙酰基金刚烷)的基因沉默活性。
图6显示在15mg/kg这些GalXC脂质缀合物的单次皮下给药之后第7天和第14天，不同组织中ALDH2 mRNA水平的基因沉默。
具体实施方式
1.核酸-配体缀合物：
所公开的新颖核酸-配体缀合物引起广泛肝外RNAi活性。脂质部分的并入促进将核酸或其类似物全身递送至若干组织，例如CNS、肌肉、脂肪和肾上腺中。
本公开的核酸-配体缀合物和其组合物可用作RNA干扰剂。在一些实施方案中，所提供的核酸-配体缀合物或其类似物抑制细胞中的基因表达。
在第一个实施方案中，本公开提供了由式I表示的核酸-脂质缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
B是核碱基或氢；
R1和R2独立地是氢、卤素、RA、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或者：
同一碳上的R1和R2与其间插原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3元饱和或部分不饱和环；
每个RA独立地是任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
每个R独立地是氢、合适的保护基，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环，或者：
同一原子上的两个R基团与其间插原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4-7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
LA独立地是PG1或-L-配体；
PG1是氢或合适的羟基保护基；
每个配体独立地是-(LC)n或金刚烷基；
每个LC独立地是包含饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链的脂质缀合物部分，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替；
每个-Cy-独立地是任选地被取代的选自以下的二价环：亚苯基，8-10元双环亚芳基，4-7元饱和或部分不饱和亚碳环基，4-11元饱和或部分不饱和螺亚碳环基，8-10元双环饱和或部分不饱和亚碳环基，亚金刚烷基，具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-11元饱和或部分不饱和螺亚杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的8-10元双环饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元亚杂芳基，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环亚杂芳基；
n是1-10；
L是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-N(R)-C(O)-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-、-V1CR2W1-或代替；
m是1-50；
X1、V1和W1独立地是-C(R)2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或-NR-；
Z是-O-、-S-、-NR-或-CR2-；并且
PG2是氢、亚磷酰胺类似物或合适的保护基。
在第二个实施方案中，第一个实施方案的核酸-配体缀合物由式I-a表示：
在第三个实施方案中，第一个实施方案的核酸-配体缀合物由式I-b或I-c表示：
或其药学上可接受的盐；其中
L1是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替；
R4是氢、RA或合适的胺保护基；并且
R5是金刚烷基，或饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
在第四个实施方案中，所述核酸-配体缀合物由式I-d或I-e表示：
或其药学上可接受的盐；其中
B是核碱基或氢；
PG1和PG2独立地是氢、亚磷酰胺类似物或合适的保护基；并且
R5是金刚烷基，或饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
V是选自-O-、-S-和-NR-的二价基团；
W是选自以下的二价基团：-O-、-S-、-NR-、-C(O)NR-、-OC(O)NR-、-SC(O)NR-、
L2是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替；
m是1-50；
X1是-C(R)2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或-NR-；
R4是氢、RA或合适的胺保护基；并且
R5是金刚烷基，或饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替；
每个RA独立地是任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
每个R独立地是氢、合适的保护基，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环。
在第五个实施方案中，第四个实施方案的核酸-配体缀合物，其中：
V是-O-；
L2是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)-、-代替；
R4是氢；
w是-O-、-NR-、-C(O)NR-、-OC(O)NR并且
R5是饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-或-C(O)O-代替。
在第六个实施方案中，核酸-配体缀合物由式I-Ib或I-Ic表示：
或其药学上可接受的盐；其中
B是核碱基或氢；
m是1-50；
PG1和PG2独立地是氢、亚磷酰胺类似物或合适的保护基；并且
R5是金刚烷基，或饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替；并且
每个R独立地是氢、合适的保护基，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环。
在第七个实施方案中，第六个实施方案的核酸-配体，其中R5选自
在一些实施方案中，寡核苷酸-配体缀合物包含由式I、I-a、I-b、I-c、I-d、I-e、I-Ib或I-Ic中的任一者表示的上文所公开的第一个至第七个实施方案中的任一者的一个或多个核酸-缀合物单元。
在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸-配体缀合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核酸-配体缀合物单元。在一些实施方案中，所述缀合物包含1个核酸-配体缀合物单元。在一些实施方案中，所述缀合物包含2个核酸-配体缀合物单元。在一些实施方案中，所述缀合物包含3个核酸-配体缀合物单元。
2.寡核苷酸-配体缀合物：
所公开的新颖寡核苷酸-配体缀合物引起广泛肝外RNase H活性。疏水性部分，例如金刚烷基或脂质部分的并入促进将寡核苷酸或其类似物全身递送至若干组织，例如CNS、肌肉、脂肪和肾上腺中。
本公开的寡核苷酸-配体缀合物和其组合物可用作RNA干扰剂。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸-配体缀合物或其类似物抑制细胞中的基因表达。
本公开的另一方面提供了包含核酸-配体缀合物的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含长度为15至30个核苷酸的反义链和一个或多个配体部分。在一些实施方案中，配体部分独立地是金刚烷基或脂质部分。在一些实施方案中，反义链具有与靶基因序列互补的区域。在一些实施方案中，互补区域的长度为至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少21个连续核苷酸。在一些实施方案中，反义链的长度为19至27个核苷酸。在一些实施方案中，反义链的长度为21至27个核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸还包含长度为10至53个核苷酸的有义链，其中有义链与反义链形成双链体区域，并且脂质部分连接至有义链。在一些实施方案中，有义链的长度为12至40个核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度为15至40个核苷酸。在一些实施方案中，双链体区域的长度为至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少21个核苷酸。在一些实施方案中，与靶序列互补的区域的长度为至少19个连续核苷酸。在一些实施方案中，有义链在其3'端包含如下所示的茎环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环。在一些实施方案中，脂质部分连接至环L。
本公开的第八个实施方案公开了寡核苷酸-配体缀合物，所述寡核苷酸-配体缀合物包含一个或多个由式II表示的核酸-配体缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
B是核碱基或氢；
R1和R2独立地是氢、卤素、RA、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；或者
同一碳上的R1和R2与其间插原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3-7元饱和或部分不饱和环；
每个RA独立地是任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
每个R独立地是氢、合适的保护基，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；或者
同一原子上的两个R基团与其间插原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4-7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
配体独立地是-(LC)n或金刚烷基；
每个LC独立地是包含饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链的脂质缀合物部分，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-代替；
每个-Cy-独立地是任选地被取代的选自以下的二价环：亚苯基，8-10元双环亚芳基，4-7元饱和或部分不饱和亚碳环基，4-11元饱和或部分不饱和螺亚碳环基，8-10元双环饱和或部分不饱和亚碳环基，具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-11元饱和或部分不饱和螺亚杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的8-10元双环饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元亚杂芳基，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环亚杂芳基；
n是1-10；
L是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-N(R)-C(O)-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-、-V1CR2W1-或代替；
m是1-50；
X1、V1和W1独立地是-C(R)2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或-NR-；
Y是氢、合适的羟基保护基、
R3是氢、合适的保护基、合适的前药，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
X2是O、S或NR；
X3是-O-、-S-、-BH2-或共价键；
Y1是连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2'或3'末端的键联基团；
Y2是氢，合适的保护基，亚磷酰胺类似物，连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的5'末端的核苷酸间键联基团，或连接至固体支撑物的键联基团；并且
Z是-O-、-S-、-NR-或-CR2-。
第九个实施方案公开了寡核苷酸-配体缀合物，其中第八个实施方案的缀合物由式II-a或II-a-1表示
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、Y、L、LC、n和Z中的每一者如上文所定义。
一些实施方案公开了寡核苷酸-配体缀合物，其中X1是-O-，Y2是亚磷酰胺并且连接性和立体化学如式II-a1所示：
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、Y、L、LC、n和Z中的每一者如上文所定义。
一些实施方案公开了寡核苷酸-配体缀合物，其中X1是-O-，Y2是磷酸酯互连基团，并且连接性和立体化学如式II-a2所示：
/>
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、Y、L、LC、n和Z中的每一者如上文所定义。
第十个实施方案公开了上文所公开的寡核苷酸-配体缀合物实施方案中的任一者的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述缀合物由式II-b或II-c表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
L1是共价键、单价或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替；
R4是氢、RA或合适的胺保护基；并且
R5是金刚烷基，或饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
第十一个实施方案公开了第八个实施方案的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述缀合物由式II-d或II-e表示：
或其药学上可接受的盐；
V是选自-O-、-S-和-NR-的二价基团；
W是选自以下的二价基团：-O-、-S-、-NR-、-C(O)NR-、-OC(O)NR-、-SC(O)NR-、
L2是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替；
R4是氢、RA或合适的胺保护基；并且
R5是饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
第十二个实施方案公开了由式II-Id或II-Ie表示的寡核苷酸-配体缀合物：
或其药学上可接受的盐；其中：
m是1-50；
B是H或核碱基；
X1是-C(R)2-、-OR、-O-、-S-或-NR-；
每个R独立地是氢、合适的保护基，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
w是选自以下的二价基团：-O-、-S-、-NR-、-C(O)NR-、-OC(O)NR-、
L2是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替；
Y是氢、/>
R3是氢或合适的保护基、合适的前药，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
X2是O或S；
X3是-O-、-S-或共价键；
Y1是连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2'或3'末端的键联基团；
Y2是氢，亚磷酰胺类似物，连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的5'末端的核苷酸间键联基团，或连接至固体支撑物的键联基团；并且
R5是金刚烷基，或饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
第十三个实施方案公开了第十一个实施方案的寡核苷酸-配体缀合物，其中：
R5选自
第十四个实施方案公开了由式II-Ib或II-Ic表示的寡核苷酸-配体缀合物：
或其药学上可接受的盐；其中
B是核碱基或氢；
m是1-50；
X1是-O-或-S-；
Y是氢、或/>
R3是氢或合适的保护基；
X2是O或S；
X3是-O-、-S-或共价键；
Y1是连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2'或3'末端的键联基团；
Y2是氢，亚磷酰胺类似物，连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的5'末端的核苷酸间键联基团，或连接至固体支撑物的键联基团；
R5是金刚烷基，或饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替；并且
R是氢、合适的保护基，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环。
第十五个实施方案公开了第十四个实施方案的寡核苷酸-配体缀合物，其中：
R5选自
在一些实施方案中，X1是-O-，Y2是亚磷酰胺并且连接性和立体化学如式II-b-1或II-c-1所示：/>
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、Y、L1和Z中的每一者如上文所定义。
在一些寡核苷酸-配体缀合物实施方案中，X1是-O-，Y2是磷酸酯互连基团，并且连接性和立体化学如式II-b-2或II-c-2所示：
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、L1和Z中的每一者如上文所定义。
在一些实施方案中，第八个实施方案的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述缀合物由式II-d或II-e表示：
或其药学上可接受的盐；
V是选自-O-、-S-和-NR-的二价基团；
W是选自以下的二价基团：-O-、-S-、-NR-、-C(O)NR-、-OC(O)NR-、-SC(O)NR-、
L2是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替；
R4是氢、RA或合适的胺保护基；并且
R5是饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
在一些寡核苷酸-配体缀合物实施方案中，其中X1是-O-，Y2是亚磷酰胺并且连接性和立体化学如式II-d-1或II-e-1所示：
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、Y、L2、V、W和Z中的每一者如上文所定义。
在一些寡核苷酸-配体缀合物实施方案中，其中X1是-O-，Y2是磷酸酯互连基团，并且连接性和立体化学如所示，从而形成包含式II-d-2或II-e-2的单元的寡核苷酸-配体缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
B、R1、R2、R3、R4、Y、L2、V、W和Z中的每一者如上文所定义。
在第十六个实施方案中，第八个至第十五个实施方案中的任一者的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述缀合物包含1至10个核酸-配体缀合物单元。在一些实施方案中，缀合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核酸-配体缀合物单元。在一些实施方案中，缀合物包含1个核酸-配体缀合物单元。在一些实施方案中，缀合物包含2个核酸-配体缀合物单元。在一些实施方案中，缀合物包含3个核酸-配体缀合物单元。
在上文所公开的方面或实施方案中的任一者的某些实施方案中，每个LC是选自C8:0、C10:0、C11:0、C12:0、C14:0、C16:0、C17:0、C18:0、C22:0、C24:0、C26:0、C22:6、C24:1、二酰基C16:0、二酰基C18:1的脂肪酸，和金刚烷羧酸。在某些实施方案中，所述金刚烷羧酸是金刚烷乙酸。
在上文所公开的方面或实施方案中的任一者的某些实施方案中，n是1或2。
在一些实施方案中，B是核碱基或氢。在一些实施方案中，B是核碱基。在一些实施方案中，B是核碱基类似物。在一些实施方案中，B是经修饰的核碱基。在一些实施方案中，B是通用核碱基。在一些实施方案中，B是氢。
在一些实施方案中，B选自鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、
在一些实施方案中，B选自表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，R1和R2独立地是氢、卤素、RA、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或者同一碳上的R1和R2与其间插原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3-7元饱和或部分不饱和环。
在一些实施方案中，R1和R2独立地是氢、氘或卤素。在一些实施方案中，R1和R2独立地是RA、-CN、-S(O)R或-S(O)2R。在一些实施方案中，R1和R2独立地是-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3。在一些实施方案中，同一碳上的R1和R2与其间插原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3-7元饱和或部分不饱和环。
在一些实施方案中，R1是甲基并且R2是氢。
在一些实施方案中，R1和R2选自表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，每个R独立地是氢、合适的保护基，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环，或者同一原子上的两个R基团与其间插原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4-7元饱和、部分不饱和或杂芳基环。
在一些实施方案中，R是合适的保护基。在一些实施方案中，R是氢、C1-6脂族基或任选地被取代的苯基。在一些实施方案中，R是任选地被取代的具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，或者R是任选地被取代的具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环。在一些实施方案中，同一原子上的两个R基团与其间插原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4-7元饱和、部分不饱和或杂芳基环。
在一些实施方案中，R是氢。在一些实施方案中，R选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，每个RA独立地是任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环。
在一些实施方案中，RA是任选地被取代的C1-6脂族基或任选地被取代的苯基。在一些实施方案中，RA是任选地被取代的具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，或任选地被取代的具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环。
在一些实施方案中，RA选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，每个配体独立地是氢或选自金刚烷基和脂质部分的疏水性部分。
如上文所定义和本文所述，每个LC独立地是包含饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链的脂质缀合物部分，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
在一些实施方案中，LC是包含饱和或部分不饱和、直链或支链C1-50烃链的脂质缀合物部分，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
如本文所用，脂质缀合物部分由本文所述的核酸或其类似物与亲脂性化合物偶联形成。在一些实施方案中，LC是包含酯化或酰胺化饱和直链脂肪酸的脂质缀合物部分。在一些实施方案中，LC是-OC(O)CH3或-NHC(O)CH3。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C2H5或-NHC(O)C2H5。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C3H7或-NHC(O)C3H7。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C4H9或-NHC(O)C4H9。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C5H11或-NHC(O)C5H11。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C6H13或-NHC(O)C6H13。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C7H15或-NHC(O)C7H15。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C8H17或-NHC(O)C8H17。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C9H19或-NHC(O)C9H19。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C10H21或-NHC(O)C10H21。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C11H23或-NHC(O)C11H23。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C12H25或-NHC(O)C12H25。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C13H27或-NHC(O)C13H27。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C14H29或-NHC(O)C14H29。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C15H31或-NHC(O)C15H31。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C16H33或-NHC(O)C16H33。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C17H35或-NHC(O)C17H35。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C18H37或-NHC(O)C18H37。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C19H39或-NHC(O)C19H39。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C20H41或-NHC(O)C20H41。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C21H43或-NHC(O)C21H43。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C22H45或-NHC(O)C22H45。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C23H47或-NHC(O)C23H47。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C24H29或-NHC(O)C24H29。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C25H51或-NHC(O)C25H51。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C26H53或-NHC(O)C26H53。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C27H55或-NHC(O)C27H55。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C28H57或-NHC(O)C28H57。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C29H59或-NHC(O)C29H59。在一些实施方案中，LC是-OC(O)C30H61或-NHC(O)C30H61。
在一些实施方案中，LC是包含酯化或酰胺化部分不饱和直链脂肪酸的脂质缀合物部分。在一些实施方案中，LC是酯化或酰胺化肉豆蔻油酸。在一些实施方案中，LC是酯化或酰胺化棕榈油酸。在一些实施方案中，LC是酯化或酰胺化智人酸(sapienic acid)。在一些实施方案中，LC是酯化或酰胺化油酸，即，在一些实施方案中，LC是酯化或酰胺化反油酸。在一些实施方案中，LC是酯化或酰胺化异油酸。在一些实施方案中，LC是酯化或酰胺化亚麻油酸。在一些实施方案中，LC是酯化或酰胺化反亚油酸。在一些实施方案中，LC是酯化或酰胺化α-次亚麻油酸，即，在一些实施方案中，LC是酯化或酰胺化花生油酸。在一些实施方案中，LC是酯化或酰胺化二十碳五烯酸，即，在一些实施方案中，LC是酯化或酰胺化芥子酸。在一些实施方案中，LC是酯化或酰胺化二十二碳六烯酸，即，在一些实施方案中，LC是酯化或酰胺化金刚烷甲酸。在一些实施方案中，LC是酯化或酰胺化金刚烷乙酸。在一些实施方案中，R5是-C(O)(CH2)1-10金刚烷。/>
在一些实施方案中，LC选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，n是1、2、3、4或5。在一些实施方案中，n是1或2。在一些实施方案中，n选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，L是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替。
在一些实施方案中，L是共价键。在一些实施方案中，L是
在一些实施方案中，L选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，L1是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替。
在一些实施方案中，L1是共价键。在一些实施方案中，L1是
在一些实施方案中，L1选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，L2是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替。
在一些实施方案中，L2是共价键。在一些实施方案中，L2是
在一些实施方案中，L2选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，m是1-50。
在一些实施方案中，m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
在一些实施方案中，m选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，R3是氢、合适的保护基、合适的前药，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环。
在一些实施方案中，R3是氢或合适的保护基。在一些实施方案中，R3是合适的前药。在一些实施方案中，R3是合适的磷酸酯/膦酸酯前药，其是谷胱甘肽敏感性部分。在一些实施方案中，R3是选自如国际专利申请第PCT/US2017/048239号中所述的那些的谷胱甘肽敏感性部分，所述申请特此通过引用整体并入。
在一些实施方案中，R3是任选地被取代的C1-6脂族基、任选地被取代的苯基、任选地被取代的具有1-2个杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环、或任选地被取代的具有1-4个杂原子的5-6元杂芳基环，其中所述杂原子独立地选自氮、氧和硫。
在一些实施方案中，R3是甲基或乙基。在一些实施方案中，R3是
在一些实施方案中，R3选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，R4是氢、RA或合适的胺保护基。
在一些实施方案中，R4是氢。在一些实施方案中，R4是RA。在一些实施方案中，R4是合适的胺保护基。
