WO2013155865A1 - 一种提高桑黄总三萜类化合物产量的方法 - Google Patents

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宫志远
苏建昌
杜兴程
刘兆辉
王继磊
刘晓
朱肖艳
周庆新
孙涛
朱珊
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山东七河生物科技股份有限公司
山东省农业科学院农业资源与环境研究所
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    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the invention relates to a liquid fermentation method for increasing the yield of total triterpenoids of mulberry yellow, and belongs to the technical field of biological fermentation engineering.
  • Hel ⁇ CPhellinus igniarius is Basidiomycotina, Hymenomycetes, Polyporales, Polyporales, Helicobacter, H we”oc z.
  • c Pyrococcus genus (Phellinus fungus, is a kind Precious large-scale medicinal fungi.
  • Traditional Chinese medicine believes that mulberry is sweet and bitter, and is used to treat blood collapse, vaginal discharge, amenorrhea, spleen diarrhea, etc. Modern pharmacological studies have shown that mulberry has anti-tumor, immune-enhancing, anti-liver fiber It has been reported that mulberry is currently the most medicinal fungus with the highest anti-tumor ability.
  • Infiltrate lymphocytes increase the phagocytic capacity and lethality of macrophages, NK cells, and T cells, and directly and indirectly kill tumor cells, and activate dormant tumor cells that are difficult to kill by chemotherapy drugs, and separate and combine drugs. Killing. Because of the unique effects of sassafras triterpenoids on dormant cells and the effective suppression of malignant tumor recurrence and metastasis, it makes up for the deficiency of traditional tumor treatment (surgery, radiotherapy, chemotherapy) and becomes an important component in tumor immunotherapy. However, the lower yield of total triterpenoids of mulberry yellow has always been a limiting factor in its application.
  • dilating proteins In recent years, a new class of proteins called dilating proteins has been found in plant cell walls. Since McQueen-Mason et al. first isolated and purified the expanded protein from the cucumber hypocotyl elongation zone, successively from the oat coleoptile cell wall, the cell wall of the apical root tip, tomato, tobacco, Arabidopsis, rice, cotton fiber, corn, soybean The presence of dilatation proteins is also found in the cell wall. It is thought to be ubiquitous in the cell walls of various dicotyledonous and monocotyledonous plants, promoting its physiological growth, affecting vegetative growth, morphogenesis, pollination and fertilization, and fruit softening.
  • this protein is different from all cell wall proteins previously found. It has the function of inducing heat-passivated in vitro cell wall to restore stretch, and is supposed to interrupt the hydrogen bond between cell wall polymers and induce acid.
  • Dependent physiological activities such as cell wall extension and pressure relaxation may be the main regulators of physiological regulation and cell wall relaxation elongation during plant growth.
  • the mechanism of action of dilating proteins is still mostly speculation and inference, and there is no clear validation and mechanism clarification at home and abroad. Therefore, confirm the expansion There have been few reports on the application of various proteins. The application of dilating proteins to the liquid fermentation production of mulberry yellow has not been reported at home and abroad for improving the yield of secondary metabolites such as triterpenoids.
  • the present invention is directed to the deficiencies of the prior art, and provides a liquid fermentation method for increasing the yield of mulberry total triterpenoids by using expanded protein.
  • a liquid fermentation method for increasing the yield of total triterpenoids of mulberry yellow comprising the following steps:
  • the plate medium in the step (1) is a PDA plate medium; the composition per liter is as follows: potato 200 g, glucose 20 g, agar 15 g, distilled water to a volume of 1000 mL.
  • the activation culture condition in the step (1) is: a temperature of 22 to 27 V, and a time of 4 to 5 days.
  • the liquid fermentation medium in the step (1) is a PD liquid fermentation medium
  • the components of the PD liquid fermentation medium per liter are as follows:
  • the concentration of the dilated protein is 0.3 to 1.0 mg/ml ; further preferably 0.35 to 0.8 mg/mlo, and most preferably, the concentration of the dilated protein in the step (2) It is 0.4 mg/ml.
  • the expanded protein solution in the step (2) can be prepared by referring to the prior art, such as using McQueen-Mason et al. in McQueen-Mason SJ, Durachko DM, Cosgrove D J. Two endogenous proteins that induce cell wall ext ension in plants. Preparation of the method described in Cell, 1992, 4: 1425-1433; it is also possible to prepare an expanded protein solution as follows:
  • Soybean or cucumber seeds are sterilized by 0.05 ⁇ 0.15 wt% HgCl 2 for 4 ⁇ 6 min, rinsed with running water for 5 ⁇ 7 h, then dark cultured at 25 ⁇ 28 °C for 4 ⁇ 6 days; cut off seedling hypocotyls top 3 ⁇ 4 Cm, pre-cooled at -20 °C for 0.5 h, add the slurry buffer pre-cooled to 4 °C, homogenize, filter with a nylon mesh with a pore size of 70 ⁇ , filter residue washed with homogenization buffer, then add the filter residue In the homogenization buffer, let stand for 1 ⁇ 3 h at room temperature to obtain a static solution; add the extract to the static solution, extract at 44 °C for 4 ⁇ 4 h, filter, and add 0.3 ⁇ 0.5 g/mL.
  • the homogenization buffer component is: 25 mmol/L HEPES (4-hydroxyethylpiperazineethanesulfonic acid), 1.5 mmol/L Na 2 S 2 0 5 , 2 mmol/ L EDTA, 0.1 wt% Triton X-100, pH 7.0;
  • the extract components were: 15 mmol/L 4-hydroxyethylpiperazineethanesulfonic acid, 1.0 mmol/L EDTA, 1.5 mmol/L Na 2 S 2 0 5 ,
  • the acidic buffer was prepared by dissolving 2.05 g of sodium acetate in water, adjusting the pH to 4.0 with glacial acetic acid, and diluting to 1 L with water.
