CN102628064A - 一种提高桑黄总三萜类化合物产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高桑黄总三萜类化合物产量的液体发酵方法，包括如下步骤：(1)将桑黄菌种接种到平板培养基上，进行活化培养，然后取菌块接种于液体发酵培养基中进行发酵培养，得初发酵液；(2)向初发酵液中加入扩张蛋白溶液，继续培养3～5天，得到桑黄菌丝体和发酵液；(3)从发酵液中提取桑黄胞外总三萜类化合物，从桑黄菌丝体中提取桑黄胞内总三萜类化合物，混合桑黄胞外总三萜类化合物和桑黄胞内总三萜类化合物，即得桑黄总三萜类化合物。本发明将扩张蛋白应用于桑黄总三萜类化合物的液体发酵中，桑黄胞外总三萜类化合物和桑黄胞内总三萜类化合物产量相比现有技术提高了2.52倍和2.19倍，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种提高桑黄总三萜类化合物产量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高桑黄总三萜类化合物产量的液体发酵方法，属于生物发酵工程技术领域。
背景技术
桑黄(Phellinus igniarius)为担子菌亚门Basidiomycotina、层菌纲Hymenomycetes、多孔菌目Polyporales、锈革孔菌科Hymenochaetacae、针层孔菌属(Phellinus)真菌，是一种珍贵的大型药用真菌。传统中医认为桑黄性甘、味苦，用于治疗血崩、带下、闭经、脾虚泄泻等。现代药理学研究表明，桑黄具有抗肿瘤、增强免疫力、抗肝纤维化等功效。据报道，桑黄是目前抗肿瘤能力最高的药用真菌。早在1968年，日本学者Tetsuro Ikekawa等用桑黄的水提取物进行细胞试验，结果发现其对小鼠S180的抑制率为96.7％，而对正常细胞无毒，同时研究发现桑黄主要活性成分为多糖组分、三萜类化合物和黄酮类物质，其中所含三萜类涵盖了不下百余种的化合物成分，其中以四环三萜类化合物为主。近来研究表明桑黄中的三萜类物质具有迅速提高免疫力的作用，表现在促进淋巴细胞增殖，提高巨噬细胞、NK细胞、T细胞的吞噬能力和杀伤力，并直接和间接毒杀肿瘤细胞，同时能够激活化疗药物难以杀死的休眠期肿瘤细胞，进行单独和联合毒杀。由于桑黄三萜类化合物对休眠期细胞的独特作用，以及对恶性肿瘤复发转移的有效遏止，弥补了传统肿瘤治疗(手术、放疗、化疗)的不足，成为肿瘤免疫治疗中的重要成分。但是桑黄的总三萜类化合物产量较低一直是限制其应用的影响因素，由于受生理状态的特殊性、复杂性以及外部环境的制约，特别是生成可应用的子实体需要多年，加之近几年人们对野生桑黄的大量采集，天然的桑黄资源已经非常稀少，同时桑黄的人工栽培也极其困难，培养条件苛刻，且生长周期长达3～4年。因此，仅是通过利用采集或人工栽培子实体从中提取总三萜类化合物的生产方式很难满足日益膨胀的市场需要。液体发酵法生产桑黄的有效成分有生产周期短、节省劳动力、受外部环境影响小等优点，是一种相对低成本、高效的生产方法，但其中总三萜类成分的分泌产量仍然较低。
目前，国内外学者对桑黄总三萜类化合物的发酵研究相对较少，主要集中在培养基组成、溶氧、pH值及产物提取分离等工艺层面上，对桑黄总三萜类化合物的发酵水平提高有限，还远不能满足现代工业化发酵生产的需要。
近年来，在植物细胞壁中发现一类被称为扩张蛋白的蛋白新家族。自McQueen-Mason等首先从黄瓜下胚轴伸长区分离纯化出扩张蛋白以来，相继从燕麦胚芽鞘细胞壁、栝楼根尖细胞壁、番茄、烟草、拟南芥、水稻、棉纤维、玉米、大豆等细胞壁中也发现了扩张蛋白的存在，被认为其普遍存在于各种双子叶和单子叶植物的细胞壁中，促进其细胞生理生长，影响营养生长、形态发生、授粉受精、果实软化等。通过重组细胞壁实验研究证实了该蛋白与以前发现的所有细胞壁蛋白不同，它具有诱导热钝化的离体细胞壁恢复伸展的功能，被推测能够打断细胞壁多聚物之间的氢键进而诱导酸依赖的细胞壁延展和压力松弛等生理活动，在植物生长过程中可能是生理调控和细胞壁松弛延伸的主要调控因子。但是，关于扩张蛋白的作用机制目前仍多是猜测和推断，国内外均未有明确的验证定论和机制阐明。因此，对扩张蛋白的各种应用的研究报道很少，将扩张蛋白应用于桑黄的液体发酵生产，用以提高桑黄三萜类化合物等次生代谢产物的产量的研究国内外均尚未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用扩张蛋白提高桑黄总三萜类化合物产量的液体发酵方法。
本发明的技术方案如下：
一种提高桑黄总三萜类化合物产量的液体发酵方法，包括如下步骤：
(1)将桑黄菌种接种到平板培养基上，进行活化培养，然后取菌块接种于液体发酵培养基中进行发酵培养，液体发酵培养条件为：温度22～27℃，摇床培养2～3天，摇床转速100～180r/min，得初发酵液；
(2)向步骤(1)制得的初发酵液中加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为0.2～1.5mg/ml，然后在温度22～27℃、摇床转速100～180r/min的条件下，继续培养3～5天，分离，得到桑黄菌丝体和发酵液；