合适的胺保护基和适用于对胺基团进行保护和脱保护的试剂和反应条件在本领域中是众所周知的，并且包括PROTECTING GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS,(T.W.Greene和P.G.M.Wuts,第3版,John Wiley&Sons,1999)中详细描述的那些，所述文献的全文通过引用并入本文。合适的胺保护基与其所连接的氮一起包括但不限于芳烷基胺、氨基甲酸酯、烯丙基胺、酰胺等。本文所述式的化合物的胺保护基的实例包括叔丁氧羰基(Boc)、乙氧羰基、甲氧羰基、三氯乙氧羰基、烯丙氧羰基(Alloc)、苯甲基氧代羰基(Cbz)、烯丙基、苯甲基(Bn)、芴基甲基羰基(Fmoc)、乙酰基、氯乙酰基、二氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、苯基乙酰基、苯甲酰基等。
在一些实施方案中，R4选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，每个R5是饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
在一些实施方案中，R5是-CH3。在一些实施方案中，R5是-C2H5。在一些实施方案中，R5是-C3H7。在一些实施方案中，R5是-C4H9。在一些实施方案中，R5是-C5H11。在一些实施方案中，R5是-C6H13。在一些实施方案中，R5是-C7H15。在一些实施方案中，R5是-C8H17。在一些实施方案中，R5是-C9H19。在一些实施方案中，R5是-C10H21。在一些实施方案中，R5是-C11H23。在一些实施方案中，R5是-C12H25。在一些实施方案中，R5是-C13H27。在一些实施方案中，R5是-C14H29。在一些实施方案中，R5是-C15H31。在一些实施方案中，R5是-C16H33。在一些实施方案中，R5是-C17H35。在一些实施方案中，R5是-C18H37。在一些实施方案中，R5是-C19H39。在一些实施方案中，R5是-C20H41。在一些实施方案中，R5是-C21H43。在一些实施方案中，R5是-C22H45。在一些实施方案中，R5是-C23H47。在一些实施方案中，R5是-C24H29。在一些实施方案中，R5是-C25H51。在一些实施方案中，R5是-C26H53。在一些实施方案中，R5是-C27H55。在一些实施方案中，R5是-C28H57。在一些实施方案中，R5是-C29H59。在一些实施方案中，R5是-C30H61。
在一些实施方案中，R5是部分不饱和直链C1-50烃。在一些实施方案中，R5是-C13H25。在一些实施方案中，R5是-C15H29。在一些实施方案中，R5是-C17H33。在一些实施方案中，R5是-C19H37。在一些实施方案中，R5是-C21H41。在一些实施方案中，R5是-C17H31。在一些实施方案中，R5是-C17H29。在一些实施方案中，R5是-C19H31。在一些实施方案中，R5是-C19H29。在一些实施方案中，R5是-C21H41。在一些实施方案中，R5是-C21H31。
在一些实施方案中，R5是-金刚烷。在一些实施方案中，R5是-CH2金刚烷。在一些实施方案中，R5是-(CH2)1-10金刚烷。
在一些实施方案中，R5是在一些实施方案中，R5是/>在一些实施方案中，R5是在一些实施方案中，R5是
在一些实施方案中，R5选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，V是选自-O-、-S-和-NR-的二价基团。
在一些实施方案中，V是-O-。在一些实施方案中，V是-S-。在一些实施方案中，V是-NR-。
在一些实施方案中，V选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，W是选自以下的二价基团：-O-、-S-、-NR-、-C(O)NR-、-OC(O)NR-、-SC(O)NR-、
不受本公开所限制，可使用一系列交联技术来促进包含本公开的脂质缀合物的核酸或其类似物的组装。在本领域普通技术人员的能力范围内，可由彼此反应以共价连接的合适的偶联部分来促进上述W或亲脂性化合物与本文所述的核酸或其类似物的偶联。预期用于本公开的示例性交联技术还包括表A中所列的那些。
表A.示例性交联技术
/>
在一些实施方案中，W是-O-。在一些实施方案中，W是-S-、-NR-。在一些实施方案中，W是-C(O)NR-。在一些实施方案中，W是-OC(O)NR-。在一些实施方案中，W是-SC(O)NR-。在一些实施方案中，W是在一些实施方案中，W是/>在一些实施方案中，W是/>在一些实施方案中，W是/>在一些实施方案中，W是/>在一些实施方案中，W是/>在一些实施方案中，W是/>在一些实施方案中，W是/>在一些实施方案中，W是/>在一些实施方案中，W是在一些实施方案中，W是/>在一些实施方案中，W是/>在一些实施方案中，W是/>在一些实施方案中，W是/>
在一些实施方案中，W选自下表1中所描绘的那些。
如下文所定义和本文所述，X是氢、合适的保护基或交联基团。
在一些实施方案中，X是氢。在一些实施方案中，X是合适的保护基。在一些实施方案中，X是交联基团。在一些实施方案中，交联基团是-OH、-SH、-NHR、-COH、-CO2H、-N3、炔基、烯烃，包括表A中所提及的交联基团中的任一者。
在一些实施方案中，X选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，X1是-O-、-S-、-Se-或-NR-。
在一些实施方案中，X1是-O-。在一些实施方案中，X1是-S-。在一些实施方案中，X1是-Se-。在一些实施方案中，X1是-NR-。
在一些实施方案中，X1选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，X2是O、S或NR。
在一些实施方案中，X2是O。在一些实施方案中，X2是S。在一些实施方案中，X2是NR。
在一些实施方案中，X2选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，X3是-O-、-S-、-BH2-或共价键。
在一些实施方案中，X3是-O-。在一些实施方案中，X3是-S-。在一些实施方案中，X3是-BH2-。在一些实施方案中，X3与R4形成-BH3。在一些实施方案中，X3是共价键。在一些实施方案中，X3是构成硼烷磷酸酯主链的共价键。
在一些实施方案中，X3选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，Y是氢、合适的羟基保护基、
在一些实施方案中，Y是氢。在一些实施方案中，Y是合适的羟基保护基。在一些实施方案中，Y是在一些实施方案中，Y是/>
在一些实施方案中，Y选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，Y1是连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2'或3'末端的键联基团。
在一些实施方案中，Y1是连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2'末端的键联基团。在一些实施方案中，Y1是连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的3'末端的键联基团。
在一些实施方案中，Y1是在一些实施方案中，Y1是/>在一些实施方案中，Y1是/>在一些实施方案中，Y1是/>
在一些实施方案中，Y1选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，Y2是氢，合适的保护基，亚磷酰胺类似物，连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的5'末端的核苷酸间键联基团，或连接至固体支撑物的键联基团。
在一些实施方案中，Y2是氢。在一些实施方案中，Y2是合适的保护基。在一些实施方案中，Y2是亚磷酰胺类似物。在一些实施方案中，Y2是下式的亚磷酰胺类似物：其中R3和X3中的每一者独立地如本文所述，并且E是卤素或-NR2。在一些实施方案中，Y2是连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的5'末端的核苷酸间键联基团。在一些实施方案中，Y2是连接至固体支撑物的键联基团。
在一些实施方案中，Y2是苯甲酰基。在一些实施方案中，Y2是叔丁基二甲基甲硅烷基。在一些实施方案中，Y2是在一些实施方案中，Y2是/>在一些实施方案中，Y2是/>在一些实施方案中，Y2是/>在一些实施方案中，Y2是/>
在一些实施方案中，Y2选自下表1中所描绘的那些。
如上述实施方案中所示，E是卤素或-NR2。
在一些实施方案中，E是卤素。在一些实施方案中，E是-NR2。在一些实施方案中，E是氯。在一些实施方案中，E是-N(iPr)2。
在一些实施方案中，E选自下表1中所描绘的那些。
如上述Y1的一些实施方案中所示，Y3是连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2'或3'末端的键联基团。
在一些实施方案中，Y3是连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2'末端的键联基团。在一些实施方案中，Y3是连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的3'末端的键联基团。
在一些实施方案中，Y3选自下表1中所描绘的那些。
如上述Y2的一些实施方案中所示，Y4是氢，保护基，亚磷酰胺类似物，连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的4'或5'末端的核苷酸间键联基团，或连接至固体支撑物的键联基团。
在一些实施方案中，Y4是氢。在一些实施方案中，Y4是保护基。在一些实施方案中，Y4是亚磷酰胺类似物。在一些实施方案中，Y4是下式的亚磷酰胺类似物：其中R3、X3和E中的每一者独立地如本文所述。在一些实施方案中，Y4是连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的4'末端的核苷酸间键联基团。在一些实施方案中，Y4是连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的5'末端的核苷酸间键联基团。在一些实施方案中，Y4是连接至固体支撑物的键联基团。
在一些实施方案中，Y4是苯甲酰基。在一些实施方案中，Y4是叔丁基二甲基甲硅烷基。在一些实施方案中，Y4是在一些实施方案中，Y4是/>在一些实施方案中，Y4是/>
在一些实施方案中，Y4选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，每个R6独立地是氢、合适的前药、RA、卤素、-CN、-NO2、-OR、-SR、-NR2、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2、-OP(O)R2、-OP(O)(OR)2、-OP(O)(OR)NR2、-OP(O)(NR2)2-、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2、-N(R)S(O)2R、-N(R)P(O)R2、-N(R)P(O)(OR)2、-N(R)P(O)(OR)NR2、-N(R)P(O)(NR2)2、-N(R)S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3。
在一些实施方案中，R6是氢。在一些实施方案中，R6是氘。在一些实施方案中，R6是合适的前药。在一些实施方案中，R6是合适的磷酸酯/膦酸酯前药，其是谷胱甘肽敏感性部分。在一些实施方案中，R6是选自如国际专利申请第PCT/US2013/072536号中所述的那些的谷胱甘肽敏感性部分，所述申请特此通过引用整体并入。在一些实施方案中，R6是RA。在一些实施方案中，R6是卤素。在一些实施方案中，R6是-CN。在一些实施方案中，R6是-NO2。在一些实施方案中，R6是-OR。在一些实施方案中，R6是-SR。在一些实施方案中，R6是-NR2。在一些实施方案中，R6是-S(O)2R。在一些实施方案中，R6是-S(O)2NR2。在一些实施方案中，R6是-S(O)R。在一些实施方案中，R6是-C(O)R。在一些实施方案中，R6是-C(O)OR。在一些实施方案中，R6是-C(O)NR2。在一些实施方案中，R6是-C(O)N(R)OR。在一些实施方案中，R6是-C(R)2N(R)C(O)R。在一些实施方案中，R6是-C(R)2N(R)C(O)NR2。在一些实施方案中，R6是-OC(O)R。在一些实施方案中，R6是-OC(O)NR2。在一些实施方案中，R6是-OP(O)R2。在一些实施方案中，R6是-OP(O)(OR)2。在一些实施方案中，R6是-OP(O)(OR)NR2。在一些实施方案中，R6是-OP(O)(NR2)2-。在一些实施方案中，R6是-N(R)C(O)OR。在一些实施方案中，R6是-N(R)C(O)R。在一些实施方案中，R6是-N(R)C(O)NR2。在一些实施方案中，R6是-N(R)P(O)R2。在一些实施方案中，R6是-N(R)P(O)(OR)2。在一些实施方案中，R6是-N(R)P(O)(OR)NR2。在一些实施方案中，R6是-N(R)P(O)(NR2)2。在一些实施方案中，R6是-N(R)S(O)2R。在一些实施方案中，R6是-Si(OR)2R。在一些实施方案中，R6是-Si(OR)R2。在一些实施方案中，R6是-SiR3。
在一些实施方案中，R6是羟基。在一些实施方案中，R6是氟。在一些实施方案中，R6是甲氧基。在一些实施方案中，R6是
在一些实施方案中，R6选自表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，E是卤素或-NR2。
在一些实施方案中，E是卤素。在一些实施方案中，E是-NR2。
在一些实施方案中，E选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，Z是-O-、-S-、-NR-或-CR2-。
在一些实施方案中，Z是-O-。在一些实施方案中，Z是-S-。在一些实施方案中，Z是-NR-。在一些实施方案中，Z是-CR2-。
在一些实施方案中，Z选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，PG1是氢或合适的羟基保护基。
在一些实施方案中，PG1是氢。在一些实施方案中，PG1是合适的羟基保护基。
如上文所定义和本文所述，PG2是氢、亚磷酰胺类似物或合适的保护基。
在一些实施方案中，PG2是氢。在一些实施方案中，PG1是亚磷酰胺类似物。在一些实施方案中，PG2是羟基保护基。
在一些实施方案中，PG1和PG2中的每一者与其所结合的氧原子一起独立地选自上文对于Y所述的合适的羟基保护基。在一些实施方案中，PG1和PG2与其间插原子一起形成环状二醇保护基，例如环状缩醛或缩酮。此类基团包括亚甲基、亚乙基、苯亚甲基、亚异丙基、亚环己基和亚环戊基；亚甲硅烷基衍生物，例如二叔丁基亚甲硅烷基和1,1,3,3-四异丙基二亚硅氧烷基；环状碳酸酯；环状硼酸酯；和基于环状单磷酸腺苷(即，cAMP)的环状单磷酸酯衍生物。在一些实施方案中，环状二醇保护基是1,1,3,3-四异丙基二亚硅氧烷基。
在一些实施方案中，PG1和PG2选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，PG3是氢或合适的胺保护基。
在一些实施方案中，PG3是氢。在一些实施方案中，PG3是合适的胺保护基。在一些实施方案中，PG3和R4是环状胺保护基(例如，邻苯二甲酰亚胺)。
在一些实施方案中，PG3选自下表1中所描绘的那些。
如上文所定义和本文所述，PG4是氢或合适的羟基保护基。
在一些实施方案中，PG4是氢。在一些实施方案中，PG4是合适的羟基保护基。
在一些实施方案中，PG4选自下表1中所描绘的那些。
表1.示例性核酸-脂质缀合物
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在一些实施方案中，本公开提供了核酸或其类似物，所述核酸或其类似物包含上表1中所陈述的本发明的脂质缀合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本公开提供了寡核苷酸-配体缀合物，所述寡核苷酸-配体缀合物包含一个或多个如实施例中所述的本公开的核酸-脂质缀合物或其药学上可接受的盐。
3.定义：
本公开的化合物(即，核酸-配体缀合物、寡核苷酸-配体缀合物和其类似物)包括本文通常描述的那些，并且由本文所公开的类别、子类和种类进一步说明。如本文所用，除非另有指示，否则以下定义将适用。出于本公开的目的，根据Periodic Table of theElements,CAS版本,Handbook of Chemistry and Physics,第75版来鉴定化学元素。另外，有机化学的一般原理描述于“Organic Chemistry”,Thomas Sorrell,University ScienceBooks,Sausalito:1999，和“March's Advanced Organic Chemistry”,第5版,Smith,M.B.和March,J.编,John Wiley&Sons,New York:2001中，所述文献的全部内容特此通过引用并入。
如本文所用，术语“脂族”或“脂族基团”意指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元的直链(即，无分支)或支链、被取代或未被取代的烃链，或者完全饱和或含有一个或多个不饱和单元但并非芳族的单环烃或双环烃(本文中也称为“碳环”、“环脂族”或“环烷基”)，所述基团与分子的其余部分具有单个连接点。除非另有规定，否则脂族基团含有1-6个脂族碳原子。在一些实施方案中，脂族基团含有1-5个脂族碳原子。在其他实施方案中，脂族基团含有1-4个脂族碳原子。在其他实施方案中，脂族基团含有1-3个脂族碳原子；并且在其他实施方案中，脂族基团含有1-2个脂族碳原子。在一些实施方案中，“环脂族”(或“碳环”或“环烷基”)是指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元但并非芳族的单环C3-C6烃，所述基团与分子的其余部分具有单个连接点。合适的脂族基团包括但不限于直链或支链、被取代或未被取代的烷基、烯基、炔基和其杂合物，例如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。碳环基可为单环、双环、桥联双环、螺环或金刚烷。
如本文所用，术语“桥联双环”是指具有至少一个桥的任何双环体系，即，碳环或杂环、饱和或部分不饱和的。如IUPAC所定义，“桥”是连接两个桥头的无分支原子链或原子或价键，其中“桥头”是键结至三个或更多个骨架原子(不包括氢)的环体系的任何骨架原子。在一些实施方案中，桥联双环基团具有7-12个环成员和0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子。此类桥联双环基团在本领域中是众所周知的，并且包括下文所陈述的那些基团，其中每个基团在任何可取代的碳或氮原子处连接至分子的其余部分。除非另有规定，否则桥联双环基团任选地被一个或多个如对于脂族基团所陈述的取代基取代。另外或替代地，桥联双环基团的任何可取代氮任选地被取代。示例性桥联双环包括：
术语“低级烷基”是指C1-4直链或支链烷基。示例性低级烷基是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。
术语“低级卤代烷基”是指用一个或多个卤素原子取代的C1-4直链或支链烷基。
术语“杂原子”意指氧、硫、氮、磷或硅中的一者或多者(包括氮、硫、磷或硅的任何氧化形式；任何碱性氮的季铵化形式；或杂环的可取代氮，例如N(如在3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或NR+(如在N-取代的吡咯烷基中)。
如本文所用，术语“不饱和”意指部分具有一个或多个不饱和单元。
如本文所用，术语“二价C1-8(或C1-6)饱和或不饱和直链或支链烃链”是指如本文所定义的直链或支链的二价亚烷基、亚烯基和亚炔基链。
术语“亚烷基”是指二价烷基。“亚烷基链”是聚亚甲基，即，-(CH2)n-，其中n是正整数，优选是1至6、1至4、1至3、1至2、或2至3。被取代的亚烷基链是其中一个或多个亚甲基氢原子被取代基代替的聚亚甲基。合适的取代基包括下文对于被取代的脂族基团所述的那些。
术语“亚烯基”是指二价烯基。被取代的亚烯基链是含有至少一个双键的聚亚甲基，其中一个或多个氢原子被取代基代替。合适的取代基包括下文对于被取代的脂族基团所述的那些。
如本文所用，术语“亚环丙基”是指具有以下结构的二价环丙基：
术语“卤素”意指F、Cl、Br或I。
单独或作为如“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”的较大部分的一部分使用的术语“芳基”是指具有总共五个至十四个环成员的单环或双环体系，其中所述体系中的至少一个环是芳族的，并且其中所述体系中的每个环含有3至7个环成员。术语“芳基”可与术语“芳基环”互换使用。在本公开的某些实施方案中，“芳基”是指可带有一个或多个取代基的芳族环系，包括但不限于苯基、联苯基、萘基、蒽基等。如本文所用，在术语“芳基”的范围内还包括其中芳族环稠合至一个或多个非芳族环的基团，例如二氢茚基、邻苯二甲酰亚氨基、萘二甲酰亚氨基、菲啶基或四氢萘基等。
单独或作为较大部分例如“杂芳烷基”或“杂芳烷氧基”的一部分使用的术语“杂芳基”和“杂芳-”是指如下基团：具有5至10个环原子，优选地5、6或9个环原子；具有6、10或14个在环状阵列中共享的π电子；并且除碳原子以外还具有一至五个杂原子。术语“杂原子”是指氮、氧或硫，并且包括氮或硫的任何氧化形式和碱性氮的任何季铵化形式。杂芳基包括但不限于噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。如本文所用，术语“杂芳基”和“杂芳-”还包括其中杂芳族环稠合至一个或多个芳基、环脂族或杂环基环的基团，其中连接基团或连接点在杂芳族环上。非限制性实例包括吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基和吡啶并[2,3-b]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮。杂芳基可为单环或双环。术语“杂芳基”可与术语“杂芳基环”、“杂芳基”或“杂芳族”互换使用，所述术语中的任一者包括任选地被取代的环。术语“杂芳烷基”是指被杂芳基取代的烷基，其中烷基和杂芳基部分独立地任选地被取代。
如本文所用，术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基团”和“杂环”可互换使用，并且是指稳定的5-7元单环或7-10元双环杂环部分，其是饱和或部分不饱和的，并且除碳原子以外还具有一个或多个、优选一个至四个如上文所定义的杂原子。当关于杂环的环原子使用时，术语“氮”包括被取代的氮。举例来说，在具有0-3个选自氧、硫或氮的杂原子的饱和或部分不饱和环中，氮可为N(如在3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或+NR(如在N-取代的吡咯烷基中)。
杂环可在任何杂原子或碳原子处连接至其侧基，从而形成稳定结构，并且环原子中的任一者可任选地被取代。此类饱和或部分不饱和杂环基的实例包括但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、噁唑烷基、哌嗪基、二氧杂环己烷基、二氧杂环戊烷基、二氮杂环庚烷基、氧氮杂环庚烷基、硫氮杂环庚烷基、吗啉基和奎宁环基。术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基环”、“杂环基团”、“杂环部分”和“杂环状基团”在本文中可互换使用，并且还包括其中杂环基环稠合至一个或多个芳基、杂芳基或环脂族环，例如吲哚基、3H-吲哚基、苯并二氢吡喃基、菲啶基或四氢喹啉基的基团。杂环基可为单环、双环、桥联双环或螺环。术语“杂环基烷基”是指被杂环基取代的烷基，其中烷基和杂环基部分独立地任选地被取代。
如本文所用，术语“部分不饱和”是指包括至少一个双键或三键的环部分。术语“部分不饱和”旨在涵盖具有多个不饱和位点的环，但不旨在包括如本文所定义的芳基或杂芳基部分。
如本文所述，本公开的化合物可含有“任选地被取代的”部分。一般而言，术语“被取代”，无论是否前置有术语“任选地”，意指指定部分的一个或多个氢被合适的取代基代替。除非另有指示，否则“任选地被取代的”基团可在所述基团的每个可取代位置处具有合适的取代基，并且当任何给定结构中的多于一个位置可被多于一个选自指定组的取代基取代时，在每个位置处的取代基可相同或不同。本公开所预期的取代基组合优选是形成稳定或化学上可行的化合物的那些。如本文所用，术语“稳定”是指当经受允许其产生、检测以及在某些实施方案中其回收、纯化和用于本文所公开的一种或多种目的的条件时，基本上无变化的化合物。
“任选地被取代的”基团的可取代碳原子上的合适单价取代基独立地是卤素；-(CH2)0-4R°；-(CH2)0-4OR°；-O(CH2)0-4R°；-O-(CH2)0-4C(O)OR°；-(CH2)0-4CH(OR°)2；-(CH2)0- 4SR°；-(CH2)0-4Ph，其可被R°取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph，其可被R°取代；-CH＝CHPh，其可被R°取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1-吡啶基，其可被R°取代；-NO2；-CN；-N3；-(CH2)0-4N(R°)2；-(CH2)0-4N(R°)C(O)R°；-N(R°)C(S)R°；-(CH2)0-4N(R°)C(O)NR°2；-N(R°)C(S)NR°2；-(CH2)0-4N(R°)C(O)OR°；-N(R°)N(R°)C(O)R°；-N(R°)N(R°)C(O)NR°2；-N(R°)N(R°)C(O)OR°；-(CH2)0-4C(O)R°；-C(S)R°；-(CH2)0-4C(O)OR°；-(CH2)0-4C(O)SR°；-(CH2)0-4C(O)OSiR°3；-(CH2)0-4OC(O)R°；-OC(O)(CH2)0-4SR-；SC(S)SR°；-(CH2)0-4SC(O)R°；-(CH2)0-4C(O)NR°2；-C(S)NR°2；-C(S)SR°；-SC(S)SR°；-(CH2)0-4OC(O)NR°2；-C(O)N(OR°)R°；-C(O)C(O)R°；-C(O)CH2C(O)R°；-C(NOR°)R°；-(CH2)0-4SSR°；-(CH2)0-4S(O)2R°；-(CH2)0-4S(O)2OR°；-(CH2)0-4OS(O)2R°；-S(O)2NR°2；-(CH2)0-4S(O)R°；-N(R°)S(O)2NR°2；-N(R°)S(O)2R°；-N(OR°)R°；-C(NH)NR°2；-P(O)2R°；-P(O)R°2；-OP(O)R°2；-OP(O)(OR°)2；SiR°3；-(C1-4直链或支链亚烷基)O-N(R°)2；或-(C1-4直链或支链亚烷基)C(O)O-N(R°)2，其中每个R°可如下文所定义被取代并且独立地是氢、C1-6脂族基、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph、-CH2-(5-6元杂芳基环)，或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环，或者尽管有上述定义，但两个独立出现的R°与其间插原子一起形成具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-12元饱和、部分不饱和或芳基单环或双环，其可如下文所定义被取代。
R°(或由两个独立出现的R°与其间插原子一起形成的环)上的合适单价取代基独立地是卤素、-(CH2)0-2R●、-(卤代R●)、-(CH2)0-2OH、-(CH2)0-2OR●、-(CH2)0-2CH(OR●)2、-O(卤代R●)、-CN、-N3、-(CH2)0-2C(O)R●、-(CH2)0-2C(O)OH、-(CH2)0-2C(O)OR●、-(CH2)0-2SR●、-(CH2)0- 2SH、-(CH2)0-2NH2、-(CH2)0-2NHR●、-(CH2)0-2NR● 2、-NO2、-SiR● 3、-OSiR● 3、-C(O)SR●、-(C1-4直链或支链亚烷基)C(O)OR●或-SSR●，其中每个R●未被取代或在前置有“卤代”的情况下仅用一个或多个卤素取代，并且独立地选自C1-4脂族基、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph，或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环。R°的饱和碳原子上的合适的二价取代基包括＝O和＝S。
“任选地被取代的”基团的饱和碳原子上的合适的二价取代基包括以下：＝O、＝S、＝NNR* 2、＝NNHC(O)R*、＝NNHC(O)OR*、＝NNHS(O)2R*、＝NR*、＝NOR*、-O(C(R* 2))2-3O-或-S(C(R* 2))2-3S-，其中每个独立出现的R*选自氢、C1-6脂族基(其可如下文所定义被取代)，或未被取代的具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环。结合至“任选地被取代的”基团的邻位可取代碳的合适的二价取代基包括：-O(CR* 2)2-3O-，其中每个独立出现的R*选自氢、C1-6脂族基(其可如下文所定义被取代)，或未被取代的具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环。
R*的脂族基团上的合适取代基包括卤素、-R●、-(卤代R●)、-OH、-OR●、-O(卤代R●)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR●、-NH2、-NHR●、-NR● 2或-NO2，其中每个R●未被取代或在前置有“卤代”的情况下仅用一个或多个卤素取代，并且独立地是C1-4脂族基、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph，或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环。
“任选地被取代的”基团的可取代氮上的合适取代基包括 或/>其中每个/>独立地是氢、C1-6脂族基(其可如下文所定义被取代)、未被取代的-OPh，或未被取代的具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环，或者尽管有上述定义，但两个独立出现的/>与其间插原子一起形成具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-12元饱和、部分不饱和或芳基单环或双环。
的脂族基团上的合适取代基独立地是卤素、-R●、-(卤代R●)、-OH、-OR●、-O(卤代R●)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR●、-NH2、-NHR●、-NR● 2或-NO2，其中每个R●未被取代或在前置有“卤代”的情况下仅用一个或多个卤素取代，并且独立地是C1-4脂族基、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph，或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环。
除非另有规定，否则本文所描绘的结构还意在包括所述结构的所有异构(例如，对映异构、非对映异构和几何(或构象))形式；例如，每个不对称中心的R和S构型，Z和E双键异构体，以及Z和E构象异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构、非对映异构和几何(或构象)混合物在本公开的范围内。除非另有规定，否则本公开化合物的所有互变异构形式在本公开的范围内。另外，除非另有规定，否则本文所描绘的结构还意在包括不同之处仅为存在一个或多个同位素富集原子的化合物。例如，具有包括氢由氘或氚代替，或碳由富集13C或14C的碳代替的本发明结构的化合物在本公开的范围内。此类化合物例如可用作分析工具，作为生物测定中的探针，或作为根据本公开的治疗剂。
如本文所使用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个提及物。例如，提及“一种方法”包括本文所述类型和/或在阅读本公开之后将是本领域技术人员显而易见的一种或多种方法和/或步骤等等。
如本文所用，除非另有指示，否则术语“和/或”在本公开中用于意指“和”或“或”。
4.用于降低基因表达的寡核苷酸-配体缀合物
另一方面公开了用于降低靶基因表达的寡核苷酸-配体缀合物，其中核酸-缀合物单元由式II表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
B是核碱基或氢；
R1和R2独立地是氢、卤素、RA、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；或者
同一碳上的R1和R2与其间插原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3-7元饱和或部分不饱和环；
每个RA独立地是任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
每个R独立地是氢、合适的保护基，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；或者