  • the separation described in step (2) is carried out by centrifugation at 15000 r/min for 5 to 10 min.
  • the method for extracting the extracellular triterpenoids of the mulberry yellow from the fermentation broth is as follows:
  • a method for extracting total triterpenoids in the mulberry yellow cell is as follows - the mulberry mycelium 65 obtained in the step (2) is dried and ground into a powder. Add methanol to each gram of mulberry mycelium powder plus 15 ⁇ 40 mL of methanol. At room temperature, pass ultrasonic extraction at a frequency of 40 KHz, power 200 W for 5-7 h, filter, and take the supernatant. The leach solution is obtained; the filter residue is repeatedly subjected to ultrasonic extraction and filtration operation, and the extract is combined, and the methanol is removed by concentrated distillation at 65 ° C to obtain a total triterpenoid compound in the mulberry yellow cell.
  • the invention has the following positive effects:
  • the present invention applies the dilating protein to the liquid fermentation of the total triterpenoids of Phellinus igniarius, and the yields of total triterpenoids of mulberry yellow and total triterpenoids of mulberry yellow respectively reach 952.12 mg/L and 475.51, respectively.
  • Mg/L which is 2.52 times and 2.19 times higher than the prior art, greatly improves the yield of total triterpenoids of mulberry yellow, and has good industrial application prospects.
  • the invention utilizes natural mulberry yellow strain as a raw material for production, is environmentally friendly and non-toxic, and has low raw material cost, and adopts the mulberry yellow liquid fermentation process and extraction method is simple and reproducible; further, the fermentation process of the present invention is controllable , independent of external environmental conditions, suitable for industrial production and application.
  • the expanded protein of the present invention can be extracted from most dicotyledonous and monocotyledonous plants and fungi, and has a wide range of sources, low cost, relatively simple preparation method, and can be scaled and produced, and the total output of mulberry yellow
  • the fermentation production of the compounds has a good promotion and promotion effect.
  • Figure 1 is a graph showing the effect of different concentrations of dilated protein solution on the total triterpenoids of mulberry and the total triterpenoids in the mulberry;
  • the fermented mulberry PheUinus igniar ⁇ strain described in the examples was purchased from the China General Microorganisms Collection and Management Center, and the strain storage number was CGMCC No. 51328.
  • Vanillin, 4-hydroxyethylpiperazineethanesulfonic acid, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), bovine serum albumin, Triton X-100 were purchased from Bioengineering (Shanghai) Co., Ltd.; ursolic acid standard solution Purchased from Jinan Shengwei Biotechnology Co., Ltd.; other reagents are common commercial products.
  • Soybean (Glycine max L. Merr. CV. M40; purchased from Jinan Weili Seed Co., Ltd.) or cucumber (Cucumis) Sativus L. CV. Jinnian No. 6; purchased from Jinan Weili Seed Co., Ltd.)
  • the seeds were sterilized by 0.1wt% HgCl 2 for 5 min, rinsed with running water for 6 h, then planted in wet vermiculite, dark culture at 27 °C. 5 d.
  • the above homogenization buffer components are: 25 mmol/L HEPES (4-hydroxyethylpiperazineethanesulfonic acid), 1.5 mmol/L Na 2 S 2 0 5 , 2 mmol/L EDTA, 0.1 wt % Triton X- 100, pH 7.0;
  • the above extract components are: 15 mmol / L HEPES, 1.0 mmol / L EDTA, 1.5 mmol / L Na 2 S 2 0 5 , 0.5 mol / L NaCl, pH 6.0;
  • the acidic buffer is prepared per liter as follows:
  • the method for determining the concentration of the expanded protein solution is detected by the Coomassie Brilliant Blue method, and can be specifically referred to by the Coomassie Brilliant Blue method described in the Guide to Fine Protein Science Experiments, ISBN: 703018086, publication date 1900-1-1.
  • the concentration of the expanded protein in the above expanded protein solution was determined to be 0.27 g/ml.
  • the PDA plate medium described in the examples was as follows: potato 200 g, glucose 20 g, agar 15 g, distilled water to a volume of 1000 mL.
  • the PD liquid fermentation medium described in the examples is as follows: potato 200 g, glucose 20 g, distilled water to a volume of 1000 mL.
  • a liquid fermentation method for using a dilating protein to increase the yield of total triterpenoids of mulberry yellow comprising the following steps -
  • the liquid fermentation culture conditions are: temperature 25 °C, shaker culture for 2 days, shaker speed 150 r/min, initial fermentation broth ;
  • step (3) extracting extracellular triterpenoids from the fermentation broth prepared in step (2), extracting total triterpenoids from mulberry yellow mycelium, and mixing the total three a terpenoid compound and a total triterpenoid compound in the mulberry, and a total triterpenoid compound;
  • the methanol was added at room temperature, ultrasonically extracted at a frequency of 40 KHz, power of 200 W for 5 h, filtered, and the supernatant was taken to obtain a leachate.
  • the seal was set at 4 ° C for refrigeration.
  • the filter residue was repeatedly subjected to ultrasonic extraction and filtration operations for 3 times, and the extracts were combined; then, methanol was removed by concentrated distillation at 65 Torr to obtain total triterpenoids in the mulberry yellow cells.
  • Preparation of extracellular triterpenoids of mulberry yellow to be tested Take extracellular triterpenoids of mulberry yellow obtained from 100 mL of fermentation broth, and make up to 2 mL with methanol to obtain extracellular cytoplasm a test sample of a terpenoid;
  • the UV colorimetric method was used in the field to determine the content of total triterpenic acid in the preparation of hawthorn preparation by spectrophotometry [J]. Journal of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine. 2003, 19( 2) : 99-100. and Wang Wenxiang, Gu Zhenxue. Determination of the content of total triterpenic acid in hawthorn by colorimetry. Chinese wild plant resources [J] . 2001, 20( 5): 47-48.