(3)从步骤(2)制得的发酵液中提取桑黄胞外总三萜类化合物，从步骤(2)制得的桑黄菌丝体中提取桑黄胞内总三萜类化合物，混合桑黄胞外总三萜类化合物和胞内总三萜类化合物，即得桑黄总三萜类化合物。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的平板培养基为PDA平板培养基；每升组分如下：
马铃薯200g、葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水定容至1000mL。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的活化培养条件为：温度22～27℃，时间4～5天。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的液体发酵培养基为PD液体发酵培养基，PD液体发酵培养基每升组分如下：
马铃薯200g、葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为0.3～1.0mg/ml；进一步优选0.35～0.8mg/ml。最优选的，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为0.4mg/ml。
所述步骤(2)中的扩张蛋白溶液可参照现有技术制备，如采用McQueen-Mason等在McQueen-Mason S J，Durachko D M，Cosgrove D J.Two endogenous proteins that induce cellwall ext ension in plants.Plant Cell，1992，4：1425～1433中的记载的方法制备；也可以按照如下方法制备扩张蛋白溶液：
将大豆或黄瓜种子经0.05～0.15wt％HgCl2消毒4～6min，流水冲洗5～7h，然后，25～28℃暗培养4～6天；剪取幼苗下胚轴顶端3～4cm，置-20℃预冷0.5h，加预冷至4℃的匀浆缓冲液，匀浆后，用孔径70μm的尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置1～3h，得静置液；向静置液中加入提取液，4℃下提取44～50h，过滤，按0.3～0.5g/mL的添加量向滤液中缓慢添加(NH4)2SO4，添加(NH4)2SO4过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，然后静置45～50h，4℃条件下25000g离心5～10min，沉淀用酸性缓冲液复溶，4℃下分子量3000Da的透析袋透析，透析液经20000g离心10min，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。
上述扩张蛋白溶液制备方法中，所述匀浆缓冲液组分为：25mmol/L HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，1.5mmol/LNa2S2O5，2mmol/L EDTA，0.1wt％ Triton X-100，pH 7.0；所述提取液组分为：15mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.0mmol/L EDTA，1.5mmol/L Na2S2O5，0.5mol/L NaCl，pH 6.0；所述酸性缓冲液配制是：将2.05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4.0，水定容至1L。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述的分离是在15000r/min条件下离心分离5～10min。
根据本发明优选的，步骤(3)中从发酵液中提取桑黄胞外总三萜类化合物的方法，步骤如下：
向步骤(2)制得的发酵液中加入3～5倍体积的体积百分数为95％的乙醇溶液，去除沉淀(沉淀为多糖和其它大分子物质)，取上清液，经70℃浓缩蒸馏去除乙醇，然后加入2～3倍体积的乙酸乙酯萃取，再经过70℃浓缩蒸馏去除乙酸乙酯，得到桑黄胞外总三萜类化合物。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中提取桑黄胞内总三萜类化合物的方法，步骤如下：
将步骤(2)制得的桑黄菌丝体65℃烘干，研成粉末，按每克桑黄菌丝体粉末加15～40mL甲醇的量加入甲醇，在室温条件下，通过频率40KHz，功率200W的超声提取5～7h，过滤，取上清液，制得浸提液；滤渣重复超声提取、过滤操作，合并浸提液，经65℃浓缩蒸馏去除甲醇，得到桑黄胞内总三萜类化合物。
本发明同已有技术相比有如下积极效果：
1、本发明将扩张蛋白应用于桑黄总三萜类化合物的液体发酵中，桑黄胞外总三萜类化合物和桑黄胞内总三萜类化合物产量分别高达到952.12mg/L和475.51mg/L，相比现有技术提高了2.52倍和2.19倍，极大的提高了桑黄总三萜类化合物的产量，具有良好的工业化应用前景。