同一原子上的两个R基团与其间插原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4-7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
配体独立地是-(LC)n或金刚烷基；
每个LC独立地是包含饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链的脂质缀合物部分，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-代替；
每个-Cy-独立地是任选地被取代的选自以下的二价环：亚苯基，8-10元双环亚芳基，4-7元饱和或部分不饱和亚碳环基，4-11元饱和或部分不饱和螺亚碳环基，8-10元双环饱和或部分不饱和亚碳环基，具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-11元饱和或部分不饱和螺亚杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的8-10元双环饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元亚杂芳基，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环亚杂芳基；
n是1-10；
L是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-N(R)-C(O)-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-、-V1CR2W1-或代替；
m是1-50；
X1、V1和W1独立地是-C(R)2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或-NR-；
Y是氢、合适的羟基保护基、
R3是氢、合适的保护基、合适的前药，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
X2是O、S或NR；
X3是-O-、-S-、-BH2-或共价键；
Y1是连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2'或3'末端的键联基团；
Y2是氢，合适的保护基，亚磷酰胺类似物，连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的5'末端的核苷酸间键联基团，或连接至固体支撑物的键联基团；
Z是-O-、-S-、-NR-或-CR2-；并且
其中所述寡核苷酸包含长度为15-53个核苷酸的有义链和长度为19-53个核苷酸的反义链，其中所述反义寡核苷酸链具有与靶基因序列的至少15个连续核苷酸互补的序列；
并且其中反义链和有义链形成双链体结构，但不共价连接。
在一些实施方案中，上文所提及的方面或实施方案中的任一者的寡核苷酸-配体缀合物包含选自式I、I-a、I-b、I-c、I-d、I-e、I-Ia、I-Ib、I-Ic、I-Id、I-Ie、II、II-a、II-b、II-c、II-d、II-e、II-Ia、II-Ib、II-Ic、II-Id和II-Ie的一个或多个核酸-配体缀合物单元，或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，上文所提及的方面或实施方案中的任一者的寡核苷酸-配体缀合物，寡核苷酸包含长度为15-53个核苷酸的有义链和长度为19-53个核苷酸的反义链，其中反义寡核苷酸链具有与靶基因序列的至少15个连续核苷酸互补的序列，并且当将寡核苷酸-缀合物引入哺乳动物细胞中时降低基因表达。
在一些实施方案中，互补区域与靶mRNA的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少21个连续核苷酸完全互补。在一些实施方案中，L是四环。在一些实施方案中，L的长度为4个核苷酸。在一些实施方案中，L包含以GAAA所示的序列。在一些实施方案中，反义链的长度为21至27个核苷酸，并且有义链的长度为12、15、20或25个核苷酸。在一些实施方案中，反义链和有义链形成长度为25个核苷酸的双链体区域。在一些实施方案中，双链体具有钝端。在某些实施方案中，双链体具有四环。
在某些寡核苷酸-配体缀合物实施方案中，核酸-配体缀合物单元存在于有义链中。
在一些寡核苷酸-配体缀合物实施方案中，反义链的长度为19至27个核苷酸。
在一些寡核苷酸-配体缀合物实施方案中，有义链的长度为12至40个核苷酸。
在一些寡核苷酸-配体缀合物实施方案中，有义链与反义链形成双链体区域。在某些实施方案中，双链体具有钝端。在一些实施方案中，有义链是截短的。
在一些寡核苷酸-配体缀合物实施方案中，互补区域与靶序列完全互补。
在某些实施方案中，有义链具有序列
5'GGUGGAUGAAACUCAGUUUAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:1)。
在某些实施方案中，反义链具有序列
3'GGCCACCUACUUUGAGUCAAAU(SEQ ID NO:2)。
在一些寡核苷酸-配体缀合物实施方案中，其中有义链在其3'端包含如下所示的茎环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环。
在一些寡核苷酸-配体缀合物实施方案中，L是四环。在某些实施方案中，L包含以GAAA所示的序列。
在一些寡核苷酸-配体缀合物实施方案中，缀合物还包含反义链上长度为两个核苷酸的3'-悬垂序列。在某些实施方案中，寡核苷酸还包含长度为一个或多个核苷酸的3'-悬垂序列，其中所述3'-悬垂序列存在于反义链、有义链、或反义链和有义链上。
在一些寡核苷酸-配体缀合物实施方案中，寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸包含2'-修饰。在一些实施方案中，2'-修饰是选自以下的修饰：2'-氨基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸。
在一些寡核苷酸-配体缀合物实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸被修饰。
在一些寡核苷酸-配体缀合物实施方案中，寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸间键。在某些实施方案中，至少一个经修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
在一些寡核苷酸-配体缀合物实施方案中，反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。在某些实施方案中，磷酸酯类似物是氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。
如本文所用，术语“4'-O-亚甲基膦酸酯”是指本文所述的所有被取代的亚甲基类似物(例如，被甲基、二甲基、乙基、氟、环丙基等取代的亚甲基)和所有膦酸酯类似物(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯等)。
如本文所用，术语“5'末端核苷酸”是指位于寡核苷酸的5'端的核苷酸。在本申请中，5'末端核苷酸还可称为“N1核苷酸”。
如本文所用，术语“酒精中毒”是指尽管反复出现不良后果，但个体仍反复使用酒精，这可能与或可能不与对饮酒的耐受、戒断和/或无法控制的驱动力相结合。酒精中毒可归类为酒精滥用、酒精使用障碍或酒精依赖。可使用多种方法来鉴定患有酒精中毒的个体。例如，世界卫生组织已建立酒精使用障碍鉴定测试(AUDIT)作为鉴定潜在酒精滥用(包括依赖)的工具，并且已开发其他类似测试，包括密歇根酒精筛选测试(MAST)。实验室测试可用于评价血液标志物以检测饮酒的长期使用和/或复发，包括检测γ-谷胺酰转移酶(GGT)、平均红细胞体积(红细胞大小)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、糖缺乏性转铁蛋白(CDT)、乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)、硫酸乙酯(EtS)和/或磷脂酰乙醇(PEth)的水平的测试。
已建立酒精中毒的动物模型(例如，小鼠模型)(参见例如Rijk H,Crabbe JC,Rigter H.,A Mouse Model of Alcoholism,PHYSIOL BEHAV.(1982)11月；29(5):833-39；Elizabeth Brandon-Warner等人,Rodent Models of Alcoholic Liver Disease:of Miceand Men,ALCOHOL.2012年12月；46(8):715-25(2012年12月；46(8))；和Adeline Bertola等人,Mouse Model of Chronic and Binge Ethanol Feeding(the NIAAA model).NATUREPROTOCOLS 8,627-37(2013))。
如本文所用，术语“ALDH2”是指醛脱氢酶2家族(线粒体)基因。ALDH2编码的蛋白质属于蛋白质的醛脱氢酶家族，并且充当从酒精合成乙酸盐(乙酸)的酒精代谢氧化途径的第二种酶。ALDH2的同源物在一系列物种中是保守的，包括人类、小鼠、大鼠、非人类灵长类物种和其他物种(参见例如NCBI HomoloGene:55480)。ALDH2也与其他醛脱氢酶编码基因(包括例如ALDH1A1)具有同源性。在人类中，ALDH2编码至少两种转录物，即，NM_000690.3(变体1)和NM_00l204889.l(变体2)，各自分别编码不同的同功型NP_00068l.2(同功型1)和NP_00l 191818.1(同功型2)。转录物变体2与转录物变体1相比在5'编码区中缺乏框内外显子，并且与同功型1相比编码较短同功型(2)。已鉴定ALDH2中的多形性(参见例如Chang JS,Hsiao JR,Chen CH.,ALDH2 polymorphism and alcohol-related cancers in Asians:apublic health perspective,J BIOMED SCI.(2017年3月3日)；24(l):19Review)。
如本文所用，术语“近似”或“约”当应用于一个或多个所关注的值时，是指类似于所叙述的参考值的值。在某些实施方案中，除非另有规定或从上下文另外显而易见(除非此数值将超过可能值的100％)，否则术语“近似”或“约”是指处于在任一方向上(大于或小于)所叙述的参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小值以内的值的范围。
如本文所用，术语“施用(administering/administration)”意指以药理学上有用(例如，以治疗受试者的疾患)的方式向受试者提供物质(例如，寡核苷酸)。
如本文所用，术语“去唾液酸糖蛋白受体”或“ASGPR”是指由主要48kDa(ASGPR-l)和次要40kDa次单元(ASGPR-2)形成的二分C型凝集素。ASGPR主要在肝细胞的血窦表面上表达，并且在含有末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基的循环糖蛋白(去唾液酸糖蛋白)的结合、内化和后续清除中起主要作用。
如本文所用，术语“适体”是指对特异性靶标具有结合亲和力的寡核苷酸，所述特异性靶标包括核酸、蛋白质、特异性全细胞或特定组织。适体可使用本领域中已知的方法获得，例如，通过从大型随机核酸序列库中进行体外选择。Lee等人,NUCLEIC ACID RES.,2004,32:D95-D100。
如本文所用，术语“安塔够妙”是指对特异性靶标具有结合亲和力的寡核苷酸，所述特异性靶标包括外源RNAi抑制剂分子或天然miRNA的向导链(Krutzfeldt等人,NATURE2005,438(7068):685-89)。
双链RNAi抑制剂分子包含两个寡核苷酸链：反义链和有义链。反义链或其区域与靶核酸的相应区域部分地、基本上或完全互补。另外，双链RNAi抑制剂分子或其区域的反义链与双链RNAi抑制剂分子或其区域的有义链部分地、基本上或完全互补。在某些实施方案中，反义链还可含有与靶核酸序列不互补的核苷酸。非互补核苷酸可在互补序列的任一侧或可在互补序列的两侧。在某些实施方案中，在反义链或其区域与有义链或其区域部分地或基本上互补的情况下，非互补核苷酸可位于一个或多个互补区域(例如，一个或多个错配)之间。双链RNAi抑制剂分子的反义链也称为向导链。
如本文所用，术语“典型的RNA抑制剂分子”是指两个核酸链，各自长度为21个核苷酸，其中心互补区域的长度为19个碱基对，用于形成双链核酸和在3'端中的每一者处形成两个核苷酸悬垂。
如本文所用，术语“互补”是指两个核苷酸之间(例如，在两个相对核酸上或在单核酸链的相对区域上)的结构关系，其允许两个核苷酸彼此形成碱基对。例如，与相对核酸的嘧啶核苷酸互补的一个核酸的嘌呤核苷酸可通过彼此形成氢键而一起碱基配对。在一些实施方案中，互补核苷酸可按沃森-克里克(Watson-Crick)方式或按允许形成稳定双链体的任何其他方式碱基配对。“完全互补”或100％互补是指第一寡核苷酸链或第一寡核苷酸链的区段的每个核苷酸单体可与第二寡核苷酸链或第二寡核苷酸链的区段的每个核苷酸单体形成碱基对的情形。小于100％互补是指两个寡核苷酸链(或两个寡核苷酸链的两个区段)的一些但并非全部核苷酸单体可彼此形成碱基对。“基本上互补”是指两个寡核苷酸链(或两个寡核苷酸链的区段)彼此展现90％或更高互补性。“充分互补”是指靶mRNA与核酸抑制剂分子之间的互补性，使得靶mRNA编码的蛋白质的量减少。
如本文所用，术语“互补链”是指与另一条链部分地、基本上或完全互补的双链核酸抑制剂分子的一条链。
如本文所用，术语“常规反义寡核苷酸”是指通过以下机制中的一者来抑制靶向基因的表达的单链寡核苷酸：(1)位阻，例如，反义寡核苷酸通过直接干扰例如基因的转录、前体mRNA的剪接和mRNA的翻译来干扰基因表达和/或所编码蛋白质产生所涉及的事件顺序中的某个步骤；(2)由RNase H诱导靶向基因的RNA转录物的酶促消化；(3)由RNase L诱导靶向基因的RNA转录物的酶促消化；(4)由RNase P诱导靶向基因的RNA转录物的酶促消化；(5)由双链RNase诱导靶向基因的RNA转录物的酶促消化；以及(6)在同一反义寡核苷酸中组合的位阻与酶促消化活性诱导。常规反义寡核苷酸不具有如同RNAi抑制剂分子的RNAi作用机制。RNAi抑制剂分子可通过若干方式与常规反义寡核苷酸相区分，包括需要Ago2与RNAi反义链组合以使得反义链将Ago2蛋白质导向预期靶标，以及需要Ago2用于靶标沉默的情况。
成簇规则间隔短回文重复(“CRISPR”)是防御入侵的噬菌体和质粒所涉及的微生物核酸酶系统。Wright等人,Cell,2016,164:29-44。这种原核系统已适用于编辑真核细胞基因组中所关注的靶核酸序列。Cong等人,SCIENCE,2013,339:819-23；Mali等人,SCIENCE,2013,339:823-26；Woo Cho等人,NAT.BIOTECHNOLOGY,2013,31(3):230-232。如本文所用，术语“CRISPR RNA”是指包含“CRISPR”RNA(crRNA)部分和/或反式活化crRNA(tracrRNA)部分的核酸，其中CRISPR部分具有与靶核酸部分地、基本上或完全互补的第一序列和与tracrRNA部分充分互补的第二序列(也称为示踪物伴侣序列)，以使得示踪物伴侣序列与tracrRNA部分杂交形成向导RNA。向导RNA与核酸内切酶如Cas核酸内切酶(例如，Cas9)形成复合物，并且引导核酸酶介导靶核酸的裂解。在某些实施方案中，crRNA部分融合至tracrRNA部分以形成嵌合向导RNA。Jinek等人,SCIENCE,2012,337:816-21。在某些实施方案中，crRNA部分的第一序列包括与靶核酸杂交的约16个至约24个核苷酸，优选约20个核苷酸。在某些实施方案中，向导RNA是约10-500个核苷酸。在其他实施方案中，向导RNA是约20-100个核苷酸。
如本文所用，术语“递送剂”是指与寡核苷酸复合或结合并且介导其进入细胞中的转染剂或配体。所述术语涵盖例如阳离子脂质体，其具有结合至寡核苷酸的负电荷的净正电荷。此术语还涵盖如本文所述的缀合物，例如GalNAc和胆固醇，其可共价连接至寡核苷酸以直接递送至某些组织。本文还描述了其他特定合适的递送剂。
如本文所用，术语“脱氧核糖核苷酸”是指在糖部分的2'位置处具有氢基的核苷酸。经修饰的脱氧核糖核苷酸是除2'位置以外具有一个或多个原子修饰或取代的脱氧核糖核苷酸，包括糖、磷酸基或碱基内部或本身的修饰或取代。
如本文所用，术语“二硫化物”是指含有基团的化合物。典型地，每个硫原子共价结合至烃基。在某些实施方案中，至少一个硫原子共价结合至除烃以外的基团。所述键联也称为SS键或二硫桥。
如本文所用，术语“双链寡核苷酸”或“双链核酸(dsNA)”是指基本上呈双链体形式的寡核苷酸。在一些实施方案中，在共价分离的核酸链的核苷酸的反平行序列之间形成双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对。在一些实施方案中，在共价连接的核酸链的核苷酸的反平行序列之间形成双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对。在一些实施方案中，由折叠(例如，经由发夹环)的单核酸链形成双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对，以提供一起碱基配对的核苷酸的互补反平行序列。在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含彼此完全呈双链的两个共价分离的核酸链。然而，在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含部分呈双链，例如在一端或两端具有悬垂的两个共价分离的核酸链。在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含部分互补的核苷酸的反平行序列，并且因此可具有一个或多个错配，其可包括内部错配或末端错配。
如本文所用，术语“双链体”是关于核酸(例如，寡核苷酸)使用，并且特别是指经由核苷酸的两个反平行序列的互补碱基配对形成的双螺旋结构。
如本文所用，术语“赋形剂”是指可包含于组合物中的非治疗剂，例如，以提供或有助于所需稠度或稳定作用。
如本文所用，术语“呋喃糖”是指具有五元环结构的碳水化合物，
其中所述环结构具有由表示的4个碳原子和一个氧原子，其中数字表示五元环结构中4个碳原子的位置。
如本文所用，术语“肝实质细胞”或“肝细胞”是指肝实质组织的细胞。这些细胞约占肝质量的70-85％，并且制造血清白蛋白、纤维蛋白原和凝血因子(因子3和4除外)的凝血酶原组。肝细胞谱系细胞的标志物可包括但不限于：转甲状腺素蛋白(Ttr)、谷氨酰胺合成酶(Glul)、肝细胞核因子la(Hnfla)和肝细胞核因子4a(Hnf4a)。成熟肝细胞的标志物可包括但不限于：细胞色素P450(Cyp3al l)、反丁烯二酰乙酰乙酸水解酶(Fah)、葡萄糖-6-磷酸(G6p)、白蛋白(Alb)和OC2-2F8。参见例如Huch等人,(2013),NATURE,494(7436):247-50，其与肝细胞标志物有关的内容通过引用并入本文。
如本文所用，术语“谷胱甘肽”(GSH)是指具有结构的三肽。GSH以约1-10mM的浓度存在于细胞中。GSH还原谷胱甘肽敏感键，包括二硫键。在所述过程中，谷胱甘肽转化为其氧化形式，谷胱甘肽二硫化物(GSSG)。一旦氧化，即可使用NADPH作为电子供体，由谷胱甘肽还原酶还原返回谷胱甘肽。
如本文所用，术语“谷胱甘肽敏感性化合物”或“谷胱甘肽敏感性部分”可互换使用，并且是指含有至少一个谷胱甘肽敏感键，例如二硫桥或磺酰基的任何化合物(例如，寡核苷酸、核苷酸或核苷)或部分。如本文所用，“谷胱甘肽敏感性寡核苷酸”是含有至少一个含谷胱甘肽敏感键的核苷酸的寡核苷酸。谷胱甘肽敏感性部分可位于糖部分的2'-碳或3'-碳上，并且包含磺酰基或二硫桥。在某个实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分与亚磷酰胺寡核苷酸合成方法相容，如在例如国际专利申请第PCT/US2017/048239号中所述，所述文献特此通过引用整体并入。谷胱甘肽敏感性部分还可位于含磷核苷酸间键上。在某个实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分选自如PCT/US2013/072536中所述的那些，所述文献特此通过引用整体并入。
如本文所用，术语“核苷酸间键联基团”或“核苷酸间键”是指能够共价连接两个核苷部分的化学基团。典型地，化学基团是含有磷或亚磷酸酯基团的含磷键联基团。磷键联基团意在包括磷酸二酯键、二硫代磷酸酯键、硫代磷酸酯键、磷酸三酯键、硫羰基烷基膦酸酯键、硫羰基烷基磷酸三酯键、亚磷酰胺键、膦酸酯键和/或硼烷磷酸酯键。许多含磷键在本领域中是众所周知的，如在例如美国专利第3,687,808号；第4,469,863号；第4,476,301号；第5,023,243号；第5,177,196号；第5,188,897号；第5,264,423号；第5,276,019号；第5,278,302号；第5,286,717号；第5,321,131号；第5,399,676号；第5,405,939号；第5,453,496号；第5,455,233号；第5,466,677号；第5,476,925号；第5,519,126号；第5,536,821号；第5,541,306号；第5,550,111号；第5,563,253号；第5,571,799号；第5,587,361号；第5,194,599号；第5,565,555号；第5,527,899号；第5,721,218号；第5,672,697号；和第5,625,050号中所公开。在其他实施方案中，寡核苷酸含有一个或多个不含磷原子的核苷酸间键联基团，例如短链烷基或环烷基核苷酸间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷酸间键，或者一个或多个短链杂芳族或杂环核苷酸间键，包括但不限于具有以下的那些：硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架；核糖乙酰基骨架；含烯烃骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；以及酰胺骨架。非含磷键在本领域中是众所周知的，如在例如美国专利第5,034,506号；第5,166,315号；第5,185,444号；第5,214,134号；第5,216,141号；第5,235,033号；第5,264,562号；第5,264,564号；第5,405,938号；第5,434,257号；第5,466,677号；第5,470,967号；第5,489,677号；第5,541,307号；第5,561,225号；第5,596,086号；第5,602,240号；第5,610,289号；第5,602,240号；第5,608,046号；第5,610,289号；第5,618,704号；第5,623,070号；第5,663,312号；第5,633,360号；第5,677,437号；第5,792,608号；第5,646,269号；和第5,677,439号中所公开。
如本文所用，术语“环”是指由核酸的单链形成的结构，其中侧接特定单链核苷酸区域的互补区域以如下方式杂交：互补区域之间的单链核苷酸区域从双链体形成或沃森-克里克碱基配对中排除。环是任何长度的单链核苷酸区域。环的实例包括存在于例如发夹和四环的结构中的未配对核苷酸。
如本文所用，术语“微小RNA”、“成熟微小RNA”、“miRNA”和“miR”可互换，并且是指在植物和动物的基因组中编码的非编码RNA分子。典型地，成熟微小RNA的长度为约18-25个核苷酸。在某些情况下，高度保守、内源表达的微小RNA通过结合至特异性mRNA的3'-非翻译区(3'-UTR)来调控基因的表达。某些成熟微小RNA似乎源自于长内源初级微小RNA转录物(也称为前体微小RNA(pre-microRNA)、初级微小RNA(pri-microRNA、pri-mir、pri-miR)或初级前体微小RNA(pri-pre-microRNA))，其长度通常是数百个核苷酸(Lee等人,EMBO 1,2002,21(17),4663-70)。
如本文所用，术语“经修饰的核苷”是指含有经修饰或通用的核碱基或经修饰的糖中的一者或多者的核苷。经修饰或通用的核碱基(本文中也称为碱基类似物)通常位于核苷糖部分的1'-位置处，并且是指在1'-位置处的除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶以外的核碱基。在某些实施方案中，经修饰或通用的核碱基是含氮碱基。在某些实施方案中，经修饰的核碱基不含氮原子。参见例如美国公开专利申请第20080274462号。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸不含核碱基(无碱基)。经修饰的糖(本文中也称为糖类似物)包括经修饰的脱氧核糖或核糖部分，例如，在糖的2'、3'、4'或5'-碳位置处发生修饰的情况下。经修饰的糖还可包括非天然替代性碳结构，例如存在于以下中的那些：锁核酸(“LNA”)(参见例如Koshkin等人(1998),TETRAHEDRON,54,3607-30)；桥联核酸(“BNA”)(参见例如美国专利第7,427,672号，和Mitsuoka等人(2009),NUCLEIC ACIDS RES.,37(4):1225-38)；和非锁核酸(“UNA”)(参见例如Snead等人(2013),MOLECULAR THERAPY—NUCLEIC ACIDS,2)。在本公开的上下文中，本文描述了合适的经修饰或通用的核碱基或经修饰的糖。
如本文所用，术语“经修饰的核苷酸”是指含有经修饰或通用的核碱基、经修饰的糖或经修饰的磷酸酯中的一者或多者的核苷酸。经修饰或通用的核碱基(本文中通常也称为核碱基)通常位于核苷糖部分的1'-位置处，并且是指在1'-位置处的除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶以外的核碱基。在某些实施方案中，经修饰或通用的核碱基是含氮碱基。在某些实施方案中，经修饰的核碱基不含氮原子。参见例如美国公开专利申请第20080274462号。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸不含核碱基(无碱基)。经修饰的糖(本文中也称为糖类似物)包括经修饰的脱氧核糖或核糖部分，例如，在糖的2'、3'、4'或5'-碳位置处发生修饰的情况下。经修饰的糖还可包括非天然替代性碳结构，例如存在于以下中的那些：锁核酸(“LNA”)(参见例如Koshkin等人(1998),TETRAHEDRON,54,3607-3630)；桥联核酸(“BNA”)(参见例如美国专利第7,427,672号，和Mitsuoka等人(2009),NUCLEIC ACIDS RES.,37(4):1225-38)；和非锁核酸(“UNA”)(参见例如Snead等人(2013),MOLECULAR THERAPY—NUCLEICACIDS,2)。经修饰的磷酸酯基团是指在天然核苷酸中不发生的磷酸酯基团的修饰，并且包括如本文所述的非天然存在的磷酸酯模拟物。经修饰的磷酸酯基团还包括非天然存在的核苷酸间键联基团，包括如本文所述的含磷核苷酸间键联基团和非含磷键联基团两者。在本公开的上下文中，本文描述了合适的经修饰或通用的核碱基、经修饰的糖或经修饰的磷酸酯。
如本文所用，术语“经修饰的核苷酸间键”是指与包含磷酸二酯键的参考核苷酸间键相比具有一个或多个化学修饰的核苷酸间键。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸是非天然存在的键。典型地，经修饰的核苷酸间键向存在经修饰的核苷酸间键的核酸赋予一种或多种所需特性。例如，经修饰的核苷酸可改进热稳定性、抗降解性、核酸酶抗性、溶解性、生物利用度、生物活性、降低的免疫原性等。
如本文所用，术语“裸核酸”是指未配制成保护性脂质纳米粒子或其他保护性制剂的核酸，并且因此当体内施用时暴露于血液和胞内体/溶酶体区室。
如本文所用，术语“天然核苷”是指与糖(例如，脱氧核糖或核糖或其类似物)形成N-糖苷键的杂环含氮碱基。天然杂环含氮碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。
如本文所用，术语“天然核苷酸”是指与连接至磷酸酯基团的糖(例如，核糖或脱氧核糖或其类似物)形成N-糖苷键的杂环含氮碱基。天然杂环含氮碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。
“带缺口的四环结构”是RNAi寡核苷酸的结构，其特征在于存在分离的有义(过客)和反义(向导)链，其中有义链具有与反义链互补的区域，使得两条链形成双链体，并且其中所述链中的至少一者(通常是有义链)从双链体延伸，其中所述延伸段含有四环和形成与四环相邻的茎区域的两个自互补序列，其中四环被配置以稳定由至少一条链的自互补序列形成的相邻茎区域。
如本文所用，术语“核酸或其类似物”是指任何天然或经修饰的核苷酸、核苷、寡核苷酸、常规反义寡核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核酶、RNAi抑制剂分子、反义寡核苷酸(ASO)、短干扰RNA(siRNA)、典型RNA抑制剂分子、适体、安塔够妙、外显子跳跃或剪接改变寡核苷酸、mRNA、miRNA或CRISPR核酸酶系统，其包含本文所述的脂质缀合物中的一者或多者。在某些实施方案中，所提供的核酸或其类似物用于反义寡核苷酸、siRNA和切丁酶(dicer)底物siRNA，包括U.S.2010/331389、U.S.8,513,207、U.S.10,131,912、U.S8,927,705、CA 2,738,625、EP 2,379,083和EP 3,234,132中所述的那些，各文献的全文通过引用并入本文。
如本文所用，术语“核酸抑制剂分子”是指减少或消除靶基因的表达的寡核苷酸分子，其中所述寡核苷酸分子含有特异性靶向靶基因mRNA中的序列的区域。典型地，核酸抑制剂分子的靶向区域包含与靶基因mRNA上的序列充分互补的序列，以将核酸抑制剂分子的作用导向指定靶基因。核酸抑制剂分子可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或经修饰的核苷酸。
如本文所用，术语“核碱基”是指天然核碱基、经修饰的核碱基或通用核碱基。核碱基是杂环部分，其位于可并入核酸双链体中的经修饰核苷酸中的核苷酸糖部分的1'位置(或者可并入核酸双链体中的核苷酸糖部分取代中的等效位置)。因此，本公开提供了包含脂质缀合物的核酸和其类似物，其中所述脂质缀合物由式I或II表示，其中核碱基通常是嘌呤或嘧啶碱基。在一些实施方案中，核碱基还可包括常见碱基鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)或其衍生物，例如适用于制备寡核苷酸的经保护的衍生物。在一些实施方案中，核碱基G、A和C中的每一者独立地包含选自以下的保护基：异丁酰基、乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基、苯氧基乙酰基、异丙基苯氧基乙酰基、苯甲酰基、9-芴基甲氧羰基、苯氧基乙酰基、二甲基甲脒、二丁基甲脒和N,N-二苯基氨基甲酸酯。核碱基类似物可与dsRNA中的其他碱基或碱基类似物形成双链体。核碱基类似物包括适用于本公开的核酸和其类似物和方法中的那些，例如，Benner的美国专利第5,432,272号和第6,001,983号以及Manoharan的美国专利公开第20080213891号中所公开的那些，所述文献通过引用并入本文。核碱基的非限制性实例包括次黄嘌呤(I)、黄嘌呤(X)、3β-D-核糖呋喃糖基-(2,6-二氨基嘧啶)(K)、3-O-D-核糖呋喃糖基-(1-甲基-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7(4H,6H)-二酮)(P)、异胞嘧啶(iso-C)、异鸟嘌呤(iso-G)、1-β-D-核糖呋喃糖基-(5-硝基吲哚)、1-β-D-核糖呋喃糖基-(3-硝基吡咯)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、4-硫-dT,7-(2-噻吩基)-咪唑并[4,5-b]吡啶(Ds)和吡咯-2-甲醛(Pa)、2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤(S)、2-氧代吡啶(Y)、二氟甲苯基、4-氟-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑、3-甲基异喹诺酮基、5-甲基异喹诺酮基和3-甲基-7-丙炔基异喹诺酮基、7-氮杂吲哚基、6-甲基-7-氮杂吲哚基、咪唑并吡啶基、9-甲基-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、异喹诺酮基、7-丙炔基异喹诺酮基、丙炔基-7-氮杂吲哚基、2,4,5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基、4,6-二甲基吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、芪基、稠四苯基、稠五苯基和其结构衍生物(Schweitzer等人,J.ORG.CHEM.,59:7238-7242(1994)；Berger等人,NUCLEIC ACIDS RESEARCH,28(15):2911-2914(2000)；Moran等人,J.AM.CHEM.SOC.,119:2056-2057(1997)；Morales等人,J.AM.CHEM.SOC.,121:2323-2324(1999)；Guckian等人,J.AM.CHEM.SOC.,118:8182-8183(1996)；Morales等人,J.AM.CHEM.SOC.,122(6):1001-1007(2000)；McMinn等人,J.AM.CHEM.SOC.,121:11585-11586(1999)；Guckian等人,J.ORG.CHEM.,63:9652-9656(1998)；Moran等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.,94:10506-10511(1997)；Das等人,J.CHEM.SOC.,PERKIN TRANS.,1:197-206(2002)；Shibata等人,J.CHEM.SOC.,PERKIN TRANS.,1:1605-1611(2001)；Wu等人,J.AM.CHEM.SOC.,122(32):7621-7632(2000)；O'Neill等人,J.ORG.CHEM.,67:5869-5875(2002)；Chaudhuri等人,J.AM.CHEM.SOC.,117:10434-10442(1995)；和美国专利第6,218,108号)。碱基类似物也可为通用碱基。