  • ursolic acid standard solution 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 mL in test tube, add vanillin 0.2 mL, perchloric acid 0.5 mL, mix the hook and incubate in a 60 °C water bath for 30 min, remove After 4 min of cold water for 4 min, add 5 mL of glacial acetic acid, and absorb the absorbance at 550 nm.
  • the microgram of ursolic acid is used as the abscissa and the absorbance is plotted on the ordinate to establish a standard curve.
  • Example 2 The liquid fermentation method as described in Example 1, except that the concentration of the expanded protein in the step (2) is 0.4 mg/mL;
  • each milliliter of fermentation broth contains 952.12 ⁇ g of extracellular triterpenoids of mulberry, which contains 952.12 mg of extracellular triterpenoids per liter of fermentation broth; per gram of mycelium (dry weight) Containing 17.26 mg of total triterpenoids in mulberry, which contains 333.47 mg of total triterpenoids in the mycelium produced per liter of fermentation broth.
  • Figure 1 The result is shown in Figure 1.
  • each milliliter of fermentation broth contains 829.51 ⁇ ⁇ of the total triterpenoid compound of mulberry yellow, which means 829.51 mg of extracellular triterpenoids per liter of fermentation broth; per gram of mycelium (dry weight) Containing 15.31 mg of total triterpenoids in mulberry, which contains 340.77 mg of total triterpenoids in the mycelium produced per liter of fermentation broth.
  • Figure 1 The result is shown in Figure 1.
  • each milliliter of fermentation broth contains 785.76 ⁇ g of extracellular triterpenoids of mulberry, which contains 785.76 mg of extracellular triterpenoids per liter of fermentation broth; per gram of mycelium (dry weight) It contains 16.34 mg of total triterpenoids in mulberry, which contains 449.51 mg of total triterpenoids in the mycelium produced per liter of fermentation broth.
  • Figure 1 The result is shown in Figure 1.
  • each milliliter of fermentation broth contains 882.37 ⁇ ⁇ of the total triterpenoid compound of mulberry, which contains 882.37 mg of extracellular triterpenoids per liter of fermentation broth; per gram of mycelium (dry weight) Containing 13.25 mg of total triterpenoids in mulberry, which contains 335.33 mg of total triterpenoids in the mycelium produced per liter of fermentation broth.
  • Figure 1 The result is shown in Figure 1.
  • each liter of fermentation broth contains 713.11 ⁇ g of extracellular triterpenoids of mulberry, which contains 713.11 mg of extracellular triterpenoids per liter of fermentation broth; per gram of mycelium (dry weight) It contains 15.94 mg of total triterpenoids in mulberry, which contains 414.72 mg of total triterpenoids in the mycelium produced per liter of fermentation broth.
  • Figure 1 The result is shown in Figure 1.
  • step (2) an acid buffer containing no expansion protein is used in place of the expanded protein solution added in the embodiment;
  • each milliliter of fermentation broth contains 270.15 ⁇ g of extracellular triterpenoids of mulberry, which contains 270.15 mg of extracellular triterpenoids per liter of fermentation broth; per gram of mycelium (dry weight) It contains 9.76 mg of total triterpenoids in mulberry, which contains 149.33 mg of total triterpenoids in the mycelium produced per liter of fermentation broth.
  • Figure 1 The result is shown in Figure 1.
  • the dilating protein has a significant promoting effect on the production of the extracellular triterpenoids of the mulberry yellow and the total triterpenoids of the mulberry, respectively, and the protein is expanded in the fermentation broth.
  • the concentrations of 0.4 mg/mL and 0.8 mg/mL the total yield of extracellular triterpenoids and total triterpenoids in the mulberry yellow reached the highest yields of 952.12 mg/L and 475.51 mg/L, respectively.
  • Comparative Example 1 it was increased by 2.52 times and 2.19 times, respectively.
  • the dilating protein of the present invention can also be extracted from the cell walls of other dicotyledonous and monocotyledonous plants and fungi such as oat germ, apical root tip, tomato, tobacco, Arabidopsis, rice, cotton fiber, corn, etc. Other common cultivars can also be used for the mulberry strain.