2、本发明利用天然桑黄菌种作为生产原料，环保无毒，原材料成本低廉，所采用的桑黄液体发酵工艺和提取方法简单，重复性好；此外，本发明所述的发酵过程可控，不受外部环境条件限制，适于工业化生产和应用。
3、本发明所述扩张蛋白可从大多数双子叶和单子叶植物及真菌等不同物种中提取，来源广泛，成本较低，制备方法也相对简单，可规模提取生产，对桑黄总三萜类化合物的发酵生产具有很好的促进和提升效果。
附图说明
图1是不同浓度的扩张蛋白溶液对桑黄胞外总三萜类化合物和桑黄胞内总三萜类化合物产量的影响曲线；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明，但本发明所保护范围不限于此。
原料及培养基
实施例中所述的发酵用桑黄(Phellinus igniarius)菌种，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为CGMCC No.51328。
香草醛、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、EDTA(乙二胺四乙酸)、牛血清白蛋白、Triton X-100均购自生工生物工程(上海)有限公司公司；熊果酸标准溶液购自济南盛伟生物科技有限公司；其他试剂均为普通市售产品。
实施例中所述的扩张蛋白溶液的制备步骤如下：
将大豆(Glycine max L.Merr.CV.M40；购自济南伟丽种业有限公司)或黄瓜(Cucumissativus L.CV.Jinnian No.6；购自济南伟丽种业有限公司)种子经0.1wt％ HgCl2消毒5min，流水冲洗6h，然后，栽入湿蛭石中，27℃暗培养5d。剪取幼苗下胚轴顶端3～4cm，即生长区约100g，置-20℃冰箱预冷0.5h，加预冷至4℃的匀浆缓冲液，高速匀浆后，用70μm尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置2h，得静置液；向静置液中加入提取液，4℃下提取48h，过滤，滤液按0.4g/mL的添加量向滤液中缓慢添加(NH4)2SO4，添加(NH4)2SO4过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，然后静置48h，4℃条件下25000g离心10min，沉淀用酸性缓冲液复溶，4℃条件下用截留分子量为3000Da的聚偏氟乙烯(PVDF)透析袋(购自北京博润莱特科技有限公司)透析，透析液经20000g离心10min，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液，置4℃下保存。其他未描述步骤可参照McQueen-Mason等在McQueen-Mason S J，Durachko D M，Cosgrove DJ.Two endogenous proteins that induce cell wall ext ension in plants.Plant Cell，1992，4：1425～1433中的描述进行。
上述匀浆缓冲液组分为：25mmol/LHERES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，1.5mmol/L Na2S2O5，2mmol/L EDTA，0.1wt％ Triton X-100，pH 7.0；
上述提取液组分为：15mmol/L HERES，1.0mmol/L EDTA，1.5mmol/L Na2S2O5，0.5mol/LNaCl，pH 6.0；
所述酸性缓冲液每升按如下方法配制：
将2.05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4.0，水定容至1L。
扩张蛋白溶液浓度的测定方法采用考马斯亮蓝法检测，具体可参照(《精编蛋白质科学实验指南》，ISBN：703018086，出版日期1900-1-1)中记载的考马斯亮蓝法进行操作，以牛血清白蛋白作标准曲线，经检测上述扩张蛋白溶液中扩张蛋白浓度为0.27g/ml。
实施例中所述PDA平板培养基，每升组份如下：马铃薯200g、葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水定容至1000mL。
实施例中所述PD液体发酵培养基，每升组份如下：马铃薯200g、葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL。
实施例1
一种利用扩张蛋白提高桑黄总三萜类化合物产量的液体发酵方法，包括如下步骤：
(1)将桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度25℃，培养时间5天，然后取直径0.3cm的菌块6块，接种于含有PD液体发酵培养基的三角瓶中(每500mL三角瓶装PD液体发酵培养基150mL)进行发酵培养，液体发酵培养条件为：温度25℃，摇床培养2天，摇床转速150r/min，得初发酵液；