如本文所用，术语“核苷”是指天然核苷或经修饰的核苷。
如本文所用，术语“核苷酸”是指天然核苷酸或经修饰的核苷酸。
如本文所用，术语“核苷酸位置”是指寡核苷酸中从5'末端的核苷酸计数的核苷酸位置。例如，核苷酸位置1是指寡核苷酸的5'末端核苷酸。
如本文所用，如本文所用的术语“寡核苷酸”是指在2个至2500个核苷酸范围内的核苷酸聚合形式。寡核苷酸可为单链或双链的。在某些实施方案中，寡核苷酸具有500-1500个核苷酸，典型地例如在基因疗法中使用寡核苷酸的情况下。在某些实施方案中，寡核苷酸是单链或双链，并且具有7-100个核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸是单链或双链，并且具有15-100个核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸是单链或双链，具有15-50个核苷酸，典型地例如在寡核苷酸是核酸抑制剂分子的情况下。在另一个实施方案中，寡核苷酸是单链或双链，具有25-40个核苷酸，典型地例如在寡核苷酸是核酸抑制剂分子的情况下。在又一个实施方案中，寡核苷酸是单链或双链并且具有19-40个或19-25个核苷酸，典型地例如在寡核苷酸是双链核酸抑制剂分子并且形成至少18-25个碱基对的双链体的情况下。在其他实施方案中，寡核苷酸是单链并且具有15-25个核苷酸，典型地例如在寡核苷酸的核苷酸是单链RNAi抑制剂分子的情况下。典型地，如本文所述，寡核苷酸含有一个或多个含磷核苷酸间键联基团。在其他实施方案中，如本文所述，核苷酸间键联基团是非含磷键。寡核苷酸可包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或经修饰的核苷酸，包括例如经修饰的核糖核苷酸。寡核苷酸可为单链或双链的。寡核苷酸可能具有或可能不具有双链体区域。作为一组非限制性实例，寡核苷酸可为但不限于小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、切丁酶底物干扰RNA(dsiRNA)、反义寡核苷酸、短siRNA或单链siRNA。在一些实施方案中，双链寡核苷酸是RNAi寡核苷酸。
如本文所用，术语“悬垂”是指在双链核酸抑制剂分子的任一链的任一端处的末端非碱基配对核苷酸。在某些实施方案中，悬垂由延伸超出与第一链或区域形成双链体的互补链的末端的一个链或区域产生。能够经由碱基对的氢键结形成双链体的两个寡核苷酸区域中的一者或两者可具有延伸超出由两个多核苷酸或区域共享的互补性的3'端和/或5'端的5'端和/或3'端。延伸超出双链体的3'端和/或5'端的单链区域被称为悬垂。
如本文所用，术语“药物组合物”包含药理有效量的经磷酸酯类似物修饰的寡核苷酸和药学上可接受的赋形剂。如本文所用，“药理有效量”、“治疗有效量”或“有效量”是指有效产生预期药理、治疗或预防结果的本公开的经磷酸酯类似物修饰的寡核苷酸的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”意指赋形剂适用于人类和/或动物而无过度不良副作用(例如毒性、刺激性和过敏反应)并且与合理效益/风险比相称。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指在合理医学判断的范围内，适合与人类和低等动物的组织接触而无过度毒性、刺激性、过敏反应等并且与合理效益/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐在本领域中是众所周知的。例如，S.M.Berge等人在J.PHARMACEUTICAL SCIENCES,1977,(66)；1-19中详细描述了药学上可接受的盐，所述文献通过引用并入本文。本公开的核酸和其类似物的药学上可接受的盐包括来源于合适的无机和有机酸和碱的那些。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是与例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和过氯酸的无机酸或与例如乙酸、草酸、顺丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、丁二酸或丙二酸的有机酸形成的氨基盐，或通过使用本领域中所用的其他方法如离子交换形成的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、甲酸盐、反丁烯二酸盐、葡萄糖庚酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙烷磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、顺丁烯二酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟碱酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、丁二酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。
来源于适当碱的盐包括碱金属、碱土金属、铵和N+(C1-4烷基)4盐。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。适当时，其他药学上可接受的盐包括无毒铵，季铵，和使用例如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根和芳基磺酸根的抗衡离子形成的胺阳离子。
如本文所用，术语“磷酸酯类似物”是指模拟磷酸酯基团的静电和/或空间特性的化学部分。在一些实施方案中，磷酸酯类似物位于寡核苷酸的5'末端核苷酸处以代替通常易于酶促去除的5'-磷酸酯。在一些实施方案中，5'磷酸酯类似物含有磷酸酶抗性键。磷酸酯类似物的实例包括5'膦酸酯，例如5'亚甲基膦酸酯(5'-MP)和5'-(E)-乙烯基膦酸酯(5'-VP)。在一些实施方案中，寡核苷酸在5'末端核苷酸处具有在糖的4'-碳位置处的磷酸酯类似物(称为“4'-磷酸酯类似物”)。4'-磷酸酯类似物的实例是氧甲基膦酸酯，其中氧甲基的氧原子结合至糖部分(例如，在其4'-碳处)或其类似物。参见例如2017年9月1日提交的国际专利申请PCT/US2017/049909、2016年9月2日提交的美国临时申请第62/383,207号和2016年9月12日提交的美国临时申请第62/393,401号，各文献中与磷酸酯类似物有关的内容通过引用并入本文。已开发针对寡核苷酸的5'端的其他修饰(参见例如WO 2011/133871；美国专利第8,927,513号；和Prakash等人(2015),NUCLEIC ACIDS RES.,43(6):2993-30l l，各文献中与磷酸酯类似物有关的内容通过引用并入本文)。
如本文所用，术语基因的“表达降低”是指与适当参考细胞或受试者相比，细胞或受试者中由基因编码的RNA转录物或蛋白质的量减少和/或基因活性的量减少。例如，与未经双链寡核苷酸(例如，具有与ALDH2 mRNA序列互补的反义链的双链寡核苷酸)处理的细胞相比，用双链寡核苷酸处理细胞的行为可使RNA转录物、蛋白质和/或酶促活性的量减少。类似地，如本文所用的“降低表达”是指使基因(例如，ALDH2)的表达降低的行为。
如本文所用，术语“互补区域”是指核酸(例如，双链寡核苷酸)的核苷酸的序列，其与核苷酸的反平行序列(例如，mRNA内的靶核苷酸序列)充分互补，以允许在适当杂交条件下，例如在磷酸盐缓冲液中、在细胞中等等，核苷酸的两个序列之间进行杂交。互补区域可与核苷酸序列(例如，存在于mRNA或其部分内的靶核苷酸序列)完全互补。例如，与mRNA中存在的核苷酸序列完全互补的互补区域具有与mRNA中的相应序列互补而无任何错配或空位的连续核苷酸序列。或者，互补区域可与核苷酸序列(例如，存在于mRNA或其部分中的核苷酸序列)部分地互补。例如，与mRNA中存在的核苷酸序列部分地互补的互补区域具有与mRNA中的相应序列互补，但与mRNA中的相应序列相比含有一个或多个错配或空位(例如，1、2、3个或更多个错配或空位)的连续核苷酸序列，条件是互补区域仍能够在适当杂交条件下与mRNA杂交。在一些实施方案中，互补区域的长度为至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个核苷酸。
如本文所用，术语“链”是指经由核苷酸间键(例如，磷酸二酯键、硫代磷酸酯键)连接在一起的单个连续核苷酸序列。在一些实施方案中，链具有两个自由端，例如，5'端和3'端。
如本文所用，术语“受试者”意指任何哺乳动物，包括小鼠、兔和人类。在一个实施方案中，受试者是人类或非人类灵长类动物。术语“个体”或“患者”可与“受试者”互换使用。
如本文所用，术语“合成”是指人工合成(例如，使用机器(例如，固态核酸合成器))或以其他方式不来源于通常产生分子的天然来源(例如，细胞或生物体)的核酸或其他分子。
如本文所用，术语“合适的前药”意在指示可在生理条件下或通过溶剂分解而转化为本文所述的生物活性核酸或其类似物的化合物。因此，术语“前药”是指药学上可接受的生物活性核酸或其类似物的前体。前药在向受试者施用时可能无活性，但在体内转化为活性化合物，例如，通过水解。前药化合物通常在哺乳动物生物体中提供溶解性、组织相容性或延迟释放的优点(参见例如Bundgard,H.,DESIGN OF PRODRUGS(1985),第7-9页,第21-24页(Elsevier,Amsterdam)。前药的论述提供于Higuchi,T.等人,“Pro-drugs as NovelDelivery Systems”,A.C.S.Symposium Series,第14卷，和BIOREVERSIBLE CARRIERS IN DRUGDESIGN,Edward B.Roche编,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987中，所述两个文献均通过引用全部并入本文。术语“前药”还意在包括任何共价键结的载剂，当向哺乳动物受试者施用此种前药时，其体内释放活性化合物。如本文所述的活性化合物的前药可通过以如下方式修饰活性化合物中存在的官能团来制备：所述修饰在常规操作下或体内裂解，得到母体活性化合物。前药包括其中羟基、氨基或巯基键结至任何基团的化合物，当向哺乳动物受试者施用活性化合物的前药时，所述基团裂解以分别形成游离羟基、游离氨基或游离巯基。合适的前药的实例包括但不限于谷胱甘肽、酰氧基、硫代酰氧基、2-烷氧羰基乙基、二硫化物、硫胺素(thiaminal)，和经磷原子修饰的核酸的烯醇酯衍生物。术语“前体寡核苷酸”或“前体核苷酸”或“核酸前药”是指已修饰为寡核苷酸的前药的寡核苷酸。膦酸酯和磷酸酯前药可见于例如Wiener等人,“Prodrugs or phosphonates andphosphates:crossing the membrane”TOP.CURR.CHEM.2015,360:115-160中，所述文献的全文通过引用并入本文。
如本文所用，短语“合适的羟基保护基”在本领域中是众所周知的，并且当与所结合的氧原子一起时独立地选自酯、醚、甲硅烷基醚、烷基醚、芳基烷基醚和烷氧基烷基醚。此类酯的实例包括甲酸酯、乙酸酯、碳酸酯和磺酸酯。具体实例包括甲酸酯、苯甲酰基甲酸酯、氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯、4,4-(亚乙基二硫基)戊酸酯、新戊酸酯(三甲基乙酰基)、巴豆酸酯、4-甲氧基-巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯甲基苯甲酸酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯、碳酸酯，例如甲基、9-芴基甲基、乙基、2,2,2-三氯乙基、2-(三甲基甲硅烷基)乙基、2-(苯基磺酰基)乙基、乙烯基、烯丙基和对硝基苯甲基。此类甲硅烷基醚的实例包括三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基和其他三烷基甲硅烷基醚。烷基醚包括甲基、苯甲基、对甲氧基苯甲基、3,4-二甲氧基苯甲基、三苯甲基、叔丁基、烯丙基和烯丙氧羰基醚或衍生物。烷氧基烷基醚包括缩醛，例如甲氧基甲基、甲硫基甲基、(2-甲氧基乙氧基)甲基、苯甲氧基甲基、β-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基和四氢吡喃基醚。芳基烷基醚的实例包括苯甲基、对甲氧基苯甲基、3,4-二甲氧基苯甲基、邻硝基苯甲基、对硝基苯甲基、对卤苯甲基、2,6-二氯苯甲基、对氰基苯甲基以及2-吡啶甲基和4-吡啶甲基。在一些实施方案中，合适的羟基保护基是酸不稳定性基团，例如三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr)、4,4',4”-三甲氧基三苯甲基、9-苯基-二苯并吡喃-9-基、9-(对甲苯基)-二苯并吡喃-9-基、苯基呫吨基(pixyl)、2,7-二甲基苯基呫吨基等，其适合于在酸敏感性寡核苷酸的溶液相和固相合成期间使用例如二氯乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸或乙酸进行脱保护。叔丁基二甲基甲硅烷基在用于合成期间去除DMTr基团的酸性条件下是稳定的，但可在用氟化物来源，例如氟化四丁基铵或氟化氢吡啶使RNA寡聚物裂解和脱保护之后去除。
如本文所用，短语“合适的氨基保护基”在本领域中是众所周知的，并且当与其所连接的氮一起时包括但不限于芳烷基胺、氨基甲酸酯、烯丙胺、酰胺等。胺的单保护基的实例包括叔丁氧羰基(BOC)、乙氧羰基、甲氧羰基、三氯乙氧羰基、烯丙氧羰基(Alloc)、苯甲基氧代羰基(CBZ)、烯丙基、苯甲基(Bn)、芴基甲基羰基(Fmoc)、乙酰基、氯乙酰基、二氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、苯基乙酰基、苯甲酰基等。胺的双保护基的实例包括经两个独立地选自上文描述为单保护基的那些的取代基取代的胺，并且还包括环状酰亚胺，例如邻苯二甲酰亚胺、顺丁烯二酰亚胺、丁二酰亚胺、2,2,5,5-四甲基-1,2,5-氮杂二硅杂环戊烷、叠氮化物等。应了解，在氨基保护基发生酸水解后，形成其盐化合物。例如，当通过用例如盐酸的酸处理来去除氨基保护基时，则将形成其盐酸盐形式的所得胺化合物。本领域普通技术人员将认识到，广泛多种酸可用于去除对酸不稳定的氨基保护基，并因此涵盖广泛多种盐形式。
如本文所用，术语“亚磷酰胺”是指含氮三价磷衍生物。本文描述了合适的亚磷酰胺的实例。
如本文所用，“效力”是指必须体内或体外施用以获得针对细胞中的预期靶标的特定活性水平的寡核苷酸或其他药物的量。例如，以1mg/kg的剂量在受试者中使其靶标的表达受到90％抑制的寡核苷酸比以100mg/kg的剂量在受试者中使其靶标的表达受到90％抑制的寡核苷酸具有更大效力。
如本文所用，术语“保护基”在常规化学意义上用作在所需反应的某些条件下可逆地促使官能团无反应性的基团。在所需反应之后，可去除保护基以使经保护的官能团脱保护。所有保护基应在不使所合成分子的实质性部分降解的条件下可去除。
如本文所用，术语“所提供的核酸”是指本文所陈述的任何属、亚属和/或种类。
如本文所用，术语“核糖核苷酸”是指具有呈戊糖形式的核糖的核苷酸，在其2'位置处含有羟基。经修饰的核糖核苷酸是除2'位置以外具有一个或多个原子修饰或取代的核糖核苷酸，包括核糖、磷酸酯基团或碱基内部或本身的修饰或取代。
如本文所用，术语“核酶”是指特异性识别独特靶核酸序列并使其裂解的催化核酸分子，所述靶核酸序列可为DNA或RNA。每个核酶具有催化组分(也称为“催化结构域”)和由两个结合结构域组成的靶序列结合组分，每个结合结构域在催化结构域的任一侧上。
如本文所用，术语“RNAi抑制剂分子”是指(a)具有有义链(过客)和反义链(向导)的双链核酸抑制剂分子(“dsRNAi抑制剂分子”)，其中反义链或反义链的一部分由Argonaute 2(Ago2)核酸内切酶用于靶mRNA的裂解中，或(b)具有单个反义链的单链核酸抑制剂分子(“ssRNAi抑制剂分子”)，其中所述反义链(或所述反义链的一部分)由Ago2核酸内切酶用于靶mRNA的裂解中。
双链RNAi抑制剂分子包含两个寡核苷酸链：反义链和有义链。有义链或其区域与双链RNAi抑制剂分子或其区域的反义链部分地、基本上或完全互补。在某些实施方案中，有义链还可含有与反义链不互补的核苷酸。非互补核苷酸可在互补序列的任一侧或可在互补序列的两侧。在某些实施方案中，在有义链或其区域与反义链或其区域部分地或基本上互补的情况下，非互补核苷酸可位于一个或多个互补区域(例如，一个或多个错配)之间。有义链也称为过客链。
如本文所用，术语“全身施用”是指药物在血流中的体内全身吸收或积累，接着分布于全身。
如本文所用，术语“靶位点”、“靶序列”、“靶核酸”、“靶区域”、“靶基因”可互换使用，并且是指“靶向”的RNA或DNA序列，例如，用于由RNAi抑制剂分子介导的裂解，所述RNAi抑制剂分子在其向导/反义区域内含有与所述靶序列部分地、基本上或完全或充分互补的序列。
如本文所用，术语“靶向配体”是指选择性结合至所关注的组织或细胞的同源分子(例如，受体)，并且可与另一种物质缀合以实现将另一种物质靶向所关注的组织或细胞的目的的分子(例如，碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质)。例如，在一些实施方案中，靶向配体可与寡核苷酸缀合以实现将寡核苷酸靶向所关注的特定组织或细胞的目的。在一些实施方案中，靶向配体选择性结合至细胞表面受体。因此，在一些实施方案中，靶向配体当与寡核苷酸缀合时，经由选择性结合至细胞表面上表达的受体和包含寡核苷酸、靶向配体和受体的复合物由细胞进行胞内体内化而促进寡核苷酸递送至特定细胞中。在一些实施方案中，靶向配体经由接头与寡核苷酸结合，所述接头在细胞内化之后或期间裂解，以使寡核苷酸从细胞中的靶向配体释放。
如本文所用，术语“治疗”是指例如经由向有需要的受试者施用治疗剂(例如，寡核苷酸)而向所述受试者提供照护的行为，以实现关于现有疾患(例如，疾病、病症)改善受试者的健康和/或福祉的目的或者预防或降低疾患发生的可能性。在一些实施方案中，治疗涉及降低受试者经历的疾患(例如，疾病、病症)的至少一种征象、症状或促成因素的频率或严重程度。
如本文所用，术语“四环”是指形成稳定二级结构的环(单链区域)，所述二级结构促成相邻沃森-克里克杂交的核苷酸的稳定性。不受理论限制，四环可通过堆栈相互作用来稳定相邻沃森-克里克碱基对。另外，四环中核苷酸之间的相互作用包括但不限于非沃森-克里克碱基配对、堆栈相互作用、氢键结和接触相互作用(Cheong等人,NATURE 1990；346(6285):680-2；Heus和Pardi,SCIENCE 1991；253(5016):191-4)。四环赋予相邻双链体的解链温度(Tm)的升高，所述升高高于由随机碱基组成的简单模型环序列所预期的。例如，四环可在10mM NaHPO4中向包含长度为至少2个碱基对的双链体的发夹赋予至少50℃、至少55℃、至少56℃、至少58℃、至少60℃、至少65℃或至少75℃的解链温度。四环可含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核苷酸和其组合。在某些实施方案中，四环由四个核苷酸组成。在某些实施方案中，四环由五个核苷酸组成。
RNA四环的实例包括四环的UNCG家族(例如，UUCG)、四环的GNRA家族(例如，GAAA)和CUUG四环。(Woese等人,PNAS,1990,87(21):8467-71；Antao等人,NUCLEIC ACIDS RES.,1991,19(21):5901-5)。DNA四环的实例包括四环的d(GNNA)家族(例如，d(GTTA))、四环的d(GNRA)家族、四环的d(GNAB)家族、四环的d(CNNG)家族和四环的d(TNCG)四环家族(例如，d(TTCG))。(Nakano等人,BIOCHEMISTRY,2002,41(48):14281-14292，Shinji等人,NIPPON KAGAKKAIKOEN YOKOSHU,2000,78(2):731)，所述文献的相关公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，四环包含于带缺口的四环结构内。
如本文所用，“通用碱基”是指位于经修饰的核苷酸中的核苷酸糖部分的1'位置或核苷酸糖部分取代中的等效位置处的杂环部分，当存在于核酸双链体中时，其可与多于一种类型的碱基相对定位而不会改变双螺旋结构(例如，磷酸酯骨架的结构)。另外，通用碱基不会破坏其所处的单链核酸与靶核酸形成双链体的能力。可通过本领域技术人员显而易见的方法(例如，UV吸收、圆二色性、凝胶位移、单链核酸酶敏感性等)来测定含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体的能力。另外，观察到双链体形成的条件可改变以确定双链体的稳定性或形成，例如温度，因为解链温度(Tm)与核酸双链体的稳定性相关。相较于与靶核酸完全互补的参考单链核酸，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，所述双链体的Tm低于与互补核酸形成的双链体。然而，与其中通用碱基已用某个碱基代替以产生单个错配的参考单链核酸相比，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，所述双链体的Tm高于与具有错配碱基的核酸形成的双链体。
一些通用碱基能够通过通用碱基与所有碱基鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)之间在碱基对形成条件下形成氢键来进行碱基配对。通用碱基不是仅与单个互补碱基形成碱基对的碱基。在双链体中，通用碱基可与双链体的相对链上与其相对的G、C、A、T和U中的每一者不形成氢键，形成一个氢键或多于一个氢键。优选地，通用碱基不与双链体的相对链上与其相对的碱基相互作用。在双链体中，通用碱基之间发生碱基配对，而不会改变磷酸酯骨架的双螺旋结构。通用碱基也可通过堆栈相互作用与同一核酸链上的相邻核苷酸中的碱基相互作用。此类堆栈相互作用使双链体稳定，尤其是在通用碱基不与双链体的相对链上与其相对定位的碱基形成任何氢键的情况下。通用结合核苷酸的非限制性实例包括肌苷、1-O-D-核糖呋喃糖基-5-硝基吲哚和/或1-β-D-核糖呋喃糖基-3-硝基吡咯(Quay等人的美国专利申请公开第20070254362号；Van Aerschot等人,Anacyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguous nucleoside,NUCLEICACIDS RES.1995年11月11日；23(21):4363-70；Loakes等人,3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR,NUCLEICACIDS RES.1995年7月11日；23(13):2361-66；Loakes和Brown,5-Nitroindole as auniversal base analogue,NUCLEIC ACIDS RES.1994年10月11日；22(20):4039-43)。
可将包含一个或多个脂质缀合物的所公开的核酸或其类似物并入多种不同的寡核苷酸结构(或形式)中。例如，在一些实施方案中，可将所公开的核酸并入包含长度均在17至36个核苷酸范围内的有义和反义链的寡核苷酸中。在一些实施方案中，提供并有所公开的核酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸在有义链的3'延伸内具有四环结构并且在反义链的3'端处具有两个末端悬垂核苷酸。在一些实施方案中，两个末端悬垂核苷酸是GG。典型地，反义链的两个末端GG核苷酸中的一者或两者与靶标互补或不互补。
在一些实施方案中，提供并有所公开的包含一个或多个脂质缀合物的核酸或其类似物的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有长度均在21至23个核苷酸范围内的有义链和反义链。在一些实施方案中，在长度为1或2个核苷酸的有义链、反义链或有义链和反义链两者上提供3'悬垂。在一些实施方案中，寡核苷酸具有23个核苷酸的向导链和21个核苷酸的过客链，其中过客链的3'端与向导链的5'端形成钝端，并且其中向导链具有两个核苷酸的3'悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸-配体缀合物是具有钝端的双链体结构。在一些实施方案中，缀合物具有截短的过客/有义链。
在一些实施方案中，寡核苷酸的1个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸包含脂质缀合物。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸的2至4个核苷酸各自与单独的脂质缀合物缀合。在一些实施方案中，2至4个核苷酸在有义链或反义链的任一端包含脂质缀合物(例如，脂质与有义链或反义链的5'或3'端的2至4个核苷酸悬垂或延伸缀合)，使得脂质部分类似于牙刷的刷毛并且寡核苷酸类似于牙刷。例如，所提供的寡核苷酸可在有义链的5'或3'端包含茎环，并且茎环的1、2、3或4个核苷酸可个别地与脂质缀合。
在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸与单价脂质缀合物缀合。在一些实施方案中，寡核苷酸与多于一个单价脂质缀合物缀合(即，与2、3或4个单价脂质缀合物缀合，并且典型地与3或4个单价脂质缀合物缀合)。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸与一个或多个二价脂质缀合物、三价脂质缀合物或四价脂质缀合物部分缀合。
在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸在核苷酸的2'或3'位置处与金刚烷基或脂质部分缀合。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸在核苷酸的5'端与金刚烷基或脂质部分缀合。
在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸的1个或更多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自与一个或多个脂质缀合物缀合。在一些实施方案中，茎环的环的2至4个核苷酸各自与单独的脂质缀合物缀合。在一些实施方案中，脂质与有义链或反义链的任一端的2至4个核苷酸缀合(例如，脂质与有义链或反义链的5'或3'端的2至4个核苷酸悬垂或延伸缀合)，使得脂质部分类似于牙刷的刷毛并且寡核苷酸类似于牙刷。例如，寡核苷酸可在有义链的5'或3'端包含茎环，并且茎环的1、2、3或4个核苷酸可个别地与脂质部分缀合。在一些实施方案中，脂质部分与有义链的核苷酸缀合。例如，四个脂质部分可与有义链的四环中的核苷酸缀合，其中每个脂质部分与一个核苷酸缀合。
i.寡核苷酸结构
在本公开的方法中存在多种适用于靶向RNA的寡核苷酸结构，包括RNAi、miRNA等。包含本文所述的一个或多个脂质缀合物的寡核苷酸可用作并有或靶向RNA序列的框架。用于靶向RNA表达(例如，经由RNAi途径)的双链寡核苷酸通常具有彼此形成双链体的有义链和反义链。在一些实施方案中，有义链与反义链不共价连接。然而，在一些实施方案中，有义链与反义链共价连接。
在一些实施方案中，提供双链寡核苷酸用于降低RNA表达接合RNA干扰(RNAi)的表达。例如，已开发RNAi寡核苷酸，其中每条链具有19-25个核苷酸的大小与至少一个1至5个核苷酸的3'悬垂(参见例如美国专利第8,372,968号)。还已开发更长的寡核苷酸，其由切丁酶加工以产生活性RNAi产物(参见例如美国专利第8,883,996号)。进一步工作产生延伸的双链寡核苷酸，其中至少一条链的至少一端延伸超出双链体靶向区域，包括其中一条链包括热力学稳定的四环结构的结构(参见例如美国专利第8,513,207号和第8,927,705号，以及W02010/033225，所述文献关于这些寡核苷酸的公开内容通过引用并入本文)。此类结构可包括单链延伸(在分子的一侧或两侧)以及双链延伸。
在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸的长度可在21至23个核苷酸的范围内。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可在有义链和/或反义链的3'端具有悬垂(例如，长度为1、2或3个核苷酸)。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸(例如，siRNA)可包含与靶RNA反义的21个核苷酸的向导链和互补的过客链，其中所述两条链粘接形成l9-bp双链体和在任一个或两个3'端的2个核苷酸悬垂。参见例如US9012138、US9012621和US9193753，各文献关于其相关公开内容并入本文。
在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸具有36个核苷酸的有义链，其包含延伸超出反义-有义双链体的区域，其中延伸区域具有茎-四环结构，其中茎是六个碱基对的双链体并且其中四环具有四个核苷酸。在那些实施方案中的某些实施方案中，除一个或多个脂质缀合物以外，四环核苷酸中的一者或多者各自与单价GalNac配体缀合。
在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸包含12-25个核苷酸的有义链和19-27个核苷酸的反义链，其当由切丁酶作用时产生并入成熟RISC中的反义链。
在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸包含25个核苷酸的有义链和27个核苷酸的反义链，其当由切丁酶作用时产生并入成熟RISC中的反义链。
用于本文所公开的组合物和方法的其他寡核苷酸设计包括：l6-mer siRNA(参见例如NUCLEIC ACIDS IN CHEMISTRY AND BIOLOGY.Blackburn(编),ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY,2006)、shRNA(例如，具有19bp或更短的茎；参见例如Moore等人METHODS MOL.BIOL.2010；629:141-58)、钝siRNA(例如，长度为19bp；参见例如Kraynack和Baker,RNA第12卷,r163-176(2006))、不对称siRNA(aiRNA；参见例如Sun等人,NAT.BIOTECHNOL.26,1379-1382(2008))、不对称较短双链体siRNA(参见例如Chang等人,MOL THER.2009年4月；17(4):725-32)、叉形siRNA(参见例如Hohjoh,FEBS LETTERS,第557卷,期号1-3；(2004年1月),第193-98页)、单链siRNA(Elsner；NATURE BIOTECHNOLOGY 30,1063(2012))、哑铃形环状siRNA(参见例如Abe等人J AM CHEMSOC 129:15108-15109(2007))，和小内部分段干扰RNA(sisiRNA；参见例如Bramsen等人,NUCLEIC ACIDS RES.2007年9月；35(17):5886-97)。前述参考文献中的每一者关于其中的相关公开内容通过引用整体并入。在一些实施方案中可用于降低或抑制基因表达的寡核苷酸结构的其他非限制性实例是微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和短siRNA(参见例如Hamilton等人,EMBO J.,2002,21(17):4671-4679；还参见美国申请第20090099115号)。
如本公开中已显示，经由RNA干扰机制起作用的siRNA可用于靶向mRNA序列的识别和降解。现有技术中的主要困难是将siRNA递送至肝外靶细胞的低效率和各种生物流体中核酸酶对siRNA的降解，这些困难已足以阻止siRNA向各种组织的有用全身递送。然而，根据本发明，各种缀合物还可与本文所提供的化学结构相结合使用，以增强并且能够实现向哺乳动物宿主内的各种器官系统和组织的递送。根据现有技术，此类缀合物已采取阳离子脂质溶液、聚合物和纳米粒子的形式。根据本发明，本文所提供的结构可被缀合以包括各种生物分子。此类分子包括并且不限于小亲脂性分子或链、抗体、适体、配体、肽或各种尺寸中的每一者的聚合物。此类缀合物是优选的，这是因为其不需要正电荷来形成复合物，具有有限毒性并且免疫原性较低。