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Abstract

公开了一种提高桑黄总三萜类化合物产量的液体发酵方法，该方法将扩张蛋白用于桑黄总三萜类化合物的液体发酵中，提高了桑黄胞外和胞内总三萜类化合物的产量。

Description

说 明 书
一种提高桑黄总三萜类化合物产量的方法 技术领域
本发明涉及一种提高桑黄总三萜类化合物产量的液体发酵方法，属于生物发酵工程技术 领域。
背景技术
桑黄 CPhellinus igniarius) 为担子菌亚门 Basidiomycotina 层菌纲 Hymenomycetes 多 孔菌目 Polyporales、 锈革孑 L菌禾斗 H we"oc z。 "c"e、 针层孔菌属 (Phellinus 真菌， 是一种 珍贵的大型药用真菌。 传统中医认为桑黄性甘、 味苦， 用于治疗血崩、 带下、 闭经、 脾虚泄 泻等。 现代药理学研究表明， 桑黄具有抗肿瘤、 增强免疫力、 抗肝纤维化等功效。 据报道， 桑黄是目前抗肿瘤能力最高的药用真菌。 早在 1968年， 日本学者 Tetsuro lkekawa等用桑黄 的水提取物进行细胞试验，结果发现其对小鼠 S180的抑制率为 96.7 %，而对正常细胞无毒， 同时研究发现桑黄主要活性成分为多糖组分、 三萜类化合物和黄酮类物质， 其中所含三萜 类涵盖了不下百余种的化合物成分， 其中以四环三萜类化合物为主。近来研究表明桑黄 中的三萜类物质具有迅速提高免疫力的作用， 表现在促进淋巴细胞增殖， 提高巨噬细胞、 NK细胞、 T细胞的吞噬能力和杀伤力， 并直接和间接毒杀肿瘤细胞， 同时能够激活化疗药 物难以杀死的休眠期肿瘤细胞， 进行单独和联合毒杀。 由于桑黄三萜类化合物对休眠期细胞 的独特作用， 以及对恶性肿瘤复发转移的有效遏止， 弥补了传统肿瘤治疗（手术、 放疗、 化 疗）的不足， 成为肿瘤免疫治疗中的重要成分。 但是桑黄的总三萜类化合物产量较低一直是 限制其应用的影响因素， 由于受生理状态的特殊性、 复杂性以及外部环境的制约， 特别是生 成可应用的子实体需要多年， 加之近几年人们对野生桑黄的大量采集， 天然的桑黄资源已经 非常稀少， 同时桑黄的人工栽培也极其困难， 培养条件苛刻， 且生长周期长达 3〜4年。 因 此，仅是通过利用釆集或人工栽培子实体从中提取总三萜类化合物的生产方式很难满足日益 膨胀的市场需要。 液体发酵法生产桑黄的有效成分有生产周期短、 节省劳动力、 受外部环境 影响小等优点， 是一种相对低成本、 高效的生产方法， 但其中总三萜类成分的分泌产量仍然 较低。
目前，国内外学者对桑黄总三萜类化合物的发酵研究相对较少，主要集中在培养基组成、 溶氧、 PH值及产物提取分离等工艺层面上， 对桑黄总三萜类化合物的发酵水平提高有限， 还远不能满足现代工业化发酵生产的需要。
近年来， 在植物细胞壁中发现一类被称为扩张蛋白的蛋白新家族。 自 McQueen-Mason 等首先从黄瓜下胚轴伸长区分离纯化出扩张蛋白以来， 相继从燕麦胚芽鞘细胞壁、栝楼根尖 细胞壁、 番茄、 烟草、 拟南芥、 水稻、 棉纤维、 玉米、 大豆等细胞壁中也发现了扩张蛋白的 存在， 被认为其普遍存在于各种双子叶和单子叶植物的细胞壁中， 促进其细胞生理生长， 影 响营养生长、 形态发生、 授粉受精、 果实软化等。 通过重组细胞壁实验研究证实了该蛋白与 以前发现的所有细胞壁蛋白不同， 它具有诱导热钝化的离体细胞壁恢复伸展的功能， 被推测 能够打断细胞壁多聚物之间的氢键进而诱导酸依赖的细胞壁延展和压力松弛等生理活动，在 植物生长过程中可能是生理调控和细胞壁松弛延伸的主要调控因子。但是， 关于扩张蛋白的 作用机制目前仍多是猜测和推断， 国内外均未有明确的验证定论和机制阐明。 因此， 对扩张 确认本 蛋白的各种应用的研究报道很少， 将扩张蛋白应用于桑黄的液体发酵生产， 用以提高桑黄三 萜类化合物等次生代谢产物的产量的研究国内外均尚未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用扩张蛋白提高桑黄总三萜类化合物产量的液 体发酵方法。
本发明的技术方案如下：
一种提高桑黄总三萜类化合物产量的液体发酵方法， 包括如下步骤：
( 1 ) 将桑黄菌种接种到平板培养基上， 进行活化培养， 然后取菌块接种于液体发酵培 养基中进行发酵培养， 液体发酵培养条件为： 温度 22〜27 °C， 摇床培养 2〜3天， 摇床转速 100〜180 r/min， 得初发酵液；
(2) 向步骤 （1 ) 制得的初发酵液中加入扩张蛋白溶液， 使扩张蛋白的浓度为 0.2〜1.5 mg/ml, 然后在温度 22〜27 °C、 摇床转速 100〜180 r/min的条件下， 继续培养 3〜5天， 分 离， 得到桑黄菌丝体和发酵液；
(3 ) 从步骤 （2) 制得的发酵液中提取桑黄胞外总三萜类化合物， 从步骤 （2) 制得的 桑黄菌丝体中提取桑黄胞内总三萜类化合物，混合桑黄胞外总三萜类化合物和胞内总三萜类 化合物， 即得桑黄总三萜类化合物。
根据本发明优选的，所述步骤（1 )中的平板培养基为 PDA平板培养基；每升组分如下： 马铃薯 200 g、 葡萄糖 20 g， 琼脂 15g， 蒸馏水定容至 1000 mL。
根据本发明优选的， 所述步骤 （1 ) 中的活化培养条件为： 温度 22~27 V , 时间 4〜5 天。
根据本发明优选的， 所述步骤 （1 ) 中的液体发酵培养基为 PD液体发酵培养基， PD液 体发酵培养基每升组分如下：
马铃薯 200 g、 葡萄糖 20 g, 蒸馏水定容至 1000 mL。
根据本发明优选的， 所述步骤（2) 中， 扩张蛋白的浓度为 0.3〜1.0 mg/ml; 进一步优选 0.35-0.8 mg/mlo 最优选的， 所述步骤 （2) 中， 扩张蛋白的浓度为 0.4 mg/ml。
所述步骤 （2) 中的扩张蛋白溶液可参照现有技术制备， 如采用 McQueen-Mason等在 McQueen-Mason S J， Durachko D M, Cosgrove D J. Two endogenous proteins that induce cell wall ext ension in plants. Plant Cell, 1992, 4: 1425-1433中的记载的方法制备；也可以按照如下 方法制备扩张蛋白溶液：