(2)向步骤(1)制得的初发酵液中加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的终浓度为0.2mg/mL，然后在温度25℃、摇床转速150r/min的条件下，继续培养5天，15000r/min条件下离心分离10min，得到桑黄菌丝体和发酵液；
(3)从步骤(2)制得的发酵液中提取桑黄胞外总三萜类化合物，从桑黄菌丝体中提取桑黄胞内总三萜类化合物，混合桑黄胞外总三萜类化合物和桑黄胞内总三萜类化合物，得桑黄总三萜类化合物；
上述提取桑黄胞外总三萜类化合物的步骤如下：
向步骤(2)制得的发酵液中加入4倍体积的体积百分数为95％的乙醇溶液，经15000r/min离心5～10min去除沉淀，取上清液，经70℃浓缩蒸馏去除乙醇，然后加入3倍体积的乙酸乙酯萃取，再经过70℃浓缩蒸馏去除乙酸乙酯，得到桑黄胞外总三萜类化合物；
上述提取桑黄胞内总三萜类化合物的步骤如下：
将步骤(2)制得的桑黄菌丝体烘干，研成粉末，按每克桑黄菌丝体粉末加15～40mL甲醇的量加入甲醇，在室温条件下，通过频率40KHz，功率200W的超声提取5h，过滤，取上清，得浸提液，封口置4℃下冷藏；滤渣重复超声提取、过滤操作3次，合并浸提液；然后，经65℃浓缩蒸馏去除甲醇，得到桑黄胞内总三萜类化合物。
桑黄总三萜类化合物含量的测定
桑黄胞外总三萜类化合物待测样品的制备：取由100mL发酵液制得的桑黄胞外总三萜类化合物，加甲醇定容至2mL，制得桑黄胞外总三萜类化合物待测样品；
桑黄胞内总三萜类化合物待测样品的制备：将由干重1.0g的菌丝体中提取出的桑黄胞内总三萜类化合物，加甲醇定容至2mL，制得桑黄胞内总三萜类化合物待测样品；
采用本领域常规的紫外比色法测定(参照皮文霞，蔡宝昌，郭胜伟等.分光光度法测定山茱萸制剂中总三萜酸的含量[J].南京中医药大学学报.2003，19(2)：99-100.和王文祥，顾振纶.比色法测定山楂总三萜酸的含量.中国野生植物资源[J].2001，20(5)：47-48.等文献报道)：
(1)标准曲线的建立
分别取熊果酸标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL于试管中，再加香草醛0.2mL，高氯酸0.5mL，混匀后于60℃水浴中保温30min，取出后置4℃冷水中10min，再加入冰醋酸5mL，于550nm处测定吸光值，以熊果酸的微克数为横坐标，吸光度为纵坐标，建立标准曲线。
(2)桑黄胞外总三萜类化合物产量的检测
加桑黄胞外总三萜类化合物待测样品0.1mL于试管中，再加香草醛0.2mL，高氯酸0.5mL，混匀后于60℃水浴中保温30min，取出后置4℃冷水中10min，再加入冰醋酸5mL，于550nm处测定吸光值，经检测，吸光值为0.293，通过标准曲线计算，0.1mL桑黄胞外总三萜类化合物待测样品中含有2.1151mg桑黄胞外总三萜类化合物。
2.1151mg×(2mL/0.1mL)/100＝0.42302mg，即每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物423.02μg，因此，每升发酵液中含有423.02mg桑黄胞外总三萜类化合物。如图1所示。
(3)桑黄胞内总三萜类化合物产量的检测
加桑黄胞内总三萜类化合物待测样品0.1mL于试管中，再加香草醛0.2mL，高氯酸0.5mL，混匀后于60℃水浴中保温30min，取出后置4℃冷水中10min，再加入冰醋酸5mL，于550nm处测定吸光值，经检测，吸光值为0.122，通过标准曲线计算，0.1mL桑黄胞内总三萜类化合物待测样品中含有470.6μg桑黄胞内总三萜类化合物。
470.6μg×(2mL/0.1mL)＝9412μg，即每克菌丝体(干重)中含有桑黄胞内总三萜类化合物9.41mg，因此，对应每升发酵液产生的菌丝体中含有142.21mg桑黄胞内总三萜类化合物。结果如图1所示。
因此，每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为：423.02mg+142.21mg＝565.23mg。
实施例2
如实施例1所述的液体发酵方法，不同之处在于，步骤(2)中扩张蛋白的浓度为0.4mg/mL；
经检测计算，每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物952.12μg，即每升发酵液中含有952.12mg桑黄胞外总三萜类化合物；每克菌丝体(干重)中含有桑黄胞内总三萜类化合物17.26mg，即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有333.47mg桑黄胞内总三萜类化合物。结果如图1所示。
因此，每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为：952.12mg+333.47mg＝1285.59mg。
实施例3
如实施例1所述的液体发酵方法，不同之处在于，步骤(2)中扩张蛋白的浓度为0.6mg/mL；