此类缀合物在过客链和/或向导链上还可具有多种位置和成簇模式。此种定位可有助于促进siRNA使靶mRNA降解的效率和能力。如所知，siRNA是聚阴离子并且因此不能直接穿透疏水性细胞膜，并且仅可通过内吞作用或胞饮作用进入细胞。同样地，如本文所述的化学修饰可影响本发明的siRNA分子的特性，包括：其对核糖核酸酶的敏感性、由RNAi系统的识别、疏水性、毒性、双链体解链温度和RNA螺旋的构象。典型地，修饰可分为核糖、磷酸酯和核碱基的修饰。据推测，双链体的总解链点可促进siRNA干扰活性的效率(Park和Shin,2015)。因此，根据本发明，位于发夹的除茎环以外的不同位置处的缀合物还将对siRNA分子的有效性有影响。连接至siRNA发夹分子的多个缀合物的使用既可集中于dsRNA的一段或一端，还可分散于寡核苷酸链的整个长度上。此类多个缀合物典型地将是短脂族链，并且产生具有显著缩短的过客链的分子。
在此类寡核苷酸修饰的另一个实施方案中，可添加双环衍生物(LNA)以保持较短的过客链稳定，同时显著提高所得siRNA的解链温度。在LNA的情况下，归因于2'碳与4'碳之间的额外环，其固定3'内核糖构象(Julien等人,2008)，因此每个核苷酸对互补链的亲和力提高2-8℃。然而，将此种修饰引入siRNA中会强烈影响其干扰活性，并且反义链对这种修饰尤其敏感。
由于双链体的热不对称性为“向导”链选择作出主要贡献，因此稳定由反义链的3'端和有义链的5'端形成的双链体的修饰和相反地去稳定由有义链的3'端和反义链的5'端形成的双链体的修饰可通过提供有利的双链热不对称性来提高RNAi的效率。因此，在双链体的不同末端引入LNA、UNA或GNA可通过增加将反义链并入RISC中的可能性而使siRNA效率提高(Vaish等人,2011)。使用缀合作为将siRNA递送至细胞的方法涉及在本领域中较早地与各种分子形成siRNA缀合物。此类缀合已包括使用叶酸盐或胆固醇(Thomas等人,2009；和Letsinger等人,1989)、抗体(Dassie等人,2009)、适体(Aronin,2006)、小肽(Cesarone等人,2007)和碳水化合物(Nair等人,2014)。此类参考文献通过引用并入本文。根据本发明，缀合分子用于通过已知的生理转运机制(例如：胆固醇(Lorenz等人,2004))帮助将分子递送至靶细胞并穿透细胞。此类短链缀合物、甚至乙基或丙基缀合物将改变本发明的寡核苷酸的行为，条件是存在所述缀合物中的一者以上。
a.反义链
在一些实施方案中，提供了包含一个或多个脂质缀合物的寡核苷酸以靶向包含反义链的RNA。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸包含反义链，所述反义链包含或由至少12个(例如，至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸的序列组成。
在一些实施方案中，所提供的双链寡核苷酸可具有长度为至多40个核苷酸(例如，长度为至多40个、至多35个、至多30个、至多27个、至多25个、至多21个、至多19个、至多17个或至多12个核苷酸)的反义链。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可具有长度为至少12个核苷酸(例如，长度为至少12个、至少15个、至少19个、至少21个、至少25个、至少27个、至少30个、至少35个或至少38个核苷酸)的反义链。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可具有长度在12至40个(例如，12至40个、12至36个、12至32个、12至28个、15至40个、15至36个、15至32个、15至28个、17至21个、17至25个、19至27个、19至30个、20至40个、22至40个、25至40个或32至40个)范围内的核苷酸的反义链。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可具有长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的反义链。
在一些实施方案中，寡核苷酸的反义链可称为“向导链”。例如，如果反义链可与RNA诱导的沉默复合物(RISC)接合并结合至Argonaut蛋白，或接合并结合至一个或多个类似因子，并且引导靶基因的沉默，则其可称为向导链。在一些实施方案中，与向导链互补的有义链可称为“过客链”。
b.有义链
在一些实施方案中，提供了包含一个或多个脂质缀合物的寡核苷酸以靶向包含有义链的RNA。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸具有有义链，所述有义链包含或由至少12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸的序列组成。
在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可具有长度为至多40个核苷酸(例如，长度为至多40个、至多35个、至多30个、至多27个、至多25个、至多21个、至多19个、至多17个或至多12个核苷酸)的有义链(或过客链)。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可具有长度为至少12个核苷酸(例如，长度为至少12个、至少15个、至少19个、至少21个、至少25个、至少27个、至少30个、至少35个或至少38个核苷酸)的有义链。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可具有长度在12至40个(例如，12至40个、12至36个、12至32个、12至28个、15至40个、15至36个、15至32个、15至28个、17至21个、17至25个、19至27个、19至30个、20至40个、22至40个、25至40个或32至40个)范围内的核苷酸的有义链。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可具有长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的有义链。
在一些实施方案中，所提供的有义链在其3'端包含茎环结构。在一些实施方案中，所提供的有义链在其5'端包含茎环结构。在一些实施方案中，所提供的茎是长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，所提供的茎环为分子提供更好的针对降解(例如，酶促降解)的保护，并且促进靶向特征以递送至靶细胞。例如，在一些实施方案中，环提供添加的核苷酸，可在其上进行修饰而基本上不影响寡核苷酸的基因表达抑制活性。在某些实施方案中，本文提供了寡核苷酸，其中有义链包含(例如，在其3'端)如下所示的茎环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在Si与S2之间形成长度为至多10个核苷酸(例如，长度为3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的环。
在一些实施方案中，茎环所提供的环是四环(例如，在带缺口的四环结构内)。四环可含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核苷酸和其组合。典型地，四环具有4至5个核苷酸。
c.双链体长度
在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为至少12个(例如，至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少21个)核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度在12-30个核苷酸的范围内(例如，长度为12至30个、12至27个、12至22个、15至25个、18至30个、18至22个、18至25个、18至27个、18至30个、19至30个或21至30个核苷酸)。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体不跨越有义链和/或反义链的整个长度。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间的双链体跨越有义链或反义链任一者的整个长度。在某些实施方案中，在有义链与反义链之间的双链体跨越有义链和反义链两者的整个长度。
d.寡核苷酸末端
在一些实施方案中，包含一个或多个本文所述的脂质缀合物的寡核苷酸包含有义链和反义链，使得在有义链或反义链任一者上或有义链和反义链两者上存在3'悬垂。在一些实施方案中，本文所提供的寡核苷酸具有一个5'端，所述5'端与另一个5'端相比在热力学上较不稳定。在一些实施方案中，提供不对称寡核苷酸，其包括在有义链的3'端的钝端和在反义链的3'端的悬垂。在一些实施方案中，反义链上的3'悬垂的长度为1-8个核苷酸(例如，长度为1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸)。
典型地，所提供的RNAi寡核苷酸在反义(向导)链的3'端具有两个核苷酸的悬垂。然而，可能存在其他悬垂。在一些实施方案中，悬垂是3'悬垂，其长度在1个与6个核苷酸之间，任选地1至5个、1至4个、1至3个、1至2个、2至6个、2至5个、2至4个、2至3个、3至6个、3至5个、3至4个、4至6个、4至5个、5至6个核苷酸，或1、2、3、4、5或6个核苷酸。然而，在一些实施方案中，悬垂是5'悬垂，其长度在1个与6个核苷酸之间，任选地1至5个、1至4个、1至3个、1至2个、2至6个、2至5个、2至4个、2至3个、3至6个、3至5个、3至4个、4至6个、4至5个、5至6个核苷酸，或1、2、3、4、5或6个核苷酸。
在一些实施方案中，有义链和/或反义链的3'端或5'端的一个或多个(例如，2、3、4个)末端核苷酸经修饰。例如，在一些实施方案中，反义链的3'端的一个或两个末端核苷酸经修饰。在一些实施方案中，反义链的3'端的最后一个核苷酸经修饰，例如包含2'-修饰，例如2'-O-甲氧基乙基。在一些实施方案中，反义链的3'端的最后一个或两个末端核苷酸与靶标互补。在一些实施方案中，反义链的3'端的最后一个或两个核苷酸不与靶标互补。在一些实施方案中，有义链或反义链的5'端和/或3'端具有反向帽核苷酸。
e.错配
在一些实施方案中，有义链与反义链之间存在一个或多个(例如1、2、3、4、5个)错配。如果有义链与反义链之间存在多于一个错配，则其可连续地定位(例如，一行中2个、3个或更多个)，或散布于整个互补区域中。在一些实施方案中，有义链的3'末端含有一个或多个错配。在一个实施方案中，在有义链的3'末端并入两个错配。在一些实施方案中，寡核苷酸有义链的3'端的区段的碱基错配或去稳定化可能通过促进切丁酶加工而改善RNAi中的合成双链体的效力。
ii.单链寡核苷酸
在一些实施方案中，所提供的用于降低RNA表达的包含脂质缀合物的寡核苷酸是单链的。此类结构可包括但不限于单链RNAi寡核苷酸。最近的努力已证明单链RNAi寡核苷酸的活性(参见例如Matsui等人(2016年5月),MOLECULAR THERAPY,第24卷(5),946-55)。然而，在一些实施方案中，本文所提供的寡核苷酸是反义寡核苷酸(ASO)。反义寡核苷酸是具有核碱基序列的单链寡核苷酸，当以5'至3'方向书写时，所述核碱基序列包含特定核酸的靶向区段的反向互补序列并且被适当修饰(例如，作为间聚体(gapmer))以诱导细胞中RNaseH介导的靶RNA的裂解或(例如，作为混聚体(mixmer))以抑制细胞中靶mRNA的翻译。可用于本公开中的反义寡核苷酸可按本领域中已知的任何合适的方式进行修饰，包括例如美国专利第9,567,587号中所示，所述专利关于反义寡核苷酸的修饰(包括例如长度、核碱基(嘧啶、嘌呤)的糖部分和核碱基的杂环部分的改变)的公开内容通过引用并入本文。此外，反义分子数十年来已用于降低特异性靶基因的表达(参见例如Bennett等人；Pharmacology ofAntisense Drugs,Annual Review of Pharmacology and Toxicology,第57卷:81-105)。
iii.寡核苷酸修饰
所提供的包含脂质缀合物的寡核苷酸可按各种方式进行修饰，以改进或控制特异性、稳定性、递送、生物利用度、对核酸酶降解的抗性、免疫原性、碱基配对特性、RNA分布和细胞摄取以及与治疗或研究用途相关的其他特征。参见例如Bramsen等人,NUCLEIC ACIDSRES.,2009,37,2867-81；Bramsen和Kjems(FRONTIERS IN GENETICS,3(2012):1-22)。因此，在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸可包括一个或多个合适的修饰。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸在其碱基(或核碱基)、糖(例如，核糖、脱氧核糖)或磷酸酯基团中具有修饰。
寡核苷酸上的修饰数目和那些核苷酸修饰的位置可能影响寡核苷酸的特性。例如，寡核苷酸可通过将其包含于脂质纳米粒子(LNP)或类似载剂中而在体内递送。然而，当寡核苷酸不受LNP或类似载剂保护(例如，“裸递送”)时，其核苷酸中的至少一些核苷酸被修饰可为有利的。因此，在本文所提供的寡核苷酸中的任一者的某些实施方案中，寡核苷酸的所有或基本上所有核苷酸被修饰。在某些实施方案中，多于一半的核苷酸被修饰。在某些实施方案中，少于一半的核苷酸被修饰。典型地，在裸递送的情况下，每种糖都在2'位置处被修饰。这些修饰可为可逆的或不可逆的。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸具有足以促成所需特征(例如，防止酶促降解、在体内施用后靶向所需细胞的能力和/或热力学稳定性)的数目和类型的经修饰核苷酸。
a.糖修饰
在一些实施方案中，经修饰的糖(本文中也称为糖类似物)包括经修饰的脱氧核糖或核糖部分，例如，其中一个或多个修饰在糖的2'、3'、4'和/或5'碳位置处发生。在一些实施方案中，经修饰的糖还可包括非天然替代性碳结构，例如存在于以下中的那些：锁核酸(“LNA”)(参见例如Koshkin等人(1998),TETRAHEDRON 54,3607-3630)、非锁核酸(“UNA”)(参见例如Snead等人(2013),MOLECULAR THERAPY-NUCLEIC ACIDS,2,el03)和桥联核酸(“BNA”)(参见例如Imanishi和Obika(2002),THE ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY,CHEM.COMMUN.,1653-1659)。Koshkin等人、Snead等人以及Imanishi和Obika与糖修饰有关的公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，糖中的核苷酸修饰包括2'-修饰。在某些实施方案中，2'-修饰可为2'-氨基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基或2'-脱氧-2'-氟-P-d-阿拉伯糖核酸。典型地，修饰是2'-氟、2'-O-甲基或2'-O-甲氧基乙基。然而，已开发用于寡核苷酸的多种2'位置修饰可用于本文所公开的寡核苷酸。参见例如Bramsen等人,NUCLEIC ACIDS RES.,2009,37,2867-2881。在一些实施方案中，糖中的修饰包括糖环的修饰，其可包括糖环的一个或多个碳的修饰。例如，核苷酸的糖的修饰可包括糖的2'-碳与1'-碳或4'-碳之间的键。例如，键可包括亚乙基或亚甲基桥。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有缺乏2'-碳至3'-碳键的无环糖。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸在例如糖的4'-位置处具有硫醇基。
在一些实施方案中，末端3'端基团(例如，3'-羟基)是磷酸酯基团或其他基团，其可用于例如连接接头、衔接头或标记或用于将寡核苷酸直接接合至另一个核酸。
b.5'-末端磷酸酯
寡核苷酸的5'-末端磷酸酯基团可能或在一些情况下增强与Argonaute 2的相互作用。然而，包含5'-磷酸酯基团的寡核苷酸可能易于经由磷酸酶或其他酶降解，这可能限制其体内生物利用度。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸包括对此种降解具有抗性的5'-磷酸酯类似物。在一些实施方案中，磷酸酯类似物可为氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸链的5'端连接至模拟天然5'-磷酸酯基团的静电和空间特性的化学部分(“磷酸酯模拟物”)(参见例如Prakash等人(2015),NUCLEIC ACIDSRES.,3月31日；43(6):2993-3011，所述文献与磷酸酯类似物有关的内容通过引用并入本文)。已开发许多可连接至5'端的磷酸酯模拟物(参见例如美国专利第8,927,513号，所述专利与磷酸酯类似物有关的内容通过引用并入本文)。已开发针对寡核苷酸的5'端的其他修饰(参见例如WO 2011/133871，所述文献与磷酸酯类似物有关的内容通过引用并入本文)。在某些实施方案中，羟基连接至寡核苷酸的5'端。
在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸在糖的4'-碳位置处具有磷酸酯类似物(称为“4'-磷酸酯类似物”)。参见例如WO 2018/045317和US 2019/177729，所述文献中的每一者与磷酸酯类似物有关的内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，本文所提供的寡核苷酸在5'末端核苷酸处包含4'-磷酸酯类似物。在一些实施方案中，磷酸酯类似物是氧甲基膦酸酯，其中氧甲基的氧原子结合至糖部分(例如，在其4'-碳处)或其类似物。在其他实施方案中，4'-磷酸酯类似物是硫甲基膦酸酯或氨基甲基膦酸酯，其中硫甲基的硫原子或氨基甲基的氮原子结合至糖部分或其类似物的4'-碳。在某些实施方案中，4'-磷酸酯类似物是氧甲基膦酸酯。在一些实施方案中，氧甲基膦酸酯由式-O-CH2-PO(OH)2或-O-CH2-PO(OR)2表示，其中R独立地选自H、-CH3、烷基、-CH2CH2CN、-CH2OCOC(CH3)3、-CH2OCH2CH2Si(CH)或保护基。在某些实施方案中，烷基是-CH2CH3。更典型地，R独立地选自H、-CH3或-CH2CH3。
c.经修饰的核苷间键
在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可包含经修饰的核苷间键。在一些实施方案中，磷酸酯修饰或取代可产生包含至少一个(例如，至少1个、至少2个、至少3个或至少5个)经修饰的核苷酸间键的寡核苷酸。在一些实施方案中，本文所公开的寡核苷酸中的任一者包含1至10个(例如，1至10个、2至8个、4至6个、3至10个、5至10个、1至5个、1至3个或1至2个)经修饰的核苷酸间键。在一些实施方案中，本文所公开的寡核苷酸中的任一者包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个经修饰的核苷酸间键。
经修饰的核苷酸间键可为二硫代磷酸酯键、硫代磷酸酯键、磷酸三酯键、硫羰基烷基膦酸酯键、硫羰基烷基磷酸三酯键、亚磷酰胺键、膦酸酯键或硼烷磷酸酯键。在一些实施方案中，如本文所公开的寡核苷酸中的任一者的至少一个经修饰的核苷酸间键是氧甲基膦酸酯或硫代磷酸酯键。
d.碱基修饰
在一些实施方案中，本文所提供的寡核苷酸具有一个或多个经修饰的核碱基。在一些实施方案中，经修饰的核碱基(本文中也称为碱基类似物)在核苷酸糖部分的1'-位置处连接。在某些实施方案中，经修饰的核碱基是含氮碱基。在某些实施方案中，经修饰的核碱基不含氮原子。参见例如US 2008/274462。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含通用碱基。在一些实施方案中，通用碱基是位于经修饰的核苷酸中的核苷酸糖部分的1'位置或核苷酸糖部分取代中的等效位置处的杂环部分，当存在于双链体中时，其可与多于一种类型的碱基相对定位而不会基本上改变双链体的结构。在一些实施方案中，相较于与靶核酸完全互补的参考单链核酸(例如，寡核苷酸)，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，所述双链体的Tm低于与互补核酸形成的双链体。然而，在一些实施方案中，与其中通用碱基已用某个碱基代替以产生单个错配的参考单链核酸相比，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，所述双链体的Tm高于与包含错配碱基的核酸形成的双链体。
通用结合核苷酸的非限制性实例包括肌苷、1-β-D-核糖呋喃糖基-5-硝基吲哚和/或1-β-D-核糖呋喃糖基-3-硝基吡咯。参见例如US 2007/254362；Van Aerschot等人,NUCLEICACIDS RES.1995年11月11日；23(21):4363-70；Loakes等人,NUCLEIC ACIDS RES.1995年7月11日；23(13):2361-6；以及Loakes和Brown,NUCLEIC ACIDS RES.1994年10月11日；22(20):4039-43，所述文献中的每一者的全文特此通过引用并入。
e.可逆修饰
尽管可进行某些修饰以保护寡核苷酸在到达靶细胞之前不受体内环境影响，但一旦寡核苷酸到达靶细胞的细胞溶质，所述修饰可降低寡核苷酸的效力或活性。可进行可逆修饰以使分子在细胞外保留所需特性，然后在进入细胞的细胞溶质环境后去除所述修饰。可例如通过细胞内酶的作用或通过细胞内部的化学条件(例如，经由细胞内谷胱甘肽的还原)来去除可逆修饰。
在一些实施方案中，可逆修饰的核苷酸包含谷胱甘肽敏感性部分。典型地，核酸分子已用环状二硫化合物部分进行化学修饰，以掩盖核苷酸间二磷酸酯键产生的负电荷并且改进细胞摄取和核酸酶抗性。参见US 2011/0294869，WO 2015/188197，Meade等人,NATUREBIOTECHNOLOGY,2014,32:1256-63，和WO 2014/088920，所述文献中的每一者的全文关于此类修饰的公开内容特此通过引用并入。核苷酸间二磷酸酯键的这种可逆修饰经设计以由细胞溶质的还原环境(例如，谷胱甘肽)细胞内裂解。早先的实例包括据报道在细胞内可裂解的中和磷酸三酯修饰(Dellinger等人,J.AM.CHEM.SOC.2003,125:940-950)。
在一些实施方案中，此种可逆修饰允许在体内施用期间加以保护(例如，经由血液和/或细胞的溶酶体/胞内体区室运输)，其中寡核苷酸将暴露于核酸酶和其他严苛环境条件(例如，pH值)。当释放至谷胱甘肽的水平高于细胞外空隙的细胞的细胞溶质中时，修饰逆转并且结果产生裂解的寡核苷酸。与使用不可逆化学修饰可获得的选择相比，使用可逆谷胱甘肽敏感性部分，有可能将空间较大的化学基团引入所关注的寡核苷酸中。这是因为这些较大的化学基团将在细胞溶质中去除，并且因此不应干扰细胞的细胞溶质中寡核苷酸的生物学活性。因此，可对这些较大的化学基团进行工程化以赋予核苷酸或寡核苷酸各种优点，例如核酸酶抗性、亲脂性、电荷、热稳定性、特异性和降低的免疫原性。在一些实施方案中，可对谷胱甘肽敏感性部分的结构进行工程化以改变其释放的动力学。
在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分连接至核苷酸的糖。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分连接至经修饰的核苷酸的糖的2'-碳。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分位于糖的5'-碳上，特别是当经修饰的核苷酸是寡核苷酸的5'末端核苷酸时。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分位于糖的3'-碳上，特别是当经修饰的核苷酸是寡核苷酸的3'末端核苷酸时。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分包含磺酰基。参见例如WO2018/039364，所述文献的全文特此通过引用并入。
v.靶向配体
在一些实施方案中，所提供的包含脂质缀合物的寡核苷酸靶向一个或多个细胞或一个或多个器官。这种靶向策略可帮助避免在其他器官中不合需要的作用，或者可避免寡核苷酸对不会得益于寡核苷酸的细胞、组织或器官的过度损失。因此，在一些实施方案中，可进一步修饰所提供的寡核苷酸以促进改善的对组织、细胞或器官的靶向。在某些实施方案中，本文所公开的寡核苷酸可促进寡核苷酸递送至大范围的组织，例如CNS、肌肉、脂肪或肾上腺。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸包含与一个或多个靶向配体缀合的核苷酸。靶向配体可包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、肽、多肽、蛋白质或蛋白质的一部分(例如，抗体或抗体片段)。在一些实施方案中，靶向配体是适体。例如，靶向配体可为用于靶向肿瘤脉管系统或神经胶质瘤细胞的RGD肽、靶向肿瘤脉管系统或造口的CREKA肽(SEQ ID NO:3)、转铁蛋白、乳铁蛋白，或靶向CNS脉管系统上表达的转铁蛋白受体的适体，或靶向神经胶质瘤细胞上的EGFR的抗EGFR抗体。
可使用适当方法或化学(例如，点击化学)将靶向配体连接至核苷酸。在一些实施方案中，使用点击接头将靶向配体与核苷酸缀合。在一些实施方案中，基于缩醛的接头用于将靶向配体与本文所述的寡核苷酸中的任一者的核苷酸缀合。基于缩醛的接头公开于例如W02016/100401中，所述文献的全文特此通过引用并入。在一些实施方案中，接头是不稳定接头。然而，在其他实施方案中，接头是稳定的。在一些实施方案中，在靶向配体与双链寡核苷酸之间提供双链体延伸(长度为至多3、4、5或6个碱基对)。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含1、2、3或4个式II-b-2的单元。在一些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个式II-b-2的单元，其中B是鸟嘌呤(G)或腺嘌呤(A)。在一些实施方案中，寡核苷酸包含GAAA四环，所述四环包含1、2、3或4个式II-b-2的单元。
表1中列出包含本公开的脂质缀合物的示例性核酸-配体缀合物。
表2中公开了包含一个或多个金刚烷基或脂质部分的示例性寡核苷酸-配体缀合物或其类似物：
表2：示例性寡核苷酸-配体缀合物
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在一些实施方案中，本公开提供了寡核苷酸-配体缀合物，其包含表2中、说明书和实施例中的所述的一个或多个金刚烷基或脂质部分，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本公开提供了双链寡核苷酸，其包含表2中、说明书和实施例中的本公开的一个或多个配体缀合物，或其药学上可接受的盐。
5.提供核酸和其类似物的一般方法
可使用本领域中已知的多种合成方法，包括标准亚磷酰胺方法来制备本文所述的包含脂质缀合物的核酸和其类似物。可使用任何亚磷酰胺合成方法来合成所提供的本公开的核酸。在某些实施方案中，亚磷酰胺用于固相合成方法中以得到反应性中间亚磷酸酯化合物，随后使用已知方法将其氧化以产生典型地具有磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷酸间键的经膦酸酯修饰的寡核苷酸。本公开的寡核苷酸合成可使用本领域已知的方法在任一方向上进行：5'至3'或3'至5'。
在某些实施方案中，用于合成所提供的核酸的方法包括：(a)经由共价键将核苷或其类似物连接至固体支撑物；(b)将核苷亚磷酰胺或其类似物偶联至步骤(a)的核苷或其类似物上的反应性羟基以在其间形成核苷酸间键，其中在固体支撑物上的任何未偶联的核苷或其类似物经封端试剂封端；(c)用氧化剂氧化所述核苷酸间键；以及(d)用后续核苷亚磷酰胺或其类似物反复地重复步骤(b)至(c)以形成核酸或其类似物，其中至少步骤(a)的核苷或其类似物、步骤(b)的核苷亚磷酰胺或其类似物或步骤(d)的后续核苷亚磷酰胺或其类似物中的至少一者包含如本文所述的脂质缀合物部分。典型地，重复偶联、封帽/氧化步骤和任选地脱保护步骤，直至寡核苷酸达到所需的长度和/或序列，此后使其从固体支撑物裂解。在某些实施方案中，制备寡核苷酸，其包含1-3个在四环上包含脂质缀合物单元的核酸或其类似物。
在下文的方案A中，在描绘特定保护基、离去基或转化条件的情况下，本领域普通技术人员将了解，其他保护基、离去基和转化条件也是合适的并且涵盖在内。需要额外保护基策略的方案A中一般预期的某些反应性官能团(例如，-N(H)-、-OH等)也涵盖在内并且是本领域普通技术人员所了解的。此类基团和转化详细描述于March'sAdvanced OrganicChemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,M.B.Smith和J.March,第5版,JohnWiley&Sons,2001,COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS,(R.C.Larock,第2版,John Wiley&Sons,1999)和PROTECTING GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS(T.W.Greene和P.G.M.Wuts,第3版,JohnWiley&Sons,1999)中，所述文献中的每一者的全文特此通过引用并入本文。
在某些实施方案中，通常根据下文列出的方案A、方案A1和方案B制备本公开的核酸和其类似物：
方案A：合成本公开的配体缀合的寡核苷酸
方案A1：合成本公开的脂质缀合的寡核苷酸
如上文方案A和方案A1中所描绘，式I-1的核酸或其类似物与一个或多个配体/亲脂性化合物缀合以形成包含一个或多个配体/脂质缀合物的式I或Ia的化合物。典型地，通过本领域中已知的技术串联或并联地经由式I-1或I-1a的核酸或其类似物与一个或多个金刚烷基和/或亲脂性化合物(例如，脂肪酸)之间的酯化或酰胺化反应进行缀合。然后可将式I或Ia的核酸或其类似物脱保护以形成式I-2或I-2a的化合物并用合适的羟基保护基(例如，DMTr)保护以形成式I-3或I-3a的化合物。在一个方面，可使式I-3或I-3a的核酸-配体缀合物共价连接至固体支撑物(例如，经由丁二酸键联基团)以形成包含一个或多个金刚烷基和/或脂质缀合物的式I-4或I-4a的固体支撑物核酸-配体缀合物或其类似物。在另一方面，式I-3或I-3a的核酸-配体缀合物可与P(III)形成试剂(例如，2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺)反应以形成包含P(III)基团的式I-5或I-5a的核酸或其类似物。然后可使式I-5或I-5a的核酸-配体缀合物或其类似物经受使用已知和通常应用的过程进行的寡聚形成条件以制备本领域中的寡核苷酸。例如，使式I-5或I-5a的化合物偶联至带有5'-羟基的固体支撑的核酸-配体缀合物或其类似物。其他步骤可包括一个或多个脱保护、偶联、亚磷酸酯氧化和/或从固体支撑物裂解，以提供由式II-1或II-Ia的化合物表示的具有各种核苷酸长度(包括一个或多个脂质缀合物核苷酸单元)的寡核苷酸。B、E、L、配体、LC、n、PG1、PG2、PG4、R1、R2、R3、X、X1、X2、X3和Z中的每一者如上文所定义和本文所述。
方案B：本公开的寡核苷酸的合成后脂质缀合
如上述方案B中所描绘，可将式I-1的核酸或其类似物脱保护以形成式I-6的化合物，用合适的羟基保护基(例如，DMTr)保护以形成式I-7的化合物，并且与P(III)形成试剂(例如，2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺)反应以形成包含P(III)基团的式I-8的核酸或其类似物。接下来，使式I-8的核酸或其类似物经受使用已知和通常应用的过程进行的寡聚形成条件以制备本领域中的寡核苷酸。例如，使式I-8的化合物偶联至带有5'-羟基的固体支撑的核酸或其类似物。其他步骤可包括一个或多个脱保护、偶联、亚磷酸酯氧化和/或从固体支撑物裂解，以提供由式II-2的化合物表示的具有各种核苷酸长度的寡核苷酸。然后可使式II-2的寡核苷酸与一个或多个配体，例如金刚烷基或亲脂性化合物(例如，脂肪酸)缀合，以形成包含一个或多个配体缀合物的式II-1的化合物。典型地，通过本领域中已知的技术串联或并联地经由式II-2的核酸或其类似物与一个或多个金刚烷基或脂肪酸之间的酯化或酰胺化反应进行缀合。B、E、L、配体、LC、n、PG1、PG2、PG4、R1、R2、R3、X、X1、X2、X3和Z如上文所定义和本文所述。
在某些实施方案中，根据下文列出的方案C和方案D制备本公开的核酸和其类似物：
方案C：合成本公开的脂质缀合的寡核苷酸
如上述方案C中所描绘，保护式C1的核酸或其类似物以形成式C2的化合物。然后将式C2的核酸或其类似物烷基化(例如，经由普梅雷尔重排(Pummerer rearrangement)使用DMSO和乙酸)以形成式C3的单硫缩醛化合物。接下来，在适当条件(例如，温和氧化条件)下使式C3的核酸或其类似物与C4偶联，以形成式C5的核酸或其类似物。然后可将式C5的核酸或其类似物脱保护以形成式C6的化合物，并且在适当酰胺形成条件(例如，HATU、DIPEA)下与式C7的配体(金刚烷基或亲脂性化合物(例如，脂肪酸))偶联，以形成包含本公开的脂质缀合物的式I-b的核酸-配体缀合物或其类似物。然后可将式I-b的核酸-配体缀合物或其类似物脱保护以形成式C8的化合物，并用合适的羟基保护基(例如，DMTr)保护以形成式C9的化合物。在一个方面，可使式C9的核酸或其类似物共价连接至固体支撑物(例如，经由丁二酸键联基团)以形成包含本公开的配体缀合物(金刚烷基或脂质部分)的式C10的固体支撑物核酸-配体缀合物或其类似物。在另一方面，式C9的核酸-配体缀合物或其类似物可与P(III)形成试剂(例如，2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺)反应以形成包含P(III)基团的式C11的核酸-配体缀合物或其类似物。然后可使式C11的核酸-配体缀合物或其类似物经受使用已知和通常应用的过程进行的寡聚形成条件以制备本领域中的寡核苷酸。例如，使式C11的化合物偶联至带有5'-羟基的固体支撑的核酸-配体缀合物或其类似物。其他步骤可包括一个或多个脱保护、偶联、亚磷酸酯氧化和/或从固体支撑物裂解，以提供由式II-b-3的化合物表示的具有各种核苷酸长度(包括一个或多个金刚烷基和/或脂质缀合物核苷酸单元)的寡核苷酸。B、E、L2、PG1、PG2、PG3、PG4、R1、R2、R3、R4、R5、X1、X2、X3、V、W和Z中的每一者如上文所定义和本文所述。