将大豆或黄瓜种子经 0.05〜0.15 wt% HgCl2消毒 4〜6 min,流水冲洗 5〜7 h，然后， 25〜 28 °C暗培养 4〜6天； 剪取幼苗下胚轴顶端 3〜4 cm， 置 -20 °C预冷 0.5 h, 加预冷至 4 °C的 匀桨缓冲液， 匀浆后， 用孔径 70 μιη的尼龙网过滤， 滤渣经匀浆缓冲液洗涤， 然后将滤渣加 入匀浆缓冲液中， 室温静置 l〜3 h， 得静置液； 向静置液中加入提取液， 4 °C下提取 44〜50 h， 过滤， 按 0.3〜0.5 g/mL的添加量向滤液中缓慢添加 （NH4) 2S04, 添加 （N ) 2S04过 程中不断搅拌， 防止 （N ) 2S04局部过饱和， 然后静置 45〜50 h， 4 °C条件下 25000 g离 心 5〜10 min,沉淀用酸性缓冲液复溶， 4 °C下分子量 3000 Da的透析袋透析，透析液经 20000 g离心 10 min， 取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。
上述扩张蛋白溶液制备方法中， 所述匀浆缓冲液组分为： 25 mmol/L HEPES (4-羟乙基 哌嗪乙磺酸）， 1.5 mmol/L Na2S205， 2 mmol/ L EDTA, 0.1 wt% Triton X- 100， pH 7.0； 所述 提取液组分为： 15 mmol/ L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸， 1.0 mmol/ L EDTA, 1.5 mmol/ L Na2S205 ,
0.5 mol/L NaCl, pH 6.0； 所述酸性缓冲液配制是： 将 2.05 g醋酸钠溶于水中， 用冰醋酸调节 pH至 4.0， 水定容至 1 L。
根据本发明优选的，步骤（2 )中所述的分离是在 15000 r/min条件下离心分离 5〜10 min。 根据本发明优选的， 步骤 （3 ) 中从发酵液中提取桑黄胞外总三萜类化合物的方法， 步 骤如下：
向步骤 （2 ) 制得的发酵液中加入 3〜5倍体积的体积百分数为 95 %的乙醇溶液， 去除 沉淀（沉淀为多糖和其它大分子物质)，取上清液，经 70°C浓缩蒸馏去除乙醇，然后加入 2〜 3倍体积的乙酸乙酯萃取， 再经过 70°C浓缩蒸馏去除乙酸乙酯， 得到桑黄胞外总三萜类化合 物。
根据本发明优选的， 所述步骤（3 ) 中提取桑黄胞内总三萜类化合物的方法， 步骤如下- 将步骤 （2 ) 制得的桑黄菌丝体 65 Ό烘干， 研成粉末， 按每克桑黄菌丝体粉末加 15〜 40 mL甲醇的量加入甲醇， 在室温条件下， 通过频率 40 KHz, 功率 200 W的超声提取 5〜7 h， 过滤， 取上清液， 制得浸提液； 滤渣重复超声提取、 过滤操作， 合并浸提液， 经 65 °C浓 缩蒸馏去除甲醇， 得到桑黄胞内总三萜类化合物。
本发明同已有技术相比有如下积极效果：
7、 本发明将扩张蛋白应用于桑黄总三萜类化合物的液体发酵中， 桑黄胞外总三萜类化 合物和桑黄胞内总三萜类化合物产量分别高达到 952.12 mg/L和 475.51 mg/L,相比现有技术 提高了 2.52倍和 2.19倍， 极大的提高了桑黄总三萜类化合物的产量， 具有良好的工业化应 用前景。
2 , 本发明利用天然桑黄菌种作为生产原料， 环保无毒， 原材料成本低廉， 所采用的桑 黄液体发酵工艺和提取方法简单， 重复性好； 此外， 本发明所述的发酵过程可控， 不受外部 环境条件限制， 适于工业化生产和应用。
3、 本发明所述扩张蛋白可从大多数双子叶和单子叶植物及真菌等不同物种中提取， 来 源广泛， 成本较低， 制备方法也相对简单， 可规模提取生产， 对桑黄总三萜类化合物的发酵 生产具有很好的促进和提升效果。
附图说明
图 1 是不同浓度的扩张蛋白溶液对桑黄胞外总三萜类化合物和桑黄胞内总三萜类化合 物产量的影响曲线；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明， 但本发明所保护范围不限于此。
原料及培养基
实施例中所述的发酵用桑黄 PheUinus igniar ^ 菌种， 购自中国普通微生物菌种保藏 管理中心， 菌种保藏号为 CGMCC No. 51328。
香草醛、 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、 EDTA (乙二胺四乙酸）、 牛血清白蛋白、 Triton X-100 均购自生工生物工程（上海）有限公司公司； 熊果酸标准溶液购自济南盛伟生物科技有限公 司； 其他试剂均为普通市售产品。
实施例中所述的扩张蛋白溶液的制备步骤如下：
将大豆（Glycine max L. Merr. CV. M40; 购自济南伟丽种业有限公司）或黄瓜（Cucumis sativus L. CV. Jinnian No. 6; 购自济南伟丽种业有限公司） 种子经 0.1wt% HgCl2消毒 5 min, 流水冲洗 6 h ， 然后， 栽入湿蛭石中， 27 °C暗培养 5 d。 剪取幼苗下胚轴顶端 3〜4 cm, 即 生长区约 100 g，置 -20 °C冰箱预冷 0.5 h，加预冷至 4 °C的匀浆缓冲液，高速匀浆后，用 70 μπι 尼龙网过滤， 滤渣经匀浆缓冲液洗涤， 然后将滤渣加入匀浆缓冲液中， 室温静置 2 h， 得静 置液； 向静置液中加入提取液， 4 °C下提取 48 h， 过滤， 滤液按 0.4 g/ mL的添加量向滤液中 缓慢添加 （NH4) 2S04, 添加 （NH4) 2S04过程中不断搅拌， 防止 （N ) 2S04局部过饱和， 然后静置 48 h， 4 °C条件下 25000 g离心 lO min, 沉淀用酸性缓冲液复溶， 4 °C条件下用截 留分子量为 3000 Da的聚偏氟乙烯 （PVDF) 透析袋 （购自北京博润莱特科技有限公司） 透 析， 透析液经 20000 g离心 10 min， 取上清液即为制备的扩张蛋白溶液， 置 4 °C下保存。 其 他未描述歩骤可参照 McQueen-Mason等在 McQueen-Mason S J, Durachko D M, Cosgrove D J. Two endogenous proteins that induce cell wall ext ension in plants. Plant Cell, 1992, 4: 1425-1433中的描述进行。