经检测计算，每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物829.51μg，即每升发酵液中含有829.51mg桑黄胞外总三萜类化合物；每克菌丝体(干重)中含有桑黄胞内总三萜类化合物15.31mg，即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有340.77mg桑黄胞内总三萜类化合物。结果如图1所示。
因此，每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为：829.51mg+340.77mg＝1170.28mg。
实施例4
如实施例1所述的液体发酵方法，不同之处在于，步骤(2)中扩张蛋白的浓度为0.8mg/mL；
经检测计算，每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物785.76μg，即每升发酵液中含有785.76mg桑黄胞外总三萜类化合物；每克菌丝体(干重)中含有桑黄胞内总三萜类化合物16.34mg，即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有449.51mg桑黄胞内总三萜类化合物。结果如图1所示。
因此，每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为：785.76mg+449.51mg＝1235.27mg。
实施例5
如实施例1所述的液体发酵方法，不同之处在于，步骤(2)中扩张蛋白的浓度为1.0mg/mL；
经检测计算，每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物838.63μg，即每升发酵液中含有838.63mg桑黄胞外总三萜类化合物；每克菌丝体(干重)中含有桑黄胞内总三萜类化合物12.07mg，即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有337.82mg桑黄胞内总三萜类化合物。结果如图1所示。
因此，每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为：838.63mg+337.82mg＝1176.45mg。
实施例6
如实施例1所述的液体发酵方法，不同之处在于，步骤(2)中扩张蛋白的浓度为1.2mg/mL；
经检测计算，每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物882.37μg，即每升发酵液中含有882.37mg桑黄胞外总三萜类化合物；每克菌丝体(干重)中含有桑黄胞内总三萜类化合物13.25mg，即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有335.03mg桑黄胞内总三萜类化合物。结果如图1所示。
因此，每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为：882.37mg+335.03mg＝1217.4mg。
实施例7
如实施例1所述的液体发酵方法，不同之处在于，步骤(2)中扩张蛋白的浓度为1.5mg/mL；
经检测计算，每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物713.11μg，即每升发酵液中含有713.11mg桑黄胞外总三萜类化合物；每克菌丝体(干重)中含有桑黄胞内总三萜类化合物15.94mg，即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有414.72mg桑黄胞内总三萜类化合物。结果如图1所示。
因此，每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为：713.11mg+414.72mg＝1127.83mg。
对比例1
如实施例1所述的液体发酵方法，不同之处在于，步骤(2)中用不含扩张蛋白的酸性缓冲液替代实施例加入的扩张蛋白溶液；
经检测计算，每毫升发酵液中含有桑黄胞外总三萜类化合物270.15μg，即每升发酵液中含有270.15mg桑黄胞外总三萜类化合物；每克菌丝体(干重)中含有桑黄胞内总三萜类化合物9.76mg，即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有149.03mg桑黄胞内总三萜类化合物。结果如图1所示。
因此，每升发酵液桑黄总三萜类化合物产量为：270.15mg+149.03mg＝419.18mg。
分析
根据以上实施例1～7及对比例1可表明：扩张蛋白对桑黄胞外总三萜类化合物、桑黄胞内总三萜类化合物的产量具有明显促进作用，分别在发酵液中扩张蛋白的浓度为0.4mg/mL和0.8mg/mL时，桑黄胞外总三萜类化合物和桑黄胞内总三萜类化合物产量分别达到最高产量952.12mg/L和475.51mg/L。相比对比例1分别提高了2.52倍和2.19倍。