方案D：本公开的寡核苷酸的合成后脂质缀合
B、E、L2、PG1、PG2、PG3、PG4、R1、R2、R3、R4、R5、X1、X2、X3、V、W和Z中的每一者如上文所定义和本文所述。如上述方案D中所描绘，可将式C5的核酸或其类似物选择性地脱保护以形成式D1的化合物，用合适的羟基保护基(例如，DMTr)保护以形成式D2的化合物，并与P(III)形成试剂(例如，2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺)反应以形成式D3的核酸或其类似物。接下来，使式D3的核酸或其类似物经受使用已知和通常应用的过程进行的寡聚形成条件以制备本领域中的寡核苷酸。例如，使式D3的化合物偶联至带有5'-羟基的固体支撑的核酸或其类似物。其他步骤可包括一个或多个脱保护、偶联、亚磷酸酯氧化和/或从固体支撑物裂解，以提供由式D4的化合物表示的具有各种核苷酸长度的寡核苷酸。然后可将式D4的寡核苷酸脱保护以形成式D5的化合物，并且在适当酰胺形成条件(例如，HATU、DIPEA)下与疏水性配体(例如，金刚烷基或亲脂性部分)偶联以形成式C7的化合物(例如，金刚烷基或脂肪酸)，以形成包含本公开的配体(例如，金刚烷基或脂肪酸)缀合物的式II-b-3的寡核苷酸。
本领域技术人员将了解，存在于本公开的核酸或其类似物中的各种官能团，例如脂族基团、醇、羧酸、酯、酰胺、醛、卤素和腈可通过本领域中众所周知的技术相互转化，所述技术包括但不限于还原、氧化、酯化、水解、部分氧化、部分还原、卤化、脱水、部分水合和水合。参见例如“MARCH’S ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY”,(第5版,Smith,M.B.和March,J.编,JohnWiley&Sons,New York:2001)，所述文献中的每一者的全文通过引用并入本文。此类相互转化可能需要前述技术中的一者或多者，并且在下文的范例中描述用于合成本公开所提供的核酸的某些方法。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于制备包含一个或多个脂质缀合物的寡核苷酸的方法，所述脂质缀合物单元由式II-a-1表示：
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式I-5a的核酸或其类似物：
或其盐，以及
(b)使所述式I-5a的化合物寡聚以形成式II-1a的化合物，其中B、E、L、LC、n、PG4、R1、R2、R3、X、X1、X2、X3、E和Z中的每一者如上文所定义和本文所述。
在上述步骤(b)中，寡聚是指使用已知和通常应用的过程进行寡聚形成条件，以制备本领域中的寡核苷酸。例如，使式I-5a的化合物偶联至带有5'-羟基的固体支撑的核酸或其类似物。其他步骤可包括一个或多个脱保护、偶联、亚磷酸酯氧化和从固体支撑物裂解，以提供包含本公开的脂质缀合物的由式II-1a的化合物表示的具有各种核苷酸长度的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于制备包含一个或多个脂质缀合物的寡核苷酸的方法，所述方法还包括制备式I-5a的核酸或其类似物：
或其盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式Ia的核酸或其类似物：
或其盐，
(b)将所述式Ia的核酸或其类似物脱保护以形成式I-2a的化合物：
或其盐，
(c)保护所述式I-2的核酸或其类似物以形成式I-3a的化合物：
或其盐，以及
(d)用P(III)形成试剂处理所述式I-3a的核酸或其类似物以形成式I-5a的核酸或其类似物，其中B、E、L、LC、n、PG4、R1、R2、R3、X、X1、X2、X3、E和Z中的每一者如上文所定义和本文所述。
在上述步骤(b)中，式Ia的化合物的PG1和PG2包含可在酸性条件下或用氟阴离子去除的甲硅烷基醚或环状亚甲硅烷基衍生物。提供用于去除基于硅的保护基的氟阴离子的试剂的实例包括氢氟酸、氟化氢吡啶、三乙胺三氢氟酸盐、四-N-丁基氟化铵等。
在上述步骤(c)中，用合适的羟基保护基保护式I-2a的化合物。在某些实施方案中，用于保护式I-2a的化合物的5'-羟基的保护基PG4包括酸不稳定性保护基，例如三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基、4,4',4”-三甲氧基三苯甲基、9-苯基-二苯并吡喃-9-基、9-(对甲苯基)-二苯并吡喃-9-基、苯基呫吨基、2,7-二甲基苯基呫吨基等。在某些实施方案中，酸不稳定性保护基适合于在酸敏感性核酸或其类似物的溶液相和固相合成期间使用例如二氯乙酸或三氯乙酸进行脱保护。
在上述步骤(d)中，用P(III)形成试剂处理式I-3a的化合物，得到式I-5a的化合物。在本公开的上下文中，P(III)形成试剂是与磷(III)化合物反应的磷试剂。在一些实施方案中，P(III)形成试剂是2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺或2-氰基乙基二氯磷酸酯。在某些实施方案中，P(III)形成试剂是2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺。本领域普通技术人员将认识到，在存在或不存在合适的碱的情况下实现P(III)形成试剂中的离去基由式I-3a的化合物的X1置换。此类合适的碱在本领域中是众所周知的并且包括有机和无机碱。在某些实施方案中，碱是叔胺，例如三乙胺或二异丙基乙胺。在其他实施方案中，使用N,N-二甲基磷氨基二氯化物作为P(V)形成试剂进行上述步骤(d)。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于制备包含一个或多个脂质缀合物的寡核苷酸的方法，所述方法还包括制备式Ia的核酸-脂质缀合物或其类似物：
或其盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式I-1的核酸或其类似物：
或其盐，以及
(b)使一个或多个亲脂性化合物与式I-1的核酸或其类似物缀合以形成包含一个或多个脂质缀合物的式Ia的核酸或其类似物，其中：B、E、L、LC、n、PG1、PG2、R1、R2、X、X1和Z中的每一者如上文所定义和本文所述。
在上述步骤(b)中，使式I-1a的核酸或其类似物与一个或多个亲脂性化合物缀合以形成包含一个或多个本公开的脂质缀合物的式Ia的化合物。典型地，通过本领域中已知的技术串联或并联地经由式I-1a的核酸或其类似物与一个或多个脂肪酸之间的酯化或酰胺化反应进行缀合。在某些实施方案中，在合适的酰胺形成条件下进行缀合，得到包含一个或多个脂质缀合物的式I的化合物。合适的酰胺形成条件可包括使用本领域中已知的酰胺偶联试剂，例如但不限于HATU、PyBOP、DCC、DIC、EDC、HBTU、HCTU、PyAOP、PyBrOP、BOP、BOP-Cl、DEPBT、T3P、TATU、TBTU、TNTU、TOTU、TPTU、TSTU或TDBTU。或者，可通过本文表A中所述的交叉偶联技术中的任一者来实现亲脂性化合物的缀合。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于制备包含一个或多个脂质缀合物的寡核苷酸的方法，所述脂质缀合物单元由式II-1表示：
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式II-2的寡核苷酸：
或其盐，以及
(b)使一个或多个亲脂性化合物与式II-2的寡核苷酸缀合以形成包含一个或多个脂质缀合物的式II-1的寡核苷酸。在上述步骤(b)中，使式II-2的寡核苷酸与一个或多个亲脂性化合物缀合以形成包含一个或多个本公开的脂质缀合物的式II-1的寡核苷酸。典型地，通过本领域中已知的技术串联或并联地经由式II-2的寡核苷酸与一个或多个脂肪酸之间的酯化或酰胺化反应进行缀合。在某些实施方案中，在合适的酰胺形成条件下进行缀合，得到包含一个或多个脂质缀合物的式II-1的寡核苷酸。合适的酰胺形成条件可包括使用本领域中已知的酰胺偶联试剂，例如但不限于HATU、PyBOP、DCC、DIC、EDC、HBTU、HCTU、PyAOP、PyBrOP、BOP、BOP-Cl、DEPBT、T3P、TATU、TBTU、TNTU、TOTU、TPTU、TSTU或TDBTU。另外，可通过本文表A中所述的交叉偶联技术中的任一者来实现亲脂性化合物的缀合。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于制备寡核苷酸的方法，所述寡核苷酸包含由式II-2表示的单元：
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式I-8的核酸或其类似物：
或其盐，以及
(b)使所述式I-8的化合物寡聚，以形成式II-2的化合物。
在上述步骤(b)中，寡聚是指使用已知和通常应用的过程进行寡聚形成条件，以制备本领域中的寡核苷酸。例如，使式I-8的化合物偶联至带有5'-羟基的固体支撑的核酸或其类似物。其他步骤可包括一个或多个脱保护、偶联、亚磷酸酯氧化和从固体支撑物裂解，以提供由式II-2的化合物表示的具有各种核苷酸长度的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于制备包含一个或多个脂质缀合物的核酸或其类似物的方法，所述方法还包括制备式I-8的核酸或其类似物：
或其盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式I-1的核酸或其类似物：
或其盐，
(b)将所述式I-1的核酸或其类似物脱保护以形成式I-6的化合物：
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或其盐，
(c)保护所述式I-6的核酸或其类似物以形成式I-7的化合物：
或其盐，以及
(d)用P(III)形成试剂处理所述式I-7的核酸或其类似物，以形成式I-8的核酸或其类似物。在上述步骤(b)中，式I-1的化合物的PG1和PG2包含可在酸性条件下或用氟阴离子去除的甲硅烷基醚或环状亚甲硅烷基衍生物。提供用于去除基于硅的保护基的氟阴离子的试剂的实例包括氢氟酸、氟化氢吡啶、三乙胺三氢氟酸盐、四-N-丁基氟化铵等。
在上述步骤(c)中，用合适的羟基保护基保护式I-6的化合物。在某些实施方案中，用于保护式I-6的化合物的5'-羟基的保护基PG4包括酸不稳定性保护基，例如三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基、4,4',4”-三甲氧基三苯甲基、9-苯基-二苯并吡喃-9-基、9-(对甲苯基)-二苯并吡喃-9-基、苯基呫吨基、2,7-二甲基苯基呫吨基等。在某些实施方案中，酸不稳定性保护基适合于在酸敏感性核酸或其类似物的溶液相和固相合成期间使用例如二氯乙酸或三氯乙酸进行脱保护。
在上述步骤(d)中，用P(III)形成试剂处理式I-7的化合物，得到式I-8的化合物。在本公开的上下文中，P(III)形成试剂是与磷(III)化合物反应的磷试剂。在一些实施方案中，P(III)形成试剂是2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺或2-氰基乙基二氯磷酸酯。在某些实施方案中，P(III)形成试剂是2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺。本领域普通技术人员将认识到，在存在或不存在合适的碱的情况下实现P(III)形成试剂中的离去基由式I-7的化合物的X1置换。此类合适的碱在本领域中是众所周知的并且包括有机和无机碱。在某些实施方案中，碱是叔胺，例如三乙胺或二异丙基乙胺。在其他实施方案中，使用N,N-二甲基磷氨基二氯化物作为P(V)形成试剂进行上述步骤(d)。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于制备包含一个或多个金刚烷基和/或脂质部分的寡核苷酸-配体缀合物的方法，所述缀合物单元由式II-b-3表示：
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式C11的核酸-配体缀合物或其类似物：
或其盐，以及
(b)使所述式C11的化合物寡聚以形成式II-b-3的化合物。在上述步骤(b)中，寡聚是指使用已知和通常应用的过程进行寡聚形成条件，以制备本领域中的寡核苷酸。例如，使式C11的化合物偶联至带有5'-羟基的固体支撑的核酸或其类似物。其他步骤可包括一个或多个脱保护、偶联、亚磷酸酯氧化和从固体支撑物裂解，以提供具有一个或多个核酸-配体缀合物单元的具有各种核苷酸长度的寡核苷酸-配体缀合物，其中每个单元由式II-b-3的化合物表示并且包含本公开的金刚烷基或脂质部分。
在一些实施方案中，制备包含一个或多个脂质缀合物的式II-b-3的寡核苷酸的方法还包括制备式C11的核酸-配体缀合物或其类似物：
或其盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式I-b的核酸-配体缀合物或其类似物：
或其盐，
(b)将所述式I-b的核酸-配体缀合物或其类似物脱保护以形成式C8的化合物：
或其盐，
(c)保护所述式C8的核酸-配体缀合物或其类似物以形成式C9的化合物：
或其盐，以及
(d)用P(III)形成试剂处理所述式C9的核酸-配体缀合物或其类似物，以形成式C11的核酸或其类似物。在上述步骤(b)中，式I-b的化合物的PG1和PG2包含可在酸性条件下或用氟阴离子去除的甲硅烷基醚或环状亚甲硅烷基衍生物。提供用于去除基于硅的保护基的氟阴离子的试剂的实例包括氢氟酸、氟化氢吡啶、三乙胺三氢氟酸盐、四-N-丁基氟化铵等。
在上述步骤(c)中，用合适的羟基保护基保护式C8的化合物。在某些实施方案中，用于保护式C8的化合物的5'-羟基的保护基PG4包括酸不稳定性保护基，例如三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基、4,4',4”-三甲氧基三苯甲基、9-苯基-二苯并吡喃-9-基、9-(对甲苯基)-二苯并吡喃-9-基、苯基呫吨基、2,7-二甲基苯基呫吨基等。在某些实施方案中，酸不稳定性保护基适合于在酸敏感性核酸或其类似物的溶液相和固相合成期间使用例如二氯乙酸或三氯乙酸进行脱保护。
在上述步骤(d)中，用P(III)形成试剂处理式C9的化合物，得到式C11的化合物。在本公开的上下文中，P(III)形成试剂是与磷(III)化合物反应的磷试剂。在一些实施方案中，P(III)形成试剂是2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺或2-氰基乙基二氯磷酸酯。在某些实施方案中，P(III)形成试剂是2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺。本领域普通技术人员将认识到，在存在或不存在合适的碱的情况下实现P(III)形成试剂中的离去基由式C9的化合物的X1置换。此类合适的碱在本领域中是众所周知的并且包括有机和无机碱。在某些实施方案中，碱是叔胺，例如三乙胺或二异丙基乙胺。在其他实施方案中，使用N,N-二甲基磷氨基二氯化物作为P(V)形成试剂进行上述步骤(d)。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于制备式II-b-3的寡核苷酸-配体缀合物的方法，所述寡核苷酸-配体缀合物包含一个或多个各自包含一个或多个金刚烷基或脂质部分的核酸-配体缀合物单元，所述方法还包括制备式I-b的核酸-配体缀合物或其类似物：
或其盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式C6的核酸-配体缀合物或其类似物：
或其盐，以及
(b)使亲脂性化合物与式C6的核酸或其类似物缀合，以形成包含一个或多个金刚烷基和/或脂质缀合物的式I-b的核酸-配体缀合物或其类似物。在上述步骤(b)中，在合适的酰胺形成条件下进行缀合，得到包含金刚烷基和/或脂质缀合物的式I-b的化合物。合适的酰胺形成条件可包括使用本领域中已知的酰胺偶联试剂，例如但不限于HATU、PyBOP、DCC、DIC、EDC、HBTU、HCTU、PyAOP、PyBrOP、BOP、BOP-Cl、DEPBT、T3P、TATU、TBTU、TNTU、TOTU、TPTU、TSTU或TDBTU。在某些实施方案中，酰胺形成条件包括HATU和DIPEA或TEA。
在某些实施方案中，以盐形式(例如，反丁烯二酸盐)提供式C6的核酸-配体缀合物或其类似物，并且在进行缀合步骤之前首先转化为游离碱(例如，使用碳酸氢钠)。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于制备包含一个或多个核酸-配体缀合物单元的式II-b-3的寡核苷酸-配体缀合物的方法，所述方法还包括制备式C6的核酸-配体缀合物或其类似物：
或其盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式C1的核酸或其类似物：
或其盐，以及
(b)保护所述式C1的核酸或其类似物以形成式C2的化合物：
或其盐，
(c)使所述式C2的核酸或其类似物烷基化以形成式C3的化合物：
或其盐，
(d)用式C4的化合物取代所述式C3的核酸或其类似物：
或其盐，以形成式C5的化合物：
或其盐，
(e)将所述式C5的核酸或其类似物脱保护以形成式C6的核酸-配体缀合物或其类似物。在上述步骤(b)中，式C2的PG1和PG2基团与其间插原子一起形成环状二醇保护基，例如环状缩醛或缩酮。此类基团包括亚甲基、亚乙基、苯亚甲基、亚异丙基、亚环己基和亚环戊基；亚甲硅烷基衍生物，例如二叔丁基亚甲硅烷基和1,1,3,3-四异丙基二亚硅氧烷基；环状碳酸酯；环状硼酸酯；和基于环状单磷酸腺苷(即，cAMP)的环状单磷酸酯衍生物。在某些实施方案中，环状二醇保护基是在碱性条件下由式C1的二醇与1,3-二氯-1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷的反应制备的1,1,3,3-四异丙基二亚硅氧烷基。
在上述步骤(c)中，在酸性条件下用DMSO与乙酸酐的混合物使式C2的核酸或其类似物烷基化。在某些实施方案中，当-V-H是羟基时，在乙酸存在下DMSO与乙酸酐的混合物经由普梅雷尔重排原位形成乙酸(甲硫基)甲酯，然后与式C2的核酸或其类似物的羟基反应以提供式C3的单硫缩醛官能化片段核酸或其类似物。
在上述步骤(d)中，使用式C4的核酸或其类似物取代式C3的核酸或其类似物的硫甲基，得到式C4的核酸或其类似物。在某些实施方案中，取代在温和氧化和/或酸性条件下发生。在一些实施方案中，V是氧。在一些实施方案中，温和氧化试剂包括元素碘与过氧化氢的混合物、脲过氧化氢复合物、硝酸银/硫酸银、溴酸钠、过氧二硫酸铵、过氧二硫酸四丁铵、氯胺T、/>II、次氯酸钠，或碘酸钾/过碘酸钠。在某些实施方案中，温和氧化剂包括N-碘丁二酰亚胺、N-溴丁二酰亚胺、N-氯丁二酰亚胺、1,3-二碘-5,5-二甲基海因、三溴化吡锭、一氯化碘或其复合物等。在温和氧化条件下典型地使用的酸包括硫酸、对甲苯磺酸、三氟甲磺酸、甲磺酸和三氟乙酸。在某些实施方案中，温和氧化试剂包括N-碘丁二酰亚胺与三氟甲磺酸的混合物。
在上述步骤(e)中，去除式C5的核酸-配体缀合物或其类似物的PG3和任选地R4(当R4是合适的胺保护基时)，得到式C6的核酸-配体缀合物或其类似物或其盐。在一些实施方案中，PG3和/或R4包含可在酸性或碱性条件下去除的氨基甲酸酯衍生物。在某些实施方案中，通过酸水解去除式C5的核酸-配体缀合物或其类似物的保护基(例如，PG3和R4两者或独立地是PG3或R4中的任一者)。应了解，在式C5的核酸-配体缀合物或其类似物的保护基进行酸水解后，形成其式C6的盐。例如，当通过用酸(例如盐酸)处理来去除式C5的核酸-配体缀合物或其类似物的酸不稳定性保护基时，则将形成其盐酸盐形式的所得胺化合物。本领域普通技术人员将认识到，广泛多种酸可用于去除对酸不稳定的氨基保护基，并因此涵盖式C6的核酸或其类似物的广泛多种盐形式。
在其他实施方案中，通过碱水解去除式C5的核酸或其类似物的保护基(例如，PG3和R4两者或独立地是PG3或R4中的任一者)。例如，可通过用碱处理来去除Fmoc和三氟乙酰基保护基。本领域普通技术人员将认识到，广泛多种碱可用于去除对碱不稳定的氨基保护基。在一些实施方案中，碱是哌啶。在一些实施方案中，碱是1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)。在某些实施方案中，在碱性条件下将式C5的核酸-配体缀合物或其类似物脱保护，接着用酸处理以形成式C6的盐。在某些实施方案中，酸是反丁烯二酸，式C6的盐是反丁烯二酸盐。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于制备包含一个或多个核酸-配体缀合物的寡核苷酸-配体缀合物的方法，所述核酸-配体缀合物单元由式II-b-3表示：
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式D5的寡核苷酸：
或其盐，以及
(b)使一个或多个金刚烷基或亲脂性化合物与式D5的寡核苷酸缀合，以形成包含一个或多个核酸-配体缀合物单元的式II-b-3的寡核苷酸-配体缀合物。在上述步骤(b)中，在合适的酰胺形成条件下进行缀合，得到包含金刚烷基或脂质缀合物的式D5的化合物。合适的酰胺形成条件可包括使用本领域中已知的酰胺偶联试剂，例如但不限于HATU、PyBOP、DCC、DIC、EDC、HBTU、HCTU、PyAOP、PyBrOP、BOP、BOP-Cl、DEPBT、T3P、TATU、TBTU、TNTU、TOTU、TPTU、TSTU或TDBTU。在某些实施方案中，酰胺形成条件包括HATU和DIPEA或TEA。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于制备寡核苷酸-配体缀合物的方法，所述寡核苷酸-配体缀合物包含由式D5表示的单元：
或其盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式D4的核酸-配体缀合物或其类似物：
或其盐，以及
(b)将所述式D4的化合物脱保护以形成式D5的化合物。在上述步骤(b)中，去除式D4的寡核苷酸的PG3和任选地R4(当R4是合适的胺保护基时)，得到式D5的寡核苷酸-配体缀合物或其盐。在一些实施方案中，PG3和/或R4包含可在酸性或碱性条件下去除的氨基甲酸酯衍生物。在某些实施方案中，通过酸水解去除式D4的寡核苷酸-配体缀合物的保护基(例如，PG3和R4两者或独立地是PG3或R4中的任一者)。应了解，在式D4的寡核苷酸-配体缀合物的保护基进行酸水解后，形成其式D5的盐。例如，当通过用酸(例如盐酸)处理来去除式D4的寡核苷酸的酸不稳定性保护基时，则将形成其盐酸盐形式的所得胺化合物。本领域普通技术人员将认识到，广泛多种酸可用于去除对酸不稳定的氨基保护基，并因此涵盖式D5的核酸-配体缀合物单元或其类似物的广泛多种盐形式。
在其他实施方案中，通过碱水解去除式D4的寡核苷酸-配体缀合物的保护基(例如，PG3和R4两者或独立地是PG3或R4中的任一者)。例如，可通过用碱处理来去除Fmoc和三氟乙酰基保护基。本领域普通技术人员将认识到，广泛多种碱可用于去除对碱不稳定的氨基保护基。在一些实施方案中，碱是哌啶。在一些实施方案中，碱是1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于制备包含一个或多个具有一个或多个金刚烷基和/或脂质部分的核酸-配体缀合物单元的方法，所述缀合物单元由式D4表示：
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式D3的核酸或其类似物：
或其盐，以及
(b)使所述式D3的化合物寡聚，以形成式D4的化合物。
在上述步骤(b)中，寡聚是指使用已知和通常应用的过程进行寡聚形成条件，以制备本领域中的寡核苷酸。例如，使式D3的核酸或其类似物偶联至带有5'-羟基的固体支撑的核酸或其类似物。其他步骤可包括一个或多个脱保护、偶联、亚磷酸酯氧化和从固体支撑物裂解，以提供包含本公开的金刚烷基或脂质缀合物的由式D4的化合物表示的具有各种核苷酸长度的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于制备包含一个或多个脂质缀合物的核酸或其类似物的方法，所述方法还包括制备式D3的核酸或其类似物：
或其盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式C5的核酸或其类似物：
或其盐，
(b)将所述式C5的核酸或其类似物脱保护以形成式D1的化合物：
或其盐，
(c)保护所述式D1的核酸或其类似物以形成式D2的核酸或其类似物：
或其盐，以及
(d)用P(III)形成试剂处理所述式D2的核酸或其类似物，以形成式D3的核酸或其类似物。在上述步骤(b)中，式C5的核酸或其类似物的PG1和PG2包含可在酸性条件下或用氟阴离子去除的甲硅烷基醚或环状亚甲硅烷基衍生物。提供用于去除基于硅的保护基的氟阴离子的试剂的实例包括氢氟酸、氟化氢吡啶、三乙胺三氢氟酸盐、四-N-丁基氟化铵等。
在上述步骤(c)中，用合适的羟基保护基保护式D1的核酸或其类似物。在某些实施方案中，用于保护式D1的化合物的5'-羟基的保护基PG4包括酸不稳定性保护基，例如三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基、4,4',4”-三甲氧基三苯甲基、9-苯基-二苯并吡喃-9-基、9-(对甲苯基)-二苯并吡喃-9-基、苯基呫吨基、2,7-二甲基苯基呫吨基等。在某些实施方案中，酸不稳定性保护基适合于在酸敏感性核酸或其类似物的溶液相和固相合成期间使用例如二氯乙酸或三氯乙酸进行脱保护。
在上述步骤(d)中，用P(III)形成试剂处理式D2的核酸或其类似物，得到式D3的化合物。在本公开的上下文中，P(III)形成试剂是与磷(III)化合物反应的磷试剂。在一些实施方案中，P(III)形成试剂是2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺或2-氰基乙基二氯磷酸酯。在某些实施方案中，P(III)形成试剂是2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺。本领域普通技术人员将认识到，在存在或不存在合适的碱的情况下实现P(III)形成试剂中的离去基由式D2的化合物的X1置换。此类合适的碱在本领域中是众所周知的并且包括有机和无机碱。在某些实施方案中，碱是叔胺，例如三乙胺或二异丙基乙胺。在其他实施方案中，使用N,N-二甲基磷氨基二氯化物作为P(V)形成试剂进行上述步骤(d)。
6.用途、配制和施用
药学上可接受的组合物
根据另一个实施方案，本公开提供了包含核酸-配体缀合物或其类似物的组合物。在另一个实施方案中，本公开提供了寡核苷酸-配体缀合物，其包含一个或多个具有金刚烷基或脂质基团作为配体的核酸-配体缀合物单元和药学上可接受的载剂、佐剂或媒介物。本公开的组合物中寡核苷酸-配体缀合物的量有效地以可测量方式调节生物样品中或患者中靶基因的表达。在某些实施方案中，配制本公开的组合物以向需要此种组合物的患者施用。在一些实施方案中，配制本公开的组合物以向患者肠胃外或口服施用。在一些实施方案中，如本文所述，组合物包含药学上可接受的载剂、佐剂或媒介物和核酸抑制剂分子，其中所述核酸抑制剂分子包含至少一个包含脂质缀合物的核苷酸。
如本文所用，术语“患者”意指动物，优选是哺乳动物，并且最优选是人类。
术语“药学上可接受的载剂、佐剂或媒介物”是指不破坏与其配制的所提供的核酸的药理活性的无毒载剂、佐剂或媒介物。可用于本公开的组合物中的药学上可接受的载剂、佐剂或媒介物包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质，例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
“药学上可接受的衍生物”意指本公开所提供的核酸的任何无毒盐、酯、酯的盐或其他衍生物，其在向接受者施用后，能够直接或间接地提供本公开所提供的核酸或其抑制活性代谢物或残基。
如本文所用，术语“其抑制活性代谢物或残基”意指其代谢物或残基也适用于调节生物样品中或患者中靶基因的表达。
本公开的组合物可经口、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或经由植入式储集器施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选地，以液体形式配制组合物用于肠胃外施用，例如，通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射。适合于肠胃外施用的剂型典型地包含一种或多种适合于肠胃外施用的媒介物，包括例如无菌水溶液、盐水、低分子量醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、植物油、明胶、脂肪酸酯(例如油酸乙酯)等。肠胃外制剂可含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期接受者的血液等张的溶质，或悬浮剂或增稠剂。可例如通过使用表面活性剂来维持适当流动性。可将液体制剂冻干并储存以稍后在用无菌可注射溶液重构后使用。
本公开的组合物的无菌可注射形式可为水性或油性悬浮液。可根据本领域中已知的技术，使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制这些悬浮液。无菌可注射制剂还可为无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液(Ringer's solution)和等张氯化钠溶液。另外，无菌非挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。
出于此目的，可采用任何温和非挥发性油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸，例如油酸和其甘油酯衍生物可用于制备可注射剂，如同天然药学上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，尤其呈其聚氧乙基化型式。这些油溶液或悬浮液还可含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或类似分散剂，其通常用于配制药学上可接受的剂型，包括乳液和悬浮液。出于配制的目的还可使用其他通常使用的表面活性剂，例如Tweens、Spans和其他乳化剂或生物利用度增强剂，其通常用于制造药学上可接受的固体、液体或其他剂型。
本公开的药学上可接受的组合物可依任何口服可接受的剂型经口施用，所述剂型包括但不限于胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在用于口服使用的片剂的情况下，通常使用的载剂包括乳糖和玉米淀粉。典型地还添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式口服施用，适用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当需要水性悬浮液以供口服使用时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，还可添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。经配制以供口服施用的本公开的组合物可与食物一起或不与食物一起施用。在一些实施方案中，本公开的药学上可接受的组合物不与食物一起施用。在其他实施方案中，本公开的药学上可接受的组合物与食物一起施用。
或者，本公开的药学上可接受的组合物可依栓剂形式施用以供直肠施用。这些组合物可通过将药剂与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温下为固体，但在直肠温度下为液体，并且因此将在直肠中熔融以释放药物。此类材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
本公开的药学上可接受的组合物也可局部施用，尤其是当治疗的靶标包括通过局部施用容易达到的区域或器官时，包括眼睛、皮肤或下肠道疾病。对于这些区域或器官中的每一者，容易制备合适的局部制剂。
直肠栓剂制剂(见上文)或合适的灌肠制剂可能会影响下肠道的局部施用。也可使用局部透皮贴剂。
对于局部施用，可将所提供的药学上可接受的组合物配制成含有悬浮或溶解在一种或多种载剂中的活性组分的合适软膏。用于局部施用本公开的核酸或其类似物的载剂包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可将所提供的药学上可接受的组合物配制成含有悬浮或溶解于一种或多种药学上可接受的载剂中的活性组分的合适洗剂或乳膏。合适的载剂包括但不限于矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
对于眼部使用，可将所提供的药学上可接受的组合物配制成等张、pH调节的无菌盐水中的微粉化悬浮液，或者优选配制成等张、pH调节的无菌盐水中的溶液，可使用或不使用防腐剂如苯扎氯铵(benzylalkonium chloride)。或者，对于眼部使用，可将药学上可接受的组合物配制成软膏，例如凡士林。