上述匀桨缓冲液组分为： 25 mmol/L HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸）， 1.5 mmol/L Na2S205 , 2 mmol/L EDTA， 0.1 wt % Triton X- 100, pH 7.0；
上述提取液组分为： 15 mmol/L HEPES, 1.0 mmol/L EDTA, 1.5 mmol/L Na2S205， 0.5 mol/L NaCl, pH 6.0；
所述酸性缓冲液每升按如下方法配制：
将 2.05 g醋酸钠溶于水中， 用冰醋酸调节 pH至 4.0， 水定容至 1 L。
扩张蛋白溶液浓度的测定方法釆用考马斯亮蓝法检测， 具体可参照 （《精编蛋白质科学 实验指南》， ISBN: 703018086, 出版日期 1900-1-1 ) 中记载的考马斯亮蓝法进行操作， 以 牛血清白蛋白作标准曲线， 经检测上述扩张蛋白溶液中扩张蛋白浓度为 0.27 g/ml。
实施例中所述 PDA平板培养基，每升组份如下： 马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g，琼脂 15 g， 蒸馏水定容至 1000 mL。
实施例中所述 PD液体发酵培养基， 每升组份如下： 马铃薯 200 g、 葡萄糖 20 g， 蒸馏 水定容至 1000 mL。
实施例 1
一种利用扩张蛋白提高桑黄总三萜类化合物产量的液体发酵方法， 包括如下步骤-
( 1 ) 将桑黄菌种接种到 PDA平板培养基上， 进行活化培养， 培养温度 25 V , 培养时 间 5天， 然后取直径 0.3 cm的菌块 6块， 接种于含有 PD液体发酵培养基的三角瓶中 （每 500 mL三角瓶装 PD液体发酵培养基 150 mL) 进行发酵培养， 液体发酵培养条件为： 温度 25 °C , 摇床培养 2天， 摇床转速 150 r/min, 得初发酵液；
(2 ) 向步骤 （1 ) 制得的初发酵液中加入扩张蛋白溶液， 使扩张蛋白的终浓度为 0.2 mg/mL, 然后在温度 25 °C、 摇床转速 150 r/min的条件下， 继续培养 5天， 15000 r/min条件 下离心分离 10 min， 得到桑黄菌丝体和发酵液；
( 3 )从步骤（2)制得的发酵液中提取桑黄胞外总三萜类化合物， 从桑黄菌丝体中提取 桑黄胞内总三萜类化合物， 混合桑黄胞外总三萜类化合物和桑黄胞内总三萜类化合物，得桑 黄总三萜类化合物；
上述提取桑黄胞外总三萜类化合物的步骤如下：
向步骤 （2) 制得的发酵液中加入 4倍体积的体积百分数为 95 %的乙醇溶液， 经 15000 r/min离心 5〜10 min去除沉淀， 取上清液， 经 70 Ό浓缩蒸馏去除乙醇， 然后加入 3倍体积 的乙酸乙酯萃取， 再经过 70 °C浓缩蒸馏去除乙酸乙酯， 得到桑黄胞外总三萜类化合物； 上述提取桑黄胞内总三萜类化合物的步骤如下- 将步骤 （2) 制得的桑黄菌丝体烘干， 研成粉末， 按每克桑黄菌丝体粉末加 15〜40 mL 甲醇的量加入甲醇， 在室温条件下， 通过频率 40 KHz, 功率 200 W的超声提取 5 h， 过滤， 取上清， 得浸提液， 封口置 4 °C下冷藏； 滤渣重复超声提取、 过滤操作 3次， 合并浸提液； 然后， 经 65 Ό浓缩蒸馏去除甲醇， 得到桑黄胞内总三萜类化合物。
桑黄总三萜类化合物含量的测定
桑黄胞外总三萜类化合物待测样品的制备： 取由 100 mL发酵液制得的桑黄胞外总三萜 类化合物， 加甲醇定容至 2 mL， 制得桑黄胞外总三萜类化合物待测样品；
桑黄胞内总三萜类化合物待测样品的制备： 将由干重 1.0 g的菌丝体中提取出的桑黄胞 内总三萜类化合物， 加甲醇定容至 2 mL, 制得桑黄胞内总三萜类化合物待测样品；
采用本领域常规的紫外比色法测定 （参照 皮文霞， 蔡宝昌， 郭胜伟等. 分光光度法测 定山茱萸制剂中总三萜酸的含量 [ J]. 南京中医药大学学报 . 2003， 19( 2): 99-100. 和 王文祥， 顾振论. 比色法测定山楂总三萜酸的含量. 中国野生植物资源 [ J] . 2001, 20( 5): 47-48.等文献 报道)：
( 1 ) 标准曲线的建立
分别取熊果酸标准溶液 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6 mL于试管中， 再加香草醛 0.2 mL, 高氯酸 0.5 mL, 混勾后于 60 °C水浴中保温 30 min, 取出后置 4 °C冷水中 10 min, 再加入冰 醋酸 5 mL， 于 550 nm处测定吸光值， 以熊果酸的微克数为横坐标， 吸光度为纵坐标， 建立 标准曲线。
(2) 桑黄胞外总三萜类化合物产量的检测
加桑黄胞外总三萜类化合物待测样品 0.1 mL于试管中， 再加香草醛 0.2 mL， 高氯酸 0.5 mL, 混匀后于 60 °C水浴中保温 30 min, 取出后置 4 'C冷水中 10 min, 再加入冰醋酸 5 mL， 于 550 nm处测定吸光值， 经检测， 吸光值为 0.293, 通过标准曲线计算， 0.1 mL桑黄胞外总 三萜类化合物待测样品中含有 2.1151 mg桑黄胞外总三萜类化合物。
2.1151 mgX (2 mL/0.1 mL) /100=0.42302 mg, 即每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜 类化合物 423.02 μβ， 因此， 每升发酵液中含有 423.02 mg桑黄胞外总三萜类化合物。 如图 1 所示。
( 3 ) 桑黄胞内总三萜类化合物产量的检测
加桑黄胞内总三萜类化合物待测样品 0.1 mL于试管中， 再加香草醛 0.2 mL， 高氯酸 0.5 mL, 混匀后于 60 °C水浴中保温 30 min, 取出后置 4 °C冷水中 10 min, 再加入冰醋酸 5 mL, 于 550 nm处测定吸光值， 经检测， 吸光值为 0.122， 通过标准曲线计算， O.lmL桑黄胞内总 三萜类化合物待测样品中含有 470.6 μg桑黄胞内总三萜类化合物。