本发明扩张蛋白还可从其它双子叶和单子叶植物及真菌等物种(如：燕麦胚芽、栝楼根尖、番茄、烟草、拟南芥、水稻、棉纤维、玉米等)的细胞壁中提取，桑黄菌种也可采用其它普通栽培品种。

Claims (10)

1.一种利用扩张蛋白提高桑黄总三萜类化合物产量的液体发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将桑黄菌种接种到平板培养基上，进行活化培养，然后取菌块接种于液体发酵培养基中进行发酵培养，液体发酵培养条件为：温度22～27℃，摇床培养2～3天，摇床转速100～180r/min，得初发酵液；
(2)向步骤(1)制得的初发酵液中加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的终浓度为0.2～1.5mg/ml，然后在温度22～27℃、摇床转速100～180r/min的条件下，继续培养3～5天，分离，得到桑黄菌丝体和发酵液；
(3)从步骤(2)制得的发酵液中提取桑黄胞外总三萜类化合物，从桑黄菌丝体中提取桑黄胞内总三萜类化合物，混合桑黄胞外总三萜类化合物和桑黄胞内总三萜类化合物，即得桑黄总三萜类化合物。
2.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤(1)中的活化培养条件为：温度22～27℃，时间4～5天。
3.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为0.3～1.0mg/mL；进一步优选0.35～0.8mg/mL；最优选扩张蛋白的浓度为0.4mg/mL。
4.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)中的扩张蛋白溶液的制备方法如下：
将大豆或黄瓜种子经0.05～0.15wt％ HgCl2消毒4～6min，流水冲洗5～7h，然后，25～28℃暗培养4～6天；剪取幼苗下胚轴顶端3～4cm，置-20℃预冷0.5h，加预冷至4℃的匀浆缓冲液，匀浆后，用孔径70μm的尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置1～3h，得静置液；向静置液中加入提取液，4℃下提取44～50h，过滤，按0.3～0.5g/mL的添加量向滤液中缓慢添加(NH4)2SO4，添加(NH4)2SO4过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，然后静置45～50h，4℃条件下25000g离心5～10min，沉淀用酸性缓冲液复溶，4℃下分子量3000Da的透析袋透析，透析液经20000g离心10min，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。
5.如权利要求4所述的液体发酵方法，其特征在于，所述匀浆缓冲液组分为：25mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.5mmol/L Na2S2O5，2mmol/L乙二胺四乙酸，0.1wt％ Triton X-100，pH 7.0。
6.如权利要求4所述的液体发酵方法，其特征在于，所述提取液组分为：15mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.0mmol/L乙二胺四乙酸，1.5mmol/L Na2S2O5，0.5mol/L NaCl，pH 6.0。
7.如权利要求4所述的液体发酵方法，其特征在于，所述酸性缓冲液每升按如下方法配制：
将2.05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4.0，水定容至1L。
8.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)中的分离，是指在15000r/min条件下离心分离5～10min。
9.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤(3)中提取桑黄胞外总三萜类化合物的步骤如下：
向步骤(2)制得的发酵液中加入3～5倍体积的体积百分数为95％的乙醇溶液，去除沉淀，取上清液，经70℃浓缩蒸馏去除乙醇，然后加入2～3倍体积的乙酸乙酯萃取，再经过70℃浓缩蒸馏去除乙酸乙酯，得到胞外总三萜类化合物。
10.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤(3)中提取桑黄胞内总三萜类化合物的步骤如下：
将步骤(2)制得的桑黄菌丝体65℃烘干，研成粉末，按每克桑黄菌丝体粉末加15～40mL甲醇的量加入甲醇，在室温条件下，通过频率40KHz，功率200W的超声提取5～7h，过滤，取上清液，制得浸提液；滤渣重复超声提取、过滤操作，合并浸提液，经65℃浓缩蒸馏去除甲醇，得到桑黄胞内总三萜类化合物。
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