本公开的药学上可接受的组合物也可通过鼻用气雾剂或吸入施用。此类组合物是根据药物配制领域中众所周知的技术制备，并且可采用苯甲醇或其他合适的防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其他常规增溶剂或分散剂制备成盐水中的溶液。
在某些实施方案中，可将所提供的核酸-配体缀合物或寡核苷酸-配体缀合物(例如，核酸抑制剂分子)与其他分子、分子结构或化合物的混合物混合、囊封、缀合或以其他方式缔合，包括例如脂质体和脂质，例如美国专利第6,815,432号、第6,586,410号、第6,858,225号、第7,811,602号、第7,244,448号和第8,158,601号中所公开的那些；聚合材料，例如美国专利第6,835,393号、第7,374,778号、第7,737,108号、第7,718,193号、第8,137,695号和美国公开专利申请第2011/0143434号、第2011/0129921号、第2011/0123636号、第2011/0143435号、第2011/0142951号、第2012/0021514号、第2011/0281934号、第2011/0286957号和第2008/0152661号中所公开的那些；用于帮助摄取、分布或吸收的衣壳、类衣壳或受体靶向分子，所述文献中的每一者的全文通过引用并入本文。
在某些实施方案中，将所提供的核酸-配体缀合物或寡核苷酸-配体缀合物(例如，核酸抑制剂分子)配制于脂质纳米粒子(LNP)中。脂质-核酸纳米粒子(例如，脂质-寡核苷酸-配体缀合物纳米粒子)典型地在脂质与核酸混合形成复合物后自发形成。取决于所需粒度分布，可任选地使用例如热桶挤出机如挤出机(Northern Lipids,Inc)将所得纳米粒子混合物挤出穿过聚碳酸酯膜(例如，100nm截止值)。为制备用于治疗用途的脂质纳米粒子，可能需要去除用于形成纳米粒子和/或交换缓冲液的溶剂(例如，乙醇)，这可通过例如透析或切向流过滤来实现。制造含有核酸抑制剂分子的脂质纳米粒子的方法在本领域中是已知的，例如美国公开专利申请第2015/0374842号和第2014/0107178号中所公开，所述文献中的每一者的全文通过引用并入本文。
在某些实施方案中，LNP包含脂质核心，所述脂质核心包含阳离子脂质体和聚乙二醇化脂质。LNP可还包含一种或多种包膜脂质，例如阳离子脂质、结构或中性脂质、固醇、聚乙二醇化脂质或其混合物。
在某些实施方案中，所提供的核酸与配体共价缀合，所述配体引导核酸递送至所关注的组织。已探索许多此类配体。参见例如Winkler,THER.DELIV.,2013,4(7):791-809。例如，所提供的核酸可与多个糖配体部分(例如，N-乙酰半乳胺糖(GalNAc))缀合以引导核酸摄取至肝脏中。参见例如WO 2016/100401。可使用的其他配体包括但不限于6-磷酸甘露糖、胆固醇、叶酸盐、转铁蛋白和半乳糖(对于其他特定示例性配体，参见例如WO 2012/089352)。典型地，当所提供的核酸与配体缀合时，所述核酸以裸核酸形式施用，其中寡核苷酸也未配制于LNP或其他保护性包衣中。在某些实施方案中，在裸核酸内的每个核苷酸在糖部分的2'-位置处典型地经2'-F或2'-OMe修饰。
这些药物组合物可通过常规灭菌技术进行灭菌或可被无菌过滤。所得水溶液可经包装以供原样使用或经冻干，在施用前将冻干制剂与无菌水性赋形剂组合。制剂的pH值典型地将在3与11之间，更优选在5与9之间或在6与8之间，并且最优选在7与8之间，例如7至7.5。固体形式的药物组合物可包装于多个单剂量单位中，每个剂量单位含有固定量的一种或多种上述药剂，例如于片剂或胶囊的密封包装中。固体形式的药物组合物还可包装于用于可调量的容器中，例如经设计用于可局部施用的乳膏或软膏的可挤压管中。
可与载剂材料组合以产生单一剂型的组合物的本公开的核酸-配体缀合物、寡核苷酸-配体缀合物或其类似物的量将根据所治疗的宿主、特定施用模式而变化。优选地，应配制所提供的组合物，以便可向接受这些组合物的患者施用0.01-100mg/kg体重/天的剂量的核酸或其类似物。
还应了解，针对任何特定患者的特定剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所采用的特定核酸或其类似物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄速率、药物组合和主治医师的判断以及所治疗的特定疾病的严重程度。组合物中本公开的核酸或其类似物的量也将取决于组合物中的特定核酸或其类似物。
核酸和其类似物和药学上可接受的组合物的用途
本文所述的核酸-配体缀合物、寡核苷酸-配体缀合物和其类似物和组合物通常可用于调节细胞内RNA水平。所提供的核酸-配体缀合物或寡核苷酸-配体缀合物或其类似物可用于调节细胞中靶基因的表达的方法中。典型地，此类方法包括以足以调节靶基因表达的量将所提供的核酸抑制剂分子(例如，寡核苷酸-配体缀合物)引入细胞中。在某些实施方案中，所述方法在体内进行。所述方法也可在体外或离体进行。在某些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于人类细胞。
在某些实施方案中，所提供的核酸-配体缀合物或寡核苷酸-配体缀合物或其类似物(例如，核酸抑制剂分子)可用于治疗有需要的患者的方法中。典型地，此类方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的药物组合物，如本文所述，所述药物组合物包含所提供的核酸抑制剂分子。
如本文所用，术语“治疗(treatment/treat/treating)”是指如本文所述，逆转、减轻疾病或病症或其一种或多种症状，延迟其发作，或抑制其进展。在一些实施方案中，可在一种或多种症状已发展之后施用治疗。在其他实施方案中，可在无症状的情况下施用治疗。例如，可在症状发作之前向易感个体施用治疗(例如，鉴于症状史和/或鉴于遗传或其他易感性因素)。也可在症状已消退之后继续治疗，例如以预防或延迟其复发。
在某些实施方案中，本文所公开的药物组合物可适用于在有需要的患者中治疗或预防与病毒感染有关的症状。一个实施方案涉及一种治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用药物组合物，如本文所述，所述药物组合物包含治疗有效量的所提供的包含脂质缀合物或其类似物(例如，核酸抑制剂分子)的核酸。此类病毒感染的非限制性实例包括HCV、HBV、HPV、HSV、HDV、HEV或HIV感染。
在某些实施方案中，本文所公开的药物组合物可适用于在有需要的患者中治疗或预防与癌症有关的症状。一个实施方案涉及一种治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用药物组合物，如本文所述，所述药物组合物包含治疗有效量的所提供的核酸-配体缀合物或寡核苷酸-配体缀合物(例如，核酸抑制剂分子)。此类癌症的非限制性实例包括胆道癌、膀胱癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、脑癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、乳腺癌、化生性癌、宫颈癌、宫颈鳞状细胞癌、直肠癌、结直肠癌、结肠癌、遗传性非息肉症结直肠癌、结直肠腺癌、胃肠道间质瘤(GIST)、子宫内膜癌、子宫内膜间质肉瘤、食道癌、食道鳞状细胞癌、食道腺癌、眼黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、胆囊癌、胆囊腺癌、肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、威尔姆斯瘤(Wilms tumor)、白血病、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、肝癌、肝癌瘤、肝肿瘤、肝细胞癌、胆管癌、肝母细胞瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、间皮瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、前体T淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病、外周T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌(NPC)、神经母细胞瘤、口咽癌、口腔鳞状细胞癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、假乳头状赘瘤、腺泡细胞癌。前列腺癌、前列腺腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、小肠癌、胃癌、胃癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、子宫癌或子宫肉瘤。典型地，本公开涉及通过施用治疗有效量的如本文所述的药物组合物来治疗肝癌、肝癌瘤、肝肿瘤、肝细胞癌、胆管癌和肝母细胞瘤的方法。
在某些实施方案中，本文所公开的药物组合物可适用于治疗或预防与增生性、炎症性、自身免疫、神经性、眼、呼吸、代谢性、皮肤病性、听觉、肝、肾或感染性疾病有关的症状。一个实施方案涉及一种治疗增生性、炎症性、自身免疫、神经性、眼、呼吸、代谢性、皮肤病性、听觉、肝、肾或感染性疾病的方法，如本文所述，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的所提供的核酸-配体缀合物或寡核苷酸-配体缀合物(例如，核酸抑制剂分子)的药物组合物。典型地，疾病或疾患是肝脏疾病。
在一些实施方案中，本公开提供了一种降低受试者中靶基因的表达的方法，所述方法包括以足以降低靶基因表达的量向有需要的受试者施用药物组合物，其中所述药物组合物包括如本文所述而提供的核酸-配体缀合物或寡核苷酸-配体缀合物(例如，核酸抑制剂分子)和也如本文所述的药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所提供的核酸-配体缀合物或寡核苷酸-配体缀合物(例如，核酸抑制剂分子)是如本文所述的RNAi抑制剂分子，包括dsRNAi抑制剂分子或ssRNAi抑制剂分子。
靶基因可为来自任何哺乳动物的靶基因，例如人类靶基因。可根据本发明方法使任何基因沉默。示例性靶基因包括但不限于因子VII、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、HBV、HCV、RSV、PDGFβ基因、Erb-B基因、Src基因、CRK基因、GRB2基因、RAS基因、MEKK基因、JNK基因、RAF基因、Erk1/2基因、PCNA(p21)基因、MYB基因、JUN基因、FOS基因、BCL-2基因、周期蛋白D基因、VEGF基因、EGFR基因、周期蛋白A基因、周期蛋白E基因、WNT-1基因、β-连环蛋白基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、存活素基因、Her2/Neu基因、拓扑异构酶I基因、拓扑异构酶IIα基因、p73基因、p21(WAF1/CIP1)基因、p27(KIP1)基因、PPM1D基因、RAS基因、小窝蛋白I基因、MIB I基因、MTAI基因、M68基因、肿瘤抑制基因的突变、p53肿瘤抑制基因、LDHA和其组合。
在一些实施方案中，所提供的核酸-配体缀合物或寡核苷酸-配体缀合物(例如，核酸抑制剂分子)使靶基因沉默，并且因此可用于治疗患有特征为靶基因的不当表达的病症或处于所述病症的风险下的受试者。例如，在一些实施方案中，所提供的核酸-配体缀合物或寡核苷酸-配体缀合物(例如，核酸抑制剂分子)使β-连环蛋白基因沉默，并且因此可用于治疗患有特征为不当β-连环蛋白表达的病症(例如，腺癌或肝细胞癌)或处于所述病症的风险下的受试者。
典型地，静脉内或皮下施用所提供的核酸-配体缀合物或寡核苷酸-配体缀合物(例如，核酸抑制剂分子)。然而，本文所公开的药物组合物还可通过本领域中已知的任何方法施用，包括例如口服、经颊、舌下、经直肠、经阴道、尿道内、局部、眼内、鼻内和/或耳内，所述施用可包括片剂、胶囊、颗粒、水性悬浮液、凝胶、喷雾、栓剂、油膏、软膏等。
在某些实施方案中，经由全身施用(例如经由静脉内或皮下施用)将药物组合物递送至受试者或生物体中的相关组织或细胞，例如肝脏。在其他实施方案中，经由局部施用或全身施用递送药物组合物。在某些实施方案中，经由局部施用将药物组合物递送至相关组织或细胞，例如肺细胞和组织，例如经由肺部递送。
本文所公开的核酸-配体缀合物或寡核苷酸-配体缀合物的治疗有效量可取决于以下：施用途径和患者的身体特征，例如受试者的体型和体重，疾病进展或穿透的程度，受试者的年龄、健康状况和性别。
在某些实施方案中，以每天每千克接受者体重20微克至10毫克、每天每千克接受者体重100微克至5毫克、或每天每千克接受者体重0.5至2.0毫克的剂量施用如本文所述而提供的核酸-配体缀合物或寡核苷酸-配体缀合物。
可每天或间歇地施用本公开的药物组合物。例如，本公开的核酸-配体缀合物或寡核苷酸-配体缀合物的间歇施用可为每周一至六天、每月一至六天、每周一次、每隔一周一次、每月一次、每隔一个月一次或每年一次或两次，或分为多个每年、每月、每周或每日剂量。在一些实施方案中，间歇给药可意指周期性施用(例如，每天施用持续一天、一周或连续两周至八周，然后是无施用的休息期持续至多一周、至多一个月、至多两个月、至多三个月或至多六个月或更长时间)，或者其可意指隔天、隔周、隔月或隔年施用。
在本公开的治疗方法中的任一者中，可作为单一疗法单独地或与本领域中已知的额外疗法组合向受试者施用核酸-配体缀合物或寡核苷酸-配体缀合物或其类似物。
范例
缩写
Ac：乙酰基
AcOH：乙酸
ACN：乙腈
Ad：金刚烷基
AIBN：2,2'-偶氮二异丁腈
Anhyd：无水
Aq：水性
B2Pin2：双(频哪醇合)二硼-4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-联(1,3,2-二氧杂环戊硼烷)
BINAP：2,2'-双(二苯基膦基)-1,1'-联萘
BH3：硼烷
Bn：苯甲基
Boc：叔丁氧羰基
Boc2O：二碳酸二叔丁酯
BPO：过氧化苯甲酰
nBuOH：正丁醇
CDI：羰基二咪唑
COD：环辛二烯
d：天
DABCO：1,4-重氮双环[2.2.2]辛烷
DAST：三氟化二乙基氨基硫
dba：二苯亚甲基丙酮
DBU：1,8-重氮双环[5.4.0]十一碳-7-烯
DCE：1,2-二氯乙烷
DCM：二氯甲烷
DEA：二乙胺
DHP：二氢吡喃
DIBAL-H：氢化二异丁基铝
DIPA：二异丙胺
DIPEA或DIEA：N,N-二异丙基乙胺
DMA：N,N-二甲基乙酰胺
DME：1,2-二甲氧基乙烷
DMAP：4-二甲基氨基吡啶
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DMP：戴斯-马丁高碘烷(Dess-Martin periodinane)
DMSO-二甲亚砜
DMTr：4,4'-二甲氧基三苯甲基
DPPA：二苯基磷酰基叠氮化物
dppf：1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁
EDC或EDCI：1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
ee：对映异构体过量
ESI：电喷雾电离
EA：乙酸乙酯
EtOAc：乙酸乙酯
EtOH：乙醇
FA：甲酸
h或hrs：小时
HATU：六氟磷酸N,N,N',N'-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲鎓
HCl：盐酸
HPLC：高效液相色谱法
HOAc：乙酸
IBX：2-碘氧基苯甲酸
IPA：异丙醇
KHMDS：六甲基二硅氮烷钾
K2CO3：碳酸钾
LAH：氢化锂铝
LDA：二异丙基氨基锂
L-DBTA：二苯甲酰基-L-酒石酸
m-CPBA：间氯过苯甲酸
M：摩尔浓度
MeCN：乙腈
MeOH：甲醇
Me2S：二甲硫醚
MeONa：甲醇钠
MeI：碘甲烷
min：分钟
mL：毫升
mM：毫摩尔浓度
mmol：毫摩尔
MPa：兆帕斯卡
MOMCl：甲基氯甲基醚
MsCl：甲烷磺酰氯
MTBE：甲基叔丁基醚
nBuLi：正丁基锂
NaNO2：亚硝酸钠
NaOH：氢氧化钠
Na2SO4：硫酸钠
NBS：N-溴丁二酰亚胺
NCS：N-氯丁二酰亚胺
NFSI：N-氟苯磺酰亚胺
NMO：N-甲基吗啉N-氧化物
NMP：N-甲基吡咯烷
NMR：核磁共振
℃：摄氏度
Pd/C：钯/碳
Pd(OAc)2：乙酸钯
PBS：磷酸盐缓冲盐水
PE：石油醚
POCl3：氧氯化磷
PPh3：三苯基膦
PyBOP：六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻
Rel：相对
R.T.或rt：室温
s或sec：秒
sat：饱和
SEMCl：氯甲基-2-三甲基甲硅烷基乙基醚
SFC：超临界流体色谱法
SOCl2：二氯化硫
tBuOK：叔丁醇钾
TBAB：溴化四丁基铵
TBAF：氟化四丁基铵
TBAI：碘化四丁基铵
TEA：三乙胺
Tf：三氟甲磺酸盐
TfAA、TFMSA或Tf2O：三氟甲磺酸酐
TFA：三氟乙酸
TIBSCl：2,4,6-三异丙基苯磺酰氯
TIPS：三异丙基甲硅烷基
THF：四氢呋喃
THP：四氢吡喃
TLC：薄层色谱法
TMEDA：四甲基乙二胺
pTSA：对甲苯磺酸
UPLC：超高效液相色谱法
wt：重量
Xantphos：4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基二苯并吡喃
一般合成方法
以下实施例旨在说明本公开并且不应解释为对本发明的限制。温度以摄氏度给出。如果未另外提及，则所有蒸发都在减压下，优选在约15mm Hg与100mm Hg(＝20-133毫巴)之间进行。通过标准分析方法(例如，微量分析)和光谱特征(例如，MS、IR、NMR)确认最终产物、中间体和起始物质的结构。所用缩写是本领域中的常规缩写。
用于合成本公开的核酸或其类似物的所有起始物质、结构单元、试剂、酸、碱、脱水剂、溶剂和催化剂可购得，或者可通过本领域普通技术人员已知的有机合成方法产生(METHODS OF ORGANIC SYNTHESIS,Thieme,第21卷(Houben-Weyl第4版1952))。此外，本公开的核酸或其类似物可通过本领域普通技术人员已知的有机合成方法产生，如以下实施例中所示。
除非另有规定，否则所有反应都在氮气或氩气下进行。
质子NMR(1H NMR)在氘化溶剂中进行。在本文所公开的某些核酸或其类似物中，一个或多个1H位移与残留蛋白溶剂信号重叠；这些信号尚未在下文所提供的实验中报告。
如以下实施例中所描绘，在某些示例性实施方案中，根据以下一般程序制备核酸或其类似物。应了解，如本文所述，尽管一般方法描绘本公开的某些核酸或其类似物的合成，但以下一般方法和本领域普通技术人员已知的其他方法可应用于所有核酸或其类似物以及这些核酸或其类似物中的每一者的子类和种类。
实施例1.合成甲酸2-(2-((((6aR,8R,9R,9aR)-8-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2,4,4-四异丙基四氢-6H-呋喃并[3,2-f][1,3,5,2,4]三氧杂二硅辛烷-9-基)氧基)甲氧基)乙氧基)乙-1-铵(1-6)
在10℃下用吡啶(11mL，134.67mmol)和四异丙基二硅氧烷二氯化物(22.63mL，70.75mmol)处理化合物1-1(25.00g，67.38mmol)于20mL DMF中的溶液。在25℃下搅拌所得混合物3小时并用20％柠檬酸(50mL)淬灭。用EtOAc(3X50 mL)萃取水层，并且在真空中浓缩合并的有机层。使粗残余物从MTBE与正庚烷的混合物(1:15，320mL)中重结晶，得到呈白色油性固体状的化合物1-2(37.20g，90％)。
用AcOH(20mL，317.20mmol)和Ac2O(15mL，156.68mmol)处理化合物1-2(37.00g，60.33mmol)于20mL DMSO中的溶液。在25℃下搅拌混合物15小时。用EtOAc(100mL)稀释反应物并用饱和K2CO3(50mL)淬灭。用EtOAc(3X50 mL)萃取水层。浓缩合并的有机层并用ACN(30mL)重结晶，得到呈白色固体状的化合物1-3(15.65g，38.4％)。
在25℃下用Fmoc-氨基-乙氧基乙醇(11.67g，35.66mmol)处理化合物1-3(20.00g，29.72mmol)于120mL DCM中的溶液。搅拌混合物，得到澄清溶液，然后用分子筛(20.0g)、N-碘丁二酰亚胺(8.02g，35.66mmol)和TfOH(5.25mL，59.44mmol)处理。在30℃下搅拌混合物，直至HPLC分析指示化合物1-3消耗量>95％。用TEA(6mL)淬灭反应物并过滤。用EtOAc稀释滤液，用饱和NaHCO3(2X100 mL)、饱和Na2SO3(2X100 mL)和水(2X100 mL)洗涤并在真空中浓缩，得到呈黄色固体状的粗化合物1-4(26.34g，93.9％)，其未经进一步纯化即直接用于下一步骤。
在5℃下用DBU(7.00mL，45.08mmol)处理化合物1-4(26.34g，27.62mmol)于DCM/水(10:7，170mL)的混合物中的溶液。在5-25℃下搅拌混合物1小时。然后分离有机层，用水(100mL)洗涤，并用DCM(130mL)稀释。用反丁烯二酸(7.05g，60.76mmol)和分子筛(26.34g)分四份处理溶液。搅拌混合物1小时，浓缩，并且从MTBE与DCM的混合物(5:1)中重结晶，得到呈白色固体状的化合物1-6(14.74g，62.9％)：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)8.73(s,1H),8.58(s,1H),8.15-8.02(m,2H),7.65-7.60(m,1H),7.59-7.51(m,2H),6.52(s,2H),6.15(s,1H),5.08-4.90(m,3H),4.83-4.78(m,1H),4.15-3.90(m,3H),3.79-3.65(m,2H),2.98-2.85(m,6H),1.20-0.95(m,28H)。
实施例2.合成(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((2-(2-[脂质]-酰氨基乙氧基)乙氧基)甲氧基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺(2-4a至2-4e)
用冰冷K2HPO4水溶液(6％，100mL)和盐水(20％，2X100 mL)洗涤化合物1-6(50.00g，59.01mmol)于150mL 2-甲基四氢呋喃中的溶液。分离有机层，并且在0℃下用己酸(10.33mL，82.61mmol)、HATU(33.66g，88.52mmol)和DMAP(10.81g，147.52mmol)处理。将所得混合物升温至25℃并搅拌1小时。用水(2X100 mL)、盐水(100mL)洗涤溶液并在真空中浓缩，得到粗残余物。硅胶快速色谱法(1:1己烷/丙酮)得到呈白色固体状的化合物2-1a(34.95g，71.5％)。
在10℃下用三乙胺三氢氟酸盐(20.61mL，126.58mmol)逐滴处理化合物2-1a(34.95g，42.19mmol)和TEA(9.28mL，126.58mmol)于80mL THF中的混合物。将混合物升温至25℃并搅拌2小时。浓缩反应物，溶解于DCM(100mL)中，并用饱和NaHCO3(5X20 mL)和盐水(50mL)洗涤。在真空中浓缩有机层，得到粗化合物2-2a(24.72g，99％)，其未经进一步纯化即直接用于下一步骤。
用N-甲基吗啉(18.54mL，168.67mmol)和DMTr-Cl(15.69g，46.38mmol)处理化合物2-2a(24.72g，42.18mmol)于50mL DCM中的溶液。在25℃下搅拌混合物2小时并用饱和NaHCO3(50mL)淬灭。分离有机层，用水洗涤，浓缩，得到浆状粗物质。硅胶快速色谱法(1:1己烷/丙酮)得到呈白色固体状的化合物2-3a(30.05g，33.8mmol，79.9％)。
在氮气氛下，用N-甲基吗啉(3.10mL，28.17mmol)和四唑(0.67mL，14.09mmol)处理化合物2-3a(25.00g，28.17mmol)于50mL DCM中的溶液。将双(二异丙基氨基)氯膦(9.02g，33.80mmol)逐滴添加至溶液中，并且在25℃下搅拌所得混合物4小时。用水(15mL)淬灭反应物，并且用DCM(3X50 mL)萃取水层。用饱和NaHCO3(50mL)洗涤合并的有机层，浓缩得到粗固体，使其从DCM/MTBE/正己烷的混合物(1:4:40)中重结晶，得到呈白色固体状的化合物2-4a(25.52g，83.4％)：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)11.25(s,1H),8.65-8.60(m,2H),8.09-8.02(m,2H),7.71(s,1H),7.67-7.60(m,1H),7.59-7.51(m,2H),7.38-7.34(m,2H),7.30-7.25(m,7H),6.85-6.79(m,4H),6.23-6.20(m,1H),5.23-5.14(m,1H),4.80-4.69(m,3H),4.33-4.23(m,2H),3.90-3.78(m,1H),3.75(s,6H),3.74-3.52(m,3H),3.50-3.20(m,6H),3.14-3.09(m,2H),3.09(s,1H),2.82-2.80(m,1H),2.65-2.60(m,1H),2.05-1.96(m,2H),1.50-1.39(m,2H),1.31-1.10(m,14H),1.08-1.05(m,2H),0.85-0.79(m,3H)；31P NMR(162MHz,d6-DMSO)149.43,149.18。
使用上文针对化合物2-4a所述的类似程序制备化合物2-4b、2-4c、2-4d和2-4e。获得呈白色固体状的化合物2-4b(25.50g，85.4％)：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)11.23(s,1H),8.65-8.60(m,2H),8.05-8.02(m,2H),7.73-7.70(m,1H),7.67-7.60(m,1H),7.59-7.51(m,2H),7.38-7.34(m,2H),7.30-7.25(m,7H),6.89-6.80(m,4H),6.21-6.15(m,1H),5.23-5.17(m,1H),4.80-4.69(m,3H),4.40-4.21(m,2H),3.91-3.80(m,1H),3.74(s,6H),3.74-3.52(m,3H),3.50-3.20(m,6H),3.14-3.09(m,2H),3.09(s,1H),2.83-2.79(m,1H),2.68-2.62(m,1H),2.05-1.97(m,2H),1.50-1.38(m,2H),1.31-1.10(m,18H),1.08-1.05(m,2H),0.85-0.78(m,3H)；31P NMR(162MHz,d6-DMSO)149.43,149.19。
获得呈灰白色固体状的化合物2-4c(36.60g，66.3％)：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)11.22(s,1H),8.64-8.59(m,2H),8.05-8.00(m,2H),7.73-7.70(m,1H),7.67-7.60(m,1H),7.59-7.51(m,2H),7.38-7.34(m,2H),7.30-7.25(m,7H),6.89-6.80(m,4H),6.21-6.15(m,1H),5.25-5.17(m,1H),4.80-4.69(m,3H),4.40-4.21(m,2H),3.91-3.80(m,1H),3.74(s,6H),3.74-3.50(m,3H),3.50-3.20(m,6H),3.14-3.09(m,2H),3.09(s,1H),2.83-2.79(m,1H),2.68-2.62(m,1H),2.05-1.99(m,2H),1.50-1.38(m,2H),1.33-1.12(m,38H),1.08-1.05(m,2H),0.86-0.80(m,3H)；31P NMR(162MHz,d6-DMSO)149.42,149.17。
获得呈灰白色固体状的化合物2-4d(26.60g，72.9％)：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)11.22(s,1H),8.64-8.59(m,2H),8.05-8.00(m,2H),7.73-7.70(m,1H),7.67-7.60(m,1H),7.59-7.51(m,2H),7.38-7.33(m,2H),7.30-7.25(m,7H),6.89-6.80(m,4H),6.21-6.15(m,1H),5.22-5.17(m,1H),4.80-4.69(m,3H),4.40-4.21(m,2H),3.91-3.80(m,1H),3.74(s,6H),3.74-3.52(m,3H),3.50-3.20(m,6H),3.14-3.09(m,2H),3.09(s,1H),2.83-2.79(m,1H),2.68-2.62(m,1H),2.05-1.99(m,2H),1.50-1.38(m,2H),1.35-1.08(m,38H),1.08-1.05(m,2H),0.85-0.79(m,3H)；31P NMR(162MHz,d6-DMSO)149.47,149.22。
获得呈白色固体状的化合物2-4e(38.10g，54.0％)：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)11.21(s,1H),8.64-8.59(m,2H),8.05-8.00(m,2H),7.73-7.70(m,1H),7.67-7.60(m,1H),7.59-7.51(m,2H),7.38-7.34(m,2H),7.30-7.25(m,7H),6.89-6.80(m,4H),6.21-6.15(m,1H),5.23-5.17(m,1H),4.80-4.69(m,3H),4.40-4.21(m,2H),3.91-3.80(m,1H),3.73(s,6H),3.74-3.52(m,3H),3.47-3.22(m,6H),3.14-3.09(m,2H),3.09(s,1H),2.83-2.79(m,1H),2.68-2.62(m,1H),2.05-1.99(m,2H),1.50-1.38(m,2H),1.35-1.06(m,46H),1.08-1.06(m,2H),0.85-0.77(m,3H)；31PNMR(162MHz,d6-DMSO)149.41,149.15。
实施例3.合成脂质GalXC缀合物
方案1.合成环上具有单脂质(直链和支链)的带缺口的四环GalXC缀合物。经由酰胺偶联反应实现合成后缀合。
R1COOH基团代表脂肪酸C8:0、C10:0、C11:0、C12:0、C14:0、C16:0、C17:0、C18:0、C18:1、C18:2、C22:5、C22:0、C24:0、C26:0、C22:6、C24:1、二酰基C16:0或二酰基C18:1
通过固相合成制备合成有义链1和反义链1。
合成缀合的有义链1a-1i。
经由合成后缀合方法合成缀合的有义链1a。在Eppendorf管1中，在室温下用HATU(1.52mg，4umol)处理辛酸(0.58mg，4umol)于DMA(0.75mL)中的溶液。在Eppendorf管2中，用DIPEA(1.39uL，8umol)处理寡聚有义链1(10.00mg，0.8umol)于H2O(0.25mL)中的溶液。将Eppendorf管1中的溶液添加至Eppendorf管2中，并且在室温下使用ThermoMixer混合。通过LC-MS分析指示反应完成后，用5mL水稀释反应混合物，并通过反相XBridge C18柱使用于ACN和H2O中的100mM TEAA的5-95％梯度来纯化。使用Genevac减压浓缩产物级分。使用Ultra-15Centrifugal(3K)相对于水(1X)、盐水(1X)和水(3X)对合并的残余溶剂进行透析。用水(3X 2mL)洗涤Amicon膜，然后将合并的溶剂冻干，得到缀合的有义链1a的无定形白色固体(6.43mg，64％产率)。
使用与合成缀合的有义链1a所述类似的程序制备缀合的有义链1b-1i，并以42％-69％的产率获得。
粘接双链体1a-1j。
将缀合的有义链1a(10mg，按重量测量)溶解于0.5mL去离子水中以制备20mg/mL溶液。将反义链1(10mg，通过OD测量)溶解于0.5mL去离子水中以制备20mg/mL溶液，其用于滴定缀合的有义链和定量双链体的量。基于计算缀合的有义链和反义链两者的摩尔量，将一定比例的所需反义链1添加至缀合的有义链1a溶液中。在95℃下搅拌所得混合物5分钟并使其冷却降至室温。通过离子交换HPLC监测粘接进程。基于粘接进程，进一步添加若干比例的反义链1以完成纯度>95％的粘接。将溶液冻干，得到双链体1a(C8)，并且基于粘接中消耗的反义链的摩尔量计算所述双链体的量。
使用与粘接双链体1a(C8)所述相同的程序制备双链体1b-1i。
以下方案1-2描绘环上具有单脂质的带缺口的四环GalXC缀合物的合成。经由Cu催化的炔烃-叠氮化物环加成反应实现合成后缀合。
方案1-2
通过固相合成制备有义链1B和反义链1B。
合成缀合的有义链1j。
在Eppendorf管1中，用脂质接头叠氮化物(11.26mg，4umol)处理寡核苷酸(10.00mg，0.8umol)于DMA/H2O的3:1混合物(0.5mL)中的溶液。在Eppendorf管2中，将CuBr二甲硫醚(1.64mg，8umol)溶解于ACN(0.5mL)中。通过使N2鼓泡通过两种溶液来脱气10分钟。然后将CuBrSMe2的ACN溶液添加至管1中，并且在40℃下搅拌所得混合物。通过LC-MS分析指示反应完成后，用0.5M EDTA(2mL)稀释反应混合物，并使用Ultra-15Centrifugal(3K)相对于水(2X)进行透析。通过反相XBridge C18柱使用于ACN(外加30％IPA)和H2O中的100mM TEAA的5-95％梯度来纯化反应粗物质。使用Genevac减压浓缩产物级分。使用/>Ultra-15Centrifugal(3K)相对于水(1X)、盐水(1X)和水(3X)对合并的残余溶剂进行透析。用水(3X 2mL)洗涤Amicon膜，并且将合并的溶剂冻干，得到缀合的有义链1j的无定形白色固体(6.90mg，57％产率)。