470.6 μ§Χ (2 mL/0.1 mL) =9412 μβ， 即每克菌丝体 （干重） 中含有桑黄胞内总三萜类 化合物 9.41 mg， 因此， 对应每升发酵液产生的菌丝体中含有 142.21 mg桑黄胞内总三萜类 化合物。 结果如图 1所示。
因此， 每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为： 423.02 mg +142.21 mg =565.23 mg。 实施例 2 如实施例 1 所述的液体发酵方法， 不同之处在于， 步骤 （2) 中扩张蛋白的浓度为 0.4 mg/mL;
经检测计算， 每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物 952.12 ^g, 即每升发酵液 中含有 952.12 mg桑黄胞外总三萜类化合物； 每克菌丝体（干重） 中含有桑黄胞内总三萜类 化合物 17.26 mg, 即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有 333.47 mg桑黄胞内总三萜类化合 物。 结果如图 1所示。
因此， 每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为： 952.12 mg +333.47 mg =1285.59 mg。 实施例 3
如实施例 1 所述的液体发酵方法， 不同之处在于， 步骤 （2 ) 中扩张蛋白的浓度为 0.6 mg/mL;
经检测计算， 每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物 829.51 μ§, 即每升发酵液 中含有 829.51 mg桑黄胞外总三萜类化合物； 每克菌丝体（干重） 中含有桑黄胞内总三萜类 化合物 15.31 mg, 即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有 340.77 mg桑黄胞内总三萜类化合 物。 结果如图 1所示。
因此， 每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为： 829.51 mg +340.77 mg =1170.28 mg。 实施例 4
如实施例 1 所述的液体发酵方法， 不同之处在于， 步骤 （2) 中扩张蛋白的浓度为 0.8 mg/mL;
经检测计算， 每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物 785.76 μg, 即每升发酵液 中含有 785.76 mg桑黄胞外总三萜类化合物； 每克菌丝体（干重） 中含有桑黄胞内总三萜类 化合物 16.34 mg, 即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有 449.51 mg桑黄胞内总三萜类化合 物。 结果如图 1所示。
因此， 每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为： 785.76 mg +449.51 mg =1235.27 mg。 实施例 5
如实施例 1 所述的液体发酵方法， 不同之处在于， 步骤 （2) 中扩张蛋白的浓度为 1.0 mg/mL;
经检测计算， 每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物 838.63 μΕ, 即每升发酵液 中含有 838.63 mg桑黄胞外总三萜类化合物； 每克菌丝体（干重） 中含有桑黄胞内总三萜类 化合物 12.07 mg， 即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有 337.82 mg桑黄胞内总三萜类化合 物。 结果如图 1所示。
因此， 每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为： 838.63 mg +337.82 mg =l 176.45 mg。 实施例 6
如实施例 1 所述的液体发酵方法， 不同之处在于， 步骤 （2) 中扩张蛋白的浓度为 1.2 mg/mL;
经检测计算， 每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物 882.37 μ§, 即每升发酵液 中含有 882.37 mg桑黄胞外总三萜类化合物； 每克菌丝体（干重） 中含有桑黄胞内总三萜类 化合物 13.25 mg, 即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有 335.03 mg桑黄胞内总三萜类化合 物。 结果如图 1所示。
因此， 每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为： 882.37 mg +335.03 mg =1217.4 mg。 如实施例 1 所述的液体发酵方法， 不同之处在于， 步骤 （2) 中扩张蛋白的浓度为 1.5 mg/mL;
经检测计算， 每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物 713.11 μg, 即每升发酵液 中含有 713.11 mg桑黄胞外总三萜类化合物； 每克菌丝体 （干重） 中含有桑黄胞内总三萜类 化合物 15.94 mg， 即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有 414.72 mg桑黄胞内总三萜类化合 物。 结果如图 1所示。
因此， 每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为： 713.11 mg +414.72 mg =1127.83 mg。 对比例 1
如实施例 1所述的液体发酵方法， 不同之处在于， 步骤 （2) 中用不含扩张蛋白的酸性 缓冲液替代实施例加入的扩张蛋白溶液；
经检测计算， 每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物 270.15 μg, 即每升发酵液 中含有 270.15 mg桑黄胞外总三萜类化合物； 每克菌丝体（干重） 中含有桑黄胞内总三萜类 化合物 9.76 mg, 即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有 149.03 mg桑黄胞内总三萜类化合 物。 结果如图 1所示。
因此， 每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为： 270.15 mg +149.03 mg =419.18 mg。 分析
根据以上实施例 1〜7及对比例 1可表明： 扩张蛋白对桑黄胞外总三萜类化合物、 桑黄 胞内总三萜类化合物的产量具有明显促进作用， 分别在发酵液中扩张蛋白的浓度为 0.4 mg/mL和 0.8 mg/mL时，桑黄胞外总三萜类化合物和桑黄胞内总三萜类化合物产量分别达到 最高产量 952.12 mg/L和 475.51 mg/L。 相比对比例 1分别提高了 2.52倍和 2.19倍。
本发明扩张蛋白还可从其它双子叶和单子叶植物及真菌等物种（如： 燕麦胚芽、栝楼根 尖、 番茄、 烟草、 拟南芥、 水稻、 棉纤维、 玉米等） 的细胞壁中提取， 桑黄菌种也可采用其 它普通栽培品种。

Claims

权 利 要 求 书
1、 一种利用扩张蛋白提高桑黄总三萜类化合物产量的液体发酵方法， 其特征在于， 包 括如下步骤-
( 1 ) 将桑黄菌种接种到平板培养基上， 进行活化培养， 然后取菌块接种于液体发酵培 养基中进行发酵培养， 液体发酵培养条件为： 温度 22〜27 °C， 摇床培养 2〜3天， 摇床转速 100〜180 r/min， 得初发酵液；
(2) 向步骤 （1 ) 制得的初发酵液中加入扩张蛋白溶液， 使扩张蛋白的终浓度为 0.2〜 1.5 mg/ml, 然后在温度 22〜27 °C、 摇床转速 100〜180 r/min的条件下， 继续培养 3〜5天， 分离， 得到桑黄菌丝体和发酵液；
(3 )从步骤（2)制得的发酵液中提取桑黄胞外总三萜类化合物， 从桑黄菌丝体中提取 桑黄胞内总三萜类化合物， 混合桑黄胞外总三萜类化合物和桑黄胞内总三萜类化合物， 即得 桑黄总三萜类化合物；
所述步骤 （2) 中的扩张蛋白溶液的制备方法如下：
将大豆或黄瓜种子经 0.05〜0.15 wt% HgCl2消毒 4〜6 min,流水冲洗 5〜7 h，然后， 25〜 28 °C暗培养 4〜6天； 剪取幼苗下胚轴顶端 3〜4 cm, 置 -20 'C预冷 0.5 h， 加预冷至 4 °C的 匀浆缓冲液， 匀浆后， 用孔径 70 μιη的尼龙网过滤， 滤渣经匀浆缓冲液洗涤， 然后将滤渣加 入匀浆缓冲液中， 室温静置 l〜3 h， 得静置液； 向静置液中加入提取液， 4 °C下提取 44〜50 h， 过滤， 按 0.3〜0.5 g/mL的添加量向滤液中缓慢添加 （NH4) 2S04, 添加 （N ) 2S04过 程中不断搅拌， 防止 （N¾) 2S04局部过饱和， 然后静置 45〜50 h， 4 °C条件下 25000 g离 心 5〜10 min,沉淀用酸性缓冲液复溶， 4 °0下分子量 3000 Da的透析袋透析，透析液经 20000 g离心 10 min， 取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。
2、 如权利要求 1所述的液体发酵方法， 其特征在于， 所述步骤（1 ) 中的活化培养条件 为： 温度 22〜27 °C , 时间 4〜5天。
3、 如权利要求 1所述的液体发酵方法， 其特征在于， 所述步骤（2) 中， 扩张蛋白的浓 度为 0.3〜1.0 mg/m。
4、 如权利要求 3所述的液体发酵方法， 其特征在于， 所述步骤（2) 中， 扩张蛋白的浓 度为 0.35〜0.8 mg/mL; 最优选扩张蛋白的浓度为 0.4 mg/mL。
5、如权利要求 1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述匀浆缓冲液组分为： 25 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸， 1.5 mmol/L Na2S205， 2 mmol/L乙二胺四乙酸， 0.1 wt% Triton X- 100， H 7.0。
6、 如权利要求 4所述的液体发酵方法， 其特征在于， 所述提取液组分为： 15 mmol/L 4- 羟乙基哌嗪乙磺酸， 1.0 mmol/L乙二胺四乙酸， 1.5 mmol/L Na2S205, 0.5 mol/LNaCL pH 6.0。
7、 如权利要求 4所述的液体发酵方法， 其特征在于， 所述酸性缓冲液每升按如下方法 配制：
将 2.05 g醋酸钠溶于水中， 用冰醋酸调节 pH至 4.0， 水定容至 1 L。
8、 如权利要求 1所述的液体发酵方法， 其特征在于， 所述步骤 （2) 中的分离， 是指在 15000 r/min条件下离心分离 5〜10 min。
9、 如权利要求 1所述的液体发酵方法， 其特征在于， 所述步骤（3) 中提取桑黄胞外总 三萜类化合物的步骤如下：
向步骤 （2) 制得的发酵液中加入 3〜5倍体积的体积百分数为 95 %的乙醇溶液， 去除 沉淀， 取上清液， 经 70°C浓缩蒸馏去除乙醇， 然后加入 2〜3倍体积的乙酸乙酯萃取， 再经 过 70 °C浓缩蒸馏去除乙酸乙酯， 得到胞外总三萜类化合物。
10、 如权利要求 1所述的液体发酵方法， 其特征在于， 所述步骤 （3 ) 中提取桑黄胞内 总三萜类化合物的步骤如下：
将歩骤 （2) 制得的桑黄菌丝体 65 °C烘干， 研成粉末， 按每克桑黄菌丝体粉末加 15〜 40 mL甲醇的量加入甲醇， 在室温条件下， 通过频率 40 KHz, 功率 200 W的超声提取 5〜7 h， 过滤， 取上清液， 制得浸提液； 滤渣重复超声提取、 过滤操作， 合并浸提液， 经 65 °C浓 缩蒸馏去除甲醇， 得到桑黄胞内总三萜类化合物。
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