使用与粘接双链体1a(C8)所述相同的程序制备双链体1j(PEG2K-二酰基C18)。
以下方案1-3描绘使用合成后缀合方法合成环上具有双脂质的带缺口的四环GalXC缀合物。
方案1-3
通过固相合成制备有义链2和反义链2。
使用与合成缀合的有义链1a所述类似的程序，但用10当量脂质、10当量HATU和20当量DIPEA制备缀合的有义链2a和2b。
使用与粘接双链体1a(C8)所述相同的程序制备双链体2a(2XC11)和2b(2XC22)。
以下方案1-4描绘使用合成后缀合方法合成与单脂质缀合的完全硫代磷酸化茎环的GalXC。
方案1-4
通过固相合成制备有义链3和反义链3。
使用与合成缀合的有义链1a所述类似的程序制备缀合的有义链3a，并以65％的产率获得。
使用与粘接双链体1a(C8)所述相同的程序制备双链体3a(PS-C22)。
以下方案1-5描绘使用合成后缀合方法合成与单脂质缀合的短有义链的GalXC。
方案1-5
通过固相合成制备有义链4和反义链4。
使用与合成缀合的有义链1a所述类似的程序制备缀合的有义链4a，并以74％的产率获得。
使用与粘接双链体1a(C8)所述相同的程序制备双链体4a(SS-C22)。
以下方案1-6描绘使用合成后缀合方法合成环上与三金刚烷部分缀合的带缺口的四环GalXC。
方案1-6通过固相合成制备有义链5和反义链5。
使用与合成缀合的有义链1a所述类似的程序制备缀合的有义链5a和5b，并以42％-73％的产率获得。
使用与粘接双链体1a(C8)所述相同的程序制备双链体5a(3X金刚烷)和双链体5b(3X乙酰基金刚烷)。
以下方案1-7描绘环上与脂质缀合的带缺口的四环GalXC的固相合成的实施例。
方案1-7
合成缀合的有义链6。
通过固相合成，使用市售寡聚合成器制备缀合的有义链6。使用2'-修饰的核苷亚磷酰胺，例如2'-F或2'-OMe，和2'-二乙氧基甲醇连接的脂肪酸酰胺核苷亚磷酰胺合成寡核苷酸。使用标准寡核苷酸合成方案在3'至5'方向上在固体支撑物上进行寡核苷酸合成。使用5-乙硫基-1H-四唑(ETT)作为偶联反应的活化剂。碘溶液用于亚磷酸三酯氧化。3-(二甲基氨基亚甲基)氨基-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT)用于形成硫代磷酸酯键。用浓氨水处理合成的寡核苷酸10小时。从悬浮液中去除氨，并且通过过滤去除固体支撑物残余物。用TEAA处理粗寡核苷酸，进行分析并通过强阴离子交换高效液相色谱法(SAX-HPLC)来纯化。合并级分，并使用Ultra-15Centrifugal(3K)相对于水(3X)、盐水(1X)和水(3X)进行透析。接着将剩余溶剂冻干，得到所需缀合的有义链6。
使用与粘接双链体1a(C8)所述相同的程序制备双链体6。
方案8.经由合成后缀合方法合成环上与一个金刚烷单元缀合的带缺口的四环GalXC。
N＝0：金刚烷甲酸；n＝1：金刚烷乙酸方案1-8
合成缀合的有义链7a和7b
使用与合成缀合的有义链5相同的方法或基本上类似的方法获得缀合的有义链7a和有义链7b。
双链体7a和7b的合成实施例
使用与合成双链体5相同的方法或基本上类似的方法获得双链体7a和双链体7b。
方案9.经由合成后缀合方法合成环上与两个金刚烷单元缀合的带缺口的四环GalXC。
方案1-9
合成缀合的有义链8a和8b
使用与合成缀合的有义链5相同的方法或基本上类似的方法获得缀合的有义链8a和有义链8b。
双链体8a和8b的合成实施例
使用与合成双链体5相同的方法或基本上类似的方法获得双链体8a和双链体8b。
以下方案1-10描绘使用合成后缀合方法合成与单脂质缀合的短有义链和短茎环的GalXC。
方案1-10
合成有义链9a
使用与合成缀合的有义链5相同的方法或基本上类似的方法获得缀合的有义链9a。
双链体9a的合成实施例
使用与合成双链体5相同的方法或基本上类似的方法获得双链体9a。
以下方案1-11描绘使用合成后缀合方法合成在5'端与单脂质缀合的GalXC。
方案1-11
合成缀合的有义链10a
使用与合成缀合的有义链5相同的方法或基本上类似的方法获得缀合的有义链10a。
双链体10a的合成实施例
使用与合成双链体5相同的方法或基本上类似的方法获得双链体10a。
以下方案1-12a和1-12b描述使用合成后缀合方法合成在3'端或5'端具有与单脂质缀合的钝端的GalXC。
方案1-12a
方案1-12b
合成缀合的有义链11a和12a
使用与合成缀合的有义链5相同的方法或基本上类似的方法获得缀合的有义链11a和12a。
双链体11a和12a的合成实施例
使用与合成双链体5相同的方法或基本上类似的方法获得双链体11a和12a。
使用与合成双链体5相同的方法或基本上类似的方法获得缀合物双链体8D和双链体9D。
实施例4.DRNA GalXC脂质缀合物的生物分布和基因沉默活性
如实施例3中所述制备双链体1a(C8)、1f(C22:6)和1c(C22)，并且测试其生物分布和基因沉默活性。双链体1c(C22)在肺、肾上腺、脂肪和骨骼肌中显示出广泛肝外分布和稳固敲低活性(50％-75％)。如图1中所示，双链体1f(C22:6)在这些肝外组织中还显示出50％-60％基因沉默活性。
实施例5.GalXC脂质缀合物双链体1c(C22)在肝外组织中的剂量反应
如实施例3中所述制备双链体1c(C22)，并且测试肝外组织反应。
向CD-1雌性小鼠静脉内施用15mg/kg GalXC脂质缀合物。向对照组给与磷酸盐缓冲盐水(PBS)。处理后120小时将动物处死。收集肝脏和肝外组织，包括肺、肾上腺、骨骼肌、脂肪、心脏、肾脏、十二指肠和淋巴结。从每个组织去除1-4mm穿孔，并将其置于干冰上的96孔板中用于mRNA分析。通过qPCR使用CFX384 TOUCHTM实时PCR检测系统(BioRadLaboratories,Inc.,Hercules,CA)测量靶mRNA的减少。将所有样品针对PBS处理的对照动物归一化，并使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA)绘图。
双链体1c(C22)在给药后第6天和第14天在肺、肾上腺、骨骼肌和脂肪中以3.75至30mg/kg剂量展示出ALDH2 mRNA的基因沉默的稳固剂量依赖性活性。如图2中所示，在两个时间点以15mg/kg剂量在骨骼肌和脂肪中观察到约75％的基因沉默。
实施例6.肝外组织中GalXC脂质缀合物双链体1c(C22)的基因沉默活性的持续时间
如实施例3中所述制备双链体1c(C22)。
使用如实施例5中所述的方法测量双链体1c(C22)的体内基因沉默活性。
向CD-1雌性小鼠皮下施用指定剂量的双链体1c(C22)。向对照组给与磷酸盐缓冲盐水(PBS)。处理后6天或14天将动物处死。收集肝脏和肝外组织，包括肺、肾上腺、骨骼肌和脂肪。如实施例4中所述测量每个组织中的靶mRNA。在单次皮下给与15mg/kg双链体1c(C22)后5周内，在骨骼肌和心脏中观察到持久ALDH2 mRNA沉默活性(约50％敲低)。如图3中所示，在单次施用后4周内，在脂肪和肾上腺中也观察到显著基因沉默(40-60％敲低)。
实施例7.肝外组织中GalXC二酰基脂质缀合物和单脂质C18缀合物的基因沉默活性
如实施例3中所述制备双链体1h(二酰基C16)、1i(二酰基C18:1)、1j(PEG2K-二酰基C18)和1b(C18)。
使用如实施例5中所述的方法测量双链体1h(二酰基C16)、1i(二酰基C18:1)、1j(PEG2K-二酰基C18)的体内基因沉默活性。在单次15mg/kg皮下注射后第7天，双链体1b(C18)在肾上腺、脂肪、心脏和骨骼肌中显示出ALDH2 mRNA的稳固基因沉默活性。如图4中所示，双链体1h(二酰基C16)、1i(二酰基C18:1)、1j(PEG2K-二酰基C18)在这些组织中展示出较少基因沉默活性。
实施例8.GalXC长脂质缀合物和金刚烷缀合物的基因沉默活性
如实施例3中所述制备GalXC长脂质缀合物双链体1d(C24)、1e(C26)、1g(C24:1)和金刚烷缀合物双链体5b(3X乙酰基金刚烷)。
使用如实施例5中所述的方法测量双链体1d(C24)、1e(C26)、1g(C24:1)和金刚烷缀合物双链体5b(3X乙酰基金刚烷)的体内基因沉默活性，具有不同脂质长度的GalXC脂质缀合物在各种组织中展示出不同基因沉默活性。与双链体1c(C22)相比，双链体1d(C24)和1g(C24:1)显示出略微改进的基因沉默活性，在骨骼肌、脂肪、肾上腺和心脏中ALDH2 mRNA敲低50％-75％。如图5中所示，第14天观察到这些组织中更强的基因沉默活性。
实施例9.RNA化学修饰对GalXC脂质缀合物的基因沉默活性的影响
图6显示具有RNA化学修饰的GalXC脂质缀合物的基因沉默活性，包括完整硫代磷酸茎环的双链体3a(PS-C22)和短有义链的双链体4a(SS-C22)，和具有双脂质的GalXC脂质缀合物，包括双链体2a(2XC11)和双链体2b(2XC22)，和GalXC三金刚烷缀合物双链体5a(3X金刚烷)。
如实施例3中所述制备GalXC脂质缀合物双链体2a(2XC11)、2b(2XC22)、3a(PS-C22)、4a(SS-C22)和GalXC三金刚烷缀合物双链体5a(3X金刚烷)。
使用如实施例5中所述的方法测量双链体2a(2XC11)、2b(2XC22)、3a(PS-C22)、4a(SS-C22)和GalXC三金刚烷缀合物双链体5a(3X金刚烷)的体内基因沉默活性。如图6中所示，在双链体3a(PS-C22)的皮下给药后第7天和第14天，在肾上腺、脂肪、心脏和骨骼肌中观察到ALDH2 mRNA的显著基因沉默(敲低40％-60％)。双链体2a(2XC11)在这些肝外组织中也显示出可比的基因沉默活性。第14天，双链体4a(SS-C22)在骨骼肌(敲低45％)中展示出优于肝脏(敲低20％)中的ALDH2沉默的选择性。
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尽管我们已描述本公开的若干实施方案，但显然可改变本文所提供的基本实施例以提供利用本公开的核酸或其类似物和方法的其他实施方案。因此，应了解，本公开的范围将由本说明书和所附权利要求而非举例表示的特定实施方案来限定。

Claims (43)

1.一种由式I表示的核酸-配体缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
B是核碱基或氢；
R1和R2独立地是氢、卤素、RA、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或者
同一碳上的R1和R2与其间插原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3元饱和或部分不饱和环；
每个RA独立地是任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
每个R独立地是氢、合适的保护基，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环，或者：
同一原子上的两个R基团与其间插原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4-7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
LA独立地是PG1或-L-配体；
PG1是氢或合适的羟基保护基；
每个配体独立地是-(LC)n和/或金刚烷基；
每个LC独立地是包含饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链的脂质缀合物部分，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替；
每个-Cy-独立地是任选地被取代的选自以下的二价环：亚苯基，8-10元双环亚芳基，4-7元饱和或部分不饱和亚碳环基，4-11元饱和或部分不饱和螺亚碳环基，8-10元双环饱和或部分不饱和亚碳环基，亚金刚烷基，具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-11元饱和或部分不饱和螺亚杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的8-10元双环饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元亚杂芳基，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环亚杂芳基；
n是1-10；
L是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-N(R)-C(O)-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-、-V1CR2W1-或代替；
m是1-50；
X1、V1和W1独立地是-C(R)2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或-NR-；
Z是-O-、-S-、-NR-或-CR2-；并且
PG2是氢、亚磷酰胺类似物或合适的保护基。
2.如权利要求1所述的核酸-配体缀合物，其由式I-a表示：
3.如权利要求1所述的核酸-配体缀合物，其中所述缀合物由式I-b或I-c表示：
或其药学上可接受的盐；其中
L1是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替；
R4是氢、RA或合适的胺保护基；并且
R5是金刚烷基，或饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
4.一种核酸-配体缀合物，其中所述缀合物由式I-d或I-e表示：
或其药学上可接受的盐；其中
B是核碱基或氢；
PG1和PG2独立地是氢、亚磷酰胺类似物或合适的保护基；并且
R5是金刚烷基，或饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替；
V是选自-O-、-S-和-NR-的二价基团；
W是选自以下的二价基团：-O-、-S-、-NR-、-C(O)NR-、-OC(O)NR-、-SC(O)NR-、
L2是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替；
m是1-50；
X1是-C(R)2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或-NR-；
R4是氢、RA或合适的胺保护基；并且
R5是金刚烷基，或饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替；
每个RA独立地是任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
每个R独立地是氢、合适的保护基，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环。
5.如权利要求4所述的核酸-配体缀合物，其中：
V是-O-；
L2是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)-、-代替；
R4是氢；
w是-O-、-NR-、-C(O)NR-、-OC(O)NR并且
R5是饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-或-C(O)O-代替。
6.一种由式I-Ib或I-Ic表示的核酸-配体缀合物：
或其药学上可接受的盐；其中
B是核碱基或氢；
m是1-50；
PG1和PG2独立地是氢、亚磷酰胺类似物或合适的保护基；并且
R5是金刚烷基，或饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
7.如权利要求6所述的核酸-配体缀合物，其中：
R5选自
8.如权利要求1至8中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，所述寡核苷酸-配体缀合物包含一个或多个核酸-配体缀合物单元。
9.如权利要求9所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述缀合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核酸-配体缀合物单元。
10.一种寡核苷酸-配体缀合物，所述寡核苷酸-配体缀合物包含一个或多个由式II表示的核酸-配体缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
B是核碱基或氢；
R1和R2独立地是氢、卤素、RA、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；或者
同一碳上的R1和R2与其间插原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3-7元饱和或部分不饱和环；
每个RA独立地是任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
每个R独立地是氢、合适的保护基，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；或者
同一原子上的两个R基团与其间插原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4-7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
配体独立地是-(LC)n或金刚烷基；
每个LC独立地是包含饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链的脂质缀合物部分，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-代替；
每个-Cy-独立地是任选地被取代的选自以下的二价环：亚苯基，8-10元双环亚芳基，4-7元饱和或部分不饱和亚碳环基，4-11元饱和或部分不饱和螺亚碳环基，8-10元双环饱和或部分不饱和亚碳环基，具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-11元饱和或部分不饱和螺亚杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的8-10元双环饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元亚杂芳基，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环亚杂芳基；
n是1-10；
L是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-、-V1CR2W1-或代替；
m是1-50；
X1、V1和W1独立地是-C(R)2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或-NR-；
Y是氢、合适的羟基保护基、
R3是氢、合适的保护基、合适的前药，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
X2是O、S或NR；
X3是-O-、-S-、-BH2-或共价键；
Y1是连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2'或3'末端的键联基团；
Y2是氢，合适的保护基，亚磷酰胺类似物，连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的5'末端的核苷酸间键联基团，或连接至固体支撑物的键联基团；并且
Z是-O-、-S-、-NR-或-CR2-。
11.如权利要求10所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述缀合物由式II-a表示：
12.如权利要求10所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述缀合物由式II-b或II-c表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
L1是共价键、单价或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替；
R4是氢、RA或合适的胺保护基；并且
R5是金刚烷基，或饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR代替。
13.如权利要求10所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述缀合物由式II-d或II-e表示：
或其药学上可接受的盐；
V是选自-O-、-S-和-NR-的二价基团；
W是选自-O-、-S-、-NR-、-C(O)NR-、-OC(O)NR-、-SC(O)NR-、
的二价基团；
L2是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替；
R4是氢、RA或合适的胺保护基；并且
R5是饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
14.一种寡核苷酸-配体缀合物，所述寡核苷酸-配体缀合物由式II-Id或II-Ie表示：
或其药学上可接受的盐；其中：
m是1-50；
B是H或核碱基；
X1是-C(R)2-、-OR、-O-、-S-或-NR-；
每个R独立地是氢、合适的保护基，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
w是选自-O-、-S-、-NR-、-C(O)NR-、-OC(O)NR-、 的二价基团；
L2是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替；
Y是氢、
R3是氢或合适的保护基、合适的前药，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
X2是O或S；
X3是-O-、-S-或共价键；
Y1是连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2'或3'末端的键联基团；
Y2是氢，亚磷酰胺类似物，连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的5'末端的核苷酸间键联基团，或连接至固体支撑物的键联基团；并且
R5是金刚烷基，或饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
15.如权利要求14所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中：
R5选自
16.一种寡核苷酸-配体缀合物，所述寡核苷酸-配体缀合物由式II-Ib或II-Ic表示：
或其药学上可接受的盐；其中
B是核碱基或氢；
m是1-50；
X1是-O-或-S-；
Y是氢、
R3是氢或合适的保护基；
X2是O或S；
X3是-O-、-S-或共价键；
Y1是连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2'或3'末端的键联基团；
Y2是氢，亚磷酰胺类似物，连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的5'末端的核苷酸间键联基团，或连接至固体支撑物的键联基团；
R5是金刚烷基，或饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替；并且
R是氢、合适的保护基，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环。
17.如权利要求16所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中：
R5选自
18.如权利要求10-17中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述缀合物包含1-10个核酸-配体缀合物单元。
19.如权利要求10-17中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述缀合物包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个核酸-配体缀合物单元。
20.如权利要求10-17中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述缀合物包含1、2或3个核酸-配体缀合物单元。
21.如权利要求8-20中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述寡核苷酸包含长度为10-53个核苷酸的有义链和长度为15-53个核苷酸的反义链，其中所述反义寡核苷酸链具有与靶基因序列的至少15个连续核苷酸互补的序列，并且当将所述寡核苷酸-缀合物引入哺乳动物细胞中时降低基因表达。
22.一种用于降低靶基因表达的寡核苷酸-配体缀合物，其中核酸-缀合物单元由式II表示：
/>
或其药学上可接受的盐，其中：
B是核碱基或氢；
R1和R2独立地是氢、卤素、RA、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；或者
同一碳上的R1和R2与其间插原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3-7元饱和或部分不饱和环；
每个RA独立地是任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
每个R独立地是氢、合适的保护基，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；或者
同一原子上的两个R基团与其间插原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4-7元饱和、部分不饱和或杂芳基环；
配体独立地是-(LC)n或金刚烷基；
每个LC独立地是包含饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链的脂质缀合物部分，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-代替；
每个-Cy-独立地是任选地被取代的选自以下的二价环：亚苯基，8-10元双环亚芳基，4-7元饱和或部分不饱和亚碳环基，4-11元饱和或部分不饱和螺亚碳环基，8-10元双环饱和或部分不饱和亚碳环基，具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-11元饱和或部分不饱和螺亚杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的8-10元双环饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元亚杂芳基，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环亚杂芳基；
n是1-10；
L是共价键或二价饱和或不饱和、直链或支链C1-50烃链，其中所述烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-N(R)-C(O)-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-、-V1CR2W1-或代替；
m是1-50；
X1、V1和W1独立地是-C(R)2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或-NR-；
Y是氢、合适的羟基保护基、
R3是氢、合适的保护基、合适的前药，或任选地被取代的选自以下的基团：C1-6脂族基，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，和具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
X2是O、S或NR；
X3是-O-、-S-、-BH2-或共价键；
Y1是连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的2'或3'末端的键联基团；
Y2是氢，合适的保护基，亚磷酰胺类似物，连接至核苷、核苷酸或寡核苷酸的5'末端的核苷酸间键联基团，或连接至固体支撑物的键联基团；
Z是-O-、-S-、-NR-或-CR2-；并且
其中所述寡核苷酸包含长度为15-53个核苷酸的有义链和长度为19-53个核苷酸的反义链，其中所述反义寡核苷酸链具有与靶基因序列的至少15个连续核苷酸互补的序列；
并且其中所述反义链与所述有义链形成双链体结构，但不共价连接。
23.如权利要求21或22所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述核酸-配体缀合物单元存在于所述有义链中。
24.如权利要求21或22所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述反义链的长度为19至27个核苷酸。
25.如权利要求21或22所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述有义链的长度为12至40个核苷酸。
26.如权利要求21至25中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区域。
27.如权利要求21所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述互补区域与所述靶序列完全互补。
28.如权利要求21至27中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述有义链在其3'端包含如下所示的茎环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环。
29.如权利要求28所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中L是四环。
30.如权利要求28所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中L包含以GAAA所示的序列。
31.如权利要求21至30中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，所述寡核苷酸-配体缀合物还包含所述反义链上长度为两个核苷酸的3'-悬垂序列。
32.如权利要求21至30中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述寡核苷酸还包含长度为一个或多个核苷酸的3'-悬垂序列，其中所述3'-悬垂序列存在于所述反义链、所述有义链、或所述反义链和所述有义链上。
33.如权利要求21至32中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。
34.如权利要求33所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述经修饰的核苷酸包含2'-修饰。
35.如权利要求34所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述2'-修饰是选自以下的修饰：2'-氨基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基、2'-脱氧-2'-氟和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖基。
36.如权利要求21至32中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸经修饰。
37.如权利要求21至36中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸间键。
38.如权利要求37所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述至少一个经修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
39.如权利要求21至36中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。
40.如权利要求39所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述磷酸酯类似物是氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。
41.一种组合物，所述组合物包含权利要求21-40中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物和赋形剂。
42.一种将寡核苷酸-配体缀合物递送至受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求41所述的组合物。
43.如权利要求21-40中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，所述寡核苷酸-配体缀合物用于降低靶基因的表达。